Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011
Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Csősz Éva Molekuláris terápiák 7. előadás REKOMBINÁNS ANTITESTEK ÉS A PHAGE DISPLAY TECHNIKA
A 7. fejezet célja, hogy bemutassa a terápiák során felhasznált antitestek termelésének lehetőségeit és korlátait. A fejezet során bemutatásra kerül az antitestek termelődésének folyamata, a terápiás antitestek termelése hibridómákban illetve a nagyfokú antitest diverzitás biztosítása fág diszplay segítségével. A 7. fejezet témakörei 7.1. Áttekintés 7.1.1. Az antitestek szerkezete és termelődése a szervezetben 7.1.2. Antigén antitest kölcsönhatás 7.2. A terápiás antitestek termelése 7.2.1. Antitestek termelése hibridómákban 7.2..2. Humanizált antitestek 7.2.3. Humán antitestek termelése 7.3. Antitestek termelése fág diszplay segítségével 7.3.1. A fág diszplay technika bemutatása 7.3.2. Fág könyvtárak készítése 7.4. A terápiás antitestek alkalmazása
Az antitestek szerkezete NH 3 + NH 3 + Szupervariábilis régió NH 3 + NH 3 + V L V H V H V L C H1 F ab régió C L COO - CH1 Könnyű lánc: C L konstans régió, variábilis régió COO - Diszulfid hidak C H2 Hinge régió Nehéz lánc: konstans régió, variábilis régió Fc régió C H3 COO - COO -
Az antitestek nehéz láncának szerkezete kb. 85 gén kb. 27 gén kb. 6 gén V H1 V H2 V H3 J H1 C V H4 V Hn D H1 D Hn J H2 J H3 J Hn C µ C C C α Nehéz lánc V H4 C IgG D H1 J H2
Az antitestek könnyű láncának szerkezete kb. 35 kappa gén kb. 5 kappa gén V L1 V L2 V L3 V L4 V Ln J L1 J L2 J L3 J Ln C kb. 30 lambda gén kb. 4 lambda gén V L2 J L3 C kappa könnyű lánc
Az antitestek termelése a B sejtekben B sejt Antitest
A klonális szelekció és klonális expanzió Rekombináció Kapcsolódási diverzitás Szomatikus hipermutáció Y Y Y Y B sejt BCR Klonális szelekció Antigén/epitóp B sejt Klonális expanzió Plazma sejt Specifikus antitest
Poliklonális antitestek B sejt Y Y Y B sejt Antitest Antigén Y Epitóp Antitest B sejt
Monoklonális antitestek B sejt Antitest Antigén Epitóp
Antitestek termelése hibridómákban Antigén Mielóma sejtek HGPRT Antitest termelés Egér immunizálása Lépsejtek izolálása HGPRT Antitest termelés Lépsejtek és mielóma sejtek fúziója, a hibridóma sejtek létrehozása Hibridómák szűrése és szaporítása Y Y Y Y Y Y Y Antitestek izolálása
Humanizált antitestek Egér antitest Humán antitest Humanizált antitest / kiméra antitest
Humán antitestek termelése génmódosított egerekben Egér immunoglobulin gén Humán immunoglobulin gén Humán vagy humanizált antitestek termelése
Az M13 bakteriofág szerkezete M13 bakteriofág 5 db p6 5 db p9 5 db p7 2700 db p8 DNS - 6.4 kb 5 db p3 900 nm F-pilus E. coli
Az immobilizált fehérjékhez kötött fágok specifikus elúciója Specifikus elúció Immobilizált fehérje / affinitás mátrix
Enzim fág diszplay mátrix
Szubsztrát fág diszplay I. mátrix
Szubsztrát fág diszplay II. mátrix mátrix
Enzim-szubsztrát fág diszplay I. mátrix
Enzim-szubsztrát fág diszplay II. mátrix mátrix
Fág könyvtárak készítése Változatos szekvenciák sokasága Fágmid Rekombináns fágmid
Proteáz szubsztrát fág könyvtár készítése TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Változatos szekvenciák létrehozása Proteáz szubsztrát szekvencia hgh gén Proteáz szubsztrát M13 giii gén hgh gén Proteáz szubsztrát M13 giii gén Fágmid vektor Fágmid vektor Fág könyvtár
Szubsztrát fág diszplay proteáz hasítóhelyek fejlesztése Proteáz érzékeny szekvenciák Proteáz hgh receptor Proteáz Szekvenálás Alacsony ph mátrix Proteáz rezisztens szekvenciák
In vivo fág diszplay ér endothel sejtek térképezése A fágok az erek falán expresszált fehérjékhez kötődnek Fág könyvtár beadása intravénásan Biopszia A kötődött fágok lemosása A fágok által hordozott peptidek/fehérjék azonosítása A kötődött fágok szaporítása
Antitest könyvtárak készítése teljes vérből Teljes vér (Immunizált donor) Antitest gének Limfociták mrns Antitest specifikus primer Fágmid cdns E. coli sejtek 10 8 különböző antitest génjét tartalmazzák
Antitest függő citotoxicitás mechanizmusa Tumor ellenes antitestek Fc receptor Tumor sejt Ölő sejt (NK sejt vagy monocita)
Immunszupresszáns hatású terápiás antitestek alkalmazása Monoklonális antitestek Adalimumab Infliximab Golimumab Cetrolizumab pegol TNFalfa Pszoriázis Reumatoid arthritisz Crohn betegség Spondilitisz Basiliximab Humán-egér kiméra antitest IL2 receptor alfa lánc Transzplantáció utáni szervkilökődés megakadályozására, főként veseátültetések esetén
A terápiás antitestek változatai Bispecifikus antitest (kb. 300 kda) IgG - scfv (Fab scfv) 2
A kisméretű terápiás antitestek változatai Fab F(ab ) 2 scfv Tandem scfv Diabody Triabody Bispecifikus antitest Fv S-S S-S dsfv scfv 2 Nanobody