EBV VCAIgMELA PKS medac Magyar 127PKSVPU/010512
GYÁRTÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg FORGALMAZÓ medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Tel.: ++49/ 4103/ 8006351 Fax: ++49/ 4103/ 8006359 RENDELÉSI CÍM Tel.: ++49/ 4103/ 8006111 Fax: ++49/ 4103/ 8006113 127PKSVPU/010512
EBV VCAIgMELA Test PKS medac Enzim immunoassay Pipettázási Kontroll Rendszerrel, EpsteinBarr vírus specifikus kapszid antigén (VCA) elleni IgM antitestek kvantitatív kimutatására szérumból Katalógusszám: 127PKS KIZÁRÓLAG IN VITRO DIAGNOSZTIKAI HASZNÁLATRA BEVEZETÉS Az EpsteinBarr vírus (EBV) a Herpesviridae családba tartozik. Duplaszálú DNSt, kapszidot, burkot és bevonatot tartalmaz. Az EBVre jellemzı, hogy latensen élethosszig perzisztál a szervezetben a primer fertızés után. Az összes felnıtt 90 95 %a EBVvel fertızött világszerte. A lefolyás, EBV primer fertızés immunkompetens egyénekben korai gyermekkorban fordul elı, általában tünetmentes. Fiatal felnıttekben az EBV fertızés mirigyláz (Pfeiffer kór) formában jelentkezik. Kissé immunszuppresszált egyénekben klinikailag csendes reaktiváció elıfordulhat. Masszívan immunszuppresszált egyénekben EBVasszociált poliklonális Bsejt limfoma fordul elı. A Hodgkinlimfomák 60 %ában EBV DNS van jelen. Az endémiásan jelentıs EBVasszociált tumor megbetegedések a Burkitt limfóma és a nasopharyngealis karcinoma. Az antitest kimutatáshoz szükséges releváns antigén komplexek az EBV specifikus nukleáris antigén (EBNA), a vírus kapszid antigén (VCA) és a korai antigén (EA). Immunkompetens egyénekben a antitestek kimutatása a primer és korábbi fertızések, illetve a szeronegativitás megkülönböztetése céljából az EBV diagnózis fókusza. Az EBV szerológia fontos lehet a lymphadenopathya és tisztázatlan neurológiás betegségek addicionális diagnosztikájában. A releváns EBV szerológia összefüggésében az EBNA1 IgG meghatározás az elsı lépés. Pozitív eredmény korábbi fertızésre utal. Negatív EBNA1 IgG esetén a VCA IgG és IgM meghatározás alapvetıen fontos a fertızés státuszának megkülönböztetésében. Az EBV VCAIgMELA PKS medac a vírus kapszid gp 125 fehérje elleni specifikus IgG antitesteket mutatja ki. A teszt gyorsan és könnyen kivitelezhetı. A µcapture és ELAmódszer lehetıvé teszi a nagyon specifikus és érzékeny diagnosztikai értelmezést. 127PKSVPU/010512 1
A TESZT ELVE A lemezt antihumán IgM immunglobulinnal vonták be. A mintában levı IgM szelektíven kötıdik az antigénhez. Az mabperoxidáz komplex és a VCA gp 125 antigén kötıdik az anti VCAIgM specifikus antitestekhez (AG = antigén,p = peroxidáz). Inkubáció a TMBszubsztráttal (*). A reakciót kénsavval állítjuk le. Az abszorbanciát fotométerrel olvassuk le. A teszt elınyei A rheumatoid faktorok által okozott nemspecifikus és álpozitív reakciók nem jelentkeznek. A magas IgG titer nem gátolja az IgM antitesteket. A Pipettázási Kontroll Rendszer színváltozással lehetıvé teszi az összes pipettázási lépés vizuális monitorozását. A törhetı csíkok lehetıvé teszik a teszt gazdaságos felhasználását. Alkalmas az automatizálásra nyílt rendszerő ELISA készülékeken 127PKSVPU/010512 2
A KIT TARTALMA Katalógusszám: 127PKS 1. MTP Mikrotiterlemez: 12 x 8 lyuk (jelölés: VCM, kerettel és szárítószerrel, vákuum zárású alumínium zacskóban), törhetı, U alakú, kecske antihumán IgM immunglobulinnal bevont, BSA és ph indikátor, felhasználásra kész. 2. CONTROL Negatív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, BSAt, fenolt, ProClin TM 300at és gentamycin szulfátot tartalmaz. 3. CONTROL + Pozitív kontroll: 1 fiola, 1,5 ml, humán szérum, felhasználásra kész, FCSt, BSAt, fenolt, ProClin TM 300at és gentamycin szulfátot tartalmaz. 4. WB Mosó puffer: 1 flakon, 100 ml, PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, ProClin TM 300 tartalmú. 5. VIRDIL Mintahígító: 1 flakon, 110 ml, PBS/Tween/BSA, ph 7,2 7,4, felhasználásra kész, ProClin TM 300 tartalmú. 6. ANTIGENDIL Antigén hígító: 1 flakon, 14 ml, Tris/NaCl, felhasználásra kész, ProClin TM 300 tartalmú. 7. ANTIGEN Antigén: 6 flakon, mindegyik 2,0 ml, EBV VCA gp 125/BSA, liofilizált. 8. CON Konjugátum: 1 fiola, 0,35 ml, anti VCA gp 125IgG egér monoklonális antitestek, HRPvel konjugált, felhasználásra kész, piros színő, BSAt, fenolt, ProClin TM 300at és gentamycin szulfátot tartalmaz. 9. TMB TMBszubsztrát: 1 flakon, 10 ml, felhasználásra kész. 10. STOP Leállító oldat: 2 flakon, mindegyik 11 ml, 0,5 M kénsav (H 2 SO 4 ), felhasználásra kész. 127PKSVPU/010512 3
1. TÁROLÁS ÉS STABILITÁS Anyag/Reagens Állapot Tárolás Stabilitás Teszt kit bontatlan 2...8 C lejárati idı végéig Mikrotiterlemez bontott 2...8 C zacskóban 6 hét szárítószerrel Kontrollok bontott 2...8 C 6 hét Mosó puffer hígított 2...8 C 6 hét Mintahígító bontott 2...8 C 6 hét Konjugátum bontott 2...8 C 6 hét Antigénkonjugátum keverék felhasználásr a kész szobahımérséklet 6 óráig TMBszubsztrát bontott 2...8 C 6 hét Leállító oldat bontott 2...8 C lejárati idı végéig Ne használjuk a reagenseket a lejárati idın túl. 2. SZÜKSÉGES DE A KITBEN NEM BIZTOSÍTOTT REAGENSEK ÉS ANYAGOK 2.1. Víz injekcióhoz (H 2 O újradesztillált). Ioncserélt víz zavarhatja a mérési eljárást. 2.2. Állítható mikropipetták. 2.3. Tiszta üveg, vagy mőanyag edények a mosó puffer hígításához. 2.4. Mikrotiterlemezek mosására alkalmas készülék (pl. többcsatornás pipetta, vagy ELISA mosó). 2.5. 37 Cos inkubátor. 2.6. Mikrotiterlemez leolvasó 450 nm és 620 650 nm szőrıkkel. 3. A REAGENSEK ELİKÉSZÍTÉSE A mérés megkezdése elıtt az összes komponenst szobahımérsékletőre kell hozni. Határozzuk meg a felhasználandó lyukak számát. 127PKSVPU/010512 4
3.1. Mikrotiterlemez Az alumínium tasakot mindig szorosan zárjuk vissza a szárítószerrel együtt. A tárolási körülmények és a stabilitási adatok az 1. pont alatt találhatóak. Megjegyzés: A mikrotiterlemez lyukai halvány zöld színőek. A lyukakban idınként elıforduló zöldesbarna elszínezıdést a gyártási eljárás okozza, a teszt teljesítıképességét nem befolyásolja. 3.2. Mosó puffer Keverjünk össze egy térfogategység mosó puffert (10x) kilenc egység injekció minıségő vízzel (pl. 50 ml mosó puffert (10x) 450 ml vízzel). 10 ml hígított mosó puffer szükséges nyolc lyukhoz. A mosó pufferben (10x) elıforduló kristályokat fel kell oldani melegítéssel (max. 37 C) és/vagy szobahımérsékleten keveréssel. 3.3. Antigénkonjugátum keverék Oldjuk fel a liofilizált antigént 2,0 ml antigén hígítóval. Óvatosan keverjük meg, ügyelve arra, hogy a kupakba tapadt részecskék is feloldódjanak. Adjunk 50 µl konjugátumot 2,0 ml antigénhez 60 perccel a felhasználás elıtt. Az antigén feloldása és a konjugátum hozzáadása után az antigénkonjugátum keverék piros lesz és felhasználásra kész. A felhasználásra kész antigénkonjugátum 6 óráig használható szobahımérsékleten tárolva (ld. 1). Soha ne keverjük a specifikus reagenseket (mikrotiterlemez, kontrollok, konjugátum, antigén, antigén hígító) a különbözı gyártási számú kitekben. Ezzel szemben a mintahígító, a mosó puffer, a TMBszubsztrát és a leállító oldat általában cserélhetı az összes Medac virológiai ELISA kitben. Más gyártó reagensei nem használhatóak. Érvényes és reprodukálható eredmények csak a használati utasítás pontos betartása esetén nyerhetık. 127PKSVPU/010512 5
4. MINTÁK 4.1. A teszt szérum minták vizsgálatára alkalmas. A beteg minták 7 napig tárolhatóak 28 ºCon. Hosszabb tárolás 20 C alatt. Kerüljük az ismételt felolvasztást és fagyasztást. 4.2. A szérumok elıkezelése pl. inaktiválás, nem szükséges. A szérumok nem lehetnek mikroorganizmusokkal szennyezettek, illetve nem tartalmazhatnak vörös vérsejteket. 4.3. A szérumokat 1:100 arányban hígítjuk a mintahígítóval. Titer meghatározáshoz további hígításokat készíthetünk. 5.A. AZ ELJÁRÁS MENETE 5.1. Vágjuk el az alumínium tasakot a simítózár felett és vegyük ki a szükséges számú lyukakat. (ld. 3.1.). A lyukak felhasználásra készek, elımosás nem szükséges. 5.2. Az A1 lyukat hagyjuk üresen a háttérnek (ld. 6.A.). Adjunk 50 µl hígított mintát, negatív és pozitív kontrollt duplikátban a lyukakba. A minták pipettázása után (semleges, vagy lúgos folyadék) a lyukak színe kék/zöldre változik. A színváltozás hiánya egy lyukban jelzi, hogy a minta, illetve kontroll hozzáadása nem történt meg. Ha szükséges, a mikrotiter lemezt szobahımérsékleten 30 percig nedves kamrában tarthatjuk. 5.3. Inkubáljuk a lemezt 60 percig (± 5 perc) 37 o Con (± 1 C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva. 5.4. Készítsük elı az antigénkonjugátum keveréket (ld. 3.3). 5.5. Az inkubáció után mossuk a lemezt háromszor 200 µl mosó pufferrel lyukanként. Ügyeljünk, hogy minden lyuk töltve legyen. A mosás után csapkodjuk a lemezt szőrıpapírra. Ne engedjük a lyukakat kiszáradni! Azonnal használjuk fel! 127PKSVPU/010512 6
5.6. Adjuk az antigénkonjugátum keveréket (piros színő) minden lyukba (kivétel A1). 50 µl antigénonjugátum keveréket pipettázzunk a lyukakba, ha manuálisan dolgozzuk fel. Kérjük figyeljen: Ha automata készülékkel dolgozunk, 60 µl antigénonjugátum keveréket pipettázzunk minden lyukba, a készülék inkubációs kamrájában elıforduló nagyobb párolgás miatt. A teszt automatán való alkalmazhatóságát a kiértékelés során megerısítették. Mindazonáltal javasoljuk, hogy a laborban mőködı automatával való kompatibilitást ellenırizzük. 5.7. Inkubáljuk ismét a lemezt 60 percig (± 5 perc) 37 o Con (± 1 o C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva. 5.8. Az inkubáció után ismét mossuk a lemezt (ld. 5.4.). 5.9. Adjunk 50 µl TMBszubsztrát oldatot minden lyukba (A1be is) és inkubáljuk 30 percig (± 2 perc) 37 o Con (± 1 C) nedves kamrában, vagy fóliával lezárva, sötétben. A pozitív minták színe kékre változik. 5.10.Állítsuk le a reakciót 100 µl leállító oldattal minden lyukba (A1be is). A pozitív minták színe sárgára változik. A fotometrikus leolvasás elıtt tisztítsuk meg a mikrotiterlemez alját és ügyeljünk arra, hogy ne legyenek levegıbuborékok a lyukakban. A leolvasást a leállító reagens hozzáadása után 15 percen belül el kell végezni. 127PKSVPU/010512 7
5.B. AZ ELJÁRÁS MENETE TÁBLÁZATOSAN Neg. kontroll Poz. kontroll Minta Háttér (A1) Negatív kontroll 50 µl Pozitív kontroll 50 µl Minta 50 µl Inkubáljuk 60 percig 37 Con, majd mossuk 3x 200 µl mosóoldattal Antigénkonjugátum keverék 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) Inkubáljuk 60 percig 37 Con, majd mossuk 3x 200 µl mosóoldattal TMBszubsztrát 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Inkubáljuk 30 percig 37 Con sötétben Leállító oldat 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Fotometrikus leolvasás 450 nmen (ref. 620 650 nm) *) Manuális/automatikus módszer (ld. 5.5.) 6.A. AZ EREDMÉNYEK SZÁMOLÁSA (ÉRVÉNYESSÉG) Olvassuk le az OD értékeket 450 nmen (referencia hullámhossz 620 650 nm). Vonjuk ki a háttér OD értékét (A1 lyuk) az összes OD értékbıl. A negatív kontrollok átlag OD értéke < 0,150. A pozitív kontrollok átlag OD értéke > 0,800. A cutoff = negatív kontrollok átlag OD értéke + 0,140 Szürke zóna = cutoff ± 10 % Ismételjük meg az eljárást, ha az eredmények nem felelnek meg a specifikációnak. 127PKSVPU/010512 8
6.B. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE /A MÓDSZER KORLÁTAI A szürke zóna alsó határánál kisebb OD értékő minták NEGATÍVnak tekintendık. A szürke zónába esı OD értékő minták KÉTESnek tekintendık. Ezeket újra kell vizsgálni 14 nappal késıbb friss mintából, a titer változás meghatározása érdekében. A szürke zóna felsı határánál nagyobb OD értékő minták POZITÍVnak tekintendık. Az eredményeket mindig a klinikai adatokkal, továbbá az EBNA1 IgG, a VCA IgG eredményekkel és további diagnosztikus paraméterekkel összhangban kell értelmezni. Egyedi esetekben más herpeszvírusok elleni antitestekkel történı keresztreakció nem zárható ki. A nagyon nagy lipid koncentráció befolyása nem zárható ki. 6.C. A MEDAC KITEKKEL VÉGZETT EBVSZEROLÓGIA DIAGNOSZTIKUS ÉRTELMEZÉSE Az eredményeknek a fertızés státuszára vonatkozó alábbi értelmezése csak immunkompetens egyénekben végzett vizsgálatokra érvényes. EBNA1 IgG VCA IgG VCA IgM Értelmezés szeronegatív + +/±/ régi fertızés +/±/ + elsıdleges fertızés Minden más kombináció tisztázatlannak értelmezendı. Tisztázatlan eredmény esetén további differenciál diagnosztikai módszerek szükségesek az értelmezéshez. A tisztázatlan eredmények csökkentése érdekében a medac EBV ELISA panel használatát javasoljuk. 127PKSVPU/010512 9
7. TELJESÍTİKÉPESSÉGI JELLEMZİK Az alábbi teljesítıképességi adatokat határoztuk meg a diagnosztikus kiértékelés során. 7.A. ÉRZÉKENYSÉG ÉS SPECIFICITÁS 352 szérumot vizsgáltak a diagnosztikus kiértékelés során. Az eredményeket Prof. Dr. Enders és munkatársai, Stuttgart laboratóriumában és az Institute of Virology of the University Homburg/Saar intézményben értékelték ki. Az eredményeket az alábbi táblázatban közöljük: Elızetes definíció (IFA) negatív cutoff pozitív negatív 237 0 11 EBV VCAIgMELA cutoff PKS medac 1 0 1 pozitív 1 0 101 Érzékenység = 89,4 % Specificitás = 99,2 % Egyezés: 96 % 7.B. PONTOSSÁG Teszten belüli szórás Tesztek közötti szórás Minta CV átlag OD SD (%) n Minta átlag OD SD CV (%) n NC 0.069 0.012 17 23 NC 0.070 0.010 14 12 BC 0.456 0.013 3 23 BC 0.441 0.019 4 12 PC 1.361 0.030 2 23 PC 1.282 0.057 4 12 N 1 0.050 0.005 10 23 N 4 0.076 0.010 13 12 N 2 0.839 0.029 3 23 N 5 0.392 0.037 9 12 N 3 1.981 0.033 2 23 N 6 0.769 0.046 6 12 N 7 1.160 0.051 4 12 N 8 1.884 0.064 3 12 NC = negatív kontroll, BC = gyenge pozitív kontroll (a kit nem tartalmazza), PC = pozitív kontroll; 127PKSVPU/010512 10
ÁLTALÁNOS KEZELÉSI TANÁCSOK A kereszt szennyezés elkerülése érdekében ne cseréljük fel a fiolákat és kupakjaikat. A reagenseket használat után azonnal zárjuk le a párolgás és a mikrobiológiai szennyezés elkerülése érdekében. Használat után a reagenseket az elıírt körülmények között kell tárolni az eltarthatóság garantálása érdekében. Használat után az összes komponenst az eredeti csomagolásban tároljuk a más kitekbıl, illetve gyártásból származó reagensekkel történı felcserélés elkerülése érdekében (ld. 3. pont alatt is). EGÉSZSÉGÜGYI ÉS BIZTONSÁGI INFORMÁCIÓK A helyi biztonsági és egészségügyi szabályokat be kell tartani. Az emberi eredető reagenseket megvizsgálták és negatívnak találták HBsAgra, HIV1/2 és HCV elleni antitestekre. Mindazonáltal erısen ajánlott, hogy ezeket, illetve az állati eredető reagenseket (ld. a kit tartalmánál) potenciálisan fertızıként kezeljük és az összes szükséges elıvigyázatossággal használjuk. MEGSEMMISÍTÉSI SZEMPONTOK A vegyi anyagok és preparátumok maradékai általánosságban veszélyes hulladéknak tekintendık. Az ilyen hulladékok megsemmisítése a nemzetközi és a helyi törvények és elıírások szerint szabályozottak. Vegyük fel a kapcsolatot a helyi hatóságokkal, illetve hulladékkezelı cégekkel, melyek segítséget tudnak nyújtani a veszélyes hulladékok megsemmisítésében. A kibocsátás dátuma: 01.05.2012 127PKSVPU/010512 11
IRODALOM Bauer, G.: EpsteinBarrVirus Bedeutung und Möglichkeiten der Labordiagnostik. Therapeutische Umschau 51(8), 558562 (1994). Bauer, G.: The rational basis for efficient EpsteinBarr Virus (EBV) serology. Clin. Lab. 41(9), 623634 (1995). Hille, A., Klein, K., Baumler, S., Grasser, F.A., MuellerLantzsch, N.: Expression of EpsteinBarr virus nuclear antigen 1, 2A and 2B in the baculovirus expression system: serogical evaluation of human antibodies to these proteins. J. Med. Virol. 39 (3), 233241 (1993). Linde, A.: Diagnosis of EpsteinBarr Virus related diseases. Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 100, 8388 (1996). Mertens, T., Haller, O., Klenk, H.D. (Hrsg.): Diagnostik und Therapie von Viruskrankheiten. 6570, Urban & Fischer Verlag (2004). Modrow, S., Falke, D. (Hrsg.): Molekulare Virologie. 454460, Spektrum Akademischer Verlag (1997). Prang, N.S., Schwarzmann, F.: Aktuelle Perspektiven in der Diagnostik EpsteinBarrVirus assoziierter Erkrankungen. Immun. Infekt. 4, 144 151 (1997). 127PKSVPU/010512 12