Nyomok - Death Valley, CA 2007 / 10 / 11 Igazságügyi genetika alapjai Molekuláris orvostudomány - molekuláris bűnjelek genetikai analízise Pádár Zsolt
Igazságügyi genetika vannak az ÉLET dolgai és vannak ROSSZ dolgok az életben ezek egy részét mi tesszük másokat velünk tesznek meg és vannak, amiről azt állítják, mi tettük meg vannak, az életben NAGYON ROSSZ dolgok is amiről azt gondoljuk, csak mással történhet meg BŰNCSELEKMÉNYEK
Genetika Transzmissziós genetika Molekuláris genetika Populáció genetika Ökológiai genetika Kvantitatív genetika Viselkedés genetika Klinikai genetika Citogenetika Mitokondriális genetika Genomika forward genetika reverse genetika evolúciógenetika - molekuláris taxonómia epigenetika farmakogenetika igazságügyi genetika patogenetika genetikai informatika génsebészet - genetic engineering genetikai etika Jogtudományok Kriminalisztika Orvostudományok Állatorvostudományok
2008. 11. 1. / 2009. 05. 04.
Az igazságügyi genetika Genetika és jogtudomány a gyermek tulajdonságai nem csupán a szülői tulajdonságok összegződése a tudomány csak eljárás, nem maga az igazság Alkalmazott tudomány fizikai nyomok és anyagmaradványok vizsgálata molekuláris genetikai technikák objektív alkalmazásával, ezáltal igazolva az adott bűncselekményt illetve az azzal fennálló kapcsolatot eszköz, melynek segítségével a kriminalisztikai hipotézisek megerősíthetők avagy elvethetők Kölcsönös befolyás az alaptudományokra molekuláris genetikai módszerek alkalmazása, módosítása alaptudományokkal kapcsolatos követelmények módosítása új tudományos adatok szolgáltatása gazdasági, társadalmi fejlődésére, közösségekre és a mindennapok emberére gyakorolt hatások
Szakkérdések Humán vonatkozások bűncselekmények emberölés, rablás, erőszakos közösülés vitatott szülőség leszármazás rendkívüli halál rendkívüli szívhalál (SCD) arrhythmiás szívhalál szindróma hirtelen csecsemőhalál (SIDS) tömegszerencsétlenségek áldozatok azonosítása
Szakkérdések Nem humán vonatkozások állatok kutyák, macskák, vadvilág állatkínzás, állat támadások, vadorzás entomologia halál időpontja, helye növények és gombák levelek, magvak pollenek Mikrobák talajbaktériumok
Genetikai polimorfizmusok analízise Recesszív gén hőmérséklet szenzitív expressziója TYR gén tirozináz enzim melanin szintézis Defektív tirozináz funkcióvesztés normál testhőmérsékleten
Első lépés - a helyszín CSIUniversity
Vizsgálati komplexitás - DNA investigation Azonosítás identifikáció Eredet meghatározása - honnan származik az eredmény? Azonosságok megállapítása közös eredet individualizáció sejtmagi és mitokondriális DNS Bármilyen biológiai anyagból és anyagmaradványból történhet Mennyiségi korlátok vizsgálhatóság, reprodukálhatóság, igazolhatóság Minőségi korlátok minőségromlás, degradálódás, bomlás, szennyezettség, felülszennyezettség Reakció komplexitás sztochasztika Genetikai komplexitás - pigmentáció
Követelmények Az igazságügyi genetikai vizsgálatok nem tudományos kísérletek, hanem tudományos módszerekkel végzett analízisek Érzékenység, megbízhatóság, ismételhetőség, ellenőrizhetőség és vannak, amiről azt állítják, mi tettük meg Technológia, módszertan Tudományos kritériumok, statisztika Etikai kritériumok Felelősség Minőségirányítás
A kiindulás Humán és nonhumán DNS Sejtmagi DNS Autoszómák Repetitive markerek (VNTR, STR) Single nucleotide polymorphisms (SNP) Ivari kromoszómák Repetitive markerek (VNTR, STR) Single nucleotide polymorphisms (SNP) Mitokondriális DNS Cytochrome (b) Kontroll régió (HVI, HVII, CR) SNP
Mérföldkövek Landsteiner Jeffreys Mullis
PCR
Short Tandem Repeats (STRs) Fluoreszcens festék AATG AATG AATG 7 repetíció 8 repetíció A flanking régiók (ahol a PCR primerek kötnek) konstans, a repetitív régió variabilis a mintákban Homozigota = mindkét allél egyforma hosszú Heterozigota = különböző allélhosszak A primerek pozíciója meghatározza a PCR termék méretét
Elválasztás és detektálás
Jelölt DNA fragmens (PCR termék) Kapilláris vagy gél Fluoreszcens detektálás Minta detektálás Ar+ LASER (488 nm) CCD Panel Méretszeparálás Detektálási régió Fluoreszcencia ABI Prism spectrograph Szín szerinti szeparálás
A laboratóriumban
Short Tandem Repeats (STRs)
13 STR lokusz kromoszómális pozíciója TPOX D3S1358 D5S818 FGA CSF1PO D8S1179 D7S820 TH01 VWA AMEL D13S317 D16S539 D18S51 D21S11 AMEL
Személyazonosító vizsgálat-multiplex STR AmpFlSTR SGM Plus kit Két eltérő személy D3 amelogenin D8 TH01 D19 VWA amelogenin D3 D19 D8 TH01 VWA D21 véletlenszerű egyezés esélye: ~1 a 3 milliárdhoz FGA D21 FGA D16 Allélméret (bp) D16 D18 D18 D2 Gombostűfejnyi vérfoltból kb. 5 óra elteltével nyert eredmény D2 10 STR és a biológiai nem egyidejű vizsgálata
9 autoszómás lokusz
15 autoszómás lókusz
mondjuk, egy szúnyogból? Ez itt én vagyok!!!
Növekvő jelentőség - Y-kromoszóma http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/ Human Genome 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Y STR lokuszok DYS19 DYS389I/II DYS390 DYS391 DYS392 DYS393 DYS385 YCAII DYS437 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y DYS438 DYS439
17 Y-kromoszómás lokusz - haplotípus
Beszédes boríték brutálisan meggyilkolt áldozat ellentmondó vallomás egyszerű személyiség nem én voltam kevés információ, sok kétség boríték a helyszínen sejtmagi DNS vizsgálat
Az ujjnyomat
Az ujjnyomat - eredmények autoszómális Y-STR lókuszok lókuszok származás
Egy-nukleotid polimorfizmusok (SNP s) Több millió SNP a genomban kb. 500-1000 bázispáronként pontmutációk génekben és/vagy regulátor régiókban Fenotípus kapcsolatok pigmentáció, testalkat, Leszármazási vonalak (Y-SNP s) Diagnosztika multifaktoriális poligénes betegségek
SNaPshot TM Multiplex Kit: Különböző hosszúságú farokkal tervezett primerek egy bázis extenzió Primer T T C A A G C Primer extenzió és termináció G Templát A T A T G C G C T A T A C G C G Szín = genotípus Elektroforézis Hossz = lókusz
Automatikus analízis
A mitokondriális genom cirkuláris DNS Cambridge Referencia Szekvencia ~ ezer kópia sejtenként nincs hiszton asszociáció magas mutációs ráta D-loop esetében ~ 9000 év alatt 1% oxidáló szabadgyök érzékenység betegségek, öregedés nincs excíziós repair-rendszer nem javítódik, csak szelektálódik palacknyak hatás heteroplazmia rekombináció egy mitokondriumon belül, nukleáris DNS-re jellemző rekombinációs variancia nincs kizárólag anyai öröklődésű öröklődése földrajzilag determinált a nem kódoló szakaszok mutációinak rögzülése és maternális öröklődése lehetőséget ad a populációk geológiai eredet szerinti elkülönítésére
A kontroll régió ND5 ND4 ND4L 16024 16365 73 340 HV1 cyt b ND6 Kontroll Régió (D-loop) O H 1/16569 HV2 16024 576 12S rrns 16 569 bp O L 16S rrns ND1 ND2 Kontroll Régió (CR) D(isplacement)-loop ~1120 bp replikációs origó hipervariábilis szakaszok HV1, HV2 és HV3 alacsony szelekciós nyomás a variációk forrása csak mutáció Szekvencia-adatbázisok EMPOP ND3 COIII ATP6 ATP8 COII COI
Igazságügyi szempontok A mtdns egyedi azonosításra kevésbé alkalmas, mint a nudns Nem az egyént, hanem az anyai leszármazási haplotípust identifikálja Ugyanakkor A diverzitás mértéke miatt nagy a valószínűsége annak, hogy két véletlenül kiválasztott személy különböző mtdns haplotípussal rendelkezik Populációtól függetlenül ez az érték általában 95 % valószínűség fölött van Új minták esetén kb. 2/3 része a mintáknak új haplotípust mutat Csak kevés ún. közönséges gyakori haplotípus van, melyek gyakorisága több mint 1% Több ezer haplotípus figyelhető meg, emiatt a haplotípusok relatív gyakorisága alacsony
Terminális (Sanger-féle) szekvenálás dntp és ddntp eltérő fragmenshossz jelölt primerek vagy jelölt nukleotidok dideoxi inhibits!
D-loop szekvencia anyai leszármazási vonal azonosításának igazságügyi eszköze A vizsgált minták mtdns szekvenciáját a referenciaként használt CRS-hoz illesztjük (pl. 16071-16140) A referencia szekvenciától való eltérések pozíciója és nukleotidja megadja az adott minta mtdns haplotípusát Bizonyíték (Q) 16093C 16129A Összehasonlító (R) 16093C 16129A
A haplotípusok
Leszármazás 3 AFRIKAI - 9 EURÓPAI - 7 ÁZSIAI FŐ HAPLOCSOPORT
Eseti alkalmazás 2004 házaspár eltűnése használati tárgyak, fésű, fogkefe, sapka, pohár 2006 NN férfi holttest emberölés gépkocsiból hajszál-töredék morfológiai hasonlatosság a fésű hajszálaival 2007 koponya, állkapocs 2008 összehasonlító minták gyermek és testvér Kié a koponya és a hajszál töredék?
Koponya maradvány
fésű csont hajszál gyermek testvér Eredmények
Eredmények kizárás
A cytochrome b gén 14747 15886 pozíció (1140 bázispár) cytochrome b-c1 komplex kódoló szekvencia: - kisebb mutációs ráta - szinonim mutációk Genetikai drift - fajok közötti szekvenciális különbségek Filogenetikai analízisek
A cytochrome b gén mint a fajazonosítás igazságügyi eszköze 14747 15886 pozíció (1140 bázispár) PCR: 358 bp szakasz Átlagos eltérés kb. 15-20%
SNP a cytochrome b génben (Canis f.)
A vélemény Szakértői válasz kiértékelés Populáció genetika Reprezentatív populáció Statisztikai genetika Származás Leszármazás, rokonság Téves vélemények Technikai okok Kontamináció, inkompatibilitás Személyi okok Jártasság
Bayes-féle hipotézis tesztelés Vád hipotézise (Hp): Pl.: A helyszínen talált vérnyom XY-tól származott Védelem ellenhipotézise (Hd): Pl.: A vérnyom az adott népességből véletlenszerűen kiválasztott másik, NN személytől származott Bayes-formula (valószínűségi tesztelés) Pr(H Pr(H p d I) I) a priori valószínűségi hányados (PrPR) Pr(E Pr(E H H p d,i),i) = Pr(H Pr(H p d E, E, I) I) valószínűségi a posteriori hányados valószínűségi (genetikai bizonyíték) hányados (PoPR) Pr: valószínűség E: bizonyíték I: információ H: hipotézis p: ügyész d: ügyvéd
A valószínűségi hányados Ha a biológiai nyom egy személytől származott, és a laboratóriumi hiba kizárt, Pr(E Hp,I)=1. LR Pr(EH p,i) = Pr(EH d,i) = Pr(G c 1 G s,h,i),i) A valószínűségi hányados legegyszerűbb formájában a genetikai-profil előfordulási gyakoriságának reciprokával egyezik meg. d Egyezési valószínűség 1 Pr(G H c d Profilgyakoriság Pr: valószínűség E: bizonyíték G: genetikai profil I: információ H: hipotézis p: ügyész d: ügyvéd c: helyszín s: gyanúsított
Köszönöm a figyelmet! Genetikailag módosított karácsonyfa, Amboy, CA