Mikotoxin-szennyezettség változása és hatása a kukorica-alapú bioetanol előállítási folyamatban Effects and changes of mycotoxin contamination in the process of corn-based bioethanol production Prettl Zsolt, Lepossa Anita, Tóth Éva, Kelemenné Horváth Ilona, Szemesné Németh Ágnes, Nagy Endre Pannon Egyetem, Műszaki Informatikai Kar, Műszaki Kémiai Kutatóintézet H-8200 Veszprém, Egyetem u. 10. Summary Nowadays bioethanol production is a growing industry. In this work dry-grind ethanol production was carried out from different corns (uncontaminated; aflatoxin B 1 contaminated; zearalenon and fumonisin B 1 +B 2 contaminated) and the changes of the ratio of the solid-liquid phase as well as toxin concentrations were examined in laboratory scale. During the fermentation, the ethanol yields of micotoxin-contaminated cornmashes were 27% lower, due to 10% less glucose-concentrations of these raw materials, compared to uncontaminated ones. To the end of the whole process, the initial 20% solid content reduced to 7% in both cornmashes, namely contaminated and uncontaminated ones. Differences were observed in concentration changes of the three examined toxins. Aflatoxin appeared mainly in the solid phase of the mash, its concentration decreased one-sixth of the initial value. Zearalenone also localized in the solid phase, but its concentrations did not alter during the etanol production process. Fumonisin concentration increased 3 times at the end of the process while it dissolved in the liquid phase in significant amount. Scale-up examinations carried out from inert raw material with SSF technique resulted in average 0.36 g ethanol/g corn yield. Bevezetés A kukorica emberi táplálkozásban és takarmányként betöltött szerepe mellett egyre jelentősebb az ipari felhasználása, ugyanakkor gazdaságosan előállítható energiaforrás is. Ez utóbbinak köszönhető, hogy világszerte a bioetanolelőállítás legfontosabb alapanyaga. A világ egyes területein különösen a mediterrán és trópusi éghajlaton a kukorica gombás megbetegedései nem csupán termésátlagot befolyásoló tényezők. A termőföldön és a raktározás során mikotoxinokat termelő penészek (Aspergillus, Fusarium és Penicillium és Alternaria fajok) anyagcseretermékeikkel komoly élelmiszerbiztonsági és állat-egészségügyi kockázatot jelentenek. A legjelentősebb mikotoxincsoportok aflatoxinok, fuzárium-toxinok (trichotecének, zearalenon, fumonizinek), ochratoxin A élőszervezetre gyakorolt hatásaival, kimutatásuk módszereivel és a megelőzés lehetőségeivel számos tanulmány foglalkozik [1,2,3,4,5,6]. Jelen munkában vizsgált mikotoxinok élelmiszerekben és takarmányokban megengedett határértékeit az 1. táblázat mutatja. A három feltüntetett toxincsoport közül aflatoxin esetében a legszigorúbbak a határértékek mind a takarmányozásra, mind az emberi fogyasztásra szánt termékekre. 1. Táblázat Mikotoxin határértékek és ajánlások Felső határértékek (μg/kg termény) AFB 1 ZEA Fumonizinek Közvetlen emberi fogyasztásra szánt gabonafélék Nem közvetlen emberi fogyasztásra szánt (>500μm) gabonaőrlési termékek (19041010 KN-kód) Takarmányalapanyagok 2,0 [7] EU: 20 [8] US: 20 [9] EU: 20 [8] US: 20 [9] Magyarázat: *irányérték 350 [10] 200 [10] 3000* [5] EU: 1000 (B 1+B 2) [10]; US: 2-4000 (B 1+B 2+B 3) [9] 1400 (B 1+B 2) [10] 20000 (sertés, B 1+B 2+B 3) [8]; 60000* (B 1+B 2) [5]
A kukoricaszemekből történő etanol előállításának két fő technológiája ismert, ezek a nedves őrlésű valamint a szárazőrlésű technológiák. A szárazőrlésnél nincs frakciókra válás, a teljes szemet megőrlik, vízzel keverik és így kerül az etanol előállítás folyamatába, ekkor a kinyerhető maximális etanol mennyiség elérése, míg a nedves őrlés esetében több hasznos termék (pl. glükózszirup, keményítő, invertcukor stb.) előállítása a cél. A nedves őrlésű technológiához a nagyobb a beruházási költség mellett nagyobb várható nyereség társul. Ennek ellenére 2007-ig az Egyesült Államok etanol iparága több mint 80%- ban szárazőrléses technológiát alkalmazott [11]. Laboratóriumi kísérleteink során vizsgáltuk a kukorica mikotoxin tartalmának változását a szuszpenzió folyadék és szilárd fázisában a szárazőrléses technológia egyes lépéseit követően. Összehasonlítottuk a tiszta és mikotoxinnal szennyezett kukorica fermentálása során előállítható maximális etanol mennyiségét. Félüzemi kísérleteket indítottunk toxinnal nem szennyezett kukoricából történő etanol előállítására SSF technológiával. koncentrációban glüko-amilázt (Spirizyme Fuel, NOVOZYME) használtunk. A ph optimális értékeinek beállítása 20%-os NH 4 OH-val illetve 25%-os H 2 SO 4 -val történt. A fermentálást 2 dm 3 hasznos térfogatú Biostat Aplus asztali fermentor készülékben, Ethanol Red (FERMENTIS, termékkód: 42138) élesztőtörzzsel (7 g/kg kukorica szárazanyag) végeztük 62 órán keresztül. Az etil-alkohol kidesztillálását szakaszos üzemű laboratóriumi desztilláló berendezéssel végeztük. Anyagok és módszerek A kísérleteket három alapanyaggal végeztük: mikotoxinnal nem szennyezett, Aflatoxinnal (AFB 1 ) szennyezett, valamint Zearalenonnal és Fumonizinnel (FB 1 +B 2 ) szennyezett kukorica. A szemes kukoricát kalapácsos terménydarálón (2880 1/min, 2 mm-es rosta) daráltuk, majd a laboratóriumi kísérletekhez kávédarálón finomra őröltük (<1 mm). Laboratóriumi kísérletek (folyamatát az 1. ábra szemlélteti) A kukoricaminták keményítőbontását 2000 g tömegű, 20%-os kukoricaőrleményt tartalmazó desztillált vizes szuszpenziókkal végeztük teljesen kevert üvegreaktorban. A keményítő elfolyósításához 0,88 mg/g kukorica szárazanyag koncentrációban α-amilázt (Liquozyme SCDC, NOVOZYME), az ezt követő elcukrosítási lépésben pedig 1,1 mg/g kukorica szárazanyag 1. ábra: Laboratóriumi kísérletek folyamatábrája A mintavételek a 2. táblázatnak megfelelően történtek az 1. folyamatábrán jelölt I-VII. pontokban, kevertetés alatt. Az ismert tömegű mintákat centrifugáltuk (12000 rpm, 4 C, 1 h), majd meghatároztuk azok folyadék- és szilárd fázisarányát.
2. Táblázat: Mintavételi pontok magyarázata az 1. ábrához Vizsgált komponens I. II. III. IV. V. VI. VII. Glükóz koncentráció - - + - - - - Toxin koncentráció + + + + + + + Etil-alkohol koncentráció - - - - + + + Magyarázat: - nem történt vizsgálat; + történt vizsgálat alapanyaghoz. A fermentálás ezen a hőmérsékleten 40 órán át, majd 28 C-on további 22 órán keresztül történt. A glükóz koncentrációját folyadékkromatográfiás, az alkohol koncentrációját gázkromatográfiás módszerrel határoztuk meg. A mikotoxin-vizsgálatok MSZ EN 12955:2000 mintaelőkészítési és AOAC 990.33:1994 (AFB 1 ), AOAC 985.18.:1988 (ZEA) és MSZ EN 13585:2002 (FB 1 +B 2 ) vizsgálati szabványok szerint történtek. Félüzemi kísérletek (folyamatát a 2. ábra szemlélteti) A kísérleteket 46 dm 3 hasznos térfogatú, teljesen kevert üvegreaktorban végeztük a 2. folyamatábrának megfelelően, SSF technológiával, toxinnal nem szennyezett alapanyagból. A kukoricaminták keményítőbontása 42 kg tömegű, 30%-os kukoricaőrleményt tartalmazó desztillált vizes szuszpenzióból történt. A keményítő elfolyósítását 0,4 mg/g kukorica szárazanyag koncentrációban α-amilázzal (Liquozyme SCDC, NOVOZYME) végeztük két lépésben, melyek közé egy 40 perces hőkezelést (92-97 C) iktattunk. Az előcukrosítást 1 mg/g kukorica szárazanyag koncentrációban, glükoamilázzal (Spirizyme Fuel, NOVOZYME) végeztük úgy, hogy egy órán át tartottuk a reakcióelegyet az enzim optimális hőmérséklettartományán (83 C). Kukoricaszuszpenzió (keményítő-elfolyósításon átesett, előcukrosított) és desztillált víz 50-50%-os elegyében 0,5 g/kg kukorica szárazanyagra számított élesztő (Ethanol Red FERMENTIS, termékkód: 42138) propagálását végeztük (6 h, 34 C, 0,4 l/min levegőztetés) Biostat Aplus asztali fermentor készülékben. Ezt a propagáló anyagot adtuk hozzá a 32 C-ra lehűtött fermentálási 2. ábra: Félüzemi kísérletek folyamatábrája A desztillálást egy szedőfeltét segítségével közvetlenül a reaktoredényben végeztük. A termelt etil-alkohol koncentrációját gázkromatográfiás módszerrel határoztuk meg. Eredmények Laboratóriumi kísérletek Az egyes kukorica-alapanyagokból előállított glükóz-koncentrációk a mikotoxinnal szennyezett minták esetén átlagosan 10%-kal alacsonyabbnak bizonyultak. A toxinmentes kukoricák esetén tapasztalt alacsonyabb hatásfokú fermentálás ellenére azok fajlagos alkohol kihozatala 27%-kal jobbnak mutatkozott (3. táblázat).
3. Táblázat: Fermentálási eredmények Kukorica alapanyag Toxinmentes AFB 1 - szennyezett ZEA+FB 1+ B 2 -szennyezett Kiind. glükóz konc. (g/dm 3 ) Etilalkohol konv. (%) Fajlagos etilalkohol kihozatal (g EtOH/g kukorica szárazanyag) 169 85 0,34 171 82 0,32 151 88 0,22 153 90 0,24 157 86 0,23 151 84 0,25 A toxinos és nem toxinos kukoricával végzett kísérletekben a szuszpenzió szilárd és folyadékfázisának aránya azonos mértékben változik az egyes technológiai lépésekben (3. ábra). A kiindulási 20%-os szárazanyag tartalom a folyamat végére 7%-ra csökken, ami főként fehérjéből és rostanyagokból (lignocellulóz, hemicellulóz, pektin) álló, jó beltartalmi értékkel bíró anyag. lokalizálódik. A folyadékfázisban mért alacsony koncentrációt okozhatja a kukoricából beoldódott egyéb komponensek zavaró hatása, melyek elfedhetik a valós toxintartalmat. Ez a hatás a szilárd fázisból történő elemzést is befolyásolhatja. 4. ábra: Aflatoxin koncentrációk változása a szilárd és folyadék fázisban A multimikotoxin-tartalmú (ZEA, FB 1 +B 2 ) kukoricából végzett előkísérlet során a zearalenon a teljes folyamat alatt a szilárd fázisból mutatható ki, a folyadékfázisban a koncentrációja mindvégig méréshatár alatt maradt. Az aflatoxin viselkedésétől eltérően a zearalenon koncentrációja jelentősen nem változik a kísérlet során (5. ábra). 3. ábra: A szilárd és folyadékfázis arányának változása a technológiai lépések végén Mikotoxin koncentrációk változása Az aflatoxin vizsgálatok során a kiindulási kukoricaőrleménynél mutatkozó nagy szórás a mintavétel homogenitási nehézségeire utal, minthogy a mikotoxinok lokálisan előforduló szennyezést okoznak a terményekben (4. ábra). Megfigyelhető, hogy a toxin koncentrációja folyamatos csökkenést mutat, a desztillálás végére mintegy hatodára csökken. A toxin jelentős része a teljes folyamat során a szilárd fázisban 5. ábra: Zearalenon koncentrációk változása a szilárd és folyadék fázisokban A fumonizin koncentrációja az általunk vizsgált másik két mikotoxinnal ellentétben folyamatos növekedést mutat az alkohol előállítás során (6. ábra). A végkoncentráció a kiindulási érték háromszorosa, amely a technológiai lépések során
bekövetkező toxinfeltáródásnak is betudható. A zearalenonnal és aflatoxinnal ellentétben a fumonizin jelentős mértékben képes a folyadékfázisba beoldódni, melyet jól magyaráz a toxin molekulaszerkezete (a hosszú szénvázon található négy karbonil-csoport mellett az amino- és hidroxil-csoportok is elősegítik a vízoldhatóságot). 6. ábra: Fumonizin B 1 +B 2 koncentrációk változása a szilárd és folyadék fázisokban Félüzemi kísérletek A méretnövelés az újabb technológiának (SSF) köszönhetően jó, átlagosan 0,36 g/g kukorica szárazanyag fajlagos etil-alkohol kihozatalt eredményezett. A folyamatban alkalmazott hőkezelés a keményítőbontás hatásfokának javítása mellett megfelelő körülményeket biztosított a sikeres fermentációhoz. A propagálási folyamattal jelentősen csökkentettük a szükséges élesztőalapanyag mennyiségét. A toxinmentes kukorica fermentációjával beállított félüzemi rendszert a későbbiekben a laboratóriumi kísérletekhez hasonlóan aflatoxinnal szennyezett kukoricával is üzemeltetni kívánjuk a mikotoxin koncentráció-változásának és az esetleges alkohol-kihozatalra gyakorolt hatásának kimutatására. Köszönetünket fejezzük ki Dr. Kovács Sándornak és Dr. Kotsis Leventének a munkánk során nyújtott értékes és odaadó szakmai segítségükért. Irodalomjegyzék [1] Scientific Report submitted to EFSA, CFP/EFSA/FEEDAP/2009/01. 1-192. [2] Wilkinson, J.R., Abbas, H.K., Toxin Reviews, 27:227-260. (2008) [3] Kabak, B., Dobson, A.D.W., Var, I., Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 46:593-619. (2006) [4] Bennett, J.W., Klich, M., Clinical Microbiology Reviews, 16(3): 497-516. (2003) [5] Szeitzné Szabó M. (Szerk.), Magyar Élelmiszerbiztonsági Hivatal, 1-33 (2009) [6] Turner, N.W., Subrahmanyam, S., Piletsky, S.A., Analytica Chimica Acta, 632:168-180 (2009) [7] 1881/2006/EK Bizottsági rendelet HL L 364., p.5. (2006) [8] FAO Food and Nutrition Paper No. 81. (2004) [9] CAST Task Force Report, No. 139., CAST, Ames, Iowa, pp.1-191. (2003) [10] A BIZOTTSÁG 1126/2007/EK RENDELETE, Az Európai Unió Hivatalos Lapja, L 255/14-17 (2007) [11] Vertés, A.A., Qureshi, N., Blaschek, H.P., Yukawa, H. (Eds), Biomass to Biofuels: Strategies for Global Industries, Wiley, Chippenham, 187-198 (2010) Köszönetnyilvánítás A kutatómunka az NKTH projekt keretében végeztük (NKTH TECH_08_A3/2-2008-0385).