1 TRYPSINUM Tripszin 01/2009:0694 [9002-07-7] DEFINÍCIÓ A tripszin proteolitikus enzim, melyet az egészséges emlõsök hasnyálmirigyébõl kivont tripszinogén aktiválásával nyernek. Szárított anyagra vonatkoztatott hatóértéke legalább 0,5 mikrokatal/mg. Oldatban az enzim aktivitása ph 8-nál maximális; az aktivitás ph 3-nál ahol a tripszin a legstabilabb reverzibilisen gátolt. ELÕÁLLÍTÁS A tripszin elõállítására felhasznált állatoknak meg kell felelniük az emberi fogyasztásra alkalmas állatok egészségi állapotára vonatkozó követelményeknek. Igazolni kell, hogy az elõállítási eljárás milyen mértékben biztosította a szennyezõ vírusok vagy más fertõzõ ágensek inaktiválását, illetve eltávolítását. Az elõállítási módszer validálásával bizonyítani kell, hogy a termék vizsgálat esetén megfelelne a következõ vizsgálat követelményének: Hisztamin (2.6.10): legfeljebb 1 g hisztamin bázis/0,2 mikrokatal tripszinaktivitás. A vizsgálandó anyag R 0,0015 M borát tompítóoldattal (ph 8,0) készült 10 g/l töménységû oldatát használjuk, melyet vízfürdõn 30 percig melegítve inaktiválunk. A hígításokat R nátrium-klorid 9 g/l töménységû oldatával készítjük. SAJÁTSÁGOK
2 Fehér vagy csaknem fehér, kristályos vagy amorf por. Vízben mérsékelten oldódik. Az amorf forma nedvszívó. AZONOSÍTÁS A. Az S oldat 1 ml-ét (lásd Vizsgálatok ) R vízzel 100 ml-re hígítjuk. A kapott oldat 0,1 ml-éhez egy fehér cseppentõ lemez mélyedésében 0,2 ml R (N-tozil-Larginin-metil-észter)-hidroklorid oldatot elegyítünk. 3 percen belül vörösesibolya színezõdés keletkezik. B. 0,5 ml S oldatot R vízzel 5 ml-re hígítunk. A hígított oldathoz R (N-tozil-L-lizilklórmetán)-hidroklorid 20 g/l töménységû oldatának 0,1 ml-ét elegyítjük. Az oldat ph-ját 7,0-re állítjuk be, majd két órán keresztül rázatjuk, végül R vízzel 50 ml-re hígítjuk. Az így kapott oldat 0,1 ml-éhez egy fehér cseppentõ lemez mélyedésében 0,2 ml R (N-tozil-L-arginin-metil-észter)-hidroklorid oldatot elegyítünk. 3 percen belül nem keletkezik vöröses-ibolya színezõdés. VIZSGÁLATOK S oldat. 0,10 g anyagot R szén-dioxid-mentes vízzel 10,0 ml-re oldunk. Az oldat külleme. Az S oldat opálossága nem lehet erõsebb, mint a III. számú összehasonlító-szuszpenzióé (2.2.1). ph (2.2.3): 3,0 6,0. Az S oldatot vizsgáljuk. Abszorbancia (2.2.25): 30,0 mg anyagot 0,001 M sósav mérõoldattal 100,0 ml-re oldunk. Az oldat spektrumát vizsgálva, 280 nm-en abszorpciós maximum, 250 nmen abszorpciós minimum található. Az abszorpciós maximumon mért fajlagos 1% abszorpciós koefficiens ( A 1cm ): 13,5 16,5, az abszorpciós minimumon mért fajlagos abszorpciós koefficiens legfeljebb 7,0 lehet. Kimotripszin. 1,8 ml R tompítóoldathoz (ph 8,0) 7,4 ml R vizet és 0,5 ml R 0,2 M acetiltirozin-etil-észter oldatot adunk. Rázogatás közben az oldathoz 0,3 ml S oldatot adunk, és elindítjuk a stopper órát. Pontosan 5 perc múlva megmérjük az oldat ph-ját (2.2.3) (vizsgálati oldat). Az összehasonlító oldatot azonos módon, de az S oldat helyett BRP kimotripszin 0,5 g/l töménységû oldatának 0,3 ml-ét
3 alkalmazva készítjük el. A kimotripszin hozzáadása után pontosan 5 perccel megmérjük az elegy ph-ját (2.2.3). A vizsgálati oldat ph-ja legyen magasabb az összehasonlító oldat ph-jánál. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 5,0%. 0,500 g anyagot szárítószekrényben, 670 Pa-t meg nem haladó nyomáson, 2 órán keresztül, 60 C-on szárítunk. Mikrobiológiai szennyezés TAMC: elfogadhatósági követelmény: 10 4 CFU /g (2.6.12). TYMC: elfogadhatósági követelmény: 10 2 CFU /g (2.6.12). Escherichia coli nem lehet jelen (2.6.13). Salmonella nem lehet jelen (2.6.13). TARTALMI MEGHATÁROZÁS A tripszin aktivitását úgy határozzuk meg, hogy összehasonlítjuk R benzoilargininetil-észter-hidroklorid-hidrolizáló sebességét, a BRP tripszin ugyanolyan körülmények között ugyanerre az anyagra mért hidrolizáló sebességével. Készülék. Kb. 30 ml térfogatú, a következõ tartozékokkal ellátott reakcióedény: termosztát, mely a hőmérsékletet 25,0 ± 0,1 C-on tartja, keverő (pl. mágneses keverő), az elektródok, a büretta-hegy és a nitrogén-bevezető cső behelyezésére és a reagensek hozzáadására alkalmas lyukakkal ellátott fedél. Automatikus vagy kézi titráló eszközt egyaránt lehet alkalmazni. Kézi titrálás esetén a büretta 0,005 ml beosztású legyen, és széles mérési tartománnyal rendelkezõ, üveg-kalomel vagy üveg-ezüst-ezüst-klorid elektródokkal felszerelt ph-mérõt használjunk. Vizsgálati oldat. 0,001 M sósav mérõoldatban annyi anyagot oldunk, hogy a 25,0 ml-re hígított oldat aktivitása végül milliliterenként megközelítõleg 700 nanokatal legyen.
4 Összehasonlító oldat. 25,0 mg BRP tripszint 0,001 M sósav mérõoldattal 25,0 mlre oldunk. Az oldatokat 0 5 C-on tároljuk. Az oldatok 1 1 ml-ét 15 perc alatt kb 25 C-ra melegítjük, és az egyes titrálásokhoz az oldatokból 50 50 l-t használunk fel. A titrálást nitrogénatmoszférában végezzük. 10,0 ml R 0,0015 M borát tompítóoldatot (ph 8,0) mérünk a reakcióedénybe és keverés közben R benzoilarginin-etil-észterhidroklorid frissen készített 6,86 g/l töménységû oldatának 1,0 ml-ével elegyítjük. Amikor a hõmérséklet 25,0 ± 0,1 C-ra beállt (kb. 5 perc után), 0,1 M nátriumhidroxid oldattal pontosan 8,0-ra állítjuk az oldat ph-ját. Ezután 50 µl vizsgálati oldatot mérünk hozzá, és elindítjuk a stoppert. A mikrobüretta hegye merüljön az oldatba, melynek ph-ját 0,1 M nátrium-hidroxid oldat hozzáadásával ph 8,0-on tartjuk. A hozzáadott mérõoldat-térfogatot 30 másodpercenként feljegyezzük. A reakciót 8 percig figyeljük. Kiszámítjuk a másodpercenként hozzáadott 0,1 M nátrium-hidroxid mérõoldat-térfogatot. A titrálást azonos módon az összehasonlító oldat alkalmazásával is elvégezzük, és kiszámítjuk a másodpercenként hozzáadott 0,1 M nátrium-hidroxid mérõoldat-térfogatot. A mikrokatal/mg-ban kifejezett aktivitást az alábbi összefüggés alapján számoljuk: m' V m V' A m m' V V' A = a vizsgálandó anyag tömege milligrammban, = a BRP tripszin tömege milligrammban, = a vizsgálati oldat esetében a másodpercenként hozzáadott 0,1 M nátrium-hidroxid mérőoldat térfogata, = az összehasonlító oldat esetében a másodpercenként hozzáadott 0,1 M nátrium-hidroxid mérőoldat térfogata, = a BRP tripszin mikrokatal/mg-ban kifejezett aktivitása. ELTARTÁS Légmentesen záró tartályban, fénytõl védve, 2 8 C-on.
5 FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni a aktivitást, mikrokatal/mg-ban kifejezve.