SZAKDOLGOZAT. Hidroxiapatit alapú nanostruktúrális biokompatibilis kompozitok előállítása és vizsgálata. Tóth Mihály

SZAKDOLGOZAT Hidroxiapatit alapú nanostruktúrális biokompatibilis kompozitok előállítása és vizsgálata Tóth Mihály Témavezető: Dr Balázsi Csaba Osztályvezető MTA TTK MFA, Kerámia és Nanokompozitok Osztály Tanszéki konzulens: Dr Hárs György egyetemi docens BME Fizikai Intézet, Atomfizika Tanszék BME 2012 1

2

Tartalomjegyzék Önállósági nyilatkozat...4 Bevezetés 5 Célkitűzés 6 A hidroxiapatit előállítása és vizsgálata.6 Irodalmi áttekintés.6 Kiindulási anyagok és módszerek..6 Vizsgálatok.9 XRD..10 FTIR..10 SEM..13 Eredmények. 14 Electrospinning. 14 A módszer és a berendezés.. 14 Aceton-ecetsavas minták...16 Aceton-izopropanolos minták 22 Konklúzió..24 Publikációk, konferenciák... 24 Összefoglalás 25 További tervek.. 26 Köszönetnyilványitás... 27 Irodalomjegyzék 28 Mellékletek 3

Önállósági nyilatkozat Alulírott Tóth Mihály kijelentem, hogy jelen értekezést önállóan készítettem, az abban foglaltak a hivatkozott forrásokon és szerzőkön kívül kizárólag saját munkám eredménye. Tóth Mihály Budapest, 2012. június 7. 4

Bevezetés A hidroxiapatit (HAP) a csontok és a fogak egyik fő alkotóeleme. Jó mechanikai tulajdonságai és biokompatibilitása miatt ideális csontokban keletkezett sérülések javítására, pótlására, implantátumok készítésére. A mi célunk nanoszerkezetű, nagy fajlagos felületű HAP szálak előállítása, amelyet később kerámia mátrixba juttatva, növelve ezzel a biokompatibilitását, csontimplantátumként lehet majd felhasználni. A dolgozatom első része más-más eljárással előállított HAP-nanostruktúrák vizsgálatáról szól. Az előállításnál "soft chemistry" módszereket alkalmaztunk, azaz nem használtunk mérgező anyagokat és nem termeltünk nem újrahasznosítható hulladékot, ugyanakkor egy kidobandó mellékterméket hasznosítunk újra. A kiindulási alapanyag hőkezelt tojáshéj illetve kagylóhéj volt, az őrlést nagy teljesítményű attritorral és bolygó golyósmalommal végeztük, a mintáinkat utólagosan különböző hőmérsékleten hőkezeltük. A végső mintáinkat Röntgendiffrakciós (XRD) és Fourier-transzformációs infravörös (FTIR) spektrumanalízissel továbbá pásztázó elektronmikroszkóp (SEM) felvételekkel elemeztem. A második rész electrospinning technológiával készített HAP tartalmú polimer szálak vizsgálatával foglalkozik. Az electrospinning (elektro-fonás) eljárás régóta ismert mikro és nano mérettartományba eső polimer szálak létrehozására. A kívánt nagy fajlagos felületet HAP nanoszolák létrehozásával akarjuk elérni, ezért polimer- HAP keverék nanoszálakat hoztunk létre, amelyek hőkezelésével remélhetőleg megkapjuk a kívánt csak HAP tartalmú struktúrát. A minták elemzését SEM-mel, és a benne található energia-diszperziós spektroszkópiával illetve Röntgen- analízissel (EDS) és az ebből létrehozott elemtérképpel (Element mapping) végeztük el. A preparációkat és a vizsgálatokat az MTA Természettudományi Kutatóközpont Műszaki Fizikai és Anyagtudományi Intézet, Kerámiák és Nanokompozitok osztályon végeztük, kivétel a XRD (MTA TTK MFA, Nanoszerkezetek osztály) és a FTIR (MTA Kémiai Kutatóközpont, IR és Raman Spektroszkópiai Laboratórium) elemzést. 5

Célkitűzés A szakdolgozatom célja hidroxiapatit nanoszálak létrehozása, ezek felhasználásával bioaktív, kerámia alapú csontimplantátumok létrehozása, továbbá adalékok hatásának vizsgálata a szerkezetre, morfológiára. Mivel nem olyan sok ideje kezdődött a projekt, ezért csak a nanoszálak létrehozásával, annak is az első lépéseivel tudtunk foglalkozni. Először nanoszemcsés HAP port kell létrehoznunk természetes alapanyagokból lágy kémiai (soft chemistry) módszerekkel. Ezt követően electrospinning módszerrel magas HAP tartalmú, kis átmérőjű polimer szálakat hozunk létre, amelyekből hőkezeléssel eltávolítjuk a polimert és remélhetőleg sikerül jól kristályosodott, mikrométer alatti átmérőjű HAP szálakat készíteni. A hidroxiapatit előállítása és vizsgálata Irodalmi áttekintés A hidroxiapatit az emberi és állati csontok fő szervetlen alkotóeleme [1,2]. Az emberi csont összetételét tekintve 50-70 % HAP, 30-50 % kötőszöveti fehérje (főként kollagén I, de tartalmazhat kollagén II-t is) és 1-5% sejtes elem. A HAP mechanikai tulajdonságait tekintve kerámia, a csontot ezért lehet úgy kezelni, mint egy kerámiafehérje kompozitot, ahol a HAP adja meg a csontnak a mechanikai stabilitását, a fehérje pedig a mátrix, amely összetartja, illetve a nyíró és húzó feszültségeket kioltja (a sejtes résztől most eltekintettünk). Biológiai szempontból 2 nagyon kedvező tulajdonsága van, amelyek miatt kiváló implantátumok készíthetők belőle, ez a bioaktivitás [3] és a biokompatibilitás [4]. A hidroxiapatit előállítható több féle anyagból: korallból [5], tojáshéjból [6], kagylóhéjból [7] és természetesen szintetikus anyagokból is. Az előállítási módszerek is elég széleskörűek: sol-gél módszer [8], kicsapatás [9], emulziós technikák [10,11], mechanokémiai módszerek [12], elektrokémiai leválasztás [13], és hidrotermalis folyamatok [14] során is előállítottak HAP-ot. Kiindulási anyagok és módszerek A hidroxiapatit kémiai képlete Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2. Az előállításához tehát kalcium-, és háromszorosan ionizálható foszfát-forrásra van szükség. A foszfátot ortofoszforsav szolgáltatja, a kalciumhoz pedig 2 féle alapanyagot használtunk. Az egyik tojáshéj, amit a KFKI menza szolgáltatott, a másik pedig kagylóhéj, amely egy Fekete-tengerben élő kagyló külső borítása. A tojáshéj összetételéről tudjuk, hogy 94%-ban kalcium-karbonát, 1% kalcium-foszfát, 1% magnézium-foszfát és egyéb szerves anyagokból (4%), illetve nyomelemekből áll. A kagylóhéj összetételéről nem tudunk ennyire pontos információkat, de ez is túlnyomó részt kalcium vegyületből áll. A HAP előállításához csak a kalciumra van szükség, ezért a többi összetevőt el kell távolítani. Erre a legegyszerűbb módszer a kifűtés. A nyers tojáshéjat illetve kagylóhéjat kemencébe raktuk, és elkezdtük fűteni. 300 fok környékén színbeli 6

elváltozást tapasztaltunk, az anyag fekete lett, ami a széntartalmú szerves anyagok égésére, kokszosodására utal. Ez a feketedés 750 o C körül megszűnt, és a CaO-ra jellemző fehérbe csapott át. A kifűtés utáni anyag túlnyomó részt CaO, kisebb szennyeződések nem számottevő mennyiségben pl.: Mg, S lehetnek benne. A fűtést tokos kemencében végeztük 50 fokonként kivéve és megvizsgálva, 900 o C-ig. A hőkezelés után a termékekről SEM felvételt készítettünk, amelyen látszik, hogy a tojáshéjban 2 mikrométer, a kagylóhéjban 3 mikrométer körüli a szemcseméret. 1. ábra: Tojáshéj és kagylóhéj SEM felvétele A nanoszekezetű hidroxiapatit előállítását mechanokémiai őrléssel kíséreltük meg. Ehhez 2 különböző malmot alkalmaztunk: Az egyik egy Fritsch Pulverisette Mill bolygómalom, a másik pedig egy DMQ nagy teljesítményű attritor. A bolygó golyósmalomnál az őrlőtégelyek egy forgó főkorongon excentrikusan elhelyezve saját tengelyük mentén forognak, amelyekben vannak az őrlőgolyók és az őrlendő anyag is. Homogén mintákat lehet kapni vele, de az őrléshez használt energia viszonylag kicsi nem csak az attritorhoz viszonyítva, hanem egyéb (vibrációs, rázó) malomfajtákhoz képest is. Az attritor egy olyan malom, amelyet nagy energiájú mechanikai vagy mechanokémiai őrléshez használnak nagyobb mennyiségű porok előállítására. Egy rögzített, vízhűtött tégelyben van az őrlendő anyag az őrlőgolyókkal együtt, amelyet egy nagy sebességgel forgó, karokkal, vagy tárcsákkal rendelkező tengely kever. Általánosan elmondható, hogy homogén, nano méretűre diszpergált anyagok állíthatók vele elő nedves és száraz üzemmódban is. A bolygómalmos őrlésnél 1:1 tömegarányban kevertük össze a hőkezelt kiindulási anyagot és a foszforsavat, így érhető el a hidroxiapatitban lévő 1,67 Ca/P arány, a mintákat 10 órán át őröltük. Az alkohol mennyiségét úgy szabályoztuk, hogy az oldat ne legyen túl híg, de az őrlőgolyók szabadon tudjanak mozogni. Az attritornál a komponenseket hasonló módon kevertük össze, ehhez öntöttünk még etil-alkoholt hígítási céllal, amelyet itt is folyamatosan pótoltunk. A mintáinkat 5 órán át őröltük. A hozzáadott alkohollal 100 g anyagot (tojás/kagyló+foszforsav) 175 ml-re hígítottunk, és őrlés közben 70 ml-t adtunk még hozzá. Az összes mintát őrlés után 7

főzőlap és infralámpa segítségével kiszárítottuk, hogy a felesleges alkohol és a foszforsavból visszamaradt víz elpárologjon. A kapott porokat még egy nano méretű rácsokkal rendelkező szitán is átszűrtük. 2. ábra: Az őrlésre használt bolygómalom és attritor 3. ábra: A kiinduláshoz használt tojáshéj nyersen, hőkezelés után, őrlés és szárítás után 8

Vizsgálatok A vizsgálatokat 4 mintán végeztük el, kiindulási alapanyag (kagylóhéj és tojáshéj) és az őrlés módjától (bolygómalom és attritor) függően. A kapott mintákat még utólagosan hőkezeltük, ugyanis a mechanokémiai folyamat és a szárítás után többféle kalcium illetve foszfát származék lehet bennük. A hőkezeléseket a fentebb említett kemencében 2 o C/perc fűtési gyorsasággal, 2 órás állási idővel 100-tól 900 o C-ig 100 fokonként végeztük. A kapott anyagokat három módszerrel elemeztük: Fourier transzformációs infravörös spektroszkópiával a kialakult kémiai kötéseket, pásztázó elektronmikroszkóppal a morfológiát és Röntgen-diffrakcióval a kristályszerkezetet. Itt nem tüntetem fel az összes különböző hőmérsékleten hőkezelt minta adatait, csak azokat, ahol lényeges szerkezeti változás történt. Ezek a hőmérsékletek 0, 600, 800 és 900 o C. A mintáink elnevezései: Minta neve Alapanyag Őrlés módja Rpm Őrlés ideje (h) Alapanyag /H 3 PO 4 (wt%) EA000 tojáshéj Attritor 4000 5 50:50 - EA600 600 EA800 800 EA900 900 SA000 kagylóhéj - SA600 600 SA800 800 SA900 900 EB000 tojáshéj Bolygó 350 10 - malom EB600 600 EB800 800 EB900 900 SB000 kagylóhéj - SB600 600 SB800 800 SB900 900 Hőkezelés hőmérséklete ( o C) 1. táblázat: A minták elnevezése és főbb adataik 9

XRD A Röntgen-diffrakciós méréseinket egy réz anódos Kα átmenetesbruker AXS D8 Discover X-Ray Diffractometer géppel végeztük. A grafikonokat a jobb átláthatóság érdekében a 2. Mellékleten tüntettem fel. Az ábrákon jól kivehető, hogy adott malomnál és hőmérsékletnél nem tapasztalható nagy eltérés a végtermékek között, annak függvényében, hogy a kiindulási anyag tojáshéj vagy kagylóhéj volt. Az attritoros mintáknál már hőkezelés nélkül is kialakultak a HAP kristályok, míg a bolygómalmos mintánál ez a folyamat a 800 o C-on kezelt mintánál kezdődik el. A hőkezeletlen bolygómalmos mintáknál a kalcium-hidroxid és kalcium-hidrogénfoszfát mellett a foszforsav kristályok találhatóak meg jelentős mennyiségben. 600 fokon az összes mintánál megfigyelhető az addig nem kimutatható kalcium-karbonát vonalainak az intenzitás növekedése. A bolygómalmos mintánál kalcium-oxid is kialakul, miközben az eddigi anyagok mennyisége csökken. 600 o C fölött gyakorlatilag nincs krisztallográfiai különbség az adott módszerrel készült minták között, csak HAP-ból és trikalciumfoszfátból állnak, amelynek aránya a hőmérséklet növekedésével a HAP kristályképződés felé tolódik el. FTIR A vizsgálatokat egy Varian Scimitar FTIR spectrometer segítségével és a rajta lévő széles sávú MCT detektorral végeztük. Az Attenuated total reflection (ATR) technológiát egy gyémánt optikai elemmel felszerelt Golden Gate ATR segítségével alkalmaztuk, a minták elemzéséhez Varian ResolutionPro 4.0 software-csomagra volt szükség [16-20]. A 2 attritoros minta között nincs jelentős különbség a spektrumok alapján, ami várható is volt. Már melegítés nélkül is kialakult a karbonatált hidroxiapatit fázis. A CO 3 a PO 4 helyére szubsztituált (B-típusú karbonát, tetraéderes elhelyezkedésben). Kis mennyiségben van még CaCO 3 és CaO is jelen. Felületi -OH is jelen van, valószínűleg a CaO-ra adszorbeál. A spektrumban még az alkohol sávjai is látszanak. Hevítve 600 C-on kialakul egy, a biológiai apatihoz hasonló fázis (gyengén kristályos karbonatált HAP), majd tovább melegítve egy jól kristályosodott HAP képződik. Hevítéssel a karbonát-tartalom csökken ugyan, de nem tűnik el teljesen (mint pl. a csont esetében), sőt - hevítés hatására - a HAP-ban az -OH helyekre is szubsztituál a karbonát. Számszerűleg a hőkezeletlen mintában a gyengén kristályos apatit fázis a domináns 3 PO 4 : 1021 és 1087 cm -1 ; 1 PO 4 : 962 cm -1 ; doublet 4 PO 4 : 599 és 562 cm -1 csúcsokkal. A karbonát csúcsok: 1550-1350 cm -1 ( 3 ), 873 cm -1 ( 2 ). A felületi -OH csúcs: 3644 cm -1, ez hőkezeletlen mintában nincs jelen. Az attritoros minták spektrumát az 1. és a 2. grafikon mutatja. 10

1. és 2. grafikon: Az EA és az SA minták FTIR spektrumai 11

A 2 bolygómalmos mintában sem volt nagy különbségőrlés során főként CaHPO 4 fázis, majd melegítés során Ca 3 (PO 4 ) 2 alakul ki. Nagy mennyiségű Ca(OH) 2 is van a rendszerben. Gyakorlatilag a szobahőmérsékletű őrlés mellett nem képződik apatit. 800 C hevítés után jelennek meg a HAP jellegzetes IR sávjai, egy jól kristályosodott apatit-fázisra utalva. Különbség viszont a karbonátosodásnál van: kis mennyiségű szabad CO 3 mellett B-típusú karbonát alakul ki. A kagylós mintánál az apatit-fázis kialakulása később, csak 900 C felett komplett. Valószínűleg a tojásos és kagylós mintáknál eltér a CaCO 3 :H 3 PO 4 arány. Hőkezelés során itt is megjelennek a felületi OH kötések. A csúcsok az attritor malomnál ismertetett értékeket veszik fel itt is, ezt most nem részletezem ismét. 12

3. és 4. grafikon: Az EB és az SB minták FTIR spektrumai SEM A vizsgálatokat JEOL IC 848-2 SEM géppel készítettük. Mivel ezeknél a képeknél a morfológiára vagyunk kíváncsiak fontos, hogy jó felbontásban legyenek láthatóak, ezért a dolgozat végén a 2. mellékletben találhatóak. A felvételek alapján látható az előző mérésekből származó tapasztalat itt is, hogy a morfológiának nincs függése a kiindulási alapanyagtól. A hőkezeletlen és a 600 fokon hőkezelt minták szerkezetében eltérés nem tapasztalható egyik mintánál sem, az attritoros minták átlagos szemcsemérete 50-300 nanométer, a szemcsék láthatóan nagy porozitásúak, míg a bolygómalmos mintáknál, a használt nagyításban csak 1-2 szemcse felülete jeleníthető meg, a szemcseméret 2 és 4 mikrométer között mozog, a felületük inkább csak érdes, mint porózus. 800 és 900 fokon látható a kristályosodási folyamat részeként a szemcsék egymáshoz tapadása. A bolygómalmos mintánál ennek folyománya, hogy a szemcseméret 2-7 mikrométer körülire növekszik, a felületi érdesség csökken, így a fajlagos felület is, míg az attritoros mintáinknál inkább csak a 100 nanométer alatti szemcsék eltűnését 13

tapasztaltuk, ezek hozzánőttek a nagyobb szemcsékhez, a porozitás megmaradt, viszont a szemcsék néhol összeálltak 1-2 mikrométeres tömbökbe, amelyek valószínűleg sem kémiailag, sem mechanikailag nem túl stabilak, az ultrahangos rázás szétbontja őket. Eredmények Mindhárom vizsgálati módszer megerősítette, hogy ugyanolyan őrlési beállításnál nincsen szignifikáns különbség a végtermékek között attól függően, hogy a kiindulási anyag tojáshéj vagy kagylóhéj. Az attritorral készített minták egyenletesebb, nanoméretű szemcseméret-eloszlást mutatnak. Itt az átlagos szemcseméret párszáz nanométer, míg a bolygómalmos minták nagyobb, inkább mikrométers mérettartományba esnek jelentős szórással. Az XRD elemzésből látszik, hogy a hőkezeletlen mintákban milyen más kalcium és foszfát származékok találhatóak. Az őrlési módszerek között itt is van különbség, az attritornál már rögtön HAP fázisok találhatóak a mintában, míg a bolygómalomnál kalcium-hidroxid és kalcium- hidrogénfoszfát a fő összetevő. A hőkezelés hatására 600 fokon karbonát ionok épülnek be a mintákba, amelyek a hidroxid és hidrogénfoszfát szubsztituenssekkel együtt 800 fokon eltűnnek, 900 fokon pedig már szinte kizárólag nanokristályos HAP alkotja a mintáinkat a minimális mennyiségben jelenlévő trikalcium-foszfát mellett. Ezen túl még felületi OH csoportok is keletkeznek a mintán, és a karbonát ionok sem tűnnek el teljesen, csak nem kristályos formában vannak jelen 800 és 900 fokon. Electrospinning A módszer és a berendezés Az electrospinning egy régóta ismert, de csak mostanában elterjedt módja a polimer szálak készítésének. A módszer lényege, hogy egy fecskendő kifolyására rögzített tű és egy target közé magas feszültséget kapcsolva a kifolyó oldatra töltés kerül, amely átviszi őt a targetre. A repülési idő alatt az oldószer elpárolog, és a polimerből szál képződik (ha nem képződik szál, akkor electrospraying a folyamat neve). A berendezés viszonylag egyszerű, és alkalmas arra, hogy a polimert prekurzorként használva oldhatatlan molekulákat is tudjunk nanoszálba vinni. Szintén használható olvadék polimerből készült szálak készítésére, így nem kell oldószer. A készült szálak rendezetlenül kerülnek a targetre, a szálátmérő rengeteg mindentől függ, 100 nanométerestől milliméteres nagyságig változhat a paraméterektől függően. Fontos megemlíteni az úgynevezett bead képződést: a szálak nagyságrendekkel megvastagodnak, és gyöngyszerű formációkat hoznak létre, amik jelentősen csökkentik a fajlagos felületet (a későbbi képeken majd látható lesz). Ezért az így készült szálak jellemzésére a szálvastagságot és a beadek számát és méretét szokták használni. Ezek a jellemzők rengeteg paramétertől függenek, amelyek között 14

még ráadásul elég sok korreláció is van pl.: viszkozitás hőmérsékletfüggése. A paraméterek között vannak, amiket a mi berendezésünkkel nem tudunk befolyásolni: nedvességtartalom, hőmérséklet, nyomás, jelenlévő atmoszféra, polimer molekulatömege. Vannak, amelyek közvetve befolyásolhatók: viszkozitás, felületi feszültség, vezetőképesség, dielektromos állandó. És vannak, amelyek közvetlenül: a kifolyási sebesség, a feszültség, a tű átmérője, a tű és a target közötti távolság. 4. ábra: Az electrospinning berendezés működési vázlata A cellulóz acetátról (CA) tudjuk, hogy részben vagy teljes egészében O- acilezett cellulóz, vízben és etil-alkoholban gyakorlatilag nem oldódik, legjobb oldószere az aceton, de ecetsavban is kiválóan oldódik. A cellulóz miatt egy biológiailag könnyen lebomló polimer. A használt berendezésünk egy KDScientific KDS202-CE electrospinning gép volt a hozzá tartozó fecskendőkkel. Az orvosi tűk közül néhány hegyét merőlegesre csiszoltuk, hogy vizsgálhassuk, hogy kifolyási pont alakjának van-e hatása a mintára. A mintáinkhoz cellulóz-acetát volt a használt polimer. A hidroxiapatit kémiailag nem túl reakcióképes az elterjedt oldószerekkel ezért az oldás helyett diszpergálással kellett kolloid oldatba vinni. Mivel a diszpergált kolloid HAP-polimer oldat fizikai és kémiai tulajdonságai nem szignifikánsan térnek el a sima cellulóz-acetát oldat ugyanilyen tulajdonságaitól, ezért az eddig meglévő irodalomban próbáltunk megfelelő oldószert találni a polimerhez. Az egyik kísérlet alapján [15] kipróbáltuk a desztillált víz-ecetsav keveréket, de ezzel a keverékkel nem sikerült polimer szálakat létrehozni, illetve 75 w/w % aceton alatt a CA kicsapódik az oldatból. Ez alapján az első kísérleteinket aceton-ecetsav keverékkel kezdtük. 15

Aceton-ecetsavas minták Mivel tiszta acetonból nem lehet jól CA szálakat húzni, ezért egy másik jó oldószerét adtuk a keverékhez. 80 w/w % aceton, 20 w/w % ecetsav oldószer és az ehhez tartozó 20 w/w % CA/oldószer összetételű csináltunk először HAP-mentes mintákat. Megfelelő szálak képződését tapasztaltuk 10-22 kv feszültség és 8-20 cm távolság beállításnál. A vizsgált mintáink végül 12 cm-es target-tű távolsággal és 15 kv feszültséggel, 0,8 mm-es tűátmérővel és 0,12 ml/perc kifolyási idővel lettek elkészítve, ugyanis ilyen beállításoknál lehetett viszonylag egyenletes szálvastagságot kapni. Ez után készítettük el a HAP-ot is tartalmazó szálakat tartalmazó mintát, amelynek kiindulási összetétele: 0,8g HAP (EA900), 1,2g CA, 8g aceton, 2g ecetsav. Electrospinning előtt először az acetont kevertük össze a cellulóz-acetáttal és külön az ecetsavat a HAP-tal. Az utóbbi keveréket egy ultrahangos zúzásnak tettük ki kétszer 40 másodpercre. A kapott szálakról a SEM képeket JEOL IC 848-2 SEM -al készítettük, az EDS elemzések pedig Jeol JSM- 25-SIII SEM -al és a rajta lévő Bruker Quantax EDS berendezéssel készültek. 16

17

5. ábra: SEM képek a készült mintáról soronként ugyanarról a helyről különböző nagyításban. A bekarikázott részek bead-eket jelölnek. 6. ábra: EDS spektrum az aceton-ecetsavas mintáról 18

Az EDS elemzés alapján látható, hogy a Ca, P, O, C csúcsok dominálnak, Mg és S szennyeződés van jelen. Az Al csúcs a mintafedő gombából származik, a Si csúcs pedig a mintahordozó lapka miatt van a spektrumban. Az utóbbi azért ilyen intenzív csúcs, mert ahhoz, hogy az elemtérkép szemléletes legyen ritka szövésű minta kellett. 7. ábra: Elemtérkép a szálakban található Ca, O, P eloszlásáról, viszonyításként a terület SEM felvétele. 19

8. ábra: Összesített elemtérkép ugyanonnan A SEM képeinken nagyon jól látszik, hogy bár a szálak átmérője viszonylag egyenletes eloszlású, 500-1000 nm, rengeteg bead is létrejött, illetve párszáz mikrométeres gömbök is képződtek. Mivel az egyik célunk minél nagyobb fajlagos felület elérése, és ezek a képződmények egy nanoszálhoz képest nagyságrendekkel nagyobb fajlagos felülettel rendelkeznek, ezért ezek számát mindenképp redukálni kell. Az EDS spektrum megerősítette, hogy a HAP az electrospinning során belekerült a CA szálakba, nem ült ki a fecskendőben. Az elem térképen viszont jól látható, hogy az eloszlása nem egyenletes, a beadekben felhalmozódik, illetve a szálakban nem ugyanolyan eloszlással található meg. Néhol 1-2 mikrométeres cluster keletkezett vannak, máshol egyáltalán nem mutatható ki Ca vagy P jelenléte. Az O azért egyenletes eloszlású, mert a cellulóz-acetát is tartalmazza. Mivel ezek a szálak nem felelnek meg olyan feltételeknek, hogy egyenletes legyen az eloszlása a HAP-nak a polimer szálban, bead-mentes legyen a minta, illetve a szálátmérő minél kisebb legyen, ezért megpróbáltunk a változtatható paramétereken állítani. Az alábbi paramétereket tudtuk állítani: 1. Feszültség: ha a többi paraméterünkön nem változtattunk 8 kv alatt nem volt akkora a feszültség, hogy átvigye az oldatot/szálakat a targetre, 10 kvon nem volt észrevehető különbség, 25 kv-on azonban már vékonyabb szálak és sokkal több bead képződött. 2. Távolság a tű és a target között: Nem nagyon volt befolyással a szálak morfológiájára, túl kis távolságnál (5cm) nem párolgott el az oldószer, ezért a minta összefolyt, nagy távolságnál (>25cm) pedig a szál nagyon gyakran 20

megszakadt, ezért szemmel is jól látható, körülbelül fél mm átmérőjű gömbök keletkeztek. 3. Tű átmérője: Tapasztalataink szerint a tű átmérője és alakja nem volt jelentős befolyással a szálak morfológiájára. A kipróbált tűink orvosi tűk voltak 0,2; 0,4; 0,5; 0,8; 1 mm átmérővel és mindegyikkel csináltunk mintát úgy is, hogy a hegye a kifolyási irányra merőlegesre lett csiszolva. A 0,2 mm-es tű könnyen eltömődött, ezért ezzel nem sikerült mintákat létrehozni, de a többi minta között nem találtunk észrevehető különbséget. 4. Kifolyás sebessége: Jelentős hatása volt a mintákra, bár nem a morfológiájukra. Kis kifolyási sebességnél ugyanis a tű nagyon gyakran beszárad, ami miatt le kell állítani a gépet, letisztítani a tűt, majd újraindítani. Nagyobb kifolyási sebességnél viszont nem jut elég töltés az oldatra, ezért a szál gyakran megszakadhat, elkezd fröcskölni. A kifolyási sebesség maximumát a tű átmérője és az oldat viszkozitása határozza meg nagy részben. 5. Oldat összetétele: Sok preparáció tapasztalata alapján a HAP/CA arányt egy adott szintig lehet növelni, fölötte vagy nem is lehet az oldatból szálakat képezni, vagy többlet HAP kiülepszik már a fecskendőben. Ez az arány tapasztalataink szerint 40/60 és 50/50 w/w között van, mi az összes mintánknál 40/60-at használtunk. Így amiket változtattunk az oldat összetételében: 1. Töménység: Elég komplex hatása volt a mintára. 10 w/w % szilárd anyag alatt nem sikerült szálakat létrehozni, továbbá a viszkozitás csökkenés miatt, mivel a HAP diszpergálva volt az oldatban rögtön a fecskendőbe töltés után kiülepedett. Picit töményebb oldatnál már sikerült nanoszálakat létrehozni, de a HAP még mindig nagyon gyorsan ülepedett, és emiatt nem volt benne a szálakban, és a szálképződés is gyakran megszakadt és inkább cseppek formájában került a targetre. Túl tömény oldatnál bedugult a tű, illetve sok megszilárdult Taylor-cone keletkezett, ami gyakori újraindításhoz vezetett. Az ideális működési paraméterek 15 és 25 w/w % szilárd anyag(hap+ca)/oldószer aránynál vannak, a töménység növelésével a szálátmérő és egyenletesség nő, a beadek száma pedig csökken, pl.: 22 w/w %-os mintánál a bead-ek szinte teljesen eltűntek, de az átlagos szálátmérő 5 mikrométer lett. 2. Aceton-ecetsav arány: A tapasztalataink szerint 30 w/w %-os ecetsav arány fölött már nem működött az electrospinning, ugyanezt tapasztaltuk az 5 w/w % alattiakra is..a köztes tartományban 20 w/w % körül egyenletes átlagos szálátmérőt kaptunk, távolodva ettől az értéktől pedig nagyságrendekkel nőtt mind az átmérő, mind a bead-ek, mind a szabad szemmel is látható párszáz mikrométer átmérőjű gömbök száma. 21

A mintakészítés konklúziója, hogy leginkább az oldószer összetétele befolyásolja a kapott termék morfológiáját. Az acetont meghagytuk a jó oldhatósága miatt, és az ecetsav helyett más oldószert kerestünk. Aceton-propanolos minták Az izopropanol dielektromos konstansa, viszkozitása, vezetőképessége negatívabban befolyásolja a bead képződést. Itt is először HAP-mentes mintákkal kísérleteztük ki a legmegfelelőbb oldatösszetételt és beállításokat. Itt figyelembe vettük az ecetsavas mintánál tapasztalt változtatható paraméterektől való függést. Így az alábbi összetételű mintából készítettük a felvételeinket:0,9 g CA, 0,6 g HAP, 1 g izopropanol és 4 g aceton ilyen beállításokkal: 15 cm-es target-tű távolság, 10 kv feszültség, 0,8 mm-es tűátmérő és 0,10 ml/perc. A minta előkészítése ugyanúgy zajlott, mint a korábbi mintánál. Az elemzéseket a fentebb említett 2 elektronmikroszkóppal végeztük el. A SEM képekből kiszűrhető, hogy HAP itt már jobban el van oszlatva a CA szálakban, mint az előző mintában. Az átlagos szálátmérő nagyon egyenletesnek tekinthető, 1000±150 nm. A bead-ek száma nem jelentős, a nagy gömbök eltűntek. Az EDS spektrum alapján készült elemtérképeken nanométeres átmérőjű HAP van eloszlatva a szálakban teljesen egyenletesen. 9. ábra: EDS spektrum az aceton-propanolos mintáról 22

Az EDS elemzés alapján látható, hogy itt is a Ca, P, O, C csúcsok dominálnak, Mg és S mellett Na szennyeződés van jelen. 10. ábra: Elemtérkép a szálakban található Ca, O, P eloszlásáról, viszonyításként a terület SEM felvétele. 23

11. ábra: Összesített elemtérkép ugyanonnan Konklúzió Az aceton-izopropanolos minták minden tekintetben felülmúlták az acetonecetsav oldószerrel készülteket. Az átlagos szálátmérő bár valamivel nagyobb, de sokkal kisebb a szórása, a HAP diszperzója a CA szálakban egyenletes mind méretben, mind lokális eloszlásban. A bead képződés minimális, nincsenek összecsomósodások. A készült mintákban kimutathatók a tojáshéj nyomelemei, amelyek a biológiai kísérletek során inkább a csontnövekedéshez szükséges ionforrásként szolgáltak, mint káros szennyeződésként. Publikációk, konferenciák Konferenciák: 2009 BME Természettudományi Kar Tudományos Diákköri Konferencia, Kísérleti Fizika szekció: Dicséret Dolgozat címe: Hidroxiapatit alapú nanostrukturális biokompatibilis kompozitok előállítása és vizsgálata 24

2009 VII. Országos Anyagtudományi Konferencia Poster and short oral szekció Előadás címe: Hidroxiapatit nanostruktúrák előállítása különböző őrlési módszerekkel 2010 XII. Országos Felsőoktatási Környezettudományi Diákkonferencia, Környezetfizika szekció 2010 BME Gépészmérnöki Kar Tudományos Diákköri Konferencia, Polomertechnika szekció: I. helyezés, Alapítványi különdíj 2011 Országos Tudományos Diákköri Konferencia, Természettudományi szekció Nanotechnológia szakirány IV. helyezés Publikációk: 2010 Production of polymer nanofibers containing hydroxyapatite by electrospinning Mihály Tóth, Gréta Gergely, István Endre Lukács, Ferenc Wéber, Attila Lajos Tóth, Levente Illés, Csaba Balázsi Materials Science Forum, Materials Science, Testing and Informatics V 2010 Processing of nano hydroxyapatite from eggshell and seashell Gréta Gergely, Ferenc Wéber, Mihály Tóth, Attila L. Tóth, Zsolt E. Horváth, Csaba Balázsi Materials Science Forum, Materials Science, Testing and Informatics V 2010 Nanoszerkezetű hidroxiapatit-biopolimer kompozitok előállítása és vizsgálata Tóth Mihály, Gergely Gréta, Wéber Ferenc, Lukács István Endre, Tóth Attila L., Horváth Zsolt E., Balázsi Csaba Anyagvizsgálók lapja, Vol. 20. évf. - 2010/1 2011 Hydroxyapatite - biopolymer mats by electrospinning G. Gergely, I. E. Lukács, M. Tóth, L. Illés, F. Wéber, Cs. Balázsi Cells and Materials Összefoglalás A munka első részében sikerült az elvárásainknak megfelelő hidroxiapatit struktúrát előállítani, ezt attritor malmos őrléssel lehet kivitelezni, a bolygómalommal nem tudtuk a szemcseméretet nano mérettartományba csökkenteni. Ez összefüggésben van az őrlés során befektetett munkával. Az attritorral továbbá sikerült utólagos hőkezelés nélkül is hidroxiapatitot létrehozni, amely azonban még nem alkalmas biológiai implantátumnak, mivel más szennyező anyagok is megtalálhatóak benne, ezért ezt még hőkezelni kell. A hőkezelés után nagy tisztaságú, porózus, nanokristályos, biokompatibilis és bioaktív hidroxiapatit port kaptunk végtermékként. A második részben electrospinning módszerrel előállítottunk azonos vastagságú, egy biokompatibilis és biodegradábilis polimerből készült nanoszálakat, amelyek nagy mennyiségű, fent említett tulajdonságú hidroxiapatitot tartalmaznak. A hidroxiapatit a szálakban egyenletesen van eloszlatva, ami bíztató ha nanoszálakat akarunk készíteni belőle. Fontos megjegyezni, hogy a preparációk során csak soft chemistry módszereket alkalmaztunk, tehát nem használtunk mérgező vegyszereket és nem termeltünk nem újrahasznosítható hulladékot. 25

További tervek A szakdolgozat elkészülésének idejében (2011) átlagosan 1 mikrométer átmérőjű 40 % HAP tartalmú CA/HAP kompozit szálakat tudtunk készíteni. Ez után próbáltuk a szálátmérőt csökkenteni, és a HAP tartalmat növelni, ami jó oldószer és polimer választással szabályozható 250-5000 nm, illetve 0-30 % között. Ezeknek a kísérleteknek az eredményeit ebben az értekezésben a terjedelmi megkötések miatt nem tudom közölni. A szálakat hőkezelve a cellulóz-acetát elbontható, így remélhetőleg nanométeres átmérőjű HAP szálakat hozhatunk létre. Ennek a stabilitását akarjuk majd növelni kerámia mátrixszal, hogy ortopéd sebészetben alkalmazható legyen. A CA/HAP szálak is felhasználhatók implantátumként, mivel egy bioaktív és egy biodegradábilis anyagból készült kompozitot alkotnak. Ennek természetesen merőben más fizikai tulajdonságai lesznek, mint a kerámia/hap kompozitnak. Ahhoz, hogy megismerjük az előállított anyagok előnyeit és hátrányait, összehasonlító mintákat is készítünk. Más polimerből (polikaprolakton, polivinilpirolidon, polivinil-alkohol) és más technológiával is (particle leach, SPS) állítunk elő porózus HAP-polimer kompozitokat. Az anyagok felhasználása Az általunk előállított anyagok közül inkább a hidroxiapatit por, mint a szálas kompozit iránt van érdeklődés. A HAP poron általában valamilyen tömbi formában (préselt, vagy cirkónium-oxiddal Spark Plasma Sintered) sejtnövesztéseket végeznek. Ezek a kísérletek, vagy a kiértékelésük éppen folyamatban vannak. A délkoreai Gangneung-Wonju National University-vel közös kísérletünk során Új-zélandi fehér nyulak koponyájába fúrtak 8 mm átmérőjű lyukakat, amelyekbe kereskedelmi forgalomban kapható HAP port, az általunk előállított nanohap port, cellulóz-acetát helyett selyemmel készült szálakat ültettek, illetve üresen is hagytak kontroll miatt. 26

Experimental Design - Fifteen, 4 months-old New Zealand white rabbits - Bilateral round shaped defects were formed in the parietal bone using trephine bur. (diameter : 8.0 mm) - The animals were sacrificed at 4weeks and 8weeks humanly. Köszönetnyilvánítás Köszönet a témavezetőmnek, Dr. Balázsi Csabának munkám során nyújtott folyamatos támogatásáért és türelméért. Hálával tartozom Gergely Grétának, aki az összes előállítási folyamatnál és vizsgálatnál segítette a munkámat. Köszönet továbbá Wéber Ferencnek a hidroxiapatit előállításánál nyújtott segítségért, Lukács Istvánnak, Tóth Attilának és Illés Leventének a SEM illetve EDS felvételekért, Mihály Juditnak a FTIR elemzésért és Horváth Zsolt Endrének az XRD spektrumokért. A kutatást az OTKA 76181 pályázat, az NKTH Öveges József Pályázat, az MTA-NSF-OTKA kétoldalú pályázat és magyar-dél-koreai kormányközi bilaterális TeT projekt (2010-2011) támogatta. 27

Irodalom [1] K.D. Groot, Biomaterials 1 (1980) 47. [2] Hench LL. Bioceramic: from concept to clinic. J Am Ceram Soc 1991;74(7):1487 510. [3] Yamamuro T, Hench LL, Wilson J, editors. Calcium phosphate and hydroxylapatite ceramics. Handbook ofbioactive ceramics, vol. 2. Boca Raton: CRC Press; 1990. [4] Jarcho M, Kay JF, Gumar KI, Doremus RH, Drobeck HP. Tissue, cellular and subcellular events at a bone ceramic hydroxylapatite interface. J Bioeng 1977; 1:79 92. [5] Ugo Ripamonti, Jean Crooks, Lerato Khoali, Laura Roden, Biomaterials 30, 1428 1439 (2009) [6] Csaba Balázsi, Ferenc Wéber, Zsuzsanna Kövér, Enikő Horváth, Csaba Németh, Journal of the European Ceramic Society 27, 1601 1606 (2007) [7] Kenneth S. Vecchio, Xing Zhang, Jennifer B. Massie, Mark Wang, Choll W. Kim, Acta Biomaterialia 3 910 918 (2007) [8] A. Bigi, E. Boanini, K. Rubini, J. Solid State Chem. 177 (2004) 3092. [9] Y.X. Pang, X. Bao, J. Eur. Ceram. Soc. 23 (2003) 1697. [10] M.J. Phillips, J.A. Darr, Z.B. Luklinska, I. Rehman, J. Mater. Sci. Mater. Med. 14 (2003) 875. [11] G.K. Lim, J. Wang, S.C. Ng, C.H. Chew, L.M. Gan, Biomaterials 18 (1997) 1433. [12] W. Kim, Q.W. Zhang, F. Saito, J. Mater. Sci. 35 (2000) 5401. [13] L.Y. Huang, K.W. Xu, J. Lu, J. Mater. Sci. Mater. Med. 11 (2000) 667. [14] M. Yoshmura, H. Suda, K. Okmoto, K. Loku, J. Mater. Sci. 29 (1994) 3399 [15]Seong Ok Hana, Ji Ho Youkb,Kyung Dan Minc, Yun Ok Kangc and Won Ho Park; Electrospinning of cellulose acetate nanofibers using a mixed solvent of acetic acid/water: Effects of solvent composition on the fiber diameter; Materials Letters Volume 62, Issues 4-5, 29 February 2008, Pages 759-762 [16] Farmer, V.C. (1974.): The Infrared Spectra of Minerals, Bartholomew Press, Dorkung, Surrey, 390 pp 28

[17] Anna Slosarczyk, Czeslawa Paluszkiewicz, Marek Gawlicki, Zofia Paszkiewicz, Ceramics International 23 (1997) 297-304. [18] C. Rey, V. Renugopalakrishnan, B. Collins, M.J. Glimcher, Calcif.Tissue Int. 49 (1991) 251^258. [19] Lisa M. Miller, Vidyasagar Vairavamurthy, Mark R. Chance, Richard Mendelsohn, Eleftherios P. Paschalis, Foster Betts, Adele L. Boskey, Biochimica et Biophysica Acta 1527 (2001) 11-19. [20] A. Shemesh, Crystallinity and diagenesis of sedimentary apatites, Geochim. Cosmochim. Acta 54 (1990) 2433-2428. [21] An Introduction to Electrospinning and Nanofibers By Seeram Ramakrishna, Teik Cheng Lim, Wee Eong Teo, 2005 1. Melléklet A használt kémiai anyagok: Aceton: ACETON a.r.; CAS: 67-64-1 Gyártási szám: 08071601; SPEKTRUM3D Cellulóz-acetát: Cellulose acetate, 40% acetyl groups; Cikkszám: 22188; M r ~29000 {9004-35-7}; Fluka/Sigma-Aldrich Ecetsav: ECETSAV 99-100 %-OS a.r.; CAS: 64-19-7; Gyártási sz.: 08071425; SPEKTRUM3D Etil-alkohol: Etanol absz. a.r.; CAS: 64-17-5; Cikkszám: 09475-2-01-65; REANAL Foszforsav: orto-foszforsav 85%-os a.r.; CAS: 7664-38-2; Cikkszám: 0400-0-12-38; REANAL Izopropanol: 2- Propanol a.r.; CAS: 67-63-0; Cikkszám:34080-1-01-65; REANAL 29

2. Melléklet (SEM képek) SA000 30

EB000 SB000 31

EA600 SA600 32

EB600 SB600 33

EA800 SA800 34

EB800 SB800 35

EA900 SA900 36

EB900 SB900 37

3. Melléklet (XRD spektrumok) 38

39

40

41