A bilirubin konjugációjának és a konjugátumok transzport folyamatainak tanulmányozása primer kollagén szendvics és hagyományos rigid májsejt kultúrában Doktori (Ph. D.) tézisek Lengyel György Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Vereczkey László, az MTA doktora Jemnitz Katalin, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Bánhegyi Gábor, az MTA doktora Dr. Tihanyi Károly, a bilológia tudományok kandidátusa Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Prof. Dr. Magyar Kálmán, az MTA rendes tagja Dr. Bánhegyi Gábor, az MTA doktora Dr. Tihanyi Károly, a bilológia tudományok kandidátusa Budapest 2006.
ÖSSZEFOGLALÁS A bilirubin metabolizmusában kulcsszerepet játszik az UGT1A1 konjugációs enzim, illetve a bilirubin glukuronidok (BG) effluxában a multidrog rezisztenciával kapcsolatos proteinek (MRP2, MRP3). A bilirubin és a BG szérum koncentrációjának változása jól tükrözi a máj mind fiziológiás, mind patológiás állapotát. Munkám célja az volt, hogy in vitro primer hepatocita kultúrában a bilirubin metabolizmusán keresztül modellezzem az emlősök változó kémiai környezethez történő adaptációját. Az adaptációt kiváltó ingert egyrészt indukciós hatású gyógyszeres kezeléssel (rifampicin, klofibrát, fenobarbitál, metilkolantrén, dexametazon), másrészt transzport gátló vegyületekkel (indometacin, probenecid, benzbromaron) értük el. A BG szekréció a sejtkultúra első négy órájában drámaian csökkent. Ennek oka feltehetőleg az, hogy a transzport proteinek lefűződtek a membránról. Modellrendszerünkben az ismert citokróm P-450 induktorok (dexametazon, klofibrát, rifampicin), a metilkolantrén kivételével, metabolikus enzimindukció révén fokozták az UGT1A1 aktivitást (Jemnitz K, Lengyel G, Vereczkey L. In vitro induction of bilirubin conjugation in primary rat hepatocyte culture. Biochem Biophys Res Commun. 2002;291(1):29-33). Kollagén szendvics konfigurációban tartott májsejteken módszert dolgoztunk ki a kanalikuláris MRP2, illetve a szinuszoidális MRP3 transzport aktivitás izolált tanulmányozására (Lengyel G et al. Canalicular and sinusoidal disposition of bilirubin mono- and diglucuronides in sandwich-cultured human and rat primary hepatocytes. Drug Metab Dispos. 2005;33:1355-60). Hepatocita szendvics kultúrában valamennyi gátlószer nagyobb mértékben gátolta a kanalikuláris effluxot, mint a szinuszoidálisat. A rifampicin esetében a metabolizáló rendszer a szinuszoidális efflux fokozódásával kompenzálta a gátolt kanalikuláris effluxot, mely lehetővé tette a toxikus kémiai hatás elhárítását. Munkám gyakorlati jelentőségét abban látom, hogy a BG efflux meghatározása primer hepatocita szendvics kultúrában alkalmas lehet a gyógyszer-indukált kolesztázis
in vitro előrejelzésére. A vizsgált kolesztatikus hatású gyógyszerek (indometacin, rifampicin), illetve transzportgátló szerek (probenecid, benzbromaron) kolesztatikus hatása kimutatható volt a BG effluxának csökkenésén keresztül. Így a gyógyszerjelőlt molekulák BG transzportjának preklinikai vizsgálata hepatocita szendvics kultúrában előre vetítheti egy súlyos mellékhatás lehetőségét (György Lengyel at al, In vitro prediction of drug induced cholestasis using sandwich culture of primary rat hepatocytes (kézirat formájában)). BEVEZETÉS Napjainkra a drogtranszport kutatás eredményeként jelentősen megnövekedett a megismerhető transzporter célfehérjék száma. Szerepük nemcsak a drogtranszportban lényeges, hanem fény derült arra is, hogy számos anyagcserezavar (pl. Dubin-Johnson szindróma) hátterében közvetve vagy közvetlenül a transzport proteinek gátlása vagy csökkent működése állhat. A transzportproteinek szerepének felismerése a gyógyszer metabolizmusban magyarázatot adhat néhány, a klasszikus farmakokinetikától eltérő jelenségre. Éppen ezért a gyógyszerkutatás preklinikai fázisában gyakran vizsgálják a gyógyszerjelölt molekula transzportproteinekre gyakorolt indukciós és gátló hatását. A jelenleg széles körben alkalmazott in vitro tesztek főként transzfektált sejtek, vagy az úgynevezett kifordított membrán vezikulák alkalmazásán alapulnak. Ezek a sejtek morfológiai és funkcionális szempontból is távol állnak a fiziológiás állapottól, ezért az adatok nem mindig extrapolálhatóak az in vivo körülményekre. Munkánk során a bilirubint választottuk modell vegyületnek főként, mert in vivo a bilirubin szérum szintek (direkt, indirekt bilirubin) hűen tükrözik a máj mind fiziológiás, mind patológiás állapotát. Fiziológiás körülmények között a májsejtek felveszik a bilirubint, majd az UGT1A1 (UDP-glukuronozil
transzferáz) hatására UDP-glukuronsavval konjugálódva bilirubinmonoglukuronid (BMG), illetve bilirubin-diglukuronid (BDG) keletkezik. A konjugátumok a glukuronidációt követően a kanalikuláris membránon lokalizálódó multidrog rezisztencia protein (MRP2) közreműködésével az epecsatornákba kerülnek. Ha az MRP2 működése akadályoztatott (genetikai deffektus, obstrukció, farmakológiai hatás), akkor a szinuszoidális membránon lokalizálódó MRP3 veszi át a hiányzó vagy csökkent MRP2 aktivitást, így a BDG/BMG a szinuszoidokba kerül, majd vizelettel ürül a szervezetből. CÉLKITŰZÉSEK Doktori munkám alapját a bilirubin metabolizmusában kulcsszerepet játszó UDP-glukuronozil transzferáz (UGT1A1) aktivitásának és a bilirubinglukuronid (BG) kanalikuláris MRP2 és szinuszoidális MRP3 mediált transzportjának vizsgálata képezte. Célul tűztük ki a bilirubin metabolizmusát érintő indukciós és gátló típusú gyógyszer interakciók tanulmányozását. 1. Az irodalomból jól ismert jelenség, hogy a rifampicin (RIF) és a dexametazon (DEX) a pregnán X receptoron keresztül, a fenobarbitál (PB) a konstitutív androsztán receptoron keresztül, a klofibrát (CL) a peroxiszóma proliferátor aktivált receptoron, míg a metilkolantrén (MC) az aromás hidrokarbon receptor közreműködésével enzimindukció révén fokozza a fázis I (citokróm P-450) enzimek aktivitását. Számos közlemény felvetette a fázis I és fázis II enzimek, valamint a fázis III folyamatok (drogtranszport) közös indukciós szabályozásának lehetőségét. Bizonyítani kívántuk a fenti modell vegyületek indukciós hatását a bilirubin UDP-glukuronsavval történő konjugációjára primer rigid májsejt kultúrában, mely mennyiségét tekintve az egyik leggyakoribb fázis II reakció.
2. Az induktorok szinuszoidális és kanalikuláis transzport proteinekre gyakorolt hatásának tanulmányozására nem alkalmas a primer rigid májsejt kultúra, mert ebben a rendszerben nem lehetett izoláltan vizsgálni az in vivo eltérő membránon lokalizálódó transzportereket. Ezért célul tűztük ki a fenti vegyületek indukciós hatásának tanulmányozását primer kollagén szendvics májsejt kultúrában. A fenti rendszerben vizsgálni kívántuk a bilirubin-glukuronidok kanalikuláris MRP2 és szinuszoidális MRP3 mediált effluxát. 3. A gyógyszerterápia során a leggyakoribb májeredetű mellékhatás a gyógyszerindukált kolesztázis, mely folyamat hátterében a gyógyszer vegyület eliminációjában kulcsszerepet játszó transzport fehérjék gátlása állhat. Célunk volt egy olyan modellrendszer fejlesztése, mely ötvözi a már ismert primer kollagén szendvics kultúra és egy, a májfunkciót jól tükröző paraméter a bilirubin-glukuronid efflux mértékét detektáló eljárás előnyeit. A fenti rendszerben vizsgálni kívántunk a klinikumból jól ismert kolesztatikus hatású gyógyszereket: indometacin (IM), rifampicin (RIF), valamint az irodalomból ismert transzport gátló vegyületeket - benzbromaron (BB), probenecid (PR). Szendvics kultúrában vizsgált, a BG effluxot érintő gyógyszeres hatásokat megerősíteni kívántuk a BG-tól, illetve a szendvics kultúrától független (vezikula transzport; konfokális lézermikroszkópia) vizsgáló módszerek segítségével is. MÓDSZEREK Májsejtkultúra A bilirubin konjugáció sebességét befolyásoló gyógyszer-interakciókat primer rigid, míg a transzport aktivitást érintő vizsgálatokat primer kollagén szendvics
májsejt kultúrában végeztük. A májsejt szuszpenziót kétfázisú májperfúziót követően izoláltuk, majd patkányfarok kollagénnel bevont petricsészékre helyeztük a májsejteket. Kollagén szendvics kultúra esetében a májsejteket az ültetéstől számított 24 óra után NaOH-oldattal neutralizált kollagén réteggel fedtük be. UGT1A1 aktivitás meghatározása rigid májsejt kultúrában A mikroszómális UDP-glukuronozil transzferáz aktivitást B. Burchell módszere szerint határoztuk meg (Methods in Enzymology Vol. 77., Jakoby, W. B. ed., 1981;188-192, Academic Press, New York). A májsejteket 0,025 mm bilirubin-oldattal inkubáltuk 60 percig. A diazotált konjugátumok mennyiségét spektofotometriás módszerrel határoztuk meg. Szinuszoidális és kanalikuláris bilirubin-glukuronid efflux meghatározása primer kollagén szendvics májsejt kultúrában A 24, 72 és 96 órás kollagén szendvics konfigurációban tartott patkány és 96 órás humán májsejteket 0,025 mm-os bilirubin-albuminoldattal inkubáltuk 60 percig. A szubsztrát eltávolítása után Ca 2+ /Mg 2+ ionok jelenlétében és hiányában a sejteket 20 percig 0,5 ml HBSS oldattal szobahőmérsékleten inkubáltuk. Az inkubációs médiumban és az efflux médiumokban a BMG és a BDG mennyiségét HPLC analízissel határoztuk meg. A 60 perces inkubációs idő alatt a termelődött glukuronidok egy része a szinuszoidális transzportereken keresztül az inkubációs médiumba, a másik része pedig a kanalikuláris transzportereken keresztül az in vitro epecsatorna rendszerbe került. Az inkubációs médium BG mennyisége a szinuszoidális transzport aktivitással arányos. Az in vitro epecsatorna BG tartalmát úgy határoztuk meg, hogy szobahőmérsékleten megvontuk a Ca 2+ /Mg 2+ ionokat az efflux médiumból,
ennek hatására a Ca 2+ /Mg 2+ ion függő sejtkapcsoló struktúrák megszűnnek, a csatorna felnyílik és az előzőleg termelődött és kiválasztott BG tartalma az efflux médiumba kerül. A szinuszoidális transzport aktivitás szobahőmérsékleten nem szűnik meg teljesen, ennek mértékére a Ca 2+ /Mg 2+ ionokat tartalmazó efflux médium BG tartalma utal. Így a valós kanalikuláris BG mennyisége a Ca 2+ /Mg 2+ ionok hiányában és jelenlétében mért BG tartalom különbségeként számítható. A csatornák BG mennyisége a kanalikuláris transzport aktivitással arányos. Szinuszoidális efflux: BG Inkubációs médium Kanalikuláris efflux: BG BG + 2+ 2+ Ca / Mg mentes HBSS 2+ 2 Ca / Mg HBSS
Indukciós kezelés A hepatociták induktorokkal történő kezelését az ültetéstől számított negyedik órában kezdtük és minden nap frissen a tápoldattal együtt adtuk a sejtekhez. Az indukciót 96 órán keresztül folytattuk, és hatását 24 óránként mértük. A kontroll sejtkultúra csak kiegészített William s Medium E tápoldatot kapott, amely 0,1% DMSO-t tartalmazott. Az induktor végkoncentrációk: 3,7 µm MC, 100 µm CL, 50 µm RIF, 250 µm PB, 0,1, 1, 10 µm DEX; valamint 100 µm CL és 10 µm DEX kombinációja. MRP2 és MRP3 proteinek gátlásának vizsgálata hepatocita szendvics kultúrában A 96 órás szendvics kultúrában tartott májsejteket gátlószerek jelenlétében (50 µm RIF, 100 µm CL, 100 µm PR, 400 µm IM) és hiányában (DMSO 0,1%) 0,025 mm bilirubin-albumin oldattal inkubáltuk 15 percig. A szubsztrát tartalmú oldatot eltávolítottuk. A sejteket Ca 2+ /Mg 2+ ionok jelenlétében és hiányában 0,5 ml HBSS-oldattal inkubáltuk (37 0 C). CDF-DA kanalikuláris felhalmozódásának vizsgálata konfokális pásztázó lézer mikroszkóp segítségével Megvizsgáltuk az alkalmazott inhibítorok BG efflux-ra gyakorolt transzportgátló hatását fluoreszcens CDF szubsztrát esetében. A módszer elve, hogy az inkubáció során a fluoreszcenciával nem rendelkező CDF-DA (5(6)- karboxi-2',7'-diklorofluoreszcein-diacetát) bejut a májsejtekbe, majd az észterázok lehasítják a molekuláról az acetil csoportokat, az így létrejött vegyület (CDF) fluoreszkál és szubsztrátja a transzport proteineknek, elsősorban az MRP2-nek. A kanalikuláris MRP2 a csatornába pumpálja a festéket, így a lézer gerjesztés hatására a csatornák alakja zöld fénnyel kirajzolódik. A fluoreszcencia intenzitása függ a csatornában található festék mennyiségétől. A csatornában található fluoreszcens festék mennyiségét a transzport gátlószerek csökkentik, így a fluoreszcencia intenzitása is csökken.
A 96 órás kollagén szendvics konfigurációban tartott sejteket a gátlószerek jelenlétében (IM 400 µm, RIF 50 µm, BB 100 µm, CL 100 µm) és hiányában (kontroll: 0,1% DMSO) 10 µm CDF-DA-val inkubáltuk 10 percig. Az inkubáció után a szubsztrát tartalmú oldatot eltávolítottuk, majd 3x2 ml hideg HBSS-oldattal mostuk a sejteket és végül felvételt készítettünk a hidegen tartott sejtekről konfokális pásztázó lézer mikroszkóppal. Vezikuláris transzport kísérletek A vezikuláris transzport kísérletek során alkalmazott kifordított (inside-out) membrán vezikulákat expressszált (bakulovírus expressziós rendszer) humán MRP2 és MRP3 transzportereket tartalmazó SF9 (Spodoptera frugiperda) sejtekből izolálták. A módszer elve: az MRP2, illetve MRP3 transzportereket tartalmazó kifordított vezikulákat esztradiol-glukuroniddal ( 3 H-E 2 17βG) inkubáltuk. A transzporterek ebben a rendszerben a szubsztrátot a vezikula belsejébe pumpálták. Az inkubáció leállítása után a vezikulákat szűrő plate -en kötöttük meg. A szubsztrát felesleg eltávolítása után meghatároztuk a vezikulákban található szubsztrát mennyiségét, folyadék szcintilláción alapuló radioaktivitás méréssel. Az MRP2 esetében 50 µm, míg az MRP3 esetében 2 µm E 2 17βG végkoncentrációt alkalmaztunk. Statisztika A sejtkultúrás kísérleteket minden esetben három független sejtpreparátummal végeztük és a vizsgálatok során 3 párhuzamos mérést végeztünk. Minden kísérlethez saját kontrollt alkalmaztunk. Az adatok átlag±s.d. formában vannak kifejezve. A statisztikailag szignifikáns különbségeket párosított student s t teszttel vizsgáltuk. A szignifikancia minden esetben: p<0,05.
EREDMÉNYEK 1. Módszert dolgoztunk ki az irodalomból jól ismert citokróm P-450 induktorok UGT1A1 enzimaktivitására gyakorolt hatásának vizsgálatára primer májsejt monolayeren, mely a diazotált BG spektrofotometriás meghatározásán alapult. Megállapítottuk, hogy a sejtkultúra idejének függvényében változik a bilirubin konjugáció sebessége: a letapadástól számított 4 órára az UGT1A1 aktivitás a kezdeti, sejtszuszpenzióban mérhető aktivitás 10%-ra csökken; ezt követően folyamatosan emelkedik, majd 72 órában éri el a szuszpenzióban mérhető kezdeti aktivitást, amely ezután már nem változik, tehát a 72 órás sejtkultúra már alkalmas a bilirubin UDP-glukuronsavval történő konjugációjának vizsgálatára. A 4 órás kultúra vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy BG közel 90%-a az intracelluláris kompartmentekben akkumulálódott, amely a transzportproteinek csökkent működésére utal. 2. 96 órás primer rigid patkány hepatocita kultúrában: a vizsgált induktorok CL, RIF, DEX a MC kivételével szignifikáns módon fokozták (176%; 168%; 178%) a bilirubin konjugáció sebességét a DEX (0,1; 1; 10 µm) koncentrációfüggő módon fokozta a bilirubin konjugáció mértékét (133%; 150%; 178%) a CL+DEX kombináció további aktivitásfokozódást (210%) eredményezett A DEX, RIF, CL kezelés hatására kialakuló enzimaktivitás hátterében fokozott UGT1A1 kifejeződés állt, mely jelenséget Western-blot analízissel igazoltunk, tehát az UGT1A1 aktivitása fokozható volt a már ismert citokróm P-450 induktorokkal.
3. Rigid sejtkultúrában nem vizsgálható a polarizált májsejtek szinuszoidális és kanalikuláris transzport proteinjeinek aktivitása, ezért áttértünk a kollagén májsejt kultúra alkalmazására, melyben módszert dolgoztunk ki a BG szinuszoidális és kanalikuláris transzportjának meghatározására. A májsejteket bilirubin-oldattal inkubáltuk, majd meghatároztuk a szinuszoidális és a kanalikuláris transzoport aktivitást. Megállapítottuk, hogy humán és patkány szendvics kultúrában a szinuszoidális és a kanalikuláris BDG/BMG arány nagymértékben hasonlít az in vivo mért paraméterekhez, így a kollagén szendvics kultúrában tartott májsejtek nem csak morfológiai, hanem funkcionális szempontból is hasonlítanak az in vivo környezetben található sejtekre. A szinuszoidális és kanalikuláris transzport membrán specifikus működését egy szinuszoidális transzportszubsztráttal teszteltük (pnitrofenol-glukuronid (pnpg)). A szubsztrát nem került számottevő mértékben a csatornákba, míg a kanalikuláris transzportszubsztrát, a BG igen, tehát a módszer alkalmas a szinuszoidális és a kanalikuláris transzport aktivitás meghatározására. 4. Primer patkány hepatocita szendvics kultúrában a vizsgált induktorok: a szinuszoidális effluxot növelték: DEX (144±9%), RIF (181±50%), a kanalikuláris effluxot növelte: RIF (138±29%) a kanalikuláris effluxot csökkentették: CL (42±23%) Megállapítható, hogy valamennyi vizsgált induktor elsősorban a BG szinuszoidális effluxát fokozta, míg a kanalikuláirs effluxot kevésbé. A CL a kanalikuláris effluxot szignifikáns mértékben gátolta, mely jelenség nem figyelhető meg primer rigid kultúrában. A CL kanalikuláris BG efflux gátló hatása egy szelektív MRP2 gátlószer felismeréséhez vezethet. Igy a továbbiakban a CL gátlószerként való alkalmazását is vizsgáltuk.
5. Primer patkány hepatocita szendvics kultúrában a vizsgált gátlószerek: a szinuszoidális effluxot növelték: RIF (202±28%) a szinuszoidális effluxot csökkentették: IM (66±26%), PR (74±1%) a kanalikuláris effluxot csökkentették: IM (53±21%), CL (74±11%), RIF (24±1%), PR (53±3%) A RIF kivételével valamennyi gátlószer csökkentette mind a kanalikuláris, mind a szinuszoidális BG effluxot, megállapíthatjuk, hogy ez a módszer alkalmas a klinikumban kolesztázist okozó transzport gátlószerek vizsgálatára. A módszerrel tanulmányozhatók a kolesztázis ellen ható kompenzatórikus folyamatok is, úgymint a RIF esetében jelentkező szinuszoidális efflux fokozódás. Hogy megerősítsük a modellrendszerünkben kapott eredményeinket a gátlószerek hatását másik két a transzport proteinek tanulmányozásában kiterjedten alkalmazott rendszerben is megvizsgáltuk. 6. Kiterjedten alkalmazott specifikus MRP szubsztrát a CDF-DA. Munkánk során vizsgáltuk a festék kanalikuláris felhalmozódásának változását gátlószerek hatására. A CL, BB, RIF csökkentette a fluoreszcencia mértékét a csatornákban, míg az IM fokozta. Megállapítható, hogy szendvics kultúrában CDF-DA alkalmazása mellett a vizsgált gátlószerek az IM kivételével, a BG effluxhoz hasonlóan gátolták az MRP2 aktivitást. Szendvics kultúrában a fluoreszcein kanalikuláris felhalmozódásának vizsgálata szemikvantitatív eredményekhez vezetett. 7. A gátlószerek hatását megvizsgáltuk MRP2 vagy MRP3 transzportereket tartalmazó kifordított membrán vezikulákon 3 H-E 2 17βG alkalmazása mellett. MRP2 aktivitást fokozta: IM, PR MRP2 aktivitást csökkentette: RIF és BB; IC 50 (RIF) = 50 µm, IC 50 (BB) = 20 µm
MRP2 aktivitást nem befolyásolta: CL MRP3 aktivitást csökkentette: RIF és BB; IC 50 (RIF) = 150 µm, IC 50 (BB)=69 µm MRP3 aktivitást nem befolyásolta: IM, CL Az MRP2 mediált 3 H-E 2 17βG transzportot az IM és a PR is fokozta, mely jelenség hátterében a szubsztrátkötő hely és a modulációs hely közötti kooperativitás áll. Az aktiváció és gátlás kialakulása nagymértékben függ a szubsztrát és a gátlószer típusától, illetve koncentrációjától. Az IM és a PR hatására a BG efflux esetében nem figyelhető meg a 3 H-E 2 17βG transzport aktiváció. A BG efflux esetén megfigyelt gátlás egybevág a klinikai megfigyelésekkel, míg a másik két rendszerben a gátlással ellentétes hatás, azaz aktiváció figyelhető meg az IM esetében, mely jelenség nem ad magyarázatot a klinikumban tapasztalt kolesztázisos mellékhatásokra.
TÉZISEK Dolgozatom célja volt bemutatni, hogy a bilirubin konjugációján keresztül modellezhető az élő szervezetek változó kémiai környezethez történő adaptációja. 1. Alátámasztottuk, hogy az ismert citokróm P-450 induktorok (RIF, CL, DEX) enzim indukció révén fokozzák a bilirubin UDP-glukuronsavval történő konjugációjának sebességét, ami további bizonyíték arra, hogy a fázis I és fázis II enzimek közös indukciós szabályozás alatt állnak. 2. Elsőként számoltunk be arról, hogy a BG szekréciója a sejtkultúra első négy órájában drámaian csökken. Feltételezésünk szerint ennek oka a transzport proteinek lefűződése a membránról. A jelenséget később konfokális mikroszkópiával is megerősítették, miszerint a transzport proteinek a sejtizolálást követően endocitózissal lefűződnek a sejtmembránról és az intracelluláris térbe kerülnek. A folyamat következtében csökken a sejtmembránban jelenlévő funkcionálisan aktív transzporterek mennyisége. 3. Igazoltuk, hogy a humán és a patkány primer kollagén szendvics konfigurációban tartott májsejtek in vitro körülmények között is megtartják in vivo jellemző BG szekréciós tulajdonságukat. Ezt támasztja alá a transzport aktivitástól nagymértékben függő BDG/BMG arány in vivo és in vitro hasonlósága. Nevezetesen, hogy az in vivo szérum és epe BDG/BMG aránya nagymértékben hasonló az in vitro felülúszó és a csatornákban tapasztalható BDG/BMG aránnyal. A transzport proteinek in vitro megtartott szelektív működésére utal, hogy a szinuszoidális transzport szubsztrát (pnpg) gyakorlatilag nem szekretálódik a csatornákba.
4. A hepatocita kollagén szendvics kultúra és a BG, mint specifikus szubsztrát alkalmazásának kombinációja egy olyan módszert eredményezett, amelynek segítségével a két efflux folyamat külön-külön is tanulmányozhatóvá vált. Munkánk során felismertük, hogy az MRP2 és MRP3 transzport proteinek mennyisége eltérő mértékben változik a már ismert citokróm p-450 induktorok hatására, mely további bizonyíték a fázis I, fázis II enzimek, valamint a transzport proteinek közös indukciós szabályzására. 5. A szendvics konfigurációban tartott májsejtek gátlószerekre adott válaszából kiderül, hogy hatásukra nem egyformán reagál a kanalikuláris és a szinuszoidális efflux. A metabolizáló rendszer a szinuszoidális efflux fokozódásával kompenzálhatja a gátolt kanalikuláris effluxot, mely lehetővé teszi a toxikus kémiai hatás elhárítását. 6. A kollagén szendvics konfigurációban végzett gátlás vizsgálatok során nem csak a transzport proteinekre gyakorolt gátló hatás, hanem a májsejtekben működő prekolesztatikus hatások is jelentkeznek (pl. RIF). Ezzel szemben a vezikuláris transzport vizsgálatoknál az aktuálisan vizsgált transzport fehérje-szubsztrát-gátlószer kölcsönhatás független más transzporterektől, illetve a sejt aktuális állapotától. Az utóbbi módszer alkalmas arra, hogy egy egyedi transzport fehérje tulajdonságait vizsgáljuk, míg az előbbi hozzájárulhat a gyógyszerindukált kolesztázis mechanizmusainak mélyebb megértéséhez. Az alkalmazott szubsztrátok (BG, 3 H-E 2 17βG, CDF) különböző mértékben kötődnek a transzport fehérjékhez. A gátlás mértéke függ a szubsztrát és az alkalmazott gátlószer kinetikai paramétereitől (K M, V max ).
7. Munkám gyakorlati jelentőségét abban látom, hogy a BG efflux meghatározása primer hepatocita szendvics kultúrában alkalmas lehet a gyógyszer indukált kolesztázis in vitro előrejelzésére. A vizsgált kolesztatikus hatású gyógyszerek (IM, RIF), illetve transzportgátló szerek (PR, BB) kolesztatikus hatása kimutatható volt a BG effluxának csökkenésén keresztül. Így a gyógyszerjelölt molekulák preklinikai vizsgálata hepatocita szendvics kultúrában előre vetítheti egy súlyos mellékhatás lehetőségét is. KÖZLEMEMÉNYEK Az értekezés témájához kapcsolódó közlemények 1. Jemnitz K, Lengyel G, Vereczkey L. In vitro induction of bilirubin conjugation in primary rat hepatocyte culture. Biochem Biophys Res Commun. 2002;291(1):29-33 [IF. 2002: 2.935]. 2. Lengyel G, Veres Z, Szabo P, Vereczkey L, Jemnitz K. Canalicular and sinusoidal disposition of bilirubin mono- and diglucuronides in sandwichcultured human and rat primary hepatocytes. Drug Metab Dispos. 2005;33:1355-60 [IF. 2004: 3.839]. 3. György Lengyel, Zsuzsa Veres, Tünde Molnár, Vereczkey László, Katalin Jemnitz. In vitro prediction of drug induced cholestasis using sandwich culture of primary rat hepatocytes (kézirat formájában). Az értekezés témájához szorosan nem kapcsolódó közlemény 4. Csuzdi E, Migleczi K, Hazai I, Berzsenyi P, Pallagi I, Horvath G, Lengyel G, Solyom S. Potential metabolites of a condensed 2,3- benzodiazepine derivative. Bioorg Med Chem Lett. 2005;15:4662-5 [IF.2004: 2.333]. Az értekezés témájához kapcsolódó poszterek 1. Jemnitz K, Veres Z, Lengyel G, Vereczkey L. The effect of dexamethasone on UGT1A1 and UGT1A6 activity induced by 3 methylcholantrene, clofibrate and rifampicin in cultured rat hepatocytes (III-1). Benzon Symposium, Copenhagen, Denmark, 2001.
2. Lengyel G, Jemnitz K, Vereczkey L. In vitro induction of bilirubin conjugation in primary rat hepatocyte culture. Pfizer Symposium, Sandwich, London, 2003. 3. Jemnitz K, Veres Zs, Lengyel Gy, Molnár T, Vereczkey L. Modulation of mrp2 and mrp3 activities by cholestatic drugs using sandwich culture of primary rat hepatocytes (P203). 16th International Sympsium on Microsomes and Drug Oxidations, Budapest, Hungary, 2006. Az értekezés témájához kapcsolódó előadások 1. Lengyel G, Jemnitz K, Vereczkey L. In vitro induction of bilirubin conjugation in primary rat hepatocyte culture. Bioorganic Chemistry Meeting, Budapest, 2003. 2. Lengyel G, Jemnitz K, Veres Zs, Vereczkey L. Primer hepatocyta szendvics kultúra alkalmazása a máj-transzporterek vizsgálatában. Magyar Toxikológiai Társaság konferenciája, Budapest, 2004. 3. Lengyel G, Jemnitz K, Veres Zs, Vereczkey L. ABC transzporterekkel kapcsolatos gyógyszer-interakciók vizsgálata primer hepatocyta szendvics kultúrában. MTA, Doktori Iskola, Tahi, 2005. 4. Lengyel G, Jemnitz K, Veres Zs, Vereczkey L. Bilirubin mono- és diglukuronid effluxának vizsgálata primer hepatocyta szendvics kultúrában. Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola, Budapest, 2005. 5. Lengyel G, Jemnitz K, Veres Zs, Vereczkey L. Aktiváló és gátlószerek hatása az MRP2 és MRP3 transzport proteinek aktivitására primer hepatocyta szendvics kultúrában. Magyar Farmakológiai Társaság továbbképző szimpózium, Mátraháza, 2006. Egyéb előadás 6. Lengyel G, Jemnitz K, Veres Zs, Vereczkey L. ABC transzporterek vizsgálata primer hepatocyta szendvics kultúrában. Akadémiai beszámoló, Budapest, 2005.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton szeretnék köszönetet mondani témavezetőimnek, Dr. Vereczkey Lászlónak és Dr. Jemnitz Katalinnak, hogy tanítottak és megteremtették a TDK, valamint a Ph.D. munkám elvégzéséhez szükséges feltételeket. Hálával és köszönettel tartozom Dr. Veres Zsuzsának, akitől elsajátítottam a precíz kísérlettervezést és a pontos laboratóriumi munkát. Köszönöm egykori farmakológia professzorom, Dr. Tekes Kornélia támogatását, aki nagy segítségemre volt a nem elsősorban tudományos jellegű problémáim megoldásában. Köszönettel tartozom Dr. Szabó Pálnak a tömegspektrometriás mérésekért; Lasztóczi Bálintnak a fénymikroszkópiás felvételekért; Molnár Tündének a konfokális mikroszkópiás felvételekért; Dr. Krajcsi Péternek és a SOLVO Rt.- nek a vezikula transzport kísérletekért. Végezetül hálával tartozom családomnak türelmükért és szeretetükért "Az élet értelme a Küzdelem. A győzelem vagy a vereség az Istenek kezében van. Ünnepeljük hát a Küzdelmet!" Szuahéli Csatadal