Miért érdekes a szerkezet...? Termodinamika 10 23 Atom Biomolekuláris szerkezet Kellermayer Miklós Mezoskála Poratka Vörösvértest, fehérvérsejt DNS Hangya Emberi hajszál Nanoskála Mikroskála Milliskála 1 milliméter Látható spektrum 10 10 Atom 10 3 Atom Kvantumkémia 10 1 Atom Kvantumfizika 5 db Si atom 10 0 Atom Biomolekuláris szerkezet A szerkezetet az anyag elektronmágneses okkal való kölcsöhatásaival vizsgáljuk Elektromágneses ok fontos paraméterei Diffrakció, interferencia Röntgen diffrakció, röntgen krisztallográfia Diffrakció-limitált mikroszkópia A feloldási határ leküzdése Polarizáció; CD spektroszkópia Tömegspektrometria Amplitudó (A) - Intenzitás ~A 2 Periódusidő: egyetlen oszcilláció alatt eltelt idő ( T ). Frekvencia: periódusidő reciproka (f); egy s alatti oszcillációk száma. Terjedési sebesség ( fázis-sebesség, v, c ) Hullámhossz (λ): egy periódusidő alatt megtett távolság Fáziseltolódás (φ): ok ugyanazon pontjai közötti távolság (szögben vagy λ egységekben fejezzük ki) λ = ct = c f
Diffrakció és interferencia Röntgen-krisztallográfia Hullámok kölcsönhatásai: konstruktív és destruktív interferencia (erősítés vagy kioltás) Diffrakció hosszal összemérhető nagyságú rés esetén (=d távolságra levő pontszerű rések, ahol d~λ) λ Kristály Rtg sugárzás Rtgnyaláb Kristály Hullámok fázisban (φ=0): erősítés Mérés Ha φ=ϖ : kioltás Kialakuló interferencia mintázat a pontszerű sugárforrások közötti távolságtól (d) függ 2-dimenziós optikai rács elhajlási interferenciaképe Erősítő interferencia feltétele: 2dsinθ = nλ +1 finomítás fázisok Elhajási interferencia mintázat Elektronsűrűség térkép illesztés 0 interferencia maximumok kis d nagy d -1 Atomi model 3D szerkezet DNS szerkezet megfejtése röntgenkrisztallográfiával Képalkotás röntgensugarakkal Képalkotás okkal Diffrakciólimitált képalkotás Tárgy (optikai rács, O) Fókuszsík (F) Kép (I) Rayleigh feltétel hélix dőlésszöge bázisok közötti távolság hélix menetemelkedése Speciális fókuszáló mechanizmusra van szükség Diffrakció miatt: pontszerű tárgy képe elhajlási korong (Airy disk) átfedés Legkisebb feloldott távolság (Abbé): d = 0.61λ n sinα
A feloldási határ leküzdése Képalkotás elektronokkal: az elektronmikroszkóp Sugárforrás: elektronágyú Az Abbé-féle képlet paramétereinek javítása (λ csökkentése, N.A. növelése) Feloldási probléma konvertálása pozicionálási problémává Nem diffrakció-limitált képalkotás Fókuszálás: elektronnyaláb kitérítése mágneslencsével F = ebv e sinα Feloldóképesség: F=elektronra ható erő; e=elektron töltése; B=mágneses térerő; V e =elektron sebessége; α=optikai tengely és a mágneses tér iránya által bezárt szög d = λ α d=legkisebb feloldott távolság λ= de Broglie hossz α=optikai tengely és a mágneses tér iránya által bezárt szög de Broglie hosz alapján elméleti d~ 0,005 nm (=5 pm) Transmissziós elektronmikroszkóp (TEM) Felbontás és kontraszt az elektronmikroszkópban A. Elméleti feloldóképesség: módosított Abbé-képlet (kis α szögekre) Elektronok sebessége (100000 km/s) alapján d=0.005 nm B. Valódi feloldóképesség: kis NA által limitált, ~0.1 nm. A kis NA miatt azonban hatalmas mélységélesség (több μm). C. Biológiai gyakorlati feloldóképesség: metszetvastagság 1/10-ed része. D. Kontrasztképződés: elektronszóródás alapján Kontrasztfokozás: elektrondenz festékek használata d = λ α Szuperfelbontású mikroszkópia Feloldási probléma (Abbé-elv) d A feloldási problémát pozíciómeghatározási problémává alakítjuk d = 0.61λ n sinα Pozíciómeghatározási probléma (pontosság a fotonszámtól függ) STORM: stochastic optical reconstruction microscopy Sztochasztikus adatgyűjtés egyedi fluorofórokról Mikrotubulusok Bekapcsolt fluorofórok 1 Bekapcsolt fluorofórok 2 Krio-elektronmikroszkópia, partikulum-analízis képrekonstrukcuó Adatgyűjtési folyamat Bekapcsolt fluorofórok 3 Bekapcsolt fluorofórok 4 Pozíciókból számított kép Mikrotubuláris rendszer
Nem diffrakció-limitált mikroszkópiák Polarizáció Pásztázó elektronmikroszkóp Pásztázó tűszondás mikroszkópiák (SPM, AFM) Oxigén atomok ródium egykristály felületén Polarizáció: kitüntetett irányú rezgés Kettős törés: anizotróp terjedési sebesség Csak a tranzverzális ok polarizálhatók. Elektromágneses ok polarizálása Polarizátor lemez Síkpolarizált Polarizátor Extinkció Analizátor Polarizáció illusztrálása a terjedési irányból nézve: nanovilág léptéke: 1 nanométer Cirkulárisan polarizált Síkpolarizált Polarizálatlan Polarizált fény kölcsönhatása az anyaggal Síkpolarizált fény Cirkulárisan polarizált fény Jobbra forgó (D) Cirkuláris dikroizmus (CD) spektroszkópia Elv: L/D cirkulárisan polarizált fény differenciált, hossz-függő elnyelése A cirkulárisan polarizált fény elnyelődése függ a rotációs iránytól (L/D) ÉS A cirkulárisan polarizált fény elnyelődése függ a frekvenciától (hossztól) Dikroizmus ( kétszínűség ): 1.) Hullámhossz függvényében a fény áthalad vagy visszaverődik az anyag felületéről 2.) Különböző polarizációs állapotú fény különböző mértékben nyelődik el az anyagban. Királis molekulák erős cirkuláris dikroizmust mutatnak Izomrost polarizációs mikroszkópban Izomrostok A-szakasz I-szakasz Balra forgó (L) CD spektrum: x-tengely: hossz vagy frekvencia; y-tengely: cirkuláris dikroizmus : az L és D cirkulárisan polarizált fényre vonatkozó moláris extinkciós együtthatók különbsége Optikai kettőstörés: a törésmutató (~fény terjedési sebessége) függ a síkpolarizált fény polarizációs síkjától. Cirkuláris kettőstörés: a törésmutató (~fény terjedési sebessége) függ a cirkulárisan polarizált fény forgási irányától Cirkuláris dikroizmus: ΔA(λ) = A(λ)LCPL - A(λ)RCPL λ: hossz
Tömegspektrometria Tömegspektrometriás alkalmazások Tömegspektrometria - mass spectrometry (MS): a minta atomjai és molekulái tömegeinek eloszlását mérő analitikai módszer. A megmért spektrum a minta elemi vagy izotóp ujjlenyomata, amely a kémiai szerkezetre jellemző. Fehérje analitika (proteomika) Valós idejű szövetanalízis ( onkokés ) Lépések: 1. Ionizáció 2. Gyorsítás 3. Elhajlás 4. Detektálás az elhajlás a tömeg-töltés aránytól (m/q) függ Detektálás Faraday kollektorok áram Relatív gyakoriság Eredmény: Vonal diagram peptid keverék sejtek vagy szövet fehérje keverék 1DE emésztés peptidekre peptid szétválasztás folyadék kromatográfiával semleges gáz electrospray ionizáció) ion-peptid Normál colon Normál máj mágnes erősítők Tömeg-töltés arány ion-peptid (prekurzor ion) tömeg analizátor ütköztetéses fragmentáció tömeg analizátor jel detektálás peptid szekvencia Tumoros colon Metasztatikus máj Ionforrás nyaláb fókuszálás iongyorsító elektroncsapda iontaszító gáz befúvó ionizáló filamentum JEL m = ion tömeg q = ion töltése A spektrumot szerkezeti adatbázissal vetjük össze relatív frekvencia (%) MS spektrum relatív frekvencia (%) MS/MS spektrum