Készült:

Átírás

1 Tananyag címe: Transzaminázok vizsgálata Szerző: Dr. Mótyán János András egyetemi tanársegéd Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet Általános Orvostudományi Kar Debreceni Egyetem Készült: A tananyag elkészítését "Az élettudományi- klinikai felsőoktatás gyakorlatorientált és hallgatóbarát korszerűsítése a vidéki képzőhelyek nemzetközi versenyképességének erősítésére" TÁMOP C-13/1/KONV számú projekt támogatta. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg. 1

2 ELMÉLETI BEVEZETŐ 1. TRANSZAMINÁZOK A Transzaminázok vizsgálata című gyakorlat tartalmazza a transzamináz reakció megfordíthatóságának vizsgálatát, a szérum glutamát-oxálacetát-transzamináz (GOT) és a glutamát-piruvát-transzamináz (GPT) aktivitásának optikai teszttel történő meghatározását és a szérum és vizelet aminosav-tartalmának vizsgálatát egy anyagcserezavar (fenilketonúria) esetében. Ezért a transzaminálási reakciók és a fenilalanin és a tirozin lebontási folyamatai kerülnek részletesebben megtárgyalásra, valamint a gyakorlatok elméleti hátterének bemutatása. 1.1 Bevezetés Az emberi szervezet fehérjéi 20 különböző aminosavból épülnek fel (1. ábra). A fehérjéket alkotó aminosavak mind L-konfigurációjúak (a glicin kivételével) és mind α- aminosavak (a prolin kivételével, amely iminosav). Minden aminosav tartalmaz karboxilcsoportot és aminocsoportot is az α-szénatomon (α-aminosavak), továbbá különböző oldalláncokat. Az oldalláncok tulajdonságai alapján megkülönböztethetünk apoláros, aromás, poláros és töltéssel nem rendelkező, savas valamint bázikus oldalláncú aminosavakat. 2

3 1. ábra. A fehérjéket alkotó aminosavak. Az aminosavak lebontása során megkülönböztetünk általános reakciótípusokat, melyek fontosak mind a lebontó mind a felépítő folyamatok szempontjából. Ilyen jellemző reakciók a transzaminálás, a dezaminálás (oxidatív és nem oxidatív), a dekarboxilálás (oxidatív és nem oxidatív), a monooxigenálás, a dioxigenálás és az egy szénatomos egységek transzfer-reakciói. Az enzimek besorolása a Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) nevezéktani bizottság szerint hat osztályba történik az általuk katalizált reakció típusa alapján: 1. oxidoreduktázok 2. transzferázok 3. hidrolázok 4. liázok 5. izomerázok 6. ligázok A transzferázok a 2. enzimosztályba tartoznak (EC 2), valamilyen funkciós csoport átviteli reakcióját katalizálják a donor és az akceptor molekula között. A nitrogén-tartalmú csoport átvitelét katalizáló enzimek (EC 2.6) közül az aminotranszferázok, vagy más néven transzaminázok (EC 2.6.1), aminocsoport átvitelét katalizálják aminosavról ketosavra, mely reakció egy új aminosavat és új ketosavat eredményez. 1.2 A transzaminálási reakciók 3

4 A transzaminálási reakciók feladata az aminosavak nitrogénjének eltávolítása. Míg a dezaminálási reakciókban a nitrogén eltávolításra kerül a szervezet aminosav-készletéből (aminosav pool), addig a transzaminálási reakciók során a nitrogén az aminosav pool-ban marad. A transzaminálási reakciók mennyiségileg az aminosav metabolizmus legjelentősebb reakciói. Minden aminosavra vannak transzamináz enzimek, a lizin és a treonin kivételével. Az aminosavak lebontása általában a transzaminálással kezdődik. A transzamináz enzimek csoportosíthatóak a sejten belüli lokalizáció (citoplazmatikus vagy mitokondriális), az aminocsoport helyzete (α, β, stb.) vagy a szubsztrátpartner szerint is. A transzaminálási reakcióban az aminosav szubsztrát aminocsoportja átadódik a transzamináz enzim piridoxál foszfát kofaktorának, majd a ketosav szubsztrátnak. Termékként a reakcióban ketosav és aminosav keletkezik. A transzamináz által katalizált reakció reverzibilis. A piridoxál foszfát a megfordított reakcióban regenerálódik, melynek során ketosav használódik fel szubsztrátként, aminosav terméket eredményezve (2. ábra). 2. ábra. A transzaminálás általános sémája. PLP = piridoxál foszfát, PMP = piridoxamin foszfát. Minden transzamináz piridoxál foszfátot (PLP) használ kofaktorként (3. ábra). A piridoxál foszfát a B 6 -vitamin származéka. 4

5 3. ábra. A piridoxin és a piridoxál foszfát kofaktor szerkezete A transzaminálás mechanizmusa A piridoxál foszfát kofaktor Schiff-bázist képez az enzim lizil oldalláncával, mely helyettesíthető aminosavval. A piridoxál foszfát kofaktor kovalensen kapcsolódik az enzimhez. Az aminosav szubsztrát bekötődése után a kofaktor az aminosavhoz kötődik, az enzimmel való kovalens kapcsolat megszűnik, de nem kovalens kölcsönhatásokkal továbbra is kapcsolódik az enzimhez. A transzaminálás során az aminosav szubsztrát aminocsoportja támadja az enzimkofaktor Schiff-bázist, melynek során aminosav-plp aldimin keletkezik. Ezt követően kinoidális intermedieren keresztül az aminosav és a piridoxál foszfát közötti kötések átrendeződnek, a Schiff-bázis hidrolízisével pedig piridoxamin foszfát jön létre és ketosav szabadul fel (4. ábra). A 4. ábra az aminotranszferázok által katalizált reakció teljes katalitikus folyamatának első részét mutatja, mely során aminosav szubsztrátból ketosav termék keletkezik (balról jobbra mutató nyilak irányba). A PLP-enzim regenerálása során, a ciklus második felében a termékként felszabaduló első ketosav helyére a második ketosav lép be, mely szubsztrátként használódik fel a reakcióban (jobbról balra mutató nyilak irányba) és az aminocsoportot a piridoxaminfoszfáttól átveszi, így a reakció aminosav terméket eredményez. 4. ábra. A transzaminálás mechanizmusa A transzaminálás jelentősége Redukáló ekvivalensek transzportja a citoszolból a mitokondriumba 5

6 A redukált elektronszállítók a terminális oxidáció során adják le hidrogénjeiket és elektronjaikat. A citrátköri reakciókban és a piruvát dehidrogenáz által katalizált reakció során keletkező redukált ekvivalensek a mitokondriumon belül oxidálódhatnak. A glikolízis során (a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz által katalizált reakcióban) keletkező NADH számára transzport mechanizmusra van szükség, mert a belső mitokondriális membrán nem permeábilis a NAD + és a NADH+H + számára sem. A citoszolban keletkező NADH-t két fő transzport mechanizmus juttathatja a mitokondriumba. Az egyik a malát-aszpartát inga, a másik a glicerofoszfát inga. Mindkét inga alkalmas a redukáló ekvivalensek transzportjára. A malát-aszpartát inga reverzibilis, magas citoszolikus NADH koncentráció esetén lép működésbe, a glicerol-3-foszfát inga működése irreverzibilis, a koncentráció viszonyok nem befolyásolják a működését. A glicerofoszfát inga esetében a glicerol-3-foszfát-dehidrogenáz a citoszolban a dihidroxiaceton-foszfátot glicerin-3-foszfáttá alakítja, miközben a NADH oxidálódik. A mitokondriumba jutást követően az enzim mitokondriális izoformája FAD kofaktora redukálása mellett alakítja vissza a glicerin-3-foszfátot dihidroxiaceton-foszfáttá. Ezen inga használatával a citoszolban keletkezett NADH tehát FADH 2 útján kerül a légzési láncba. A malát-aszpartát inga is a redukált elektronhordozók transzportját végzi a mitokondrium belső membránján keresztül. Ezen transzportmechanizmus használatával a citoszolban keletkezett NADH az elektrontranszport láncot NADH-ként éri el. Ennek során a malát-dehidrogenáz enzim által katalizált reakcióban a NADH az oxálacetátot redukálja maláttá a membránközti térben. A malát a malát-α-ketoglutarát transzporter segítségével jut a mátrixba, ahol oxálacetáttá alakulása közben a malát-dehidrogenáz NAD kofaktora redukálódik és NADH szabadul fel. Transzaminálási reakcióban (a glutamát α-ketoglutaráttá alakulása mellett) az oxálacetát aszpartáttá alakul az aszpartát-aminotranszferáz (glutamát-oxálacetát transzamináz) által katalizált reakcióban. Az aszpartát a glutamát-aszpartát cseretranszport segítségével jut ki a membránközti térbe. Itt ismételt transzaminálási reakció során α-ketoglutarátból oxálacetát keletkezik, mely újra részt vehet a NADH mitokondriális transzportjában, úgy, hogy a malát dehidrogenáz által katalizált reakcióban redukálódik (5. ábra). 6

7 5. ábra. A malát-aszpartát inga Nitrogén gyűjtése glutamátba A transzaminálás fő szerepe az aminosavak amino nitrogénjének gyűjtése glutamátba. A glutamát dezaminálódhat (lásd 3. pont) és a glutamátba gyűjtött nitrogén felhasználódhat az urea szintéziséhez, mely által a nitrogén eltávolításra kerül az aminosav pool-ból (lásd 5. pont). A legjelentősebb dezaminálási reakció a glutamát dehidrogenáz által katalizált reakció. A dezaminálást követően az aminosavak szénlánca energiatermelésre használódhat fel. A glutamát jelentősége továbbá, hogy a glutamát-α-ketoglutarát a leggyakoribb aminosav-ketosav pár, mely számos transzaminálási reakcióban vesz részt Transz-dezaminálás A transz-dezaminálás esetében a közös intermedier a glutamát, mely a transzaminálást követően oxidatív dezaminálással alakul tovább. A glutamát dehidrogenáz (GDH) által katalizált reakcióban α-ketoglutarát keletkezik és ammónia szabadul fel (6. ábra). Ebben az oxidatív folyamatban NAD kofaktor használódik fel, a reakcióban az ammónia felszabadulása révén az amino nitrogén kikerül az aminosav pool-ból. A glutamát dehidrogenáz által katalizált reakció in vitro reverzibilis, in vivo azonban az ammónia keletkezés irányába zajlik. A megfordított reakcióban glutamát keletkezik és a kofaktor NADPH. 7

8 6. ábra. Transzdezaminálás A glükóz-alanin ciklus A glükóz-alanin ciklus a szervek közötti nitrogén transzportban jelentős szerepet tölt be. Ez a ciklus a máj és az izom között működik. Jelentősége, hogy a glükoneogenezis révén glükózt szolgáltat az izom számára. Az izomszövet igen nagy transzaminációs kapacitással rendelkezik, ugyanis az itt keletkező piruvát (mely a glikolízisben keletkezik) transzaminálással alaninná alakul. A keletkező alanin a vérkeringéssel a májba szállítódik, ahol transzaminálással piruváttá alakul. A piruvát a glükoneogenezis számára szolgáltat szubsztrátot, glükózzá alakulva ismét energiaforrást biztosít úgy, hogy a vérkeringéssel az izomszövetbe szállítódik (7. ábra). A glükóz piruváttá alakulása során ugyan keletkezik NADH, azonban ez nem használódik fel a piruvát laktáttá történő átalakítására normoxiás állapotban, ugyanis ez a reakció elhasználná a piruvátot, mely nem lenne képes transzaminálási reakcióban alaninná alakulni. Relatív hipoxia esetén azonban (például fokozott izommunka esetén) nem történik meg a glükóz teljes eloxidálása vízzé és CO 2 -dá, az anaerob glikolízis következtében így nagyobb mennyiségű laktát keletkezik. 8

9 7. ábra. A glükóz-alanin ciklus Urea szintézis Az urea szintézis számára a dezaminálási reakciók mellett transzaminálási reakciók is biztosíthatják a nitrogént, így a keletkező urea mindkét nitrogénje származhat glutamátból. Az urea szintézishez szükséges aszpartátot transzaminálási reakció szolgáltatja. A glutamát dehidrogenáz (GDH) által katalizált reakcióban keletkező ammónia az urea ciklus előkészítő lépésében használódik fel, a karbamoil foszfát szintetáz I (CPS I) használja fel karbamoil-foszfát szintézisére. Az urea ciklusba belépő aszpartát az oxálacetátnak a glutamáttal való transzaminálása során keletkezik, tehát az urea ciklus és a citrát ciklus egymással szoros kapcsolatban állnak (8. ábra). 8. ábra. Az urea ciklus és a citrát ciklus kapcsolata. 9

10 Az aminosavak átalakulásai Az aminosavak lebontása általában a transzaminálással kezdődik, melyekben a glutamát és az α-ketoglutarát aminosav-ketosav pár vesz részt. A treonin és a lizin kivételével minden aminosavra van transzamináz reakció. Amennyiben szükséges, a nem esszenciális aminosavak szintézise történhet aminotranszferázok által katalizált reakcióban. Ilyenkor az α-ketosavak használódnak fel prekurzorként és aminocsoport transzfere valósul meg. Azok a transzaminálási reakciók, amelyekben esszenciális aminosavak vesznek részt, általában egyirányúak, mert az ekvivalens α- ketosavakat a szervezet nem képes előállítani Klinikai vonatkozások Kevés, a transzaminázokkal kapcsolatos anyagcserezavar ismert, ugyanis a transzaminázok teljes hiánya az élettel nem összeegyeztethető. Például, a valin és az izoleucin lebontásának is első lépése transzaminálási reakció. Ezen enzimek enzimopátiái ismertek, a transzaminázok hiánya hipervalinémiát, hiperleucinizoleucinémiát okoz. A transzaminázoknak fontos diagnosztikai jelentősége van, ugyanis a szérumban kimutatható mennyiségük fontos információt nyújthat az orvos számára. A transzaminázok jellemzően intracelluláris enzimek, így koncentrációjuk a szérumban alacsony. Normál értékük szérumban a glutamát-oxálacetát-transzamináz (GOT) esetében nkat/l (3,8-15,8 U/l), míg a glutamát-piruvát-transzamináz (GPT) esetében nkat/l (0,5-17,3 U/l). Szövetkárosodás (például sejt-nekrózis, membrán permeabilitás-változás, stb.) esetén azonban a sejtekből kiszabaduló enzim koncentrációja megnő. Mivel a GOT legnagyobb mennyiségben a szívizomban, a GPT pedig a májban található, a transzaminázok mérése a májszövet vagy a szívizomszövet károsodása esetén bír diagnosztikai jelentőséggel. A szérum GOT-aktivitás megnövekedése például szívizom-infarktus után 4-6 órával megnő és kb. 24 óra alatt éri el a maximumot (akár 1700 nkat/l is lehet). Ezt követően az érték csökken, a normál értéket kb. egy hét alatt éri el. Ez alatt a GPT-aktivitás nem változik. A szérum GPT-aktivitás elsősorban májkárosodás esetén növekedik meg. Különösen magas értékek mérhetők fertőzéses májgyulladásos betegek szérumában. Szívinfarktus után is megnőhet a GPTaktivitás a szérumban, ha a máj rossz vérellátása miatt a májsejtek károsodnak. 1.3 Aminosavak reackiói: fenilalanin és tirozin A fenilalanin és a tirozin lebontása döntően a májban történik. 10

11 A lebontás fő útvonalának első reakciója során a fenilalanin monooxigenálási lépésben alakul tirozinná (9. ábra). A fenilalanin lebontás mellékútvonala transzaminálási lépéssel indul, azonban ezen útvonal kapacitása kicsi. A mellékutak a fenilalanin koncentráció megemelkedése esetén kapnak szerepet a fenilalanin lebontásában, mely során a fenilalanin transzaminálással fenilpiruváttá alakul. További mellékutak még a fenillaktáttá vagy fenilacetáttá való átalakulás (lásd később) (11. ábra). A fenilalanin hidroxiláz által katalizált reakció monooxigenálási reakció, melynek során a molekuláris oxigén egyik atomja a fenilalaninra kerül, a másik pedig víz formájában szabadul fel. A reakcióban tirozin keletkezik, ezt követően a fenilalanin és a tirozin metabolizmusa közös (9. ábra). 9. ábra. A fenilalanin és a tirozin átalakulása homogentizinsavvá. A fenilalanin hidroxiláz által katalizált monooxigenálási lépés oxigént és kofaktorként tetrahidrobiopterint (BH 4 ) igényel. A tetrahidrobiopterin GTP-ből szintetizálódik a GTP ciklohidroláz I. által katalizált reakcióban. A BH 4 a fenilalanin hidroxiláz reakcióban oxidálódik és dihidrobiopterinné (BH 2 ) alakul. A BH 2 visszaredukálódhat a dihidrobiopterin reduktáz által katalizált reakcióban (10. ábra). 10. ábra. A dihidrobiopterin reduktáz által katalizált reakció. A fenilalanin és tirozin lebontás második lépésében, egy aminotranszferáz reakcióban tirozinból p-hidroxi-fenilpiruvát keletkezik, eközben α-ketoglutarátból glutamát jön létre (9. ábra). A p-hidroxi-fenilpiruvátot dioxigenáz enzim alakítja homogentizinsavvá. Az ezt követő reakciók eredményeképpen a homogentizinsavból acetoacetát és fumarát keletkezik. 11

12 1.3.1 A fenilketonúria és lehetséges okai A fenilalaninnak és a tirozinnak számos prekurzor funkciója van. Fontosak például a neurotranszmitterek (katekolaminok: dopamin, noradrenalin, adrenalin) és a tiroxin szintézisében is. A tirozináz által katalizált reakcióban tirozinból dopa keletkezik, mely a melanin (pigment) szintézisében használódik fel. A fenilketonúria az aminosav anyagcsere leggyakoribb betegsége. A fenilalanin és a tirozin metabolizmusát érintő hiánybetegségek különböző anyagcserezavarok kialakulásához vezethetnek, így például a csökkent tirozinképződés miatt korlátozott a katecholaminok szintézise és a melanin termelése is Klasszikus fenilketonúria - fenilalanin hidroxiláz hiány A fenilalanin hidroxiláz gén mutációinak következménye a fenilketonúria (PKU) kialakulása. Autoszómálisan recesszíven öröklődik és a fenilalanin-tirozin átalakulást érinti. Az enzimhiány következtében a fenilalanin nem tud továbbalakulni és felhalmozódik. A fenilalanin hidroxiláz enzim hiánya a klasszikus fenilketonúria kialakulásához vezet. A PKU esetében az enzimdefektus a vérben magas fenilalanin koncentráció kialakulását okozza. Jellemző tünete a melaninszintézis zavara miatt kialakuló világos bőrszín és a szellemi visszamaradottság kialakulása. A PKU esetében fontos a korai diagnózis, ugyanis az időben felismert betegség esetén olyan diéta alkalmazható terápiásan, mely minimális mennyiségben tartalmaz fenilalanint a többi esszenciális aminosav biztosítása mellett. A diéta alkalmazásával elkerülhető az idegsejtek károsodása és a szellemi fejlődés zavara, valamint a súlyos tünetek kialakulása. A fenilketonúria szűrővizsgálat Magyarországon kötelező Kofaktor defektusos fenilketonúria - dihidrobiopterin reduktáz hiány A klasszikus fenilketonúriával szemben a kofaktor defektusos fenilketonúria a PKU esetek kb. 3%-át teszik ki. A kofaktor elégtelenség következtében fenilalanin tirozinná alakulását katalizáló fenilalanin hidroxiláz reakció érintett, mely tetrahidrobiopterin kofaktorkt igénylő monooxigenálási lépés. Kofaktor elégtelenség esetében sem tud a fenilalanin tirozinná alakulni, így felhalmozódik és transzaminálási fenilpiruváttá alakul reakcióban (miközben piruvát alakul alaninná) (11. ábra). 12

13 11. ábra. A fenilpiruvát, fenillaktát és fenilacetát kialakulása. A fenilpiruvát és a belőle kialakuló anyagok (fenillaktát és fenilacetát) (11. ábra) felhalmozódnak és a központi idegrendszeri problémák kialakulásához vezetnek. Ezek az anyagok károsítják az idegsejtek mielinhüvelyét így szellemi visszamaradottság alakulhat ki a kofaktor defektusos PKU esetében is. Ez a fajta PKU a kofaktor hiánya miatt nem csak a fenilalanin degradációt, hanem más reakciókat is érint (pl. dopamin szintézis). Ez a három metabolit egészséges emberek vizeletében csak kis mennyiségben van jelen, míg fenilketonúriás beteg esetében koncentrációjuk megnő, a vizelettel fokozottan ürülnek. A betegség jellemzője az egérszagú vizelet. A szellemi visszamaradottságért fenilalanin toxikus hatása felelős, ugyanis magas koncentrációja miatt csökken más aromás aminosavak transzportja az agyba. A terápia ebben az esetben is jelenthet csökkenetett fenilalanin tartalmú diétát (mely azonban tirozint tartalmaz). A biopterin hiány kezelhető biopterin adásával. A reduktáz hiánya súlyosabb tüneteket okoz, ugyanis a katekolamin és szerotonin termelés csökken, ez felelős az idegrendszeri tünetekért Anyai fenilketonúria Abban az esetben, ha a magzat heterozigóta, akkor az anya vérének magas fenilalanin koncentrációja a magzatot károsíthatja, agykárosodást és a szív fejlődési rendellenességét okozva Tirozin aminotranszferáz hiány 13

14 Ritka, de súlyos betegség. Jellemző tünete a tirozinémia, szellemi visszamaradottság is kialakul általában. Az idegrendszer károsodása mellett a szem és a bőr károsodása is jellemzi, egyik jellemző tünete a káposztaszagú lehelet A BH 4 szintézis útvonal enzimjeinek érintettsége Ritka esetekben a GTP-ből történő kofaktor szintézis is érintett lehet a lépéseket katalizáló enzimek valamelyikének defektusa miatt. 1.4 Gyakorlat elméleti alapjai: A transzamináz-reakció megfordíthatóságának vizsgálata Az aminosavak kimutatása ninhidrin próba segítségével történik. A ninhidrin-reakció valamennyi α-aminosavra pozitív. A ninhidrin reagens a terminális aminocsoporttal reagál, majd a ninhidrin az α-aminosavakból képződő ammóniával lilás színű festékké kondenzálódik (12. ábra). 12. ábra. Aminosavak kimutatása ninhidrin reakcióval Szérum GOT és GPT aktivitásának meghatározása optikai teszttel A gyakorlaton a glutamát-oxálacetát-transzamináz (GOT) és a glutamát-piruváttranszamináz (GPT) aktivitásának (13. ábra) szérumból történő meghatározására Warburg-féle optikai tesztet használunk. 14

15 13. ábra. A GOT és a GPT által katalizált reakciók. A Warburg-féle optikai tesztet Warburg 1936-ban írta le. A mérési módszer a NAD + (NADP + ) és NADH (NADPH) eltérő abszorpciós tulajdonságain alapul. A reakcióközegben lévő redukált formák, azaz a NADH vagy NADPH koncentrációjának változása fotometriásan mérhető, ugyanis a mérés során használt 366 nm hullámhosszon az oxidált formák nem nyelnek el fényt, míg a redukált formák abszorpciója jelentős (14. ábra). A mérést nm hullámhosszon tartományában végezzük, ezért a tesztet UV-tesztnek is nevezzük. A módszer felhasználható enzimek aktivitásának mérésére. 14. ábra. A NAD + (NADP + ) és NADH (NADPH) abszorpciója különböző hullámhosszokon. A gyakorlaton a GOT és a GPT aktivitásának mérésére is ezt az UV-tesztet használjuk. Ezen enzimek aktivitása nem határozható meg közvetlenül, mert az általuk katalizált reakcióban nem keletkezik vagy használódik fel NAD + vagy NADH. Annak érdekében, hogy aktivitásukat meghatározhassuk, ún. összetett optikai tesztet kell alkalmaznunk, azaz a transzamináz reakciót 15

16 (mérőreakciót) szükséges egy olyan reakcióval kiegészíteni, melyben NADH (vagy NADPH) képződése vagy felhasználása történik (indikátor reakció) egy segédenzim által. A GOT által katalizált mérőreakcióban aszpartát és α-ketoglutarát szubsztrátokból glutamát és oxálacetát termékek keletkeznek. Ezt követően az oxálacetát maláttá alakul a malát dehidrogenáz (MDH) segédenzim által katalizált indikátor reakcióban, melynek során NAD + keletkezik (15. ábra). A teszt során az abszorpció csökkenését mérjük, ugyanis a MDH elhasználja a NADH-t, így a NADH koncentrációjának csökkenésével a 366 nm-en mért abszorpció is csökken. A Lambert-Beer törvény, a fotometria alaptörvénye segítségével az abszorbeált fény mennyiségéből kiszámítható az abszorbeáló molekula koncentrációja. A = Ɛ * c * l A - abszorpció Ɛ - moláris extinkciós koefficiens c - az abszorbeáló molekula koncentrációja l - az optikai úthossz 15. ábra. A GOT mérése során használt mérőreakció és indikátor reakció. A GPT által katalizált mérőreakcióban alanin és α-ketoglutarát szubsztrátokból glutamát és piruvát termékek keletkeznek. Ezt követően a piruvát laktáttá alakul a laktát dehidrogenáz (LDH) segédenzim által katalizált indikátor reakcióban, melynek során NAD + keletkezik (16. ábra). 16

17 16. ábra. A GPT mérése során használt mérőreakció és indikátor reakció. Annak érdekében, hogy a mérőreakció legyen az egész reakciósor sebességmeghatározója, a MDH és LDH segédenzimeket feleslegben kell alkalmazni. Az abszorbancia változásából meghatározható az enzimaktivitás. Másodpercenként 1 mol NADH képződése (vagy felhasználása) 1 katal, míg a percenként 1 µmol NADH képződése (vagy felhasználása) 1 U enzimaktivitást jelent Aminosavak reakcióinak vizsgálata: fenilketonúria. Szérum és vizelet aminosavtartalmának vizsgálata vékonyrétegű ioncserélő kromatográfiával A vékonyréteg-kromatoráfia gyors és egyszerű analitikai módszer. Alkalmas aminosavak, kis tagszámú peptidek, antibiotikumok, stb., vizsgálatára, így felhasználható a szérum és a vizelet aminosav-összetételének meghatározására. A gyakorlaton ezt a módszert egy anyagcserezavar betegség kimutatására használjuk fel. A gyakorlaton Polygram (Ionex-25 SA-Na) lemezt használunk, mely műanyag fóliára rögzített kationcserélő vékonyréteg, amely poliakrilamid hordozóhoz rögzített szulfátcsoportokat tartalmaz, az ellenion Na +. Az aminosavak elválaszthatósága függ a puffer összetételétől (ph, ionerősség, stb.), mert adott puffer esetén az aminosavak vándorlási sebessége töltéseik számától és a disszociábilis csoportok pk értékeitől függ. A gyakorlaton alkalmazott pufferben a bázikus és aromás aminosavak választhatók el jól egymástól. Az ioncserélő vékonyréteggel bevont lemezre mikropipettával kell felvinni a mintákat. A minta felcseppentésének helyét ceruzával kell bejelölni a lemezen, a lemez aljától kb. 1 cm távolságra úgy, hogy a felcseppentett minták ne érintkezzenek egymással. Annak érdekében, hogy minél kisebb foltokat kapjunk felcseppentéskor, meleg levegőárammal (hajszárítóval) száríthatjuk a mintákat a felvitel során. A mintafelvitelt követően a kromatográfiás lemezt 17

18 zárható edénybe (futtatókádba) helyezzük úgy, hogy az oldószer ne érintkezzen a felcseppentett mintákkal. A kapilláris hatás következtében az oldószer vándorol a rétegen. Az oldószert a lemez tetejétől 1-1,5 cm távolságig kell hagyni felfutni. A lemezt ezt követően ismét meg kell szárítani hajszárítóval, majd a foltok láthatóvá tételéhez előhívó reagenssel kell bepermetezni a lemezt, majd a foltok előtűnéséhez ismét megszárítani. Az értékelés során meg kell figyelni a minta foltjainak a felcseppentés helyétől számított távolságát, amennyiben szükséges a foltok átmérőit is. 18

19 Önellenőrző kérdések 1. Hogyan vesznek részt transzaminálási reakciók a citoszolban keletkező redukált elektronszállítóknak a mitokondriumba történő transzportjában? 2. Hogyan vesznek részt transzaminálási reakciók a glükóz-alanin ciklusban? 3. Milyen diagnózis állítható fel 260 nkat/l-nél magasabb GOT (glutamát-oxálacetáttranszamináz) szérum koncentráció érték esetén? 4. Milyen diagnózis állítható fel 290 nkat/l-nél magasabb GPT (glutamát-oxálacetáttranszamináz) szérum koncentráció érték esetén? 5. Mi a különbség a klasszikus és a kofaktor defektusos fenilketonúria között? 19

20 IRODALOMJEGYZÉK 1. Biokémia és molekuláris biológia. II. Anyagcsere. Harmadik kiadás. Debrecen, Szerkesztette: Fésüs László. Írták: Aradi János, Fésüs László, Punyiczki Mária, Sümegi Balázs, Szondy Zsuzsa és Tőzsér József. 2. Orvosi biokémia. Szerkesztette: Ádám Veronika. Második kiadás. Budapest, Medicina Könyvkiadó Rt. 3. Textbook of Biochemistry with clinical correlations. Ötödik kiadás. Szerkesztette: Thomas M. Devlin, Wiley-Liss, Biokémiai gyakorlatok évi változatlan utánnyomás. Szerkesztette: Teichmann Farkas. Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Biokémiai és Molekuláris biológiai Intézet. Debreceni Egyetemi Kiadó, A Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) honlapja URL: 20