A Proteomika Szolgáltató Laboratóriumban elérhető szolgáltatások Dr. Csősz Éva
Proteomika Szolgáltató Laboratórium műszerpark MALDI-TOF (ABSciex) PSZL ESI-4000 QTRAP (ABSciex) Kétdimenziós elektroforézis rendszer (Bio-Rad) BioPlex (Bio-Rad)
I. Szekvencia alapú fehérje azonosítás - MS/MS spektrumokon alapuló fehérjeazonosítás - A spektrumok segítségével fehérje szekvencia részlet azonosítása történik, majd a megfelelő fehérje hozzárendelése az egyre bővülő adatbázisokból - ProteinPilot 4.0 (ABSciex) illetve Mascot keresőprogramok segítségével, az eredmények manuális értékelésével nagy biztonsággal történik a fehérje azonosítás
I. Szekvencia alapú fehérje azonosítás Fehérjét tartalmazó foltok/sávok kivágása 2DE Enzimes (tripszin) emésztés A sejt lízise Fehérjék azonosítása Tömegspektrometriás analízis
II. Fehérje kvantitálás metabolikus jelölést követően intenzitás SILAC Stable isotope labelling with amino acids in cell culture Tápfolyadék normál Arg-el (könnyű Arg) Tápfolyadék 13 C tartalmú Arg-el (nehéz Arg) Sejtek lízise és homogenizálása Minta összekeverése Sejtek lízise és homogenizálása MS/MS 6 Da m/z
III. Fehérje kvantitálás kémiai jelölést követően intenzitás intenzitás itraq (isobaric tag for relative and absolute quantitation) 114 B R 115 B R 116 B R 117 B R Kontroll Kezelt sejt 60 min Kezelt sejt 120 min Kezelt sejt 240 min Sejtek feltárása, összekeverése MS m/z jelölés MS/MS 115 Fehérje mennyiségi adat a görbe alatti területből számolva 114 116 117 m/z
Fehérje kvantitálás metabolikus (SILAC) vagy kémiai (itraq) jelölést követően Metabolikus jelölés Előny 100%-os jelölést biztosítanak Egyazon rendszerben vizsgálható a két minta Hátrány Csak sejtkultúrákra alkalmazható Bizonyos sejtek kiemelt figyelmet igényelnek (speciális tápfolyadék stb.) Kémiai jelölés Előny Tetszőleges mintán alkalmazható Egyazon rendszerben vizsgálható 2-8 minta Hátrány A jelölés hatékonysága soha sem 100% Jelölés nem teljesen specifikus
Könnyfehérjék kvantitálása itraq jelölést követően Csosz et. al. (2012) J. Proteomics
IV. Fehérjék kvantitálása MRM/SRM módszer segítségével Q1 analizátor Ütközési cella Q3 analizátor Peptid kiválasztása Peptid fragmentálása Fragmens kiválasztása Detektálás
IV. Fehérjék kvantitálása MRM módszer segítségével MRM módszer kidolgozása szöveti fehérjékre AALVLAQAPAALADVLEGDSSEDRAFRVRIAG DAPLQGVLGGALTIPCHVHLRPPPSRRAVLG SPRVKWTFLSRGREAEVLVARGVRVKVNEAY RFRVALPAYPASLTDVSLARCEVQHGIDDSSD AVEVKVKGVVFLYREGSARYAFSFSGAQEAC TPEQLYAAYLGGYEQCDAGWLSDQTV Fehérje szekvencia Elméleti tripszin hasítás BLASTp MRM spektrum MRM átmenetek tervezése Csak a fehérjére jellemző szekvenciák kiválogatása
V. Aminosav analízis un. intelligens reagensek segítségével
V. Aminosav analízis un. intelligens reagensek segítségével
VI. Proteomikai profil változás vizsgálata kétdimenziós gélelektroforézis segítségével Alkalmas a proteomikai profilban bekövetkezett változások kimutatására, nyomon követésére A Minta B Minta gélanalízis kvalitatív és kvantitatív különbségek
VI. Proteomikai profil változás vizsgálata kétdimenziós gélelektroforézis segítségével A proliferatív vitreoretinopátiára (PVR) jellemző fehérje profil vizsgálata Dispase TG2 KO egér TG2 KO PVR egér
VII. Gélanalízis Kétdimenziós gélelemzés
VII. Gélanalízis Géldokumentáció Gélanalízis Master gél Expressziós különbségek
VII. Gélanalízis Egydimenziós gélelemzés QuantityOne (BioRad) szoftverrel M H1 AD1 AD2 AD3 H2 240 kda 165 kda 125 kda 93 kda 72 kda 63 kda 42 kda 35 kda 1 2 3 4 5 6 7 H1 H2 AD2 AD3 25 kda 20 kda 8 9 17 kda 10 11 12
VIII. Szkennelés Quantity One 1-D PDQuest Delta2D szoftverek PharosFX Plus System gélek blottok microplate-ek agar-agar lemezek szkennelése
VIII. Szkennelés Fluorescens szkennelés: 488 nm 532 nm 635 nm lézerek Telepszámlálás agar-agar lemezen
Összefoglalás Vállalt szolgáltatások: Szekvencia alapú (MS/MS) fehérjeazonosítás Fehérje kvantitálás (SILAC, itraq) MRM alapú fehérje azonosítás és kvantitálás Gyors aminosav analízis 1D és 2D elektroforézisek kivitelezése Géldokumentáció Gélanalízis Fluoreszcens szkennelés Fehérje profilok változásának vizsgálata
Elérhetőségek Honlap: http://bmbi.med.unideb.hu/proteomics Cím: DE OEC Elméleti Tömb, 204. Személyes kapcsolat: Dr. Tőzsér József tozser@med.unideb.hu Dr. Csősz Éva cseva@med.unideb.hu Köszönöm a figyelmet!