Alanin ALAT LDH Laktát PDH. Piruvát



Hasonló dokumentumok
Alanin ALAT LDH Laktát PDH. Piruvát

A piruvát-dehidrogenáz komplex. Csala Miklós

Citrátkör, terminális oxidáció, oxidatív foszforiláció

09. A citromsav ciklus

MEDICINÁLIS ALAPISMERETEK BIOKÉMIA AZ AMINOSAVAK ANYAGCSERÉJE 1. kulcsszó cím: Az aminosavak szerepe a szervezetben

Glikolízis. emberi szervezet napi glukózigénye: kb. 160 g

A glükóz reszintézise.

Bevezetés a biokémiába fogorvostan hallgatóknak

Glikolízis. Csala Miklós

A bioenergetika a biokémiai folyamatok során lezajló energiaváltozásokkal foglalkozik.

MEDICINÁLIS ALAPISMERETEK BIOKÉMIA A SZÉNHIDRÁTOK ANYAGCSERÉJE 1. kulcsszó cím: A szénhidrátok anyagcseréje

ZSÍRSAVAK OXIDÁCIÓJA. FRANZ KNOOP német biokémikus írta le először a mechanizmusát. R C ~S KoA. a, R-COOH + ATP + KoA R C ~S KoA + AMP + PP i

Integráció. Csala Miklós. Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Patobiokémiai Intézet

Zsírsav szintézis. Az acetil-coa aktivációja: Acetil-CoA + CO + ATP = Malonil-CoA + ADP + P. 2 i

ALLOSZTÉRIKUSAN SZABÁLYOZÓ METABOLITOK HATÁSA A PIRUVÁT-KINÁZ L és M IZOENZIMRE

Szénhidrátok monoszacharidok formájában szívódnak fel a vékonybélből.

TEJSAVAS (LAKTÁT) ACIDÓZIS Csala Miklós

Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet. Mitokondrium. Fésüs László, Sarang Zsolt

jobb a sejtszintű acs!!

A légzési lánc és az oxidatív foszforiláció

A szénhidrátok lebomlása

A felépítő és lebontó folyamatok. Biológiai alapismeretek

A szénhidrátok anyagcseréje. SZTE AOK Biokémiai Intézet Gyógyszerész hallgatók számára 2014.

Energiaforrásaink Szénvegyületek forrása

Hiperammonémiák. Támpontok az egyes célkitűzések tárgyalásához

A szénhidrátok lebomlása

, mitokondriumban (peroxiszóma) citoplazmában

Az aminosav anyagcsere orvosi vonatkozásai Csősz Éva

SZÉNHIDRÁT ANYAGCSERE ENZIMHIÁNYOS BETEGSÉGEI (konzultáció, Buday László) I, Monoszacharid anyagcseréhez kapcsolt genetikai betegségek

Energiatermelés a sejtekben, katabolizmus. Az energiaközvetítő molekula: ATP

ph jelentősége a szervezetben

Prenatalis diagnosztika lehetőségei mikor, hogyan, miért? Dr. Almássy Zsuzsanna Heim Pál Kórház, Budapest Toxikológia és Anyagcsere Osztály

A tabletta csaknem fehér színű, ovális és UCY 500 kódjelzéssel van ellátva.

Növényélettani Gyakorlatok A légzés vizsgálata

TERMELÉSÉLETTAN. Az Agrármérnöki MSc szak tananyagfejlesztése TÁMOP /1/A projekt

Modul cím: MEDICINÁLIS ALAPISMERETEK BIOKÉMIA LIPIDEK ANYAGCSERÉJE 1. kulcsszó cím: A lipidek szerepe az emberi szervezetben

A METABOLIZMUS ENERGETIKÁJA

A METABOLIZMUS ENERGETIKÁJA

A mikrobaszaporodás alapösszefüggései TÁPOLDATOK, TÁPTALAJOK HOZAMKIFEJEZÉS ÁLTALÁNOSITÁSA. Fermentációs tápoldatok MIKROORGANIZMUSOK TÁPANYAG IGÉNYE

Sav-bázis egyensúly. Dr. Miseta Attila

A KOLESZTERIN SZERKEZETE. (koleszterin v. koleszterol)

Több oxigéntartalmú funkciós csoportot tartalmazó vegyületek

BIOKÉMIA GYAKORLÓ TESZT 1. DEMO (FEHÉRJÉK, ENZIMEK, TERMODINAMIKA, SZÉNHIDRÁTOK, LIPIDEK)

Homeosztázis A szervezet folyadékterei

Készült:

Vércukorszint szabályozás

Mire költi a szervezet energiáját?

Sporttáplálkozás. Étrend-kiegészítők. Készítette: Honti Péter dietetikus július

Kollokviumi vizsgakérdések biokémiából humánkineziológia levelező (BSc) 2015

A felvétel és a leadás közötti átalakító folyamatok összességét intermedier - köztes anyagcserének nevezzük.

Fehérjék. SZTE ÁOK Biokémiai Intézet

A gasztrointesztinális (GI) rendszer élettana IV. Táplálkozás élettan.

A citoszolikus NADH mitokondriumba jutása

Az enzimműködés termodinamikai és szerkezeti alapjai

A biokémiai folyamatokat enzimek (biokatalizátorok) viszik véghez. Minden enzim. tartalmaz fehérjét. Két csoportjukat különböztetjük meg az enzimeknek

Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet. Lipid anyagcsere. Balajthy Zoltán, Sarang Zsolt

Az AS nitrogénjének eltávolítása

AMINOSAVAK, FEHÉRJÉK

A sokoldalú L-Karnitin

A szövetek tápanyagellátásának hormonális szabályozása

Zsírsavoxidációs zavarok klinikuma és kezelése. Papp Ferenc

11. Dr. House. Biokémiai és sejtbiológiai módszerek alkalmazása az orvoslásban

Tények a Goji bogyóról:

ENZIMSZINTŰ SZABÁLYOZÁS

Májátültetés és veleszületett anyagcsere betegségek. Dezsőfi Antal

A diabetes mellitus laboratóriumi diagnosztikája

TÁPLÁLKOZÁSI AKADÉMIA

Táplálkozás. SZTE ÁOK Biokémiai Intézet

Energia források a vázizomban

Az Etanol Metabolizmusa és az Alkoholos Májkárosodás Biokémiája

SZÉRUM KOLESZTERIN ÉS TRIGLICERID MEGHATÁROZÁS

Sejtszintű anyagcsere Ökrös Ilona

ELEKTROLIT VIZSGÁLATOK 1. ELEKTROLITOK

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Szénhidrát anyagcsere. Kőszegi Tamás, Lakatos Ágnes PTE Laboratóriumi Medicina Intézet

A neuroendokrin jelátviteli rendszer

A MITOKONDRIÁLIS ENERGIATERMELŐ FOLYAMATOK VIZSGÁLATA

PAJZSMIRIGY HORMONOK ÉS A TESTSÚLY KONTROLL

Mit tud a genetika. Génterápiás lehetőségek MPS-ben. Dr. Varga Norbert

mi a cukorbetegség? DR. TSCHÜRTZ NÁNDOR, DR. HIDVÉGI TIBOR

Az idegsejtek kommunikációja. a. Szinaptikus jelátvitel b. Receptorok c. Szignál transzdukció neuronokban d. Neuromoduláció

Titokzatos gyümölcskocsonya

A génterápia genetikai anyag bejuttatatása diszfunkcionálisan működő sejtekbe abból a célból, hogy a hibát kijavítsuk.

Az edzés és energiaforgalom. Rácz Katalin

Sav-bázis és vérgáz elemzés. Dr Molnár Zsolt Pécsi Tudományegyetem

Az enzimek katalitikus aktivitású fehérjék. Jellemzőik: bonyolult szerkezet, nagy molekulatömeg, kolloidális sajátságok, alakváltozás, polaritás.

A keringı tumor markerek klinikai alkalmazásának aktuális kérdései és irányelvei

A rotavírus a gyomor és a belek fertőzését előidéző vírus, amely súlyos gyomor-bélhurutot okozhat.

Molekuláris genetikai vizsgáló. módszerek az immundefektusok. diagnosztikájában

MIKROBIOM ÉS ELHÍZÁS HEINZ GYAKY 2018 BUDAPEST

Engedélyszám: /2011-EAHUF Verziószám: Kémiai vizsgálatok követelménymodul szóbeli vizsgafeladatai

BETEGTÁJÉKOZTATÓ RHEUMATOID ARTHRITISBEN SZENVEDŐ BETEGEK SZÁMÁRA I. RHEUMATOID ARTHRITIS. origamigroup.

A veseműködés élettana, a kiválasztás funkciója, az emberi test víztereinek élettana (5)

A biokémia alapjai. Typotex Kiadó. Wunderlich Lívius Szarka András

Elso elemzés Example Athletic

I. MELLÉKLET ALKALMAZÁSI ELŐÍRÁS

A genetikai lelet értelmezése monogénes betegségekben

Immunológia alapjai. 16. előadás. Komplement rendszer

folsav, (a pteroil-glutaminsav vagy B 10 vitamin) dihidrofolsav tetrahidrofolsav N CH 2 N H H 2 N COOH

Új szignalizációs utak a prodromális fázisban. Oláh Zita

Átírás:

Tejsavas acidózis I. Háttér információk Több öröklõdõ betegség jellemzõ tünete a metabolikus acidózis, melyben a legfõbb komponens a laktát felszaporodás. A keringésben elõforduló tejsav a glukóz anaerob metabolizmusa során keletkezik fõként a vörösvértestekben, a bõrben, a vese velõállományában és a harántcsíkolt izomzat fehér rostjaiban. A laktát egy része oxidálódik a vörös izmokban, a vese kéregállományában, de a legnagyobb mennyiségben a máj veszi fel és alakítja át glukózzá, vagy oxidálja. Az egyedüli reakció, amely a metabolizmusban laktát termelõdésére vezet, a piruvát NADH 2 - val történõ redukciója és a laktát mindig ennek a reakciónak a megfordításával tûntethetõ el. Ebbõl következik, hogy minden olyan állapot, amely piroszõlõsav felhalmozódásával és a tejsav, valamint a piroszõlõsav keringésbõl való elégtelen eltávolításával jár, tejsavas acidózis kifejlõdéséhez vezethet. Glukóz PEP PEPCK PK OAA Piruvát PC Alanin ALAT LDH Laktát PDH Acetil-KoA Zsírsavak 1. ábra: A piruvát lehetséges metabolikus útjai. A piruvát foszfoenolpiruváttá (PEP), oxálacetáttá (OAA), acetil koenzim A-vá, alaninná, illetve laktáttá alakulhat. A folyamat enzimei: PK = piruvát kináz, PC = piruvát karboxiláz, PEPCK = foszfoenolpiruvát karboxikináz, ALAT = alanin aminotranszferáz, LDH = laktát dehidrogenáz, PDH = piruvát dehidrogenáz A piruvát oxidatív metabolizmusa a piruvát dehidrogenáz (PDH) közvetítésével a Krebs ciklusban és a terminális oxidációban történik, míg a piruvát anabolikus felhasználása primeren a piruvát karboxiláz által történhet. Fiziológiás körülmények között a teljes piruvát mennyiségnek csak kis százaléka transzaminálódik alaninná. Bármely, piruvátot felhasználó reakcióút defektusa a piruvát és laktát akkumulációhoz vezethet. Számos vitaminhiányos állapotban mutattak ki tejsavas acidózist. A legközönségesebb, tejsavas acidózishoz vezetõ állapot a piruvát dehidrogenáz komplex csökkent mûködése eredményeképpen jön létre. A piruvát dehidrogenáz komplex veleszületett rendellenessége kóros tünetek sokaságával jár együtt. A legkifejezettebb elváltozások az idegrendszerben tapasztalhatók, de fejlõdési visszamaradottság és szervi

diszfunkció más szervekben; pl. az izomban és a májban is tapasztalható. Az agy, más szervektõl eltérõen normál körülmények között energiáját majdnem kizárólagosan a glukóz glikolízisben és citrát ciklusban történõ eloxidálásából nyeri. Ezen folyamatok blokkolása a piruvát oxidáció, a piruvát dehidrogenáz komplex szintjén az ATP szint csökkenéséhez, az agy és egyéb szervek károsodásához vezet az enzim részleges vagy teljes hiányában szenvedõ betegeken. Jelenleg a PDH hiányra hatékony terápia nem létezik és a gyermekek súlyos PDH hiánnyal legfeljebb két vagy három évig élnek. A kevésbé súlyos PDH hiányos szindrómákban az agyban az acetil-koa termelõdés csökken. Ez az acetilkolin szintézis csökkenéséhez vezet, ami egyik lehetséges lehet az enyhe PDH deficienciában észlelhetõ mozgáskoordináció csökkenésnek. II. A PDH komplex defektusa A PDH multienzim komplex, ami három különbözõ E 1, E 2 és E 3 enzimbõl áll, és öt különbözõ koenzimet igényel. A PDH által katalizált reakció: piruvát + + + NADH + KoA SH Acetil - KoA + NADH + H CO 2 TPP KoA-SH Piruvát E 1 E 2 E 2 Acetil-KoA TPP Lipoát Dihidrolipoát E 3 FADH 2 FAD NAD NADH 2 2. ábra: A piruvát dehidrogenáz komplex mûködése. E 1 = piruvát dekarboxiláz, E 2 = dihidrolipoil transzacetiláz, E 3 = dihidrolipoil dehidrogenáz, TPP = tiamin pirofoszfát A piruvát dehidrogenáz komplex elégtelensége az E1 rész (piruvát dekarboxiláz) deficienciájából, az E3 rész (dihidrolipoil dehidrogenáz) hiányából, vagy egyik- másik a

PDH-ban koenzimként, vagy kofaktorként szereplõ vitamin szerzett hiányából adódhat. Az E 3 (dihidrolipoát dehidrogenáz) az α-ketoglutarát dehidrogenáznak, az elágazó szénláncú ketosav dehidrogenáznak, és a glicin hasítását végzõ enzimnek is komponense. Azok a csecsemõk, akiknek hiányzik a dehidrolipoát dehidrogenázuk, ritkán érik meg a több hónapos kort. Bõrbiopsziás anyagból nyert és szövettenyészetben fenntartott fibroblasztok kiválóan alkalmasak PDH deficienciára gyanús egyéneken a diagnózis felállítására. Esetismertetés 9 hónapos terhesség végén 2,9 kg-os fiúgyermek született szövõdménymentes szüléssel. Újszülöttként súlygyarapodása megállt hányással, metabolikus acidózissal járó periódusok többször elõfordultak. 8 hónapos korában renális tubuláris acidózis diagnózist állítottak fel. Az akkor elvégzett fizikális vizsgálatok szerint a gyermek fizikálisan alulfejlett 4,1 kg hipotóniás, kis izomtömegû, mozgás-koordinációja rossz. A feji régió computertomográfiája az agykéreg atrophiáját mutatta. A látó és hallóideg súlyos atrophiája is kimutatható volt. A laboratóriumi leletek perzisztáló acidózist; ph 7,0-tõl 7,2-ig 9,0 mm-os vér laktát koncentrációval (normálérték 2,2 mm), 2,4 mm piruvát koncentrációval (normál 0,7 mm) és 1,4 mm-os alanin koncentrációt (normál 0,09-0,31 mm) mutattak. Az állapotot tiaminnal 600 mg/nap és biotinnal 10 mg/nap kezeléssel próbálták meg rendezni négy héten át, de ez nem befolyásolta sem a klinikai állapotot, sem a vér laktát illetve piruvát szintjét. A szérum bikarbonát szint 20 mm alatt volt (normál 25-26 mm) és ott is maradt a napi 4.9 g orális nátriumbikarbonát kezelés ellenére. A vizeletminták gázkromatográfiás, tömeg spektrometriás vizsgálata kimutatta a tejsav, α-hidroxi vajsav, β-hidroxi valeriánsav és α-ketoglutársav felszaporodását. Ezek a vegyületek a normál vizeletnek nem összetevõi. Fibroblaszt kivonatok piruvát dehidrogenáz komplex, α-ketoglutarát dehidrogenáz és lipoamid dehidrogenáz aktivitását vizsgálták. Az eredményeket az 1. táblázat mutatja. PDH-K α-kgdh-k LAD LAD K M (µmol/min/mg protein) (mm lipoamide) Normál (n=20) 200 ± 25 109 ± 11 62 ± 7 1.41 ± 0.10 Beteg kontrol * (n=26) 156 ± 17 107 ± 9 59 ± 4 1.64 ± 0.37 Ataxia + (n=17) 139 ± 21 104 ± 10 52 ± 4 1.51 ± 0.15 Laktacidózis x (n=39) 134 ± 13 81 ± 6 50 ± 6 2.3; 1.6; 1.3 Összes kontroll (n=102) 154 ± 9 97 ± 5 56 ± 2 l.55 ± 0.l1 Beteg (4x mérve) 58.9 ± 27 19.8 ± 2 12.4 ± 1.9 1.29 ± 0.29 * betegek ataxia vagy laktacidózis nélkül + betegek Friedrich ataxiával x betegek laktacidózissal, de normál LAD aktivitással 1. számú táblázat: Fibroblaszt kivonatok piruvát dehidrogenáz komplex (PDH-K), α- ketoglutarát dehidrogenáz (α-kgdh-k) és lipoamid dehidrogenáz (LAD) aktivitásai.

A KM és a Vmax dihidrolipoil dehidrogenázban mért értékeit a 2. táblázat mutatja. Lipoamid NAD Lipoamid-H 2 NADH 2 (mm) (µm) (mm) ( µm) Kontroll K M 1.75 201.00 1.00 56.00 Beteg K M 1.30 382.00 1.17 83.00 Kontroll V Max 44.50 34.50 36.00 52.00 Beteg V Max 12.50 14.00 16.00 20.00 2. táblázat: Lipoamid dehidrogenáz bõr fibroblaszt tenyészetben mért látszólagos K M és V Max értékei A fehérjebevitel kismértékû megszorítása (2 g/kg/nap) nem tudta enyhíteni a tejsavas acidózist. A szénhidrát bevitelt, ha a teljes kalória bevitel 40 %-ára csökkentették az acidózis rosszabbodott, a szénhidrát megszorítás kéthetes periódusa alatt. A hozzátartozók beleegyezésével orális liponsav terápiát kezdtek. (25-50 mg/testsúly kg/nap). A kezelés hatására a tejsavas és piroszõlõsavas acidózis nagymértékben javult. A fenti terápia a vizeletben megtalálható abnormális szerves savak ürítését is megszüntette. Fenntartó kezelésként 50 mg/kg/nap liponsav adását és 2-2 5 g fehérje/kg/nap diétás bevitelét folytatták két évig, mellékhatások nélkül. Acidózis nem jelentkezett, kivéve azokat az eseteket, amikor a kezelést fertõzések miatt félbeszakították. A beteg kismértékû, de állandó súlygyarapodást mutatott, 30 hónapos korában testsúlya 9 kg volt és motoros fejlõdése számottevõen javult. Kérdések 1. Miért volt a piruvát, laktát és alanin koncentráció abnormálisan magas a betegnél? 2. A PDC komplex, az α-kgdh komplex és a dihidrolipoát dehidrogenáz enzim aktivitások a beteg fibroblasztjaiban mind alacsonyabbak voltak, mint az egészségesekben. Magyarázza meg, hogyan vezethet egy enzimet kódoló gén mutációja ezekhez az effektusokhoz? 3. Ha liponsavat fibroblaszt homogenizátumokhoz adtak, a hozzáadás nem növelte a dihidrolipoát dehidrogenáz aktivitását, ennek ellenére az in vivo liponsav kezelés drámai hatást mutatott. Magyarázza meg a jelenséget! 4. Milyen okoskodás állhat a fenti terápiás próbálkozások hátterében: tiamin, biotin bikarbonát és fehérje megszorítás? 5. A diétás szénhidrátbevitelnek a teljes kalória fogyasztás 40 %-ára való visszaszorítása hatékony terápiának bizonyult azon paciensekben, akiknél a tejsavas acidózis a piruvát dehidrogenáz komplex E 1 alegysége genetikus hiányával volt magyarázható. Adjon magyarázatot arra a megfigyelésre, hogy a mi esetünkben említett betegnél a diétás szénhidrát megszorítás miért eredményezte az acidózis rosszabbodását? 6. Adjon biokémiai magyarázatot a vér bikarbonát koncentrációjának alacsony értékére. 7. A diklóracetát, a piruvát dehidrogenáz kináz inhibitora, bizonyos tejsavas acidótikus kórképekben hasznos terápiás eszköznek bizonyult. Mit gondol, mely enzim defektusa kezelhetõ ezzel a terápiával és miért? 8. Írja le a mechanizmusokat, melyek által a PDC aktivitása szabályozott. a) allosztérikusan, b) kovalens módosítással. 9. Az alább felsorolt metabolitok koncentrációjának csökkentése hogyan befolyásolja a citrátkör sebességét? a: ATP, b: acetil-koenzim A, c: NADH 2? Hogyan befolyásolják ezek a változások a glikolízist, glukoneogenézist?

Irodalom Brown et al. The clinical and biochemical spectrum of human pyruvate dehydrogenase complex deficiency. Annals New York Academy of Sciences 1989; 573:360-368 Ho L. et al. Genetic defects in human pyruvate dehydrogenase Annals New York Academy of Sciences 1989; 573:347-359 Kwan-Fu Rex Sheu et al. Abnormalities of pyruvate dehydrogenase complex in brain disease Annals New York Academy of 5ciences 1989; 573:378-391 Matalon R. et al. Lipoamide dehydrogenase deficiency witr primary lactic acidosis: Favorable response to treatment with oral lipoic acid J. Pediatr., 1984; 164:65-69 III. Piruvát karboxiláz hiány A piruvát karboxiláz (PC) mitokondriális enzim, amely négy egyforma alegységbõl áll. Minden alegységen kötõhelyek találhatók a szubsztrátok, úgymint piruvát, ATP, bikarbonát és az allosztérikus effektor, acetil-koa számára. Minden alegység kötõhelyet tartalmaz egy molekula kovalensen kapcsolt biotin számára is. A piruvát karboxiláz reakcióját az alábbi egyenlet mutatja. piruvát + HCO 3 + acetil-coa + ATP oxálacetát + ADP + P + H i + A piruvát karboxiláz aktivitása majdnem teljesen az allosztérikus aktivátor, az acetil koenzim-a jelenlététõl függ, A piruvát karboxiláz által katalizált reakció a glukoneogenézis elsõ lépése, és zsírsavak mobilizálása illetve acetil-koa képzõdésével együtt járó állapotokban aktiválódik. Az enzim legnagyobb aktivitást azon szövetekben mutat, ahol glukoneogenézis történik (máj és vese), de jelen van minden mitokondriumot tartalmazó szövetben. Mind az agy, mind a zsírszövet nagy koncentrációban tartalmazza az enzimet, amely anaplerotikus szerepet játszik és fontos a zsírsav szintézis szempontjából. A piruvát karboxiláz az izomban is szereppel bír, ahol is a foszfoenolpiruvát karboxikináz (PEPCK) enzimmel együtt a citrátkör intermedierek koncentrációját szabályozza. A piruvát karboxiláz hiánya a klinikai és biokémiai manifesztáció szempontjából két csoportra osztható. A betegség egyszerû formájában ( a forma) a beteg az élet elsõ hónapjaiban közepesen súlyos acidózisban szenved és fejlõdésében elmarad. A betegség súlyosabb formája ( b forma) hamarosan a megszületés után súlyos tejsavas acidózissal kezdõdik, amelyet hepatomegália, emelkedett vér ammónia, citrullin és lizin koncentráció kísér. A b formában szenvedõ betegek ritkán élik túl a 3 hónapos kort. A két forma összehasonlító jellemzõit a 3. táblázat mutatja.

Group A [n = 13] Group B [n = 11] Origin 8 Amerindian, 1 Canadian (1 with Egyptians Parents) 1 Canadian Italian parents, 4 French, 2 U.K., 1 West German, 3 U.S. Caucasian, 1 Japanese 1 Saudi Arabian, 1 Swede Presentation Metabolic acidosis Metabolic acidosis Delayed neurologic development Hepatomegaly Age of presentation Birth of 5 month Neonatal Survival 2 survive to 5 years; severe mental All dead in 3 month retardation Biochemical α-ketoglutarate in urine Lactic acidosis mild with severe attacks on α-ketoglutarate in urine Lactic acidosis chronically severe infection Pyruvate carboxylase activity < 5 % control < 5 % control Lactate / pyruvate ratio Normal Elevated (XS) Acetoacetate / 3HOB ratio Normal? Elevated (XS) Blood ammonia Normal Elevated (XS) Alanine Elevated Elevated Citrulline Normal Elevated (XS) Lysine Normal Elevated Proline Elevated Elevated PC [ 3 H]biotin protein (125 kda) Present Absent in 6/10 cases PC immunoreactive Protein Present Absent in 6/10 cases PC mrna Present Absent in 4/10 cases Refs. 85 to 92 +3 unpublished cases* Refs. 93 to 98 +3 unpublished cases* 3. táblázat: A piruvát karboxiláz (PC) hiány megjelenési formái és következménye Az a formában szenvedõ betegekben piruvát karboxiláz aktivitás még kimutatható, ezzel szemben a b formában piruvát karboxiláz aktivitás nem mérhetõ. Néhány vizsgált paciensnél mind a fehérje, mind a szintéziséért felelõs messenger RNS hiányzott. Az a formában szenvedõ paciensek közül a túlélõk súlyos szellemi visszamaradottságban szenvednek. A szellemi visszamaradottság feltételezhetõ oka az agyi neuronok pusztulása, annak ellenére, hogy normál körülmények között piruvát karboxiláz enzim aktivitás nem a neuronokban, hanem az asztrocitákban található. Ezek a megfigyelések azt mutatják, hogy a piruvát karboxiláz elengedhetetlen anaplerotikus szereppel bír az asztrocitákban és hiányában a neuron meg van fosztva olyan, létezése számára elengedhetetlen tápanyagoktól, amelyeket normálisan az asztrocitáktól kapna. A jelenlegi kísérleti eredmények arra utalnak, hogy a neurotranszmitter raktárak részben a preszinaptikus terminálokban történõ de novo szintézissel töltõdnek fel részben pedig a neuronok az asztrocitákból származó glutamint használják fel mind a glutaminsav, mind a γ-aminovajsav (GABA) szintézisére A piruvát karboxiláz hiányára a metabolikus acidózisból és a vér magas tejsav koncentrációjából következtethetünk. Ezek azonban közvetett bizonyítékok. Végleges diagnózis a piruvát karboxiláz aktivitásának direkt kimutatásán alapul, bõrbõl tenyésztett fibroblasztokban. Olyan fibroblasztokban, amelyekben az enzim aktivitás csökkent, vagy nem mutatható ki, kívánatos megbizonyosodni arról, hogy az enzim fehérje kimutatható-e. A piruvát karboxiláz fehérje fibroblasztokból való kimutatására két technikát, a tricilált biotin jelzést és az S-metioninnal jelzett fehérje immun precipitációját használják. Az elsõ technikánál a sejteket biotin hiányos táptalajon tartják, majd magas specifikus aktivitású jelzett biotinnal inkubálják együtt. A fehérjéket nátrium-laurilszulfát gélelektroforézissel (SDS-PAGE) választják szét. A szárított gélek fluorometriás vizsgálatánál három csík látható. Az elsõ csík M = 125000, a piruvát karboxiláz polipeptidjét jelöli, a második M = 75000 a β-

M = 73000, a propionil-koenzim-a- metil-krotonil-koenzim-a karboxilázét, a harmadik az karboxilázét (M = molekulatömeg D-ban kifejezve). FIGURE 3. [ 3 H]biotin labeling of carboxylase proteins in cultured skin fibroblasts. SDS/PAG electrophoresis was carried out on amniocyte or skin fibroblast extracts after labeling with [ 3 H]biotin, followed by fluorography of the dried gel. Cell strains used were lane 1: control cell strain 1206; lane 2: control cell strain 1568; lane 3: PCdeficient cell strain 988 (presentation I); lane 4: PC-deficient cell strain 1140 (presentation II); lane 5: PCdeficient cell strain 1520 (presentation II); lane 6: cell strain 1582 (mother of 1520); lane 7: cell strain 1583 (father of 1520). 3. ábra. Egy tipikus elektroforetikus kép. A PC = piruvát karboxiláz, MCC = β-metilkrotonil-koenzim-a karboxiláz, PCC = propionil-koenzim A karboxiláz pozíciója a gélen. Fentiekkel azonos eredmények nyerhetõk olyan fibroblaszt extraktumokkal, amelyek [ 35 S]- metionin jelenlétében nõttek. Ezekben az esetekben radioaktívan jelzett piruvát karboxilázt anti-pc-antiszérummal immunprecipitálták és SDS-PAGE gélelektroforézissel vizsgálták. Ez a kísérlet mutatta, hogy a biotin jelzéssel ki nem mutatható piruvát karboxiláz fehérje az 1140-el és az 1520-al jelzett (3. ábra) sejtvonalakban az immunreaktív fehérje hiányának tulajdonítható, és nem a karboxiláz defektív biotinilációjának következménye. Fent leírtakhoz hasonló kísérleteket végeztek abból a célból, hogy összefüggést keressenek a betegség klinikai megjelenési formái és a biokémiai léziók között. Az a tipusban sorolható betegek rendszerint CRM pozitívak, azaz a piruvát karboxiláznak megfelelõ immunreaktív fehérje (cross reacting material, CRM) mutatható ki bennük, míg a súlyosabb klinikai tünetekkel járó esetekben fehérjét nem találtak. Ezek az egyének vagy olyan fehérjéket szintetizálnak, amelyek sem nem biotinilálódnak, sem nem csaphatók ki anti-pc antitesttel, vagy egy másik lehetséges magyarázat szerint egyáltalán nem szintetizálnak PC fehérjét.

A CRM - negatív piruvát karboxiláz deficienciának súlyos metabolikus következményei vannak. Valószínûsíthetõ, hogy a beteg személyekben az intraceluláris aszpartát igen-igen hiányzik. Ha a piruvát karboxiláz hiányzik az érintett személyek az oxálacetáthoz a táplálékkal bevitt aszpartátból, glutamátból, vagy glutaminból jutnak hozzá, ami a fenti hármast esszenciális aminosavakká teszik. A CRM negatív személyek aszpartát és oxálacetát hiánya tükrözõdhet 1 ) az urea ciklus deficienciájában, 2) a mitokondriális és citoplazmatikus redox állapot megváltozásában, 3) a lizin defektív metabolizmusában. II. Esetismertetés Három hónapos leány gyermek fejlõdése zavartalan volt, mielõtt a görcsrohamok megjelentek volna. A csecsemõ állapota gyorsan romlott, hipotóniás lett, pszichomotoros fejlõdése lelassult. A piruvát és laktát plazmakoncentrációi a normálist hétszeresen meghaladták. A plazma alanin koncentrációja is magasabb volt és alanin bevitelére a normális glukoneogenetikus válasz elmaradt. Fibroblasztokból létrehozott szövettenyészeten a piruvát karboxiláz aktivitását mérték és a normális 1 %-ánál is kevesebbnek találták. A betegbõl izolált fibroblasztok lipid tartalma ötszöröse volt a normál értéknek. Kérdések a piruvát karboxiláz esettanulmányhoz 1. Mi a piruvát karboxiláz metabolikus jelentõsége? 2. Hogy mérne piruvát karboxiláz aktivitást egy fibroblaszt kivonatból? 3. A b típusú betegségben szenvedõk redoxállapota is eltérést mutat a normálistól, amennyiben a citoszólt inkább az oxidált állapot jellemzi, amit a normálisnál magasabb acetecetsav / β-hidroxi vajsav hányados is jellemez. Adjon biokémiai magyarázatot a fenti megfigyelésre.* 4. Magyarázza meg, hogy alanin adagolásával miért nem lehetett glukoneogenézist indukálni a betegben? 5. Miért akkumulálódtak lipidek a beteg fibroblasztjaiban? 6. Magyarázza meg, hogy a szövettenyésztõ médiumhoz adott glutamin miért serkentette a beteg fibroblasztjainak növekedését? 7. Milyen kezelést ajánlana betegének? Véleményét magyarázza meg! 8. A legtöbb PC hiányos paciens nagyon korán meghal, és a túlélõk is szellemileg károsodottak. Milyen biokémiai módszereket használna fel a genetikai tanácsadáson? 9. Miért károsodik az urea ciklus a PC deficienciában? 10. Mi az a biotinidáz? Milyen hatása lenne a biotinidáz defektusának a PC aktivitására?** 11. Mit jelent az alábbi állítás? A PC anaplerotikus szerepet játszik a zsírsav bioszintézisében, vagy a PC anaplerotikus szerepet játszik az agyi metabolizmusban. * ** A megjelölt kérdések értelmezésére késõbbi konzult ációk során kerül sor. Irodalom Stanbury et al. Metabolic basis of inherited diseases. Deficiency of pyruvate carboxylase 1983, 196-201

Robinson B.H. et al. The French and North American phenotypes of pyruvate carboxylase deficiency. Am. J. Human Genet. 1987; 40:50-59 Coster R.N., Fernhoff P.M., De Vivo D.C. Pyruvate carboxylase deficiency: A benign variant with normal development Pediatr. Res. 1991; 30:1-4 Dakshinamurti and Chauhon Regulation of biotine enzymes Ann. Rev. Nutr. 1988; 8:211-233 IV. A piruvát karboxiláz deficiencia prenatális diagnózisa A következõ cikkben Marsac és mtsai a piruvát karboxiláz deficiencia elsõ prenatális diagnózisát írják le. A piruvát karboxiláz aktivitását amnion folyadékból izolált sejtekben mérték, olyan terhesség esetén, ahol a piruvát karboxiláz hiány kockázata felmerült. A házaspárnak korábban két kisgyermeke halt meg PC deficienciában. A diagnózis négy laboratórium egymástól függetlenül állította fel és a terhesség megszakítása után a fetusból sem tudták kimutatni a piruvát karboxiláz aktivitását. Kérdések 1. Miért határozták meg az idézett cikkben a propionil-koa-karboxiláz, a β-metilkrotonil-koa-karboxiláz és a foszfoenolpiruvát-karboxikináz aktivitásokat? 2. Milyen reakciókat katalizálnak a fenti reakciók (egyenlet, képlet)? 3. Értelmezze a piruvát karboxiláz meghatározás módszerét. Milyen anyagokat, és miért használ a meghatározáskor? 4. Mi az értelme az enzimaktivitás meghatározásnak a máj, vese és agyszövetben? Milyen funkciókhoz szükséges a piruvát karboxiláz az itt felsorolt szövetekben? Irodalom Marsac C. et al. Prenatal diagnosis of pyruvate carboxylase deficienc, Clinica Chimica Acta, 1982; 11:121-127