A szteroidok mint antioxidánsok és ennek klinikai jelentosége a hormonpótló kezelésben

A szteroidok mint antioxidánsok és ennek klinikai jelentosége a hormonpótló kezelésben Ph. D. értekezés DR. BÉKÉSI GÁBOR Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Vezeto: PROF. DR. TULASSAY ZSOLT az orvostudomány doktora, klinikaigazgató 2/1-s program: A hepatológia immunológiai és szabadgyökös vonatkozásai Programvezeto és témavezeto: PROF. DR. FEHÉR JÁNOS, az orvostudomány doktora A szigorlati bizottság tagjai: PROF. DR. SOMOGYI JÁNOS, PROF. DR. KÖTELES GYÖRGY és PROF. DR. HALMY LÁSZLÓ Hivatalos bírálók: PROF. DR. GYÍRES KLÁRA és PROF. DR. TÓTH KÁROLY SÁNDOR Semmelweis Egyetem Budapest, 2003 1

Összefoglaló...4 Abstract...6 Rövidítések:...8 Bevezetés és irodalmi háttér...9 Menopauza, hormonpótlás és annak kardiovaszkuláris szempontjai...9 Az ösztrogénkezelés klinikailag kedvezo kardiovaszkuláris hatásai...10 A hormonpótló terápia és a kardiovaszkuláris rizikó...11 Nyitvamaradt kérdések a hormonpótlás kardiovaszkuláris prevenció céljából való indikációjával kapcsolatban...12 A Magyar Menopauza Társaság legújabb ajánlása...13 Az ösztrogén és az ateroszklerózis...16 Fiziológiás szabadgyök reakciók...16 Az ateroszklerózis szabadgyökös patogenezise...17 Az ösztrogén antioxidáns hatása...19 A többi szteroid hormon szerepe a szabadgyökös reakciókban...19 Célkituzések...20 In vivo vizsgálatok...21 In vitro kísérletek...21 Módszerek...21 I. Mérési eljárások...21 A granulociták intracelluláris mieloperoxidáz-aktivitásának mérése...21 A plazma mieloperoxidáz koncentrációjának mérése...22 A granulociták szeparálása...22 A granulocitákból felszabaduló mieloperoxidáz mennyiségének mérése...22 A granulociták szuperoxid-termelésének mérése...23 II. Vizsgálati csoportok...24 In vivo vizsgálatok...24 Az intracelluláris MPO-aktivitás vizsgálata hormonálisan aktív és menopauzás nok, valamint fiatal és idosebb férfiak esetében...24 A plazma mieloperoxidáz koncentrációjának mérése hormonálisan aktív és menopauzás nok, valamint fiatal és idosebb férfiak esetében...24 A granulociták intracelluláris mieloperoxidáz-aktivitásának és a belolük felszabaduló mieloperoxidáz mennyiségének változása a hormonpótló kezelés hatására...24 A tesztoszteron és a prednizolon hatásának vizsgálata az MPO termelésre...25 In vitro vizsgálatok...25 A mieloperoxidáz szuperoxid termelésben játszott szerepének vizsgálata...25 A neutrofil granulociták szuperoxid termelésének vizsgálata MPO-gátlók és natrium-hipoklorit adására...25 A neutrofil granulociták szuperoxid termelésének vizsgálata különbözo szteroidok hatására...26 III. Statisztikai analízis...26 Eredmények...27 In vivo vizsgálatok...27 Az intracelluláris MPO-aktivitás hormonálisan aktív és menopauzás nok valamint fiatal és idosebb férfiak esetében...27 A plazma mieloperoxidáz koncentrációja hormonálisan aktív és menopauzás nok, valamint fiatal és idosebb férfiak esetében...28 A granulociták intracelluláris mieloperoxidáz-aktivitásának és a belolük felszabaduló mieloperoxidáz mennyiségének változása a hormonpótló kezelés hatására...28 A tesztoszteron hatása az MPO termelésre...30 A prednizolon hatása az intracelluláris mieloperoxidáz aktivitásra...31 In vitro vizsgálatok...32 A sejtszuszpenziókhoz adott mieloperoxidáz hatása a granulociták szuperoxid-termelésére...32 A neutrofil granulociták szuperoxid termelésének változása MPO-gátlók és natrium-hipoklorit hatására...33 A neutrofil granulociták szuperoxid termelésének változása különbözo szteroidok, valamint különbözo szteroidok + MPO-gátlók együttes hatására...34 Megbeszélés...39 A kísérleti eredmények összefoglalása, új megállapítások...44 Következtetések...45 2

Köszönetnyilvánítás...46 Irodalom...48 Saját közlemények jegyzéke...62 Az értekezés témájában megjelent saját közlemények:...62 Az értekezés témájában megjelent idézheto absztraktok:...64 Eloadások, poszterek:...65 3

Összefoglaló Háttér: Számos kísérletes és klinikai adat szól amellett, hogy az élettani és patológiás szteroid státus változások fontos szerepet játszhatnak bizonyos megbetegedések iránti fogékonyság létrejöttében illetve megváltoztathatják azok gyakoriságát. A szteroidok számtalan biokémiai mechanizmust képesek befolyásolni, és ezáltal lényeges szerepet játszanak alapveto fiziológiai folyamatokban. Ennek legpregnánsabb példája, hogy az ösztrogének specifikus endokrinológiai hatásaikon túl a lipid és csont-anyagcserében is fontos szerepet töltenek be. Az utóbbi években növekvo számmal találkozunk az irodalomban a szteroid hormonok antioxidáns szerepére utaló adatokkal. Abból kiindulva, hogy a morbiditási és mortalitási statisztikákat világszerte vezeto megbetegedések patogenezisében a szabadgyököknek érdemi szerep jut, továbbá abból, hogy a gyöktermelés egyik legfontosabb helye a neutrofil granulocita, logikusnak tunt aziránti érdeklodésünk, hogy a szteroid hormonok miként befolyásolják ezen gyulladásos sejtek gyöktermelo aktivitását, és hogy milyen következményei lehetnek ennek a hatásnak a kardiovaszkuláris megbetegedések tekintetében. Célkituzések: Azt vizsgáltuk, (1) hogy a menopauza együtt jár-e a neutrofil granulocitákban található és a szabadgyökös reakciókban szereplo mieloperoxidáz enzim aktivitásának változásával, (2) hogy a hormonpótló kezelés befolyással van-e ezen enzim mennyiségi és aktivitási viszonyaira, (3) hogy a fentieknek vannak-e következményei a szabadgyökök termelését illetoen. Azt is tanulmányoztuk, (4) hogy hogyan változik a mieloperoxidáz enzim plazma koncentrációja az életkor elorehaladtával és nemek szerint, (5) és hogy a szteroid hormonok antioxidáns szerepe és a mieloperoxidáz enzim e kifejtett hatása között milyen kapcsolat áll fenn. Módszerek: Az intracelluláris mileoperoxidáz aktivitási eloszlásokat a Semmelweis Egyetem II. számú Belklinikájának random válogatott betegeinél az egyéb célú vérképvizsgálatok során Technicon H-3 hematológiai készülékkel automatikusan megmért átlagos peroxidáz index értékek összegyujtésével határoztuk meg. Ezt az automatát használtuk az ösztrogén és a prednizolon mieloperoxidáz aktivitásra kifejtett hatásainak megítélésére is. Az egészséges önkéntesektol nyert plazmákban illetve neutrofil sejtjeik flülúszóiban található mieloperoxidáz enzim kimutatására ELISA módszert alkalmaztunk. A szuperoxid anion meghatározása fotometriával történt a mieloperoxidáz enzim, az enzim inhibitorai és az egyes szteroidok hatásának megítélése során. 4

Eredmények, új megállapítások: Az intracelluláris mieloperoxidáz aktivitás és az enzim plazma szintje a hatodik évtizedben a korábbi évekhez képest szignifikáns csökkenést mutat mindkét nemben. Menopauzás nok ösztrogén pótlását követoen az enzim aktivitása és a neutrofilekbol felszabaduló mennyisége viszont szignifikánsan növekszik. Hasonló növekedést tapasztaltunk az intracelluláris enzim aktivitás tekintetében prednizolon, az extracelluláris enzim felszabadulást illetoen pedig tesztoszteron adásával. Neutrofil granulocitákhoz in vitro hozzáadott mieloperoxidáz hatására a szuperoxid anion szabadgyök mennyiségének szignifikáns csökkenését lehetett elérni. Mieloperoxidáz inhibitoroknak neutrofil sejtekkel történo in vitro inkubálása révén a szabadgyök termelés szignifikáns növekedését találtuk, ugyanakkor ezen inhibitorok felfüggesztették több szteroid hormon szuperoxid anion produkciót csökkento hatását. A mieloperoxidáz enzim által katalizált reakció végterméke, a hipoklorit anion viszont szintén a szuperoxid gyök termelésének csökkenését okozta rendszerünkben. Következtetések: Eredményeink amellett szólnak, hogy bizonyos szteroid struktúrák antioxidáns hatásúak, és ez a hatás minden bizonnyal legalábbis részben a mieloperoxidáz enzim mennyiségének és aktivitásának fokozásán keresztül valósul meg. A mieloperoxidáz enzim az antioxidáns képesség új indikátoraként és a szabadgyökös eredetu betegségek esetleges prediktoraként is szóba jöhet a nem túl távoli jövoben. Minden olyan törekvés tehát, amely az antioxidáns szteroidok szintje élettani csökkenésének hátráltatását, hiányzó mennyiségük pótlását, esetleg a mieloproxidáz enzim mennyiségének vagy aktivitásának növelését célozza, ígéretesnek látszik a számtalan, szabadgyökök által mediált megbetegedés elleni harcban. 5

Abstract Background: There are numerous experimental and clinical data to support the view that changes in physiological and pathological steroids' status can play an important role in forming susceptibility to certain diseases or in increasing the frequency of such illnesses. Steroids are capable of exerting an influence on many essential biochemical mechanisms and thereby of playing a substantial role in essential physiological processes. Apart from the specific endocrinological effects, the most significant example of this in the case of estrogens is their role in lipid and bone metabolism. In recent years we have come across more and more data in the literature referring to the antioxidant role of steroid hormones. Starting from the fact that, alongside other factors, free radicals have achieved a substantial role in the pathogenesis of diseases at the forefront of worldwide morbidity and mortality statistics, and from the fact that neutrophil granulocytes represent one of the most important locations for production of radicals, it seemed logical to make a summary of our interest in how steroid hormones influence the radical producing activities of these cells and in what the consequences might be in respect of one of the leading killers, cardiovascular diseases. Objectives: To examine (1) whether the menopause implies changes in the activities of the myeloperoxidase enzyme, which figures in free radical reactions and can be found in neutrophil granulocytes, (2) whether hormone replacement treatment has an effect in terms of the quantity and activity of this enzyme and (3) whether this has consequences in respect of the production of free radicals. To assess (4) how plasma concentration of the myeloperoxidase enzyme changes with age and by gender and (5) whether a connection exists between the antioxidant role of steroid hormones, as mentioned above, and its effect on the myeloperoxidase enzyme. Methods: We determined the levels of intracellular myeloperoxidase activity in randomly selected patients at the 2 nd Medical Clinic of Semmelweis University during blood count examinations carried out for other purposes, by compiling mean peroxidase index values measured automatically by a Technicon H-3 haematology device. We also used this machine to assess the effects of oestrogen and prednisolone on myeloperoxidase activity. We applied the ELISA method to measure quantities of the myeloperoxidase enzyme in plasmas or in supernatants of neutrophil cells obtained from healthy volunteers. Superoxide anion was determined by photometry during 6

examination of the role of MPO, MPO-inhibitors and certain steroids in the superoxide generation. Results and new claims: Intracellular myeloperoxidase activity and the plasma level of enzyme show a significant reduction for people of both sexes in the sixth decade, compared with previous years. But for menopausal women, following oestrogen replacement, there is a significant rise in enzyme activity and quantities released from neutrophils. We observed a similar increase in intracellular enzyme activity after prednisolon administration and in release of the ezyme from neutrophils by adding testosterone. A significant reduction could be achieved in quantities of the free radical known as superoxide anion on the effect of myeloperoxidase mixed in rising quantities and in vitro with neutrophil granulocytes. We found a significant increase in free radical production through in vitro incubation of myeloperoxidase inhibitors with neutrophil cells, furthermore, these inhibitors stopped the reducing effect of several steroid hormones on superoxide anion production. However, hypochlorite anion, the end product of the reaction catalyzed by the myeloperoxidase enzyme, also caused a reduction in superoxide radical production in our methodology. Conclusions: Our results support the view that certain steroid structures have an antioxidant effect, and this effect is probably realized at least in part through an increase in activity and quantity of the myeloperoxidase enzyme. Thus any attempt to target obstruction of a physiological reduction in the level of antioxidant steroids, replacement of quantities, or even an increase in the activity or quantity of the myeloproxidase enzyme appears promising in the fight against the many diseases transmitted by free radicals. In the non-too-distant future and after further research the myeloperoxidase enzyme might also be thought of as a kind of new indicator of antioxidant capability and even a predictor of diseases originating from free radicals. 7

Rövidítések: MPO: mieloperoxidáz MPXI: átlagos peroxidáz index SEM: standard error of the mean SD: standard deviation DHEA: dehidroepiandroszteron DHEAS: dehidroepiandroszteron szulfát NADPH: redukált nikotinamid adenin dinukleotid foszfát NO: nitrogén-monoxid NOS: NO szintáz ABAH: aminobenzoésav-hidrazid fmlp: formil-metionin-leucin-fenilalanin DNS: dezoxi-ribonukleinsav HPK: hormonpótló kezelés MHT: menopauzális hormonterápia E2: ösztradiol SERM: szelektív ösztrogén receptor modulátor LPO: lipid peroxidáció PMA: forbol-mirisztát acetát 8

Bevezetés és irodalmi háttér Menopauza, hormonpótlás és annak kardiovaszkuláris szempontjai Sokat emlegetett klinikai tapasztalati tény a reproduktív korban lévo nok védettsége az ateroszklerózissal szemben (66). A menopauza jelentkezését követoen viszont lényegesen emelkedik a progresszív érfalkárosodás kockázata (1,66,100,101). E gyakorlati megfigyelést nagyban alátámasztják a Központi Statisztikai Hivatal 2001-es évre vonatkozó mortalitási adatai is. Ebben az évben Magyarországon a 35-39 éves korosztályban 10.000 azonos korú és nemu lakosra átszámítva 0.56 no és 1.97 férfi halt meg acut miokardiális infarktusban. (Az abszolút számok 17 és 60 voltak.) Az 55-59 éves korcsoportban ugyanezek a számok a következoknek bizonyultak: 5.8; 20.7 (abszolút számok:193; 580). A 60-64 éves korcsoportban még kifejezettebb emelkedést találunk: 11; 31.7 (abszolút számok:332; 728). A cerebrovaszkuláris elzáródás miatti halálozási adatok ugyanezen idoszakban illetve nem és korcsoportok szerinti beosztásban az alábbiak voltak: 0.07; 0.2 (2; 6) a legfiatalabb csoportban, 2. 84; 7.3 (94; 205) az 55-59 évesek között és 5.9; 15.8 (180; 363) a harmadik korcsoport esetében. (Az elso szám minden esetben a nokre, a második a férfiakra vonatkozik, a zárójelben az abszolút halálozási számok találhatók.) A szívizom infarktusra vonatkozó adatokat elemezve a hormonálisan aktív korosztályhoz képest a 60 év feletti populációban 20-szoros növekedést találunk noknél. Férfiak esetében ez a növekedés csak 16-szoros. A cerebrovaszkuláris halálozási adatokban a nok esetében 85-szörös, a férfiaknál 79-szeres emelkedés figyelheto meg az elso és a harmadik korcsoport adatait összevetve. Bár mind az abszolút számokat, mind a 10.000 fore vetített adatokat tekintve a férfiaknál mindenhol magasabb értékeket látunk, a korral elorehaladva jelentkezo növekedés mértéke a noknél erosebb, tehát a két nem közötti olló az idosebb korosztályokban fokozatosan záródik, és az itt nem részletezett adatok alapján a nyolcadik évtized elejére a nok elonye megszunik, sot a késobbiekben a 10.000 lakosra számított adatok némileg még magasabbak is lesznek a gyengébbik nem esetében. Az adatokat összegezve a férfiak negyedik-ötödik évtizedben tapasztalható magasabb kardiovaszkuláris halálozási rátája a késobbi életkorokban kiegyenlítodik, 9

tehát a nok hormonális aktivitásának megszunése egyúttal egyfajta védo funkció elmaradását is jelentheti. Számos megfigyeléses vizsgálat eredménye alapján úgy tunt, hogy e negatív tendencia hormonpótlással megfékezheto, néhány újabban lezárult, randomizált, kontrollált vizsgálat azonban megkérdojelezni látszik ezt a feltevést. Az ösztrogénkezelés klinikailag kedvezo kardiovaszkuláris hatásai Kísérletes adatok bizonyítják, hogy az ösztrogének gátolják az ateroszklerotikus plakk kialakulásának számos lépését, továbbá integráló szerepet játszanak az ischaemiát megelozo hemodinámia fenntartásában. Az ösztrogén kezelés csökkenti az LDLkoleszterin szintet a hepatikus LDL-receptorok számának növelése révén (108), valamint serkenti a HDL szintézisét és gátolja annak lebontását (102,109). Emellett csökkenti a leginkább aterogénnek tekintheto lipidfrakció, a lipoprotein (a) szintjét (103), és gátolja az LDL oxidációját (67), mely folyamatnak központi jelentosége van az ateroszklerózis kialakulásában. Ugyanakkor viszont emeli a C-reaktív proteinnek, mint aterogén tényezonek a szintjét (106). Az erek sérülése esetén csökkenti a simaizomsejtek migrációját és proliferációját, a neointimaképzodést (25,76,105), hiperkoleszterinémiás állatok ereiben csökkenti az adhéziós molekulák expresszióját és a leukocyták adhézióját (16,90). Állatkísérletekben az ösztrogénpótlás gátolta az atheroszklerotikus plakk növekedését (2,112). A lipid profil javítása mellett az ösztrogénterápia kedvezoen befolyásolja a cukoranyagcserét is: csökkenti az éhezési szérum glükóz és az inzulin szintjét, valamint az inzulin rezisztenciát (3,14,75). Ugyanakkor a hormon kezelés mind a koagulációs, mind a fibrinolítikus folyamatok fokozódását elosegíti (56). Ez egészséges nokben nem bontaná meg e folyamatok egyensúlyát. Azokban a nokben azonban, akik bizonyos mutációkat hordoznak a koagulációs-fibrinilítikus faktorokért felelos génekben (Leiden V fator mutáció, protrombin 20210 G/A mutáció, protein C és protein S deficiencia, antitrombin deficiencia), az exogén noi hormonok hatására trombózis következhet be (40,86). Több vizsgálat is igazolta, hogy ezen mutációk valamelyikét hordozó nokben a hormonpótlás növeli a vénás és artériás trombózis kockázatát, szemben a mutációt nem hordozókkal (26,27,78). E hatásokon túlmenoen ismertek a hormon hemodinamikai hatásai is: a krónikus ösztrogénkezelés a vaszkuláris kontraktilitást csökkenti, a véráramlást növeli (62). Az 10

endotélium által termelt faktorok közül csökkenti a vazokonstriktor hatású endotelin produkcióját (33,111), fokozza viszont az értágító hatású prosztaciklin (51,68), továbbá - az endoteliális nitrogénmonoxid-szintáz(e-nos) expressziójának növelésén keresztül - a nitrogénmonoxid (NO) termelését (61,115). Ezek mellett az akut ösztradiolkezelés direkt, nongenom érhatásaira is fény derült: viszonylag magas dózisokban néhány perces reakcióidovel értágulatot okoz (50,52), egyrészt az e-nos aktivitásának fokozásán, másrészt a simaizomsejtek Ca2+-csatornáinak blokkolásán (116), valamint a K+-csatornák kinyitásán (87) keresztül. Több klinikai tanulmány szerint az akut szublingvális ösztradiolkezelés jótékony hatású myocardiális ischaemiában (83,81). A hormonpótló terápia és a kardiovaszkuláris rizikó Jónéhány epidemiológiai tanulmány mutatja egybehangzóan, hogy az ösztrogént szedo posztmenopauzális noknél alacsonyabb a kardiovaszkuláris betegségek incidenciája (28,29,30,75,97). Ezen adatok után nagy port kavart fel az elso nagylétszámú, randomizált, kontrollált vizsgálat, a HERS (Heart and Estrogen/progestin Replacement Study) eredménye, mely szerint 18-23 éve posztmenopauzában lévo, idos, szívbeteg noknél megkezdett nagydózisú konjugált equin ösztrogénnel és medroxiprogeszteron-acetáttal való kombinált hormonpótó terápia elso évében fokozódik a koronária történések rizikója, míg késobb mérséklodik (45). Két nagy - a hormonpótlás szekunder prevencióban való szerepét elemzo - nem randomizált vizsgálat is megerosítette, hogy a hormonpótló kezelés (HPK) elso félévében-évében megnohet a kardiovaszkuláris események rizikója, míg a további években a hormonpótlás egyértelmuen csökkenti ezen események gyakoriságát (31,38). Mindezek alapján az American Heart Association 2001-ben közzétett állásfoglalása szerint a HPK önmagában a kardiovaszkuláris betegségek szekunder prevenciójára nem javallt (37,73). A hormonpótló kezelés primer prevencióban való szerepének tisztázására indult WHI (Women s Health Initiative) vizsgálatnak a kombinált hormonpótlás hatásait kutató ágát az Egyesült Államok szív- és érrendszeri, tüdo-, valamint vérképzoszervi betegségeket felügyelo intézete 2002 nyarán a követés 5,2 évében leállította. Az addig eltelt idoszak alatt ugyanis a kombinált hormonpótlásban részesülok körében a placebocsoporthoz képest szignifikáns mértékben nott a szívinfarktus, a stroke, a tromboemboliás események, valamint az emlorák kockázata, ugyanakkor csökkent a vastag- és végbélrákok, továbbá a csípotáji és egyéb csonttörések kockázata (110). 11

Nyitvamaradt kérdések a hormonpótlás kardiovaszkuláris prevenció céljából való indikációjával kapcsolatban Bár a nok saját választása, valamint az egészséges-szedok okozta torzítás valamelyest módosíthatja a megfigyeléses vizsgálatok eredményeit, az utóbb említett, randomizált vizgálatoknak is vannak hiányosságai, az e témával foglalkozó, ismert, európai munkacsoportok által kifogásolt pontjai (a placebo csoportban az antitrombotikus hatású sztatinok használata nagyobb arányú volt; a placebo csoportban ismeretlen okok miatt a vártnál jelentosen kisebb volt a koronáriatörténések elofordulása az elso évben; túl idos noket vontak be, stb; 84,82,43). Lehetséges-e általános következtetéseket levonni az eddigi adatokból az ösztrogén és gesztagén család minden tagjára vonatkozóan? Az elobbiekben említett vizsgálatokban csak egyetlen kezelési sémát alkalmaztak: konjugált equin ösztrogén (CEE) nagy dózisa (0,625 mg) mellett medroxiprogeszteronacetát (MPA) szintén magas dózisát (2,5 mg) használták hormonpótlásra. Európában és Magyarországon is a korszerubb, mikrokristályos 17? -ösztradiolt tartalmazó készítmények honosodtak meg, gesztagén komponensként pedig a norethisteron-acetát, a didrogesteron és a természetes progeszteron. Nem tudhatjuk, hogy más készítményekkel, kisebb adagokkal hasonló eredményt kapnánk-e (63). Az említett vizsgálatokban résztvevo nok átlagéletkora magas volt. Ebben az életkorban az erek már ateroszklerotikusak, és az ösztrogén ismert, koagulációt fokozó mellékhatása az arra hajlamosakban segítheti kardiovaszkuláris események kialakulását. Kérdés, hogy a hormonpótlást a menopauza jelentkezésekor azonnal elkezdve hasonló hatást észlelnénk-e? A hormonpótlásnak az ateroszklerózis progresszójára való hatását kutató, szintén randomizált, koronária-angiográfiás, illetve carotis-ultrahangos vizsgálatok, az ERA (41) és a PHOREA (4) sem tudták igazolni a hormonpótlás kedvezo hatását már elorehaladott ateroszklerózis esetén. Ezzel szemben az EPAT (42) - mely szintén randomizált, kontrollált, carotis-ultrahangos vizsgálat azt bizonyította, hogy 2 éves 17? -ösztradiol kezelés csökkenti a szubklinikai ateroszklerózis progresszióját azon egészséges, posztmenopauzális noknél, akiknél nem áll fenn kardiovaszkuláris betegség, és az ösztrogénpótlást viszonylag hamar megkezdik a menopauza után. Ezzel párhuzamosan állatkísérletekben is azt találták, hogy bár az ösztrogénpótlás gátolta az atheroszklerotikus plakk növekedését, majmoknál az 12

ösztrogén kezelést évekkel a menopauza után kezdve a beavatkozás alig csökkentette az ateroszklerózis kiterjedtségét a placebóhoz képest (112,113). Még ellentmondásosabbak az adatok a progeszteron kardiovaszkuláris hatásait illetoen, bár kiterjedten használják a hormonpótló kezelés részeként az endometrium hiperplázia és karcinoma prevenciójára. A progeszteron gátolja az intracelluláris ösztrogénreceptorok expresszióját minden szövetben, ezáltal csökkentve annak genom hatásait (91). Így a progeszteron foleg az erosebb progesztogén hatású medroxiprogeszteron-acetát - hozzáadása az ösztrogénkezeléshez csökkentheti annak kedvezo hatásait (108,70). A WHI vizsgálatnak is csak az ösztrogén + MPA ágát állították le az elobb említett erdmények miatt, az önmagában adott ösztrogénkezeléssel folytatott vizsgálat folytatódik. Kérdés, hogy az MPA hozzáadása volt-e az oka a kardiovaszkuláris események fokozódásának. Ugyanakkor a természetes progeszteron az ösztrogén néhány kedvezo hatását erosíteni látszik (52,85). A Magyar Menopauza Társaság legújabb ajánlása A változókorú noket, mindenek elott az egészséges életmódra, a dohányzás abbahagyására, az alkoholfogyasztás mérséklésére, diétára és testmozgásra kell buzdítani függetlenül attól, hogy szükségük van-e MHT-ra. Az MHT alatt peri- és postmenopauzális korú nok ösztrogén hiány (1. sz. táblázat) által indukált vagy súlyosbított tüneteinek, kóros állapotainak megelozése és kezelése céljából bevezetett és tartósan folytatott ösztrogén- vagy ösztrogén és progesztogén kezelését értjük. Fertilis korú nok petefészek muködési zavar, vagy az ováriumok mutéti eltávolítása miatt kialakult ösztrogén hiányának kezelése esetén beszélhetünk valódi ösztrogén szubsztitúcióról. Az MHT-re általában csak klimakteriális szindróma esetén a tünetek súlyosságának arányában van szükség, és addig kell folytatni, ameddig azok panaszt okoznak. Tünetmentes nok esetében oszteoporózis prevencióra és kezelésre az MHT csak a nem hormonális kezelési lehetoségek ellenjavallata, vagy nem hormonális terápiával történo kombinált kezelés szükségessége esetén jöhet szóba. A kezelés megkezdését részletes állapotfelmérés, kivizsgálás elozi meg (4. sz. táblázat) szükség esetén társszakmai konzíliumokkal kiegészítve. Az MHT megkezdésérol és folytatásáról (évente) a döntést a kezelés vezetésében jártas szakorvosnak és az érintett páciensnek együtt kell meghoznia. A döntésnél figyelembe 13

kell venni a kardiovaszkuláris trombózisra hajlamosító és az emlorákkal kapcsolatos kockázati tényezoket, a klinikai tüneteket és az ellenorzo vizsgálatok eredményeit. Összességében úgy kell dönteni, hogy a kezelés kockázata ne haladja meg annak várható hasznát. Az MHT során, a mellékhatások és szövodmények (2. és 3. sz. táblázat) elkerülése miatt törekedni kell a legkisebb, még hatékony dózis eloírására, mérlegelve az MHT rendelkezésre álló alkalmazási módjainak (orális, transzdermális, orrpermet, intravaginális, intrauterin) az adott páciens szempontjából fennálló elonyeit és hátrányait (5. sz. táblázat). Az MHT-nak egyénre szabottnak kell lennie, a kezelés során észlelt klinikai visszajelzéseket messzemenoen figyelembe kell venni, és a terápiát azoknak megfeleloen módosítani. A progesztogéneknek (természetes progeszteron és a progesztinek) az endometrium hiperplázia megelozése céljából történo alkalmazásától csak hiszterektómián átesett nok esetében tekinthetünk el. A progesztogének a megfigyeléses és RCT vizsgálatok szerint egyaránt csökkentik az endometrium rákok elofordulását, de ronthatják az ösztrogének kedvezo kardiovaszkuláris hatásait, és növelik az MHT emlorák kockázatát. Hatás/mellékhatás spektrumuk az ösztrogénekénél szélesebb. Az MHT megválasztásánál elonyben kell részesíteni a hosszú ciklusú (2-3 havonta adott progesztogén), vagy a kombinált folyamatos adagolási módot. Speciális szerepe van a tibolonnak, mely nem természetes hormon, sajátos szövetspecifikussága ösztrogén, progesztogén és androgén hatást ötvöz. Mérlegelni kell az MHT, különösen annak kombinált (ösztrogén + progesztogén) formájának öt éven túli adagolását az emlorák abszolút kockázatában várható 1-2 es növekedés miatt. Ha az MHT osteoporosis miatt folyik, és a páciensnek nincsenek egyéb ösztrogénhiányos tünetei, vagy fokozott az emlorák kockázat, megfontolandó a váltás nem hormonális alternatívákra, biszfoszfonátokra (alendronate, risedronate), raloxifenre (SERM Selective Estrogen Receptor Modulator). Az MHT primer és szekunder kardiovaszkuláris prevencióra minden valószínuség szerint nem alkalmazható. Bizonyos esélye a primer prevenciónak maradt, ha az MHT-t még ép érrendszeru nokben a postmenopauza elso 10 évében kezdik el. Nem sikerült még hitelt érdemloen igazolni az ösztrogének kedvezo hatását a memóriavesztésre és az Alzheimer kór gyakoriságára. 14

Az MHT választható alternatívái között külön kategóriát képeznek a fitofarmakonok és a fito-ösztrogeneket tartalmazó táplálék kiegészítok, melyek hatásvizsgálata még folyamatban van, de kisebb mellékhatás spektrumuk miatt mind gyakrabban alkalmazzák. (Az eloterjesztést Dr Tóth Károly Sándor Tanár Úr, a társaság elnöke készítette.) 1. sz. táblázat A menopauzális hormontherapia javallatai (az ösztrogén hiány potenciális tünetei): - hohullámok, éjszakai izzadás, palpitatio, - ingerlékenység, kimerültség, hangulatzavarok, pánik, - alvászavar - colpoxerosis, dyspareunia, - késztetéses incontinentia, - osteopenia, osteoporosis, arthropathia climacterica (kisizületi fájdalom) 2. sz. táblázat A menopauzális hormontherapia (MHT) mérlegelendo ellenjavallatai: - emlorák, endometrium carcinoma, vagy az azokat megelozo és követo állapotok, - aktív thromboemboliás betegség vagy annak hajlama, thrombophilia, - aktív májbetegség, panaszokat okozó epekövesség - elozetes myocardialis infarctus, ISzB, több kardiovaszkuláris kock ázati tényezo, - familiaris hypertriglyceridaemia, - tisztázatlan eredetu meno- és metrorrhagia A menopauzális hormontherapia (MHT) mellékhatásai: - oedemakészség fokozódása, mastalgia, retinaoedema (látászavar), - cholecystopathia, - venalgia, - lábikragörcs. 3. sz. táblázat 4. sz. táblázat Kivizsgálás az MHT kezdetén és az ellenorzés során: - anamnézis - periodikus szív-érrendszeri rutin ellenorzés, testsúly, RR, EKG, fizikális vizsgálat, visszér, stb. - mammográfia - a kezeléas elott, majd egy-két évente - osteodensitometria - a kezelés megkezdésekor és egy év múlva - laboratóriumi vizsgálatok: vérkép, szérum ionok, vérzsírok, májenzimek, FSH, E2, prolactin, TSH, szabad T4, vizelet individuálisan mérlegelve - kismedencei UH- egy-két évente (4-6 mm endometrium vastagság a vérzés utáni 5. napon illetve posztmenopauzában) - egyéb, az MHT vezetéséhez szükséges vizsgálatok és konzíliumok szükség szerint 15

5. sz. táblázat Csak ösztrogén kezelés (hysterectomia után): - 17? - oestradiolum és oestradiolum valericum per os 0.5 1.0 mg, - oestrogenum conjugatum per os 0.3 0.625 mg, - 17? - oestradiolum tapasz 12.5 50.0mcg, - 17? - oestradiolum zselé 0.5 1.0 mg, - 17? - oestradiolum orrpermet 150 300 mcg, Szekvenciális vagy folyamatos progesztin kiegészítés: - progesteronum per os 100 200 mg intra vag. 100 200 mg - dydrogesteronum per os 5 20 mg, - norethisteronum aceticum per os 0.5 1.0 mg, tapasz 15 30 mg, - levonorgestrelum per os 150 250 mg, intrauterin 14 20 mcg/nap - dienogestum per os 1.0 2.0 mg, - cyproteronum aceticum per os 1.0 mg, - medroxyprogestreronum aceticum per os 2.5 10 mg. Az ösztrogén és az ateroszklerózis Számos adat bizonyítja, hogy az idoben elkezdett, tartós ösztrogénexpozíció mérsékli az ateroszklerózis progresszióját (2,59,112). A hormonálisan aktív nok védettsége és az aterogenezis szabadgyökös elmélete tükrében kézenfekvo az a kutatási irány, amely a noi nemi hormonok antioxidáns hatásának kimutatását célozza. Az irodalomban egyre nagyobb számban találhatók olyan közlemények, amelyek e hatás meglétét bizonyítják, ennek mechanizmusa azonban még nem tisztázódott. A szabadgyökös reakciók a szervezet jónéhány fiziológiás és patológiás folyamatában játszanak dönto szerepet. Fiziológiás szabadgyök reakciók Ha a fagocitákat megfelelo inger éri, akkor egy összetett, metabolikus reakciósor zajlik le bennük, amelyet respiratory burst -nek nevezünk. Az aktivációra mind partikulált (opszonizált baktériumok, latexszemcsék), mind szolubilis ágensek (forbolmirisztát-acetát:pma, limfokinek, C5a, immunkomplexek, immunglobulinok) képesek. Az aktiváció által okozott membránperturbáció muködésbe hozza a membránban elhelyezkedo NADPH-oxidázt, amely a következo reakciót katalizálja:. 2O 2 + NADPH? 2O - 2 + NADP + + H + 16

A keletkezo szuperoxidot a szuperoxid-dizmutáz (SOD) hidrogénperoxiddá (H 2 O 2 ) alakítja. A fagocitált partikula a fagocitotikus vakuolumba kerül, amely sejten belül összeolvad a neutrofilekben és mononukleáris fagocitákban található azurofil granulumokkal. E granulumokban található a mieloperoxidáz enzim (MPO), amely a kloridionok hipokloritionokká való oxidációját katalizálja hidrogénperoxid felhasználásával: Cl - + H 2 O 2? ClO - + H 2 O A mikroorganizmusok elpusztítása a sejtfal halogenálásával vagy aminósavainak dekarboxilálásával történhet: R-CHNH 2 -COOH? R-CHO + CO 2 + NH 3 A fagocita vakuolumokban további szabadgyökök is keletkezhetnek:. H 2 O 2 + O - 2?. OH + OH - + O 2 (fémkatalízis). R-OOH + O - 2?. OH + OR - + O 2 A reaktív oxigén intermedierek egy része átszivárog a citoplazmába és az extracelluláris térbe is. A citoplazmát a benne elhelyezkedo szuperoxid -dizmutáz, kataláz és glutation-peroxidáz védi. Az extracelluláris tér antioxidánsainak (cöruloplazmin, transzferrin, tetramer SOD) aktivitása lényegesen gyengébb, ezért az extracelluláris tér sokkal kevésbé védett a szabadgyök-reakciókkal szemben. A szabadgyökös reakciók fontos szerepet játszanak az öregedés, a gyulladás, az ateroszklerózis, a daganatok, a reumatoid artritis, a májkárosodás és még sok más betegség patogenezisében (23). Az ateroszklerózis szabadgyökös patogenezise Az ateroszklerózist segítik az artéria falát irritáló faktorok. Ilyenek a molekuláris oxigén többszörösen telítetlen zsírsavakkal való reakciója során keletkezo lipidperoxidok. A szérumban állandóan meglévo és a korral fokozódó LPO tehát iniciálhatja az aterogenezist az artériafal sérüléseinek létrehozásával, tehát ez az ateroszklerózis patogenezisének alapveto elméleti hátteréül szolgáló response to injury teória részjelenségét képezi. A szabadgyökös reakciók gátolják a szérum elasztáz-inhibitor és a prosztaciklinszintetáz enzimek aktivitását. Az elasztáz inhibitor gátlása miatt az érfalban aktiválódnak az elasztázok, ezáltal felbomlanak az elasztin keresztkötései, és a lizin 17

oldalláncok reakcióba lépnek a plazmában és az erek falában eloforduló lipidperoxidációs termékekkel, így abnormális keresztkötések képzodnek, melyek több telítetlen kötést is tartalmaznak, így könnyen autooxidálódanak és polimerizálódnak, létrehozva egy peroxidált lipoid-kalcium-elasztin komplexet. Az abnormális keresztkötések megakadályozzák az elasztin normális funkcióját, rugalmasságát és vízköto képességét, a kalciumlerakódás miatt pedig az ér fala elmeszesedik, megkeményedik. A prosztaciklinszintézis csökkenése következtében a trombociták intenzívebben kötodnek az endotélhez, ezek is termelnek reaktív oxigén intermediereket, azáltal tovább fokozódik az érkárosodás mértéke (23). Hiperkoleszterinémiás betegek hajlamosabbak az ateroszklerózisra, de nem maga a koleszterin, hanem annak oxidációs termékei képesek iniciálni és ezután fokozni az artériafal endotéljének károsodását (35,36,46). Lipidperoxidok hatására a koleszterin átalakul az elobb említett oxidációs termékké (74). A vér alakelemei, különösen a fehérvérsejtek fontos szerepet játszanak az atherogenesisben (22). A leukocyták és az endothel sejtek kóros interakciójában is meghatározó tényezonek tartja a szakirodalom a szabadgyököket (18, 71). A szklerotikus plakk kristályos koleszterinje aktiválja a komplement 5a-t, ami a granulociták aggregációjához, endotél sejtekhez történo adhéziójához és a respiratory burst aktiválásához, így további érfalkárosodáshoz vezet. (23). A legfontosabb szabadgyöknek a szuperoxid-aniont tarthatjuk. Bár ez a gyök önmaga korlátozott mértékben reaktív, azonban a lecitin-koleszterol-membránokban peroxidációs folyamatokat indukál (94), és számos más, jóval agresszívebb gyök forrásául is szolgál. Hidrogén-peroxiddal reagálva hidroxilgyök és szinglet oxigén keletkezik belole, ezek a fo okai a lipidek szabadgyökös átalakulásának, a lipidperoxidációnak, azaz az aterogenezis dönto mozzanatának. Állatkísérletes adatok szerint a szuperoxid-anion szignifikánsan stimulálja az érfal simaizomsejtjeinek a proliferációját (15). Reakcióba lép az értágító, trombocita-aggregációt és simaizomproliferációt gátló nitrogén monoxiddal (NO), és közömbösíti azt. A keletkezo peroxinitrit is oxidálja a lipoproteineket, illetve további, igen reaktív gyökökké alakul át (104), állatmodellekben pedig a szívizomzat effektivitásának csökkenését okozza (24). 18

Az ösztrogén antioxidáns hatása Az oxidált LDL-nek központi szerepe van az ateroszklerózis kialakulásában és progressziójában. In vitro kísérletekben az ösztrogének 10-8 -10-5 M dózisban gátolták az LDL oxidációját (20,89,96). Feltehetoleg az észterifikálódó ösztrogén beépül a lipoprotein partikulumba, s az így kialakult hidrofób molekulák gátolják a foszfolipid réteg szabadzsírsav részeinek oxidációját. Az ösztrogén nem receptoriális hatással, fenolstruktúrája révén képes a hidroxilgyökök (OH. ) befogására (72). Okklúziósreperfúziós állatkísérletekben az elozetes ösztrogénkezelés csökkentette a kialakuló nekrózis nagyságát, a kamrai aritmiák számát és az n-pentán kilégzést, amely a lipidperoxidáció markere, ezzel szemben fokozta az antioxidáns hatású glutation peroxidáz termelodését (53,54,92). Egyes közlemények szerint az ösztrogén fokozza a superoxid anion termelést (58,88), míg mások eredményei alapján ennek éppen az ellenkezõje az igaz (6,0,80). A többi szteroid hormon szerepe a szabadgyökös reakciókban Néhány, sokszor ellentmondásos adat a többi steroidnak a szuperoxid anion felszabadulásra gyakorolt hatásáról is rendelkezésre áll (19,55,58,65,79,88,98,99,107). E munkák során a legkülönfélébb sejttípusokat használták, így érthetõ a levont következtetések nem egységes volta. Hidrokortizon parenteralis adását két órával követõen egér lép sejtekben a szuperoxid anion mennyiségének növekedését figyelték meg (107). Egy másik kísérlet során human anyagon a mellékvese glukokortikoid hormonja a szuperoxid kiáramlást csökkentette (79). A progeszteronról kiderült, hogy emberi spermiumok szuperoxid termelését fokozza (19), de gátolja ugyanezt patkányok mononuklearis sejtjeiben (98). Más közlemények szerint az ösztrogén, a progeszteron, a tesztoszteron és a kortizol közül semelyik sem befolyásolja a szuperoxid anion produkciót (55,98). A szteroidok egyéb támadáspontokon megnyilvánuló antioxidáns hatására is találunk irodalmi adatokat. Csaknem valamennyi képviseloje a közös szteroidoknak - szterolok, epesavak, D-vitamin, C18, C19, C21 szteroidok - rendelkezik valamilyen 19

gyök eltakarító, scavenger tulajdonsággal (7). A metilprednizolonról bebizonyosodott, hogy gátolja a liposzomákban az ultraibolya fény általi fotoperoxidációt (94), és képes megelozni a lipid-hidroperoxid termelést (20). A glukokortikoidok gyengítik a szabadgyökös reakciókat és a lipid peroxid képzést macska gerincveloi szövetben (34). A 21-aminoszteroidokról sikerült igazolni, hogy befogják a lipid-peroxil gyököket és a szuperoxid aniont, és hogy blokkolják a szabadgyökös lipid láncreakciókat valamint az oxigén gyökök által stimulált intracelluláris proteolízist. Kiderült, hogy gátolják az oxigén gyökök generálását, és megelozik a lipid gyökök membránon keresztüli diffúzióját. Tisztázódott továbbá, hogy képesek lassítani az antioxidáns hatású E vitamin inaktivációját és fokozzák e vitamin gyökfogó képességét (47). A 21-aminoszteroidok ezenkívül mérséklik a vasfüggo lipid peroxidációt idegi struktúrákban (8). Ez a hatás erõsebb, ha a szteroid szerkezet D gyurujéhez vas kelátor kapcsolódik (9). Továbbá az antioxidáns 21-aminoszteroidok citoprotektív aktivitással és szöveti kultúrákban a sejt növekedésre és funkcióra gyakorolt hatással is rendelkeznek (10). Ezen említett hatásokon túlmenõen a 21- aminoszteroidok lipid-peroxil és phenoxi- gyökfogó tulajdonsággal is bírnak (11). A dehidroepiandroszteron (DHEA) szintén gátolja a vasfüggo lipid peroxidációt, és fékezi patkányokban az aorta falában történõ fatty streak képzodést, ugyanakkor fokozza a szuperoxid aniont lebontó enzim -szuperoxid dizmutáz, (SOD)- máj mitokondriumbeli termelodését, késlelteti az öregedés folyamatát, és redukálja a karcinogenek mitogén hatásait (93). A DHEA-nak preventív szerepet tulajdonít a szakirodalom az ateroszklerózis kifejlõdésével szemben, csökkent vérszintje fokozza a kardiovaszkuláris mortalitást (5). Célkituzések A szteroidok itt felsorolt, több támadáspontú antioxidáns képességének hátterében számos, eddig csak részben tisztázott mechanizmus állhat. A hormonálisan aktív korú nok védettsége a kardiovaszkuláris betegségekkel szemben, az ateroszklerózis szabadgyökös eredete és a fehérvérsejtek aterogenezisben játszott szerepe alapján kézenfekvonek látszott a neutrofil granulociták aktivitás változásának vizsgálata ennek megbízható markere a sejtekben található mieloperoxidáz enzim (MPO) aktivitása és mennyisége - szteroid hatásra. 20

In vivo vizsgálatok Izgalmas kérdésként merült fel számunkra, hogy a menopauza milyen hatással van a granulociták mieloperoxidáz aktivitására, illetve hogy az intracelluláris MPOaktivitás, illetve a plazma MPO szint értékében van-e különbség a hormonálisan aktív és a menopauzás nok, valamint a fiatal és az idos férfiak csoportjai között. Szükségesnek véltük továbbá megvizsgálni, vajon milyen változás következik be a neutrofil granulociták aktivitásában a noi hormon hatására. Tisztázni kívántuk, hogyan változik a MPO enzim intracelluláris aktivitása, illetve extracelluláris mennyisége hormonpótlást kapó, menopauzás nok esetében. A tesztoszteron és a prednizolon hatását az MPO termelésre szintén vizsgáltuk. In vitro kísérletek Annak tisztázására, hogy a mieloperoxidáz enzim milyen szerepet játszik a szuperoxid termelésben, egészséges önkéntesek izolált neutrofil sejtjeihez növekvo mennyiségu MPO-t adtunk, majd ezzel történo inkubációjukat követoen megmértük szuperoxid anion termelésüket. További in vitro kísérletekben vizsgáltuk az izolált neutrofil granulociták szuperoxid termelését MPO-gátlók és natrium-hipoklorit (az MPO által katalizált reakció végterméke) adására, valamint különbözo szteroidokkal való inkubáció után. Mértük továbbá, hogy az MPO-gátlók mennyiben módosítják a különbözo szteroidok hatását a granulociták szuperoxid termelésére. Módszerek I. Mérési eljárások A granulociták intracelluláris mieloperoxidáz-aktivitásának mérése A vérmintákban az intracelluláris enzimaktivitás mérése a Technicon H-3 hematológiai automatán történt (Bayer AG). A neutrofil sejtekhez H 2 O 2 -ot és a gyártó által javasolt kromogént adva precipitátum keletkezik peroxidáz jelenlétében. A festodés intenzitása a peroxidáz aktivitástól függ, amit a készülék a MPO tartalmú 21

sejtek abszorpciójának detektálásával mér. A sejtek egyenként egy optikus csatornán futnak végig, amelyben két detektor van. Az egyik a sejtek méretének szóródását érzékeli, így adva meg és ábrázolva az y-tengelyen az egyes sejtféleségek százalékos megoszlását, azaz a kvalitatív vérképet, a másik pedig az abszorpciót rögzíti, és vetíti az x-tengelyre. A megvilágítást Wolfram-lámpa biztosítja. Az eredményeket úgynevezett mean peroxidase index formájában (MPXI) adjuk meg, amely azt jelzi, hogy a vizsgált egyén neutrofil populációjának MPO-aktivitás átlaga mennyiben tér el az átlag népességnél talált nagyságtól (a normális érték +10 és 10 között mozog). A plazma mieloperoxidáz koncentrációjának mérése Az EDTA-t tartalmazó vákuumcsövekbe levett vérmintákat 2000/perc-es fordulatszámmal centrifugáltuk 20 percig. A felülúszókat lefagyasztottuk -20?C-on. A plazma MPO mennyiségének meghatározása ELISA-módszerrel történt (MPO-kit, Bioxytech-Oxis). Az eredményeket ng/ml-ben adtuk meg. A granulociták szeparálása A heparinizált vérmintát Ficollra történo felrétegezés és egy órás várakozás után 63 és 72%-os Percollra áthelyezve 25 percen keresztül 1530/perc-es fordulatszámmal centrifugáltuk 20?C-on. Az így különvált granulocitákat kétszer mostuk Hankspufferben, és centrifugáltuk 1200/perc-es fordulatszámmal. A cso alján összegyult sejteket néhány ml pufferral reszuszpendáltuk, majd Türk-oldat segítségével sejtszámolást végeztünk, és a törzsoldat sejtkoncentrációját úgy állítottuk be, hogy az inkubálás céljára szolgáló lemezen a sejtszám mintánként 500 000 legyen. A granulocitákból felszabaduló mieloperoxidáz mennyiségének mérése A granulociták szeparálása és a sejtszám beállítása után a sejtszuszpenziókat 90 percig 37?C-on inkubáltuk, majd pipettával leszívtuk a felülúszót, és azt az esetleges alakelemek eltávolítása céljából 10 percen át 1500/perc-es fordulatszámmal ismét centrifugáltuk. E felülúszókat -20?C-on lefagyasztottuk, és belolük választott idopontban meghatároztuk a MPO mennyiségét, amely a granulocitákból felszabaduló 22

enzimnek felelt meg. A MPO mennyiségének meghatározására ELISA-technikát használtunk. Coat -ként poliklonális anti MPO-antitest (Dako) került felhasználásra. MPO-standardként Calbiochem terméket alkalmaztunk. A szubsztrát összetétele TMB (tetrametilbenzidin), DMSO (dimetilszulfoxid), mátrium-perborát tartalmú foszfát puffer (Sigma) és 1%-os H 2 O 2 volt. Az eredményeket mu/ml-ben adtuk meg. A granulociták szuperoxid-termelésének mérése A granulociták szeparálása után a sejtszuszpenziókat a következokben leírtak szerint 2 órán át inkubáltuk különbözo anyagokkal (MPO, MPO-gátlók, szteroidok, natriumhipoklorit), majd mértük szuperoxid termelésüket Guarnieri és mtsainak (32) Jansson és mtsai (49) által módosított módszere szerint. A szuperoxid hatására redukálódó ferricitokróm-c-t (Sigma) fotometria segítségével mértük. A maximális szuperoxidtermelés az optikai denzitás változásaként (?OD) jelentkezett 5 perc elteltével (percenként mérve) attól kezdve, hogy a granulocitákat 10? M FMLP-vel (formil-met- Leu-Phe, Sigma) aktiváltuk. 23

II. Vizsgálati csoportok In vivo vizsgálatok Az intracelluláris MPO-aktivitás vizsgálata hormonálisan aktív és menopauzás nok, valamint fiatal és idosebb férfiak esetében Elso vizsgálatunkban klinikánk 135 random módon kiválasztott betegénél a - klinikailag egyébként is indokolt - laboratóriumi vérvételek során nyert minták egy részét használtuk fel az intracelluláris MPO-aktivitás mérésére. A vizsgálatból kizártuk azon betegeket, akiknek betegségük a fehérvérsejtek aktivációjával vagy szupressziójával, leukocitózissal vagy leukopéniával járt. Összehasonlításokat végeztünk a fiatal (30-45 éves) és idosebb (55-65 éves) nok és férfiak között. A plazma mieloperoxidáz koncentrációjának mérése hormonálisan aktív és menopauzás nok, valamint fiatal és idosebb férfiak esetében Az elozo vizsgálat folytatásaként 106 egészséges véradó vérmintáiból meghatároztuk a plazma mieloperoxidáz koncentrációkat. Szintén összehasonlításokat végeztünk a fiatal (20-40 éves) és idosebb (50-70 éves), nemdohányzó nok és férfiak között. A granulociták intracelluláris mieloperoxidáz-aktivitásának és a belolük felszabaduló mieloperoxidáz mennyiségének változása a hormonpótló kezelés hatására Következo vizsgálatunkban az intracelluláris mieloperoxidáz aktivitást és a granulocitákból felszabaduló mieloperoxidáz enzim mennyiségét vizsgáltuk a hormonpótlás megkezdése elott és a kezelés 13. napján 11 menopauzában lévo, nemdohányzó (48-64 éves) no vérmintáiban. E betegeknek a nogyógyász javasolt hormonpótló kezelést (Trisequens tabletta, Novo-Nordisk), és a terápiás, illetve a mellékhatások nyomonkövetésére levett éhgyomri, laboratóriumi vérvételek során nyert vérminták egy részét használtuk fel e vizsgálatokra (TUKEB 37/1995 sz. engedély) az elozo fejezetben ismertetett módon. A kezelés során a betegek 12 napig csak ösztrogént (1 mg ösztriol + 2 mg ösztradiol), ezután 10 napig ösztrogént és gesztagént kombinálva 24

kaptak (1 mg ösztriol + 2 mg ösztradiol + 1 mg noretiszteron-acetát), majd a ciklus utolsó 6 napjában az elso ösztrogénadag felét gesztagén nélkül. A vérvétel 12 napi ösztrogénterápia után, a gesztagén megkezdése elott történt. A második ciklus 13. napján 6 no esetében megismételtük a mérést. A tesztoszteron és a prednizolon hatásának vizsgálata az MPO termelésre Annak tisztázára, hogy a tesztoszteron is befolyásolja-e a granulocitákból történo mieloperoxidáz felszabadulást, munkacsoportunkból 7 önkéntes férfi vérmintáiból alapállapotban, illetve 12 napig tartó napi 3x40 mg tesztoszteron (Andriol, Organon) szedése után meghatároztuk a felszabaduló mieloperoxidáz enzim mennyiségét. Munkacsoportunk 4 további önkéntese 25 mg prednizolont kapott iv. (Di-Adreson F aquosum, Organon). Alapállapotban, illetve két órával az iv. prednizolon után meghatároztuk a granulociták intracelluláris mieloperoxidáz-aktivitását. In vitro vizsgálatok A mieloperoxidáz szuperoxid termelésben játszott szerepének vizsgálata A mieloperoxidáz szuperoxid termelésben játszott szerepének vizsgálatára 20 egészséges önkéntes (11 férfi, 9 no, 30-65 évesek) vérmintáiból szeparáltuk a granulocitákat a már ismertetett módon. Ezután mieloperoxidáz különbözo mennyiségeit adtuk a sejtszuszpenziókhoz a 70, 140 és 280 ng/ml mieloperoxidázkoncentráció eléréséhez. A kontroll szuszpenziókat és a három különbözo mieloperoxidáz koncentrációjú szuszpenziót (mindegyikbol kettot készítettünk) két óráig inkubáltuk 37 C-on. A granulociták szuperoxid-termelését mértük az elozo fejezetben leírt fotometriás módszerrel. A neutrofil granulociták szuperoxid termelésének vizsgálata MPO-gátlók és natriumhipoklorit adására In vitro kísérletsorozatunk következo lépéseként további önkéntesekbol szeparált granulocita szuszpenziókhoz 50 és 100?M koncentrációban MPO-gátló 4- aminobenzoésav hidrazidot (ABAH, Sigma), illetve 15 és 40?M koncentrációban 25

szintén MPO-inhibitor tulajdonsággal bíró indometacint (Sigma) adtunk. Az MPOgátlók különbözo koncentrációjával való két órás, 37 C-on történt inkubáció után szintén a granulociták szuperoxid termelését mértük. Egy további sorozatban a granulocita szuszpenziókat natrium-hipoklorittal (az MPO által katalizált reakció végterméke) inkubáltuk két órán át, 37 C-on, három különbözo koncentrációban (1, 10 és 100? M natrium-hipoklorit), majd mértük szuperoxid termelésüket. A neutrofil granulociták szuperoxid termelésének vizsgálata különbözo szteroidok hatására Utolsó kísérletsorozatunkban az önkéntesekbol szeparált granulocita szuszpenziókat különbözo szteroidokkal inkubáltuk 2 órán át. 10-7 M koncentrációban 17?-ösztradiollal (Sigma), progeszteronnal (Sigma), tesztoszteronnal (Fluka), hidrokortizonnal (Sigma), d-aldoszteronnal (Sigma) és kortexolonnal (Sigma), valamint 10-5 M koncentrációban dehidroepiandroszteronnal (DHEA, Sigma) és dehidroepiandroszteron-szulfáttal (DHEAS, Sigma). Ezután mértük szuperoxid termelésüket fotometriás módszerrel. Mértük továbbá, hogy az MPO-gátlók hozzáadása mennyiben módosítja a különbözo szteroidok hatását a granulociták szuperoxid termelésére (6.-7. táblázat). III. Statisztikai analízis Az MPXI populációs adatok kiértékelésére Mann-Whitney U tesztet alkalmaztunk. A hormonpótlást kapó menopauzás nok eredményeinek megítélésére F próbát követoen student t próbát és Wilcoxon tesztet végeztünk. Annak vizsgálatára, hogy a hormonpótlást követoen tapasztalható MPXI és MPO eltérések nem függenek-e össze esetleges fehérvérsejt szám emelkedéssel, lineáris regressziót használtunk. A kívülrol hozzáadott MPO hatására jelentkezo szuperoxid anion eltérések elemzésére F próbát követo t tesztet, variancia analízist és Tukey s post hoc tesztet alkalmaztunk. Az ABAH-indometacin-Na hipoklorit adatok statisztikai értékelésére ANOVA módszert és LSD post hoc tesztet használtunk. A plazma MPO koncentrációk és a tesztoszteron illetve prednizolon kezelés utáni MPO értékek feldolgozásánál student próbát végeztünk 26