2016. 10. 14. KERINGŐ EXTRACELLULÁRIS VEZIKULÁK ÁLTAL INDUKÁLT GÉNEXPRESSZIÓS MINTÁZAT VIZSGÁLATA TROPHOBLAST SEJTVONALBAN Kovács Árpád Ferenc 1, Pap Erna 1, Fekete Nóra 1, Rigó János 2, Buzás Edit 1, Pállinger Éva 1 1 Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Semmelweis Egyetem, 2 I. sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika, Semmelweis Egyetem
PREECLAMPSIA FELTÉTELEZETT PATOMECHANIZMUSA Magzati rész Anyai rész KERINGŐ EXTRACELLULÁRIS VEZIKULÁK Decidua Myometrium SPIRÁLIS ARTÉRIA REMODELLING ANYAI VÉR Extravillosus trophoblast Endovaszkuláris trophoblast Syncytiotrophoblast sejtréteg Cytotrophoblast Endotél sejt Simaizomsejt Monocita/ Makrofág Syncytiotrophoblast eredetű extracelluláris vezikulák
AZ ANYAI-MAGZATI HATÁRFELÜLET C B EGÉSZSÉGES VÁRANDÓS PREECLAMPSIÁS VÁRANDÓS
EXTRACELLULÁRIS VEZIKULA (EV) MEDIÁLT SEJTKOMMUNIKÁCIÓ (1) EV BIOGENÉZIS APOTOTIKUS TESTEK 300-3000 nm EXOSZÓMÁK 35-150 nm CÉLSEJT MIKROVEZIKULÁK 100-1000 nm
EXTRACELLULÁRIS VEZIKULA MEDIÁLT SEJTKOMMUNIKÁCIÓ (2) EV SZERKEZET Hidrofób molekulák Foszfatidiliszerin (Annexin A5) Hidrofil molekulák Tetraspanin (CD63, CD81, CD9) Anyasejtre jellemző molekula (pl. HLA-G) mir, mrns, DNS, mtdns Fehérje cargo Lipid cargo
CÉLKITŰZÉS A preeclampsia asszociált keringő extracelluláris vezikulák trophoblast sejtek adhéziós génexpressziós mintázatra kifejtett hatásainak felderítése.
2. nap 1. nap 0. nap MÓDSZER (1) Idővonal Lépések 1 ml PFP/ minta 20 12.500 g 12.5K pellet Mikrovezikula Vezikulaszámlálás: 1*10 6 vezikula 12.500 g 15 100.000 g 70 70 100.000 g 24h 100K pellet Exoszóma Inkubáció BeWo sejtek 12.5K vagy 100K pellettel 5*10 5 BeWo sejthez BeWo sejtekből RNS izolálás Átírás cdns-sé RT-PCR Analízis
MÓDSZER (2) 1.) 5*10 5 BeWo BeWo sejtek Antigén Expresszió CD18 - CD44 - Bcl2 -/+ Pgp +/- CD11c - CD162 - CD95 - CD54 + HLA-G ++ PSR ++ HLA-DR - CD62L - CD49d - CD11b - FasL +/- CD34 - CD10-2.) 1*10 6 EV 3.) 24h inkubáció BeWo sejtekből RNS izolálás cdns-sé írás qrt-pcr (ABI 7900RT FAST)
M V / 1 m ic lite r p s m a Mikrovezikula/ μl plazma KERINGŐ EXTRACELLULÁRIS VEZIKULA MINTÁZAT JELLEMZÉSE 12.5K pellet MIKROVEZIKULA 100K pellet EXOSZÓMA ELMI DLS APOGEE ELMI DLS APOGEE HP HP HP HP 500 nm PE PE 200nm PE PE 1 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 6 0 0 0 0 *** *** EGÉSZSÉGES H e a lth y P re e c la m p tic HP MV 282 protein PREECLAMPSIÁS PE MV 297 protein EGÉSZSÉGES HP exo 163 protein PE exo 159 protein PREECLAMPSIÁS 4 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 H L A -G *** C D 6 2 C D 4 1 A n n e x in V 49 233 64 137 26 22 *** H e a lth y P re e c la m p tic MS MS
CI CI Avg. Migration (µm) Avg. Motility (µm) KERINGŐ EXTRACELLULÁRIS VEZIKULÁK FUNKCIONÁLIS HATÁSAI 140 H-EV VS P-EV SEJTMIGRÁCIÓS HATÁSA H-EV VS P-EV SEJTMOTILITÁS BEFOLYÁSOLÁSA 120 100 BeWo + H-EV 650 600 550 500 BeWo + H-EV 80 450 400 BeWo + P-EV 60 40 20 BeWo BeWo + P-EV 350 300 250 200 150 100 BeWo 0 50 100 150 200 250 300 Time (unit = 20 sec) 50 50 100 150 200 250 300 Time (unit = 20 sec) 10 H-EV VS P-EV ADHÉZIÓS HATÁSA 9 EV KONCENTRÁCIÓ FÜGGŐ HATÁSA VEZIKULA HATÁS A KORAI ADHÉZIÓRA 9 8 7 6 5 4 3 2 BeWo + H-EV BeWo + P-EV BeWo 8 7 6 5 4 3 2 BeWo + H-EV BeWo + 10x hígított H-EV H-EV BeWo BeWo + P-EV BeWo + H-EV BeWo 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 Normalized slope 1 1 0 20 40 60 80 Time / h 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Time / h
GÉN r e la tív m R N S e x p r e s s z ió r e la tív m R N S e x p r e s s z ió HP MV kezelt BeWo PE MV kezelt BeWo EV INDUKÁLT GÉNEXPRESSZIÓS MINTÁZAT (2) CD44 CD82 CLDN1 CXCR4 ICAM1 MMP2 MMP7 MMP9 MMP11 TGFB1 VCAM1 VDR VEGFA VEGFB VEGFC 2 0 1 5 1 0 5 0 B e W o + H -E V VEGFB ** B e W o + P -E V ** B e W o 2 0 1 5 1 0 5 0 B e W o + H -E V MMP2 ** B e W o + P -E V ** B e W o Expression levels compared to non-treated BeWo cells Növekedett (>1.5x) Változtatlan Csökkent (<0.5x) Nem detektált ANOVA, p<0.05, Dunnett s test
MEGBESZÉLÉS
KÖVETKEZTETÉS Az eltérő keringő extracelluláris vezikula mintázat kiváltotta funkcionális hatásaira (trophoblast inváziós képességét) részben magyarázatot ad a megfigyelt adhéziós génexpressziós változás (növekedett VEGFB, TGFB1, csökkent MMP2).
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS SE Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet Extracelluláris vezikula csoport Prof. Dr. Buzás Edit Dr. Pállinger Éva Dr. Wiener Zoltán Dr. Tamási Viola Dr. Pap Erna Fekete Nóra SE I. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Prof. Dr. Rigó János Dr. Alasztics Bálint Kemotaxis csoport Dr. Kőhidai László Dr. Láng Orsolya Dr. Lajkó Eszter Krausz Máté MTA Természettudományi Központ Dr. Turiák Lilla Kísérletes Orvostudományi Központ Prof. Kittel Ágnes
Köszönöm a megtisztelő figyelmet!