A MICROSATELLITA-STÁTUS ÉS A MORFOLÓGIAI KÉP ÖSSZEFÜGGÉSE VASTAGBÉLRÁKOKBAN Szentirmay Zoltán, Gallai Mónika, Serester Orsolya, Szőke János, Tóth Erika Országos Onkológiai Intézet, Sebészi és Molekuláris Daganatpatológiai Centrum, Budapest A microsatellita-instabilitás (MSI) hozzájárul a vastagbélrák kialakulásához, befolyásolja annak várható kórlefolyását és a személyre szabott daganatellenes kezelés körülményeit. Az MSI a daganat morfológiai megjelenésének megváltozásával is együtt jár, ezért a rutin hematoxilin-eozin (H&E) alapú szövettani vizsgálat alkalmas lehet a microsatellita-státus valószínűsítésére. Munkánk célja volt, hogy a rutin szövettani diagnosztikai gyakorlat számára használható módon bemutassuk azokat a klinikopatológiai jellegzetességeket, amelyek megkönnyítik a microsatellita-stabil és -instabil colorectalis carcinomák felismerését. Az Országos Onkológiai Intézet Sebészi és Molekuláris Daganatpatológiai Centrumában vizsgált vastagbélrák-esetek közül 384 daganat lokalizációját, klinikai stádiumát, microsatellita-státusát, valamint a daganat felfedezésekor a betegek életkorát figyelembe véve választottunk ki 26 herediter nem-polyposus colorectalis carcinomát (HNPCC), 22 sporadikus MSI-H (magasfokú microsatellita-instabilitás) és 76 microsatellita-stabil (MSS) vagy alacsonyfokú microsatellita-instabilitást mutató (MSI-L) carcinomát. Ezekben az esetekben vizsgáltuk az MSI-státussal összefüggésbe hozható morfológiai jellegzetességek előfordulási gyakoriságát. Vizsgálatunk során kimutattuk, hogy az MSS/MSI-L, illetve a HNPCC és az időskori sporadikus MSI-H tumorok a kormegoszlás, a felfedezéskori klinikai stádium, a lokalizáció és a szövettani szerkezet segítségével nagy valószínűséggel akkor is felismerhetőek, ha egyébként genetikai microsatellita-instabilitási teszt nem áll rendelkezésre. A kifejezett microsatellita-instabilitással összefüggésbe hozható morfológiai jel a tumorsejtek között vagy a daganat stromájában tumorinfiltráló limfociták jelenléte, a kerek vagy ovális, nagy izolált nucleolust tartalmazó vesicularis sejtmag és az expanzív növekedés a daganat széli részein. Ha a rutin patológiai vizsgálat során a fenti klinikopatológiai jellegzetességeket figyelembe vesszük, akkor nagy valószínűséggel helyesen következtethetünk egy vastagbélrák microsatellita-státusára. Ez az eljárás megkönnyíti és széles körben hozzáférhetővé teszi a legmegfelelőbb daganatellenes terápia meghatározását, illetve az ehhez szükséges molekuláris patológiai vizsgálatok kiválasztását. Magyar Onkológia 54:169 178, 2010 Kulcsszavak: colorectalis carcinoma, microsatellita-instabilitás, tumormorfológia, kliniko patológiai alapú genetikai predikció Microsatellite instability (MSI) influences the development and clinical course of colorectal cancers (CRCs) and induce specific morphological alterations of such neoplasms, therefore hematoxylin-eosin (H&E) based histology allows to predict the microsatellite status of a given tumor. The aim of this article is to demonstrate clinicopathological features that are useful in recognition of microsatellite-stable and -unstable CRCs on routine histological examination. In the Center of Surgical and Molecular Pathology of National Institute of Oncology, from 384 CRC cases 26 hereditary non-polyposis colorectal cancers (HNPCC), 22 sporadic high-level microsatellite-instable (MSI-H) cancers and 76 microsatellite-stable (MSS) or low-level MSI (MSI-L) CRCs were selected on the basis of the localization, clinical stage, microsatellite status, and patient age at the time of the diagnosis. Our results showed that we can recognize MSS/MSI-L carcinomas, HNPCCs and sporadic MSI-H tumors with high probability on the base of clinicopathological features like patient s age, tumor localization, clinical stage and histological characteristics of CRCs, even if the genetic MSI test is not available. The main morphological characteristics related to microsatellite instability are intratumoral or stromal infiltrating lymphocytes/leukocytes, large, vesicular nuclei with prominent nucleoli, and expansive infiltrative edge of the tumors. Careful and detailed morphological analysis of colorectal cancers helps to select the appropriate molecular method to determine the molecular features that influence the clinical care of patients and allow to consider the most appropriate anti-tumor therapy. Szentirmay Z, Gallai M, Serester O, Szőke J, Tóth E. Correlation between microsatellite instability and morphology in colorectal cancer. Hungarian Oncology 54:169 178, 2010 Közlésre érkezett: 2010. május 13. Elfogadva: 2010. május 17. Levelezési cím: Dr. Szentirmay Zoltán Országos Onkológiai Intézet 1122 Budapest Ráth György u. 7 9. Telefon: (06-1) 224-8783 Fax: (06-1) 224-8671 E-mail: szentirmay@ oncol.hu A dolgozat az EGT és a Norvég Finanszírozási Mechanizmusok támogatás: Közös stratégia kifejlesztése molekuláris módszerek alkalmazásával a rák kezelésére (megelőzésére, korai diagnózisára és terápiájára) Magyarországon és Norvégiában. No 107/2008/ NA támogatásával készült. Rövidítések jegyzéke: CRC: colorectalis adenocarcinoma; H&E: hematoxilin-eozin; HNPCC: herediter nem-polyposus colorectalis carcinoma; i-til: intratumorális tumorinfiltráló limfocita; MMR: mismatch repair; MSI: microsatellita-instabilitás; MSI-H: magasfokú microsatellita-instabilitás; MSI-L: alacsonyfokú microsatellita-instabilitás; MSS: microsatellitastabil; SIL: stromát infiltráló limfocita; TIL: tumorinfiltráló limfocita Keywords: colorectal carcinoma, microsatellite instability, tumor morphology, clinicopathologically based genetic prediction 169
SZENTIRMAY ÉS MTSAI A colorectalis adenocarcinomák (CRC) mai ismereteink szerint gyakorlatilag két, egymástól alapvetően eltérő genetikai útvonalon keresztül alakulnak ki. A daganatok egyik csoportja (több mint kétharmada) jellemzően kromoszomális instabilitást, a wnt szignálút károsodását és ún. polyp-cancer szekvenciát mutat (32, 43), míg a másik csoportra a kromoszomális stabilitás, valamint az ún. microsatellita-instabilitás jellemző. Satellita szekvenciáknak eredetileg a humán genomban előforduló 100 vagy több bázis-ismétlődéseket nevezik. Ezen kívül előfordulnak egyszerű, a fentieknél jóval rövidebb, 1 5-féle bázisból felépülő ismétlődő szekvenciák is, ezeket nevezzük microsatellitáknak. A microsatelliták elszórtan, több ezer helyen fordulnak elő a humán genomban, hosszuk veleszületetten állandó és egyéni különbségeket mutat. A DNS replikációja során 1000 2000 bázisonként óhatatlanul beépülnek hibás bázisok, amelyek felismerésére és kijavítására két fő mechanizmus működik (42): (i) A másolási hibát elsősorban maga a DNS-polimeráz-komplex javítja ki a proofreading mechanizmus segítségével, azonban ismétlődő szekvenciák (microsatelliták) esetén a több vagy kevesebb bázis beépülését ez a mechanizmus általában nem ismeri fel. (ii) Közvetlenül a DNSpolimerázok nyomában másfajta enzimrendszer is működik, ezek az ún. mismatch repair (MMR) enzimek, amelyek ugyancsak felülvizsgálják az új DNSszálat azért, hogy a polimeráz enzimek proofreading mechanizmusa után megmaradó másolási hibát is kijavítsák. Ha a MMR-rendszer hibásan működik, az új microsatellita-kópiák másolási hiba következtében meghosszabbodnak, vagy megrövidülnek. Ezt az állapotot amely végső soron sok microsatellitaszekvenciát érint a progenitor sejtek genomjában nevezzük microsatellita-instabilitásnak (MSI) (5). Megkülönböztetünk magas fokú (MSI-H) és alacsony fokú (MSI-L) microsatellita-instabilitást (4). MSI-Hhoz vezet a MMR gének (döntő többségében az MLH1 vagy MSH2) örökletes funkcióvesztő mutációja vagy az MLH1 gén promoter régiójának hipermetilációja, amely epigenetikus géninaktivációt eredményez. Itt jegyezzük meg, hogy a MMR-rendszernek nem egyedüli szerepe az újonnan szintetizált DNS-ben keletkezett nukleotidhibák javítása, hanem a környezeti mutagének által okozott DNS-hibák kijavításában is részt vesz. Ha egy microsatellita-szekvencia valamely gén fehérjét kódoló DNS-szakaszában fordul elő és hossza a fent említett mechanizmus következtében megváltozik, akkor a kódolt fehérje aminosav-szerkezete is megváltozik és funkciója elvész. Az MSI ilyen hatását először coloncarcinoma sejtvonalakon fedezték fel, amelyekben 11-ből 9 sejtvonalban a TGF-β II. típusú receptor gént amely a fehérjét kódoló régiójában microsatellitaszekvenciát tartalmaz mutánsnak találták (21). Ugyanezt a génhibát nemsokára kimutatták MSI-H-t mutató primer colorectalis carcinomákban (CRC) is (23, 26). A TGF-βR génnek kiemelten fontos növekedésgátló hatása van az ép hámsejtekben, működésének hiányában a sejtproliferáció szabályozatlanná válik (41). Jelenleg az MSI összes hatása még nem ismert. Azt azonban tudjuk, hogy számos gén fehérjeleolvasási keretében található microsatellita, amelyek instabilitása egyrészt a gén által kódolt fehérjék funkciójának elvesztésével jár, és ezzel hozzájárul a CRC kialakulásához (9), másrészt az MSI befolyásolja a vastagbélrákok kemoterápiás érzékenységét is (pl. rezisztensek 5-fluorouracil-alapú adjuváns kezelésre, 29). A rosszindulatú daganatok génelváltozásaihoz a citológiai kép és a szöveti struktúra megváltozása társul, amelyre azután a daganatok morfológiai diagnózisa alapul. A patológusok a diagnózis felállításához hagyományosan hematoxilin-eozin (H&E) metszeteket használnak. A daganatok így előálló szövettani képe azon génelváltozások szintézise, amelyek érintettek a malignus transzformációban (30). Egy daganatban a mutációk nagyobbik része kevésbé jelentős, valószínűleg önmagukban nem okoznak daganatot, de a sejtfunkció zavarát és fenotípusának bizonyos megváltozását eredményezhetik. A génmutációk kisebb része azonban a daganatkialakulás szempontjából szignifikáns mutáció, amelyek elsősorban a sejtproliferáció és a növekedés kontrollját károsítják súlyosan (6). Az a kérdés, hogy ilyen szignifikáns mutációk járhatnak-e specifikus és felismerhető morfológiai képpel? A molekuláris patológia rutinná válása során sikerült megfigyelni, hogy összefüggés található egyes meghatározó genetikai eltérések és az általuk okozott daganatok fenotípusa között. Erre példa specifikus fúziós gén jelenléte a megfelelő lágyrészsarcomában, carcinomában és lymphomában (22), a MYCN-amplifikáció citológiai képe differenciálatlan neuroblastomában (17, 38), vagy az EGFR- (esetleg KRAS-) mutáció szövettani jelei tüdőadenocarcinomában (28, 35). Korábban már néhány tanulmányban kimutatták, hogy az MSI-H vastagbélrákokra jellemző a szövettani heterogenitás, a differenciálatlan morfológia, az expanzív növekedési mintázat, a tumorinfiltráló limfociták (TIL) megemelkedett száma és kifejezett gyulladásos reakció a tumorok növekedési zónájában (Crohn-szerű reakció) (1, 12, 36). Jelenleg Magyarországon a microsatellita-státust protokollszerűen nem veszik figyelembe az előrehaladott CRC adjuváns kezelésének megtervezésénél. Az MSI rutinszerű vizsgálata Magyarországon a Zala Megyei Kórház Patológiai Osztályán immunhisztokémiai, illetve az Országos Onkológiai Intézetben molekuláris patológiai módszerekkel történik. A H&E alapú szövettani vizsgálat azonban szintén lényeges információval szolgálhat, és jelentősen hozzájárulhat az MSI-H vastagbélrákok felismeréséhez. Ilyen módon nagy valószínűséggel ki lehet választani azokat a daganatokat, amelyeknél az MSI-tesztet érdemes elvégezni abból a meggondolásból, hogy a betegek a legmegfelelőbb daganatellenes terápiát kaphassák meg. Ennek a munkának az a célja, hogy saját tapasztalatokra támaszkodva összegyűjtsük, értékeljük és a rutin szövettani diag- 170
A MICROSATELLITA-STÁTUS MORFOLÓGIAI JELEI nosztikai gyakorlat számára használható módon bemutassuk azokat a morfológiai jellegzetességeket, amelyek megkönnyítik a microsatellita-stabil (MSS) és -instabil CRC felismerését. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK A vizsgálat megtervezése és a szövetminta szelekciója Az Országos Onkológiai Intézet Sebészi és Molekuláris Daganatpatológiai Centrumában 2003. január 1. és 2010. március 31. között olyan vastagbélrákokat vizsgáltunk, amelyeket részben az Intézetben operáltak, részben az ország egész területéről küldtek be formalin-fixált és paraffinba ágyazott tumorszövetminták formájában génmutáció-analízis céljából. Ezek közül jelenleg részletesen 384 CRC lokalizációját, klinikai stádiumát, microsatellita-státusát és a daganat felfedezésének időpontjában a betegek életkorát vettük figyelembe. Közülük választottunk ki olyan 26 herediter nem-polyposus colorectalis carcinomát (HNPCC), 22 sporadikus MSI-H és 76 MSS carcinomát, amelyek diagnózisát előzetesen klinikai, szövettani és egyes esetekben MLH1 vagy MSH2 immunhisztokémiai vizsgálatokkal, továbbá minden esetben genetikai microsatellita-tesztek segítségével állítottuk fel. A HNPCC diagnózisának felállításakor a revideált Bethesda-guideline útmutatását is figyelembe vettük (39). Az MSS vastagbélrákok közé 9 MSI-L carcinomát és 7 olyan 35 év alatti betegekben kialakult carcinomát is besoroltunk, amelyeknél az örökletesség biztosan kizárható volt. Ezeket a végső értékelés során külön alcsoportban azért nem tüntettük fel, mert sem az irodalmi adatok, sem a saját megfigyeléseink szerint lényegesen nem különböztek az egyéb MSS tumoroktól (25). Összesen 124 betegből származó daganaton vizsgáltuk azoknak az irodalomból már ismert, vagy saját megfigyelésen alapuló szövettani és citológiai elváltozásoknak az előfordulási gyakoriságát, amelyek a microsatellita-státusszal összefüggésbe hozhatók voltak (1, 12, 31, 34, 36). Célul tűztük ki, hogy mindhárom fent definiált tumorcsoportban meghatározzuk azokat a szövettani jellegzetességeket, amelyek a legnagyobb valószínűséggel segítenek egy új tumor megfelelő besorolásában. Mindezekhez hozzávettük a betegek életkorát, a daganat lokalizációját és klinikai stádiumát, amelyek tovább segíthetik a tumorok morfológiai alapú genetikai osztályozását. Patológiai analízis 1. Szövettani megjelenés Medullaris (differenciálatlan) szöveti szerkezet nincs mirigyes formáció, a sejtek trabekuláris vagy egybefüggő solid gócokba rendezettek a citoplazma rendszerint enyhén eozinofil elszórtan igen kis nyáktócsák előfordulhatnak (nyákfestésekkel pozitív) Kevert szövettani struktúra medulláris részek mellett mirigyes szerkezet mucinosus gócok, néha a mirigyek lumenében nyák Megtartott mirigyes gócok kisebb-nagyobb szabálytalan alakú mirigycsoportok rendszerint egyrétegű, néha többmagsoros hámbéléssel lehet intraglanduláris (nem infiltráló) pecsétgyűrűsejtes átalakulás eozinofil citoplazma Mucinosus szerkezet nagy nyáktócsák pecsétgyűrűsejtekkel, amelyek citoplazmája néha széles, finoman szemcsézett infiltráló pecsétgyűrűsejtek extracelluláris mucin nélkül a tumor >40%-ában nagy nyáktócsák, amelyekben kisebb-nagyobb mirigyhám-trabekulák úsznak, pecsétgyűrűsejtek nincsenek Mirigy ( dirty ) necrosis egy mirigyet érintő rendszerint részleges elhalás nagyobb, összefüggő térképszerű elhalást nem szabad figyelembe venni 2. Sejtmag világos, relatíve egyforma nagyságú, kerek, ovális vagy lobulált mag, éles, jól kivehető maghártya, prominens nucleolus hyperchrom, kerek vagy változó nagyságú sötét sejtmagok kis nucleolusszal 3. Tumorinfiltráló limfociták (TIL) (12, 36) Intratumorális tumorinfiltráló limfocita (i-til): A tumoros mirigyek bazális membránján belül, a hámsejtek között kis mononuclearis sejtek, körülöttük világos udvar (halo). Öt nagy nagyítású (40x-es, 0,94 mm 2 ) látótérben számoljuk. Határérték: 2/NNL. Prominens stromát infiltráló limfocita (SIL) reakció: Változó mennyiségű limfocita diffúz vagy gócos eloszlásban főleg a tumorok széli, növekedési zónájában. A limfocitákhoz leukociták is keveredhetnek (Crohnszerű beszűrődés). Prominensnek tekinthető a beszűrődés, ha legalább három limfocita-aggregáció van jelen a metszetben. Minden kiválasztott esetben legalább 3 reprezentatív paraffinba ágyazott tumorszövetblokk állt rendelkezésre, az ezekből készült 3 5 μm vastag H&E-festett metszeteken azonos módon egy patológus (Sz. Z.) értékelte a morfológiai jellegzetességeket. A vizsgált szövettani paraméterek definíciója a következő: 4. Növekedési mintázat Expanzív: széles csapok formájában, a szöveteket maga előtt tolva nő. Infiltratív: kis hámsejtcsoportok elszórtan a szövetek között. 171
SZENTIRMAY ÉS MTSAI 1. ábra. Microsatellita-instabilitás vizsgálata valósidejű PCR (LightCycler) és hibridizációs próba olvadáspont-analízis segítségével vastagbélrákokban. A próba jelentősen alacsonyabb hőfokon olvad le, ha hibásan illeszkedik a megváltozott hosszúságú microsatellitaszekvenciához, ebben az esetben a BAT-26-hoz. A leolvadási hőmérséklet csökkenése a próba hibásan illeszkedő bázisainak számától függ, amely esetenként változik. Ezt a jelenséget a három függőleges vonal által behatárolt görbék mutatják Microsatellita-instabilitási teszt A kiválasztott paraffinos blokkból makro-blokkdisszekciót végeztünk és így a tumorsejt ép sejt arány minden esetben >30% volt. Az így előkészített blokkból kb. 10 20 μm vastag metszetet készítettünk, amelyeket 20 μg/μl koncentrációjú proteináz-k enzimmel 56 C-on éjszakán át emésztettünk. A DNS-izolálás MagNA Pure Compact Instrument (Roche) segítségével történt. Az MSI-vizsgálatot Dietmaier és Hofstadter módszere szerint (7), BAT-25 és BAT-26 microsatellita-próbák segítségével valósidejű PCR- és olvadáspont-analízissel végeztük (1. ábra). A BAT-25 marker a c-kit gén 16. exonjában lévő microsatellita-szekvenciát, a BAT-26 marker az MSH-2 gén 5. exonjában lévő microsatellita-szekvenciát ismeri fel. A két marker együttes alkalmazásával az összes microsatellita-instabil daganat legalább 98%-a kimutatható (13, 14, 27). A módszer beállításakor az eredményeket az alábbi microsatellita-referenciapanel segítségével is ellenőriztük: BAT-25, BAT-26, D5S346, D2S123, D17S250 (4). Statisztikai analízis A betegek születési dátumát, a daganat felfedezéskori időpontját és klinikai stádiumát, továbbá a daganatok lokalizációját, microsatellita-státusát, a részletes morfológiai paramétereket és az ezek segítségével megadott tumorbesorolást Microsoft Excel táblázatban kódolva rögzítettük. Az adatgyűjtés során az adatokat többször is ellenőriztük és az esetleges adathibákat javítottuk. A gyakorisági eloszlásokat az Excel függvények segítségével számoltuk. A további statisztikai vizsgálatok kontingenciatábla-analízisnek és χ 2 -tesztnek feleltek meg és BMDP90 statisztikai software programcsomag segítségével történtek (8). 2. ábra. 384 vastagbélrákos beteg kormegoszlása a daganat felfedezésének időpontjában. A daganatok gyakorisági megoszlása: 311 MSS/ MSI-L, 42 HNPCC, 31 sporadikus időskori MSI-H tumor EREDMÉNYEK A 384 vastagbélrákos beteg kormegoszlását a daganat felfedezésének időpontjában a 2. ábra mutatja. A kormegoszlás a három betegcsoportban egymástól jelentősen eltér. A HNPCC leggyakrabban 30 55 éves kor között fordult elő és két gyakorisági maximumot mutat a 35 39, valamint a 45 49 közötti években. Harminc éves kor alatt 42 betegből összesen 4 betegben alakult ki vastagbélrák. A 31 sporadikus MSI-H tumor leginkább 60 és 85 éves kor között jelentkezett, ilyen típusú vastagbélrákok 45 éves kor alatt nem fordultak elő. A kormegoszlás a 60 65, illetve a 80 85 éves korcsoportban markáns gyakorisági maximumot mutat. Az MSS tumorok kormegoszlásának gyakorisági maximuma 60 éves kor körül van, de a betegség kisebb valószínűséggel jóval idősebb és jóval fiatalabb életkorban is jelentkezhet. Különös figyelmet érdemel, hogy az ide tartozó 311 beteg között 26 olyan beteg is volt, amelyek daganata 35 éves kor alatt alakult ki és nem függött össze semmiféle örökletes rákszindrómával. A vastagbélrákok felfedezéskori, TNM-re alapozott klinikai stádiumát és lokalizációját tumorcsoportok szerinti bontásban az 1. táblázat mutatja. Az egyes tumorcsoportok a fenti klinikai paraméterek tekintetében egymástól szignifikánsan eltérnek. Az MSS vastagbélrákok leggyakrabban III. klinikai stádiumban kerültek felismerésre, a HNPCC és az MSI-H daganatok felfedezéskor leginkább II. stádiumúak voltak. A sporadikus MSI-H carcinomák sokkal gyakrabban adtak áttéteket (gyakrabban fedezték fel őket előrehaladott klinikai stádiumban), mint a HNPCC-k. Az MSS carcinomák elsősorban a bal colonfélben, a microsatellita-instabil carcinomák főleg a sporadikus MSI-H daganatok a jobb colonfélben alakultak ki, és lényegesen gyakoribb volt közöttük a többgócú daganat. Érdemes megjegyezni, hogy betegeink között IV. stádiumú HNPCC-t nem találtunk. A vizsgált 13 morfológiai paraméter tumorcsoportonkénti valószínűségi előfordulását a 2. táblázat mutatja. E paraméterek együttes előfordulási gyakorisága az MSS, a HNPCC és a sporadikus MSI-H carcinomákban egymástól szignifikánsan különbözik. Az MSS tumo- 172
A MICROSATELLITA-STÁTUS MORFOLÓGIAI JELEI 1. táblázat. Összesen 384 vastagbélrák felfedezéskori klinikai stádiuma és lokalizációja genetikai típusok szerinti bontásban. A klinikai stádiumokat az AJCC Cancer Staging Manual (6. kiadás) előírásai szerint adtuk meg. MSS: microsatellita-stabil, kromoszomálisan instabil vastagbélrák. HNPCC: herediter nem-polyposis eredetű carcinoma. MSI-H: sporadikus, kifejezetten microsatellita-instabil, kromoszomálisan stabil vastagbélrák. Multiplex: többgócú vastagbélrák, legalább egy daganatgóc a jobb colonfélben van. Jobb colonfél: a daganat a coecumban, a felszálló vastagbélben vagy a haránt vastagbél jobb felében van. Bal colonfél: a daganat a flexura lienalisban, a leszálló vastagbélben illetve a sigmabélben van. Rectum: a daganat a recto-simoideális határra vagy a rectumra lokalizált. A P-értékeket Pearson χ 2 -teszt segítségével adtuk meg, és ezek szerint az egyes genetikai tumorcsoportok mind a klinikai stádium, mind a lokalizáció tekintetében egymástól szignifikánsan eltérnek Stádium P=0,0009 Lokalizáció P=0,0000 Klinikai adatok MSS (N=311) Gyakoriság (%) HNPCC (N=42) Gyakoriság (%) MSI-H (N=31) Gyakoriság (%) I. 12,5 16,7 6,5 II. 31,8 57,1 54,8 III. 36,3 26,2 38,2 IV. 19,3 6,5 Multiplex 3,2 19,1 12,9 Jobb colonfél 25,4 47,6 71,0 Bal colonfél 30,9 26,2 9,7 Rectum 40,5 7,1 6,5 rokra jellemző a mirigyes szerkezet, egyes mirigyek részleges ( dirty ) necrosisa, a hyperchrom pleiomorph sötét vagy világos festődésű durva kromatinrögöket tartalmazó sejtmag és az infiltratív növekedési mintázat (3. ábra). A medulláris és főleg a kevert szöveti struktúra ritka. A HNPCC döntően kevert szövettani képet mutat, amelyre a differenciált mirigyes, mucinosus és medulláris szerkezet jellemző. A nyákos területeken az extracellularis mucinban rendszerint pecsétgyűrűsejtek találhatók. A daganatsejtek magja nagyon jellegzetes, általában közel egyforma nagyságú, kerek, világos és benne egy nagy nucleolus látható. A maghártya egyenletesen vastag, élesen kirajzolódik. Csaknem minden esetben megfigyelhető a daganatsejtek között látóterenként >2 tumorinfiltráló limfocita (i-til), vagy prominens stromát infiltráló limfoid reakció (SIL), amely hasonló a Crohn-betegségben látottakhoz. A HNPCC több mint 90%-a expanzívan, a környező szöveteket maga előtt tolva nő, részleges daganatos mirigynecrosist ( dirty necrosis) egyáltalán nem figyeltünk meg (4. ábra). A sporadikus MSI-H carcinoma szövettani képe részben hasonlít, részben eltér a HNPCC-étől. Ezekre a tumorokra abszolút jellemző a differenciálatlan medulláris tumormorfológia, amely át van járva nem csak limfocitákkal, hanem különböző egyéb fehérvérsejtekkel is. A vegyes összetételű lobsejtes infiltráció megfigyeléseink szerint itt sokkal gyakoribb, mint HNPCC-ben, amelyekre inkább a tisztán limfocitákból álló klasszikus megjelenésű i-til vagy SIL a jellemző. A sporadikus MSI-H daganatsejtek citoplazmája eozinofil festődésű, magja változó nagyságú, vesicularis, rendszerint lobulált, a maghártya határozottan kirajzolódik, és itt is van egy prominens, eozinofil festődésű nucleolus. A medulláris szerkezetű gócokon belül nagy nyáktócsák láthatók, amelyekben pecsétgyűrűsejtekké átalakuló daganatos mirigyek vannak. A pecsétgyűrűsejtekre jellemző a széles, szemcsés citoplazma és kis, sötét, kompakt sejtmag (5. ábra). Nyáktócsák pecsét- 2. táblázat. 76 microsatellita-stabil vastagbélrák (MSS), 26 herediter nem-polyposis eredetű colorectalis carcinoma (HNPCC) és 22 sporadikus, kifejezetten microsatellita-instabil rák (MSI-H) morfológiai paramétereinek százalékos gyakorisági eloszlása. A 13 morfológiai jellegzetesség alapján az egyes genetikailag különböző daganatcsoportok egymástól Pearson χ 2 -teszttel vizsgálva magas szignifikanciaszinten különböznek Morfológiai jellegzetességek Előfordulási valószínűség (%) MSS carcinoma HNPCC Sporadikus MSI-H ca. Tisztán medulláris szöveti szerkezet 3,9 3,8 63,9 Kevert szövettani struktúra 23,7 80,8 27,3 Tisztán mirigyes struktúra 72,4 15,4 9,1 Nyáktócsák pecsétgyűrűsejtekkel 9,2 38,5 36,4 Pecsétgyűrűsejtek extracelluláris mucin nélkül 3,9 3,8 0,0 Nagy nyáktócsák pecsétgyűrűsejtek nélkül 21,6 30,8 9,1 Mirigy dirty necrosis 22,4 0,0 0,0 Világos kerek vagy lobulált mag, éles maghártya, nagy nucleolus 10,5 80,8 68,2 Hyperchrom, változó nagyságú sejtmagok, kis nucleolus 89,5 19,2 31,8 i-til >2/NNL 19,7 88,5 54,4 Prominens SIL 21,1 57,7 29,1 Expanzív növekedési mintázat 32,9 92,3 86,4 Infiltratív növekedési mintázat 67,1 7,7 18,2 P = 0,0000 173
S Z E N T I R M AY É S M T S A I 3. ábra. Microsatellita-stabil (MSS) és alacsonyfokú microsatellita-instabilitást (MSI-L) mutató vastagbélrákokra jellemző szövettani szerkezet. A: Differenciált daganatos mirigyek, változó nagy, hyperchrom, sötét sejtmagok. B: Rosszul differenciált mirigyek, pleiomorph, durva kromatintartalmú sejmagok, egyenetlenül megvastagodott magmembránnal. C: Részleges ( dirty ) mirigynecrosis. D,E: Differenciálatlan mirigyes szerkezet, infiltratív növekedési minta és extracelluláris mucin pecsétgyűrűsejtek nélkül. MSI-L vastagbélrák a bal colonfélben 4. ábra. Herediter nem-polyposis colorectalis carcinoma (HNPCC). A: Differenciálatlan mirigyes szerkezet, a daganatsejtek között nagyszámú, világos udvarral körülvett tumorinfiltráló limfocita (i-til, nyilaknál). B: Medulláris szerkezetű tumoros terület. A daganatsejtek halvány eozinofil citoplazmával, nagyjából egyforma kerek világos maggal és nagy nucleolusszal rendelkeznek, a magmembrán élesen kirajzolódik, egyenletesen vastag. C: Medulláris daganatos területen belül kialakult mucinosus góc, az extracelluláris nyákban pecsétgyűrűsejtek úsznak. D: Daganatos mirigyek stromájában intenzív limfocitás, plazmasejtes beszűrődés (SIL). E: Expanzív carcinomás növekedési mintázat 174 I S S N 0 0 2 5-0 24 4 A k a d é m i a i K i a d ó, B U DA PES T M a g ya r O n ko l ó g i a 5 4:16 9 17 8, 2 010 D O I: 10.15 5 6 / M O n ko l. 5 4. 2 010. 2.12
A M I C R O S AT E L L I TA - S TÁT U S M O R F O L Ó G I A I J E L E I 5. ábra. Sporadikus MSI-H vastagbélrák. A: Differenciálatlan medulláris szerkezetű terület, a daganatsejtek között kevert limfocitás-leukocitás beszűrődés. A sejtmagok változó nagyságúak, finoman szemcsés kromatinszerkezetük miatt világosan festődnek és sejtmembránjuk jól kirajzolódik, rendszerint lobuláltak és bennük egyetlen prominens nucleolus látható. B: Medulláris daganatgóc, amely keskeny eozinofil citoplazmájú sejtekből épül fel. A sejtmagok relatíve egyformák, kerekek, világos festődésűek, bennük egyetlen prominens nucleolus van. Ez a daganatszövet-részlet hasonlít a HNPCC-ben látottakhoz. C: Differenciált daganatos mirigy, amelynek lumenében nyákos váladék van. A daganatsejtek között (nyilaknál) jellegzetes megjelenésű tumorinfiltráló limfociták (i-til). D: Medulláris struktúrán belül mucinosus góc, amelyekben pecsétgyűrűsejtes átalakulást mutató mirigyfragmentumok vannak gyűrűsejtek nélkül ritkák, extracelluláris mucin nélküli pecsétgyűrűsejtek vagy dirty mirigynecrosisok nem fordulnak elő. A tumorszövet széli részeire döntően expanzív növekedési mintázat a jellemző. MEGBESZÉLÉS A vastagbélrákok lényegében három egymástól különböző genetikai úton alakulnak ki, de a microsatellitastátus alapján két fő csoportra lehet őket osztani. A daganatok kisebb csoportjára az MSI-H fenotípus és a kromoszomális stabilitás jellemző. Ide soroljuk a HNPCC-t és az időskori MSI-H vastagbélrákot. A vastagbélrákok többségében kromoszomális instabilitás és microsatellita-stabilitás (MSS) vagy alacsony fokú microsatellita-instabilitás (MSI-L) mutatható ki. Az a kérdés, hogy indokolt-e az MSS és MSI-L tumorok öszszevonása, vagy két külön entitásról van szó? Az MSI-L tumorokban az O-6-metilguanin-DNS-metiltranszferáz (MGMT) metilációja és a néhány tumorszuppresszor gén promoter régiójában a CpG-szigetekben a citozin metilációja (CIMP) fordul elő, de ilyen genetikai eltérés a klasszikus MSS rákokra nem jellemző (24, 44). Ezzel szemben Tomlinson és mtsai (37) azt találták, hogy gyakorlatilag az összes CRC-ben különböző fokozatú microsatellita-instabilitás található, ha a kimutatáshoz elegendően nagy számú markert használunk. Az említett tanulmány szerzői arra következtettek, hogy az MSS és MSI-L tumorok közötti különbség csupán kvantitatív jellegű, és kevéssé valószínű, hogy kialakulásuk folyamata lényeges különbségeket mutatna. Ebből következik, hogy a microsatelliták nem tekinthetők megfelelő markernek az MSI-L tumorok biztos elkülönítésére és nincs olyan fenotípusos/genotípusos jel vagy eltérő klinikai viselkedés, amelyek alapján az MSI-L tumorok jelentős része az MSS tumoroktól elkülöníthető lenne (25). Ezért a jelen vizsgálatban mi sem különböztettük meg az MSI-L és MSS tumorokat. A magas fokú microsatellita-instabilitást mutató carcinomákhoz mint említettük két, egymástól jól elkülöníthető vastagbélrák-entitás tartozik. Az MSI-H daganatok 3 5%-a a HNPCC-szindrómával kapcsolatos. A HNPCC kialakulásához az MLH1, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1 vagy PMS2 mismatch repair (MMR) gének germline mutációja szükséges. Az MLH1 vagy MSH2 gének mutációja együttesen majdnem 90%-os, az MSH6 gén mutációja csaknem 10%-os gyakorisággal fordul elő, az MSH3, PMS1 és PMS2 gén örökletes mutációja rendkívül ritka. A daganatkialakulást nevével ellentétben konvencionális adenoma stádium előzi meg, azonban a folyamat nagyon gyorsan átmegy I S S N 0 0 2 5-0 24 4 A k a d é m i a i K i a d ó, B U DA PES T M a g ya r O n ko l ó g i a 5 4:16 9 17 8, 2 010 D O I: 10.15 5 6 / M O n ko l. 5 4. 2 010. 2.12 175
SZENTIRMAY ÉS MTSAI 3. táblázat. A leginkább jellemző azon klinikai és morfológiai jellegzetességek, amelyek a rutin szövettani vizsgálat során valószínűsítik egy adott vastagbélrák genetikai eredetét, illetve segítik kiválasztani azt a molekuláris patológiai diagnosztikai eljárást, amely egy megfelelő betegellátás meghatározásához szükséges. Valamely daganat besorolásánál az összes paramétert együtt kell figyelembe venni. Pgy-sejtek = pecsétgyűrűsejtek. A betegek életkora a daganat felfedezésének időpontjában értendő, az átlagéletkort 311 MSS/MSI-L, 42 HNPCC és 31 időskori sporadikus MSI-H vastagbélrákos beteg adataiból számoltuk Jellemző paraméterek Vastagbélráktípusok MSS/MSI-L HNPCC Időskori MSI-H Átlagéletkor (év) 57,2 41,9 69,4 Lokalizáció bal colonfél jobb colonfél jobb colonfél Stádium III IV I II II III Szöveti szerkezet mirigyes kevert medulláris Mucin extracelluláris, pgy-sejtek nélkül extracelluláris, pgy-sejtekkel extracelluláris, pgy-sejtekkel Dirty necrosis van nincs nincs Növekedési minta infiltratív expanzív expanzív Sejtmag pleiomorph, hyperchrom világos, egyforma, nagy nucleolus vesicularis, lobulált nagy nucleolus i-til >2/NNL nem jellemző jellemző gyakori Prominens SIL ritka gyakori ritka carcinomába, ezért nem mindig lehet az adenomákat felismerni. Egy HNPCC-re hajlamos személy a mutáns MMR gén tekintetében heterozigóta, mert a károsodott gént vagy az apától, vagy az anyától örökölte, míg a másik szülőtől kapott gén ép és normális fehérjét kódol. A dysplasiás és carcinomás szövetben az ép allél elvész (loss of heterozygosity, LOH), ami a MMR rendszer teljes funkcióvesztéséhez vezet, és ekkor következik be az MSI-H (15, 20). Az időskori vastagbélrákok előfordulási aránya mintegy 15%, fogazott (serrated) adenomából alakulnak ki, gyakori a BRAF-mutáció és az MLH1 gén promoter régiója irreverzíbilisen metilált, ami ugyanúgy MSI-H-t eredményez, mint a génmutáció. Az ilyen daganatokban az MSH2 gén soha nem érintett (2, 10). Jelenlegi vizsgálatunkban kimutattuk, hogy az MSS/ MSI-L, illetve a HNPCC és az időskori sporadikus MSI-H tumorok a klinikai és morfológiai paraméterek segítségével egymástól nagy valószínűséggel akkor is megkülönböztethetőek, ha egyébként genetikai microsatellita-instabilitási teszt nem áll rendelkezésre. Klinikai paraméterek A HNPCC-re jellemző az 50 éves kor alatti és a túlnyomórészt a proximális colonfélre lokalizált előfordulás, a gyakori multiplicitás, valamint felfedezéskor az I. és II. klinikai stádium. A szervi áttétek ritkák, anyagunkban nem is fordultak elő (11). A sporadikus MSI-H carcinomák 55 éves kor után, de inkább 65 80 éves kor között jelentkeznek, gyakorlatilag mindig a jobb colonfélre lokalizáltak, felfedezéskor hasonlóan korai stádiumban vannak, mint a HNPCC, de távoli áttétek is megjelenhetnek. Az MSS/MSI-L carcinomák leggyakrabban 60 éves kor körül alakulnak ki, azonban fiatalabb, sőt idősebb életkorban is előfordulhatnak, főleg a distalis colonfélre és a rectumra lokalizáltak és gyakran előrehaladott klinikai stádiumban kerülnek felismerésre. Az MSI-H tumorok kedvező prognózisa a nagyobb genetikai stabilitással magyarázható, szemben az MSS/ MSI-L tumorokkal, amelyekre a kromoszomális instabilitás a jellemző (19, 40). A HNPCC fiatalkori megjelenése azzal magyarázható, hogy az érintett MMR gén ép allélja az LOH következtében nagyon gyorsan, már az adenoma stádiumban elvész és az örökletes mutáció válik dominánssá. Ezzel ellentétben a sporadikus MSI-H tumorokban az MLH1 gén irreverzíbilis promotermetilációja mindig idősebb korban alakul ki (2, 10, 16, 18, 19, 31). Morfológiai jellegzetességek A HNPCC egy tumoron belül általában többféle szövettani szerkezetet mutat, vagyis mindig vannak differenciált mirigyes részek, az esetek felében differenciálatlan solid gócok, ritkábban mucinosus területek, amelyeken belül pecsétgyűrűsejtes átalakulás rendszerint megfigyelhető. Az időskori MSI-H vastagbélrákokban a medulláris struktúra gyakorlatilag mindig jelen van, e mellett mirigyes és mucinosus területek megjelenhetnek. Az MSI-H carcinomákban a mucinosus területek pecsétgyűrűsejtekkel gyakrabban fordulnak elő, mint az MSS/MSI-L tumorokban, a nyákösszetétel kevert, egyaránt tartalmaz intestinalis (MUC2-pozitív) és gyomor típusú (MUC5AC-pozitív) komponenseket (16, 31). Infiltráló pecsétgyűrűsejtek extacelluláris mucin nélkül inkább csak az MSS/MSI-L daganatokban fordulnak elő. Az MSI-H daganatsejtek magja világos, vesicularis, prominens nucleolust tartalmaz, HNPCC-ben kisebb, egyforma, kerek vagy ovális sejtmagok vannak, sporadikus MSI-H tumorokban nagyobb, esetleg lobulált, MSS/MSI-L vastagbélrákokban pedig pleiomorph, hyperchrom, durva kromatintartalmú a sejtmag és 176
A MICROSATELLITA-STÁTUS MORFOLÓGIAI JELEI nincs prominens nucleolus. Ez a jelenség azzal magyarázható, hogy az MSI-H tumorok diploid, az MSS/MSI-L tumorok aneuploid DNS-tartalommal rendelkeznek (10, 15, 31). Az MSI-H tumorokra a daganatok széli részén látható expanzív növekedési mintázat és az i-til, valamint a SIL; az MSS/MSI-L tumorokra az infiltratív növekedés és az ún. mirigy ( dirty ) necrosis nagyon jellemző (1, 12, 16, 33, 36). Az i-til és prominens Crohnszerű stromareakció valamivel gyakoribb HNPCC-ben, mint az időskori MSI-H tumorokban, legnagyobbrészt keverten CD4- illetve CD8-pozitív T-limfocitákból áll és a tumor megemelkedett immunreaktivitásával függ össze (3, 36). Az egyes daganatcsoportokra leginkább jellemző, diagnosztikus értékű klinikai és morfológiai paramétereket a 3. táblázatban foglaltuk össze. Ezek segítségével a microsatellita genetikai teszt ismerete nélkül is 235 MSS/MSI-L vastagbélrák közül 211 daganatot, 16 HNPCC közül 13 daganatot és 9 időskori sporadikus MSI-H daganat közül 7 tumort helyesen soroltunk be a nekik megfelelő genetikai típusba. A besorolást az utólag elvégzett PCR-alapú microsatellita-instabilitás vizsgálattal ellenőriztük és értékeltük. A HNPCC és az időskori MSI-H carcinoma elkülönítését a BRAF gén 600. codonjának mutációanalízisével is megerősítettük, ennek a vizsgálatnak az eredményét most nem mutatjuk. Végeredményben elmondhatjuk, ha egy vizsgáló a rutin patológiai diagnózis megszületésekor a 3. táblázatban felsorolt paramétereket is figyelembe veszi, akkor nagy valószínűséggel helyesen következtethet egy vastagbélrák genetikai státusára. Ez az eljárás megkönnyíti, költséghatékonnyá és széles körben hozzáférhetővé teszi a legmegfelelőbb daganatellenes terápia meghatározását, illetve az ehhez szükséges molekuláris patológiai vizsgálatok kiválasztását. IRODALOM 1. Alexander J, Watanabe T, Wu TT, et al. Histopathologic identification of colon cancer with microsatellite instability. Am J Pathol 158:527 535, 2001 2. Arai T, Esaki Y, Sawabe M, et al. Hypermethylation of the hmlh1 promoter with absent hmlh1 expression in medullary-type poorly differentiated colorectal adenocarcinoma in the elderly. Mod Pathol 17:172 179, 2004 3. Banerjea A, Ahmed S, Hands RE, et al. Colorectal cancers with microsatellite instability display mrna expression signatures characteristic of increased immunogenicity. Mol Cancer 3:21, 2004 4. Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, et al. A National Cancer Institute Workshop on microsatellite instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer Res 58:5248 5257, 1998 5. de la Chapelle A. Microsatellite instability. N Engl J Med 349:209 210, 2003 6. Ding L, Getz G, Wheeler DA. Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma. Nature 455:1069 1075, 2008 7. Dietmaier W, Hofstadter F. Detection of microsatellite instability by real time PCR and hybridization probe melting point analysis. Lab Invest 81:1453 1456, 2001 8. Dixon WJ (ed.). BMDP Statistical Software, Inc. Release 7, University of California Press, Berkeley, Los Angeles, Oxford, 1992 9. Duval A, Hamelin R. Mutations at coding repeat sequences in mismatch repair-deficient human cancers: toward a new concept of target genes for instability. Cancer Res 62:2447 2454, 2002 10. Gafà R, Maestri I, Matteuzzi M, et al. Sporadic colorectal adenocarcinomas with high-frequency microsatellite instability. Pathobiologic features, hmlh1 and hmsh2 expression, and clinical outcome. Cancer 89:2025 2037, 2000 11. Goecke T, Schulmann K, Engel C, et al. Genotype-phenotype comparison of German MLH1 and MSH2 mutation carriers clinically affected with Lynch syndrome: a report by the German HNPCC Consortium. J Clin Oncol 24:4285 4292, 2006 12. Greenson JK, Bonner JD, Ben-Yzhak O. Phenotype of microsatellite unstable colorectal carcinomas. Well-differentiated and focally mucinous tumors and the absence of dirty necrosis correlate with microsatellite instability. Am J Surg Pathol 27:563 570, 2003 13. Hoang J-M, Cottu PH, Thuille B, et al. BAT-26, an indicator of replication error phenotype in colorectal cancers and cell lines. Cancer Res 57:300 303, 1997 14. Ichikawa A, Sugano K, Fujita S. DNA variants of BAT-25 in Japanese, a locus frequently used for analysis of microsatellite instability. Jpn J Clin Oncol 31:346 348, 2001 15. Jass JR. HNPCC and sporadic MSI-H colorectal cancer: review of the morphological similarities and differences. Fam Cancer 3:93 100, 2004 16. Jass JR. Classification of colorectal cancer based on correlation of clinical, morphological and molecular features. Histopathology 50:113 130, 2007 17. Kobayashi C, Monforte-Munoz HL, Gerbing RB, et al. Enlarged and prominent nucleoli may be indicative of MYCN amplification. Cancer 103:174 181, 2005 18. Kuismanen SA, Holmberg MT, Salovaara R, et al. Epigenetic phenotypes distinguish microsatellite-stable and -unstable colorectal cancers. Proc Natl Acad Sci USA 96:12661 12666, 1999 19. Lanza G, Gafà R, Matteuzzi M, Santini A. Medullary-type poorly differentiated adenocarcinoma of the large bowel: a distinct clinicopathologic entity characterized by microsatellite instability and improved survival. J Clin Oncol 17:2429 2438, 1999 20. Lynch HT, de la Chapelle A. Hereditary colorectal cancer. N Engl J Med 348:919 932, 2003 21. Markowitz S, Wang J, Myeroff L, et al. Inactivation of the type II TGF-β receptor in colon cancer cells with microsatellite instability. Science 268:1336 1338, 1995 22. Miettinen M. From morphological to molecular diagnosis of soft tissue tumors. In: New Trends in Cancer for the 21st Century. Eds. López-Guerrero JA, et al. Springer, Berlin-Heidelberg 2006, pp. 99 113 23. Myeroff LL, Parsons R, Kim SJ, et al. A transforming growth factor β type II gene mutation common in colon and gastric but rare in endometrial cancers with microsatellite instability. Cancer Res 55:5545 5547, 1995 24. Ogino S, Kawasaki T, Kirkner GJ, et al. Molecular correlates with MGMT promoter methylation and silencing support CpG island methylator phenotype-low (CIMP-low) in colorectal cancer. Gut 56:1564 1571, 2007 25. Ogino S, Goel A. Molecular classification and correlates in colorectal cancer. J Mol Diagn 10:13 27, 2008 26. Parsons R, Myeroff LL, Liu B, et al. Microsatellite instability and mutations of the transforming growth factor beta type II receptor gene in colorectal cancer. Cancer Res 55:5548 5550, 1995 27. Pasterello C, Baglioni S, Tibiletti MG, et al. Stability of BAT-26 marker in tumours of hereditary nonpolyposis colorectal cancer patients with MSH2 intragenic deletion. Eur J Hum Genet 15:139 141, 2007 28. Pao W, Miller V, Zakowsky M. EGF receptor gene mutations are common in lung cancer from never-smokers and are associated with sensitivity of tumors to gefinitib and erlotinib. Proc Natl Acad Sci USA 101:13306 13311, 2004 177
SZENTIRMAY ÉS MTSAI 29. Ribic CM, Sargent DJ, Moore MJ, et al. Tumor microsatellite-instability status as a predictor of benefit from fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer. New Engl J Med 349:247 257, 2003 30. Rosai J. The continuing role of morphology in the molecular age. Mod Pathol 14:258 260, 2001 31. Rüschoff J, Dietmaier W, Lüttges J, et al. Poorly differentiated colonic adenocarcinoma, medullary type: clinical, phenotypic, and molecular characteristics. Am J Pathol 150:1815 1825, 1997 32. Schneikert J, Behrens J. The canonical Wnt signalling pathway and its APC partner in colon cancer development. Gut 56:417 425, 2007 33. Shia J, Ellis NA, Philip B, Paty PB, et al. Value of histopathology in predicting microsatellite instability in hereditary nonpolyposis colorectal cancer and sporadic colorectal cancer. Am J Surg Pathol 27:1407 1417, 2003 34. Szentirmay Z, Szakács O, Gallai M. Morfológia és molekuláris patológia összefüggése vastagbélrákban. 66. Patológus Kongreszszus, Balatonfüred, 2007 35. Szőke J, Csernák E, Szentirmay Z. Mutational analysis of the epidermal growth factor receptor gene in clinical samples of adenocarcinoma of the lung. Revis Med Farmac 54(Suppl 3):495 498, 2008 36. Takemoto N, Konishi F, Yamashita K, et al. The correlation of microsatellite instability and tumor-infiltrating lymphocytes in hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) and sporadic colorectal cancers: the significance of different types of lymphocyte infiltration. Jpn J Clin Oncol 34:90 98, 2004 37. Tomlinson I, Halford S, Aaltonen L, et al. Does MSI-low exist? J Pathol 197:6 13, 2002 38. Tornóczky T, Semjén D, Shimada H, Ambros IM. Pathology of peripheral neuroblastic tumors: significance of prominent nucleoli in undifferentiated/poorly differentiated neuroblastoma. Pathol Oncol Res 13:269 275, 2007 39. Umar AC, Boland R, Terdiman JP, et al. Revised Bethesda guidelines for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome) and microsatellite instability. J Natl Cancer Inst 96:261 268, 2004 40. Wagner A, van Kessel I, Kriege MG, et al. Long term follow-up of HNPCC gene mutation carriers: compliance with screening and satisfaction with counseling and screening procedures. Fam Cancer 4:295 300, 2005 41. Wang J, Sun L, Myeroff L, et al. Demonstration that mutation of the type II transforming growth factor β receptor inactivates its tumor suppressor activity in replication error-positive colon carcinoma cells. J Biol Chem 270:22044 22049, 1995 42. Weinberg RA. Maintenance of genomic integrity and the development of cancer. In: The Biology of Cancer. Garland Science. Taylor & Francis Group, LLC, New York and Abingdon 2007, pp. 463 526 43. van de Wetering M, Sancho E, Verweij C, et al. The beta-catenin/ TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells. Cell 111:241 250, 2002 44. Whitehall V L, Walsh M D, Young J, et al. Methylation of O-6- methylguanine DNA methyltransferase characterizes a subset of colorectal cancer with low-level DNA microsatellite instability. Cancer Res 61:827 830, 2001 178