Fehérjék elválasztására alkalmazható mikrofludikai rendszerek Bioanalyzer, LabChip rendszerek. A készülékek működési elve, felépítésük, alkalmazásuk. Kapilláris elektroforézis tömegspektrometriás detektálással A CE-MS kapcsolások megvalósításának módszerei (Agilent és a Sciex/Beckman cégek kapcsolóelemei). Kiegészítő folyadék (sheath liquid) szerepe, kiválasztásának általános elvei. Alkalmazások,
Mikrocsip elektroforézis, Bioanalyzer 2100 Csipek a Bioanalyzer készülékhez Az Agilent Bioanalyzer 2100 készülék 2
Mikrocsip elektroforézis, Bioanalyzer 2100 3
Fehérjék meghatározása Bioanalyzer 2100 készülékkel 1. Először 12 ml gél-festék keveréket az A4 portba kell pipettázni, majd fecskendő segítségével (3 bar 60 s-ig) az A4 portból a csatornákat feltöltik. 2. 12 ml gél-festék keveréket pipettáznak a B4, C4 és D3 portokba. 3. 12 ml festéktelenítő (gél SDS-festék nélkül) oldatot pipettáznak a D4 portba. 4. 6 ml pufferrrel hígított mintaoldatokat a 10 mintatartó portba pipettázzák. A mintaoldatok az alsó és felső fehérjemarkereket is tartalmazzák. 5. 6 ml pufferrel hígított létrastandardot pipettáznak a D2 portba. 6. A csipet ezután a készülékbe helyezik, először a fehérjestandardot áramoltatják a D2 portból a B4 port felé feszültség alkalmazásával, majd miután a felső fehérjemarker eléri az injektálási kereszteződést a feszültséget a C4 és D4 portokra kapcsolják. 4
Fehérjék meghatározása Bioanalyzer 2100 készülékkel A fehérje elemzések mérési adatainak megjelenítése a Bioanalyzer 2100 készüléknél 5
Fehérjék meghatározása A LabChip 90 készülékkel kapott virtuális gél és a klasszikus SDS-PAGE módszerrel kapott gél mintázatainak összehasonlítása 6
Fehérjék meghatározása LabChip 90 készülékkel vákuum feszültség az elválasztáshoz feszültség a festéktelenítéshez feszültség a festéktelenítéshez feszültség az injektáláshoz feszültség az injektáláshoz markerek feszültség az elválasztáshoz szívókapilláris 7
Fehérjék meghatározása LabChip 90 készülékkel hígító folyadékáram elválasztó csatorna hígító folyadékáram A festék mennyiségének csökkentése (destaining) a csipben a fehérjék elválasztásakor 8
9
CE-MS elektromos kapcsolás hidraulikus kapcsolás 10
CE-ESI-MS 11
CE-MS interfész segédfolyadékáram segítségével (sheath flow). Tri-axial sheath flow CE-MS 12
CE-MS interfész segédfolyadékáram nélkül (sheathless) wire-in-capillary fokozatosan elvékonyított kvarckapillárist vonnak be aranyfilmmel 13
CE-MS interfész folyadékcsatlakozás segítségével (liquid junction) 14
ESI interfészek CE-MS-hez 15
CE-MS
CE-MS, Agilent
CE-MS, Sciex (CESI)
CE-MS,Sciex (CESI)
CE-MS módszerfejlesztések szempontjai CE elválasztás: kapilláris hossza, belső átmérője, felülete elektrolit ph-ja, ionerőssége, ionok minősége, oldószer MS detektálás: MS paraméterek (ESI és (MS) kapilláris feszültség, fragmentáló feszültség, stb.) pótlólagos folyadékáram paraméterei (ionok minősége, oldószer, ionerősség, ph, áramlási sebesség) porlasztás paraméterei (porlasztó gáz nyomás, szárítógáz hőmérséklet, sebesség,
CE-MS-nél használatos elektrolitok optimális: illékony, könnyen ionizálódó ion, stabil ph Kationokhoz nem használható: nehezen ionizálódó ion (pl. foszfát, borát), detergens (MEKC) polimer (CGE) Anionokhoz
CE-MS-nél használatos pótlólagos folyadékok optimális: illékony, könnyen ionizálódó közeg és ion könnyű porlaszthatóság (felületi feszültség, viszkozitás) stabil ph kis ionerősség
CZE-MS
CZE-MS Intens. 4000 3000 2000 1000 0 x10 5 1.5 1.0 0.5 0.0 Intens. x10 5 x10 5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 Intens. Intens. x10 x104 0.8 0.8 0.6 0.6 0.4 0.4 0.2 0.2 0.0 0.0 2000 2000 1500 1500 1000 1000 500 500 Intens. 0 x10 4 0.6 0.4 0.2 Intens. 0.0 x10 4 0.75 0.50 0.25 0.00 Intens. x10 4 2 1 0 Intens. mintak000007.d: BPC +All MS, -Spectral Bkgrnd mintak000007.d: EIC 132.0863±0.01 +All MS, -Spectral Bkgrnd mintak000007.d: EIC 147.0869±0.01 +All MS, -Spectral Bkgrnd mintak000007.d: EIC 147.0869±0.01 +All MS, -Spectral Bkgrnd mintak000007.d: mintak000007.d: EIC EIC 148.0901±0.01 148.0901±0.01 +All +All MS, MS, -Spectral -Spectral Bkgrnd Bkgrnd mintak000007.d: mintak000007.d: EIC EIC 150.0237±0.01 150.0237±0.01 +All +All MS, MS, -Spectral -Spectral Bkgrnd Bkgrnd mintak000007.d: mintak000007.d: EIC EIC 156.0873±0.01 156.0873±0.01 +All +All MS, MS, -Spectral -Spectral Bkgrnd Bkgrnd mintak000007.d: mintak000007.d: EIC EIC 166.0980±0.01 166.0980±0.01 +All +All MS, MS, -Spectral -Spectral Bkgrnd Bkgrnd mintak000007.d: EIC EIC 175.1309±0.01 +All +All MS, MS, -Spectral -Spectral Bkgrnd Bkgrnd 8 10 12 14 16 18 20 22 mintak000007.d: EIC 182.0938±0.01 24 +All MS, -Spectral Time Bkgrnd [min] Leu Gln Glu Met His Phe Arg 4000 3000 2000 1000 Intens. 0 4000 3000 2000 1000 0 mintak000007.d: EIC 205.0519±0.01 +All MS, -Spectral Bkgrnd 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Time [min] Liquor (agyvíz) minta CZE-MS elemzése (közvetlen injektálás, nincs mintaelőkészítés) Tyr Trp
Fehérjék azonosítása MALDI-TOF-MS tecnikával 25
Fehérjék azonosítása MALDI-TOF-MS tecnikával 26