Ehető vakcina előállítása transzgénikus növények segítségével Szakdolgozat biológia alapszak, biológus szakirány készítette: Zelenyánszki Helga témavezető: Dr. Tamás László, egyetemi docens Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszék EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNYEGYETEM TERMÉSZETTUDOMÁNYI KAR BIOLÓGIAI INTÉZET Budapest, 2011
Tartalomjegyzék Oldalszám Bevezetés 3 Kifejtés 6 1. A mukózális immunrendszer 6 1.1 Az emésztőrendszerhez kapcsolódó nyirokszövetek szerkezete 6 1.2 Az adaptív immunválaszt elemei 7 1.3 A mukózális és az injektált vakcinák hatása 10 1.4 A vakcina antigén célsejtekhez juttatására alkalmas rendszerek és mukózális adjuvánsok szerepe 10 1.5 Az orális tolerancia 12 2. Növénytranszformáció 12 2.1 Agrobaktérium közvetítette géntranszfer 13 2.2 Génmódosítás génpuskával plasztisz transzformáció 15 2.3 Tranziens expresszió 16 3. A sejtmagban kódolt idegen fehérjék expressziójának jellemzői 18 3.1 A növényi gének promótereinek rövid jellemzése 18 3.2 A szövetspecifikus promóterek felhasználása ehető vakcina előállításához 19 3.3 Fehérje transzport, akkumuláció és glikoziláció 20 4. A kloropasztiszban kódolt idegen fehérjék expressziójának jellemzői 22 4.1 A plasztisz genom szerveződése és a homológ rekombinációhoz szükséges célszekvenciák 22 4.2 Prokarióta jellegek és következményeik 23 5. Növényekben termelt vakcina antigének alkalmazása 23 5.1 Példák a sejtmagban kódolt vakcina fehérjék alkalmazására 23 5.1.1 Az LTB fehérjét termelő transzgénikus kukorica hatása emberekben 25 5.1.2 A Hepatitis B vírus antigénjét termelő transzgénikus nyers burgonya fogyasztásának hatása emberekre 27 5.2 Példák a plasztiszban kódolt vakcina fehérjék alkalmazására 28 5.2.1 Pestisfertőzés elleni védelmet kiváltó dohányban termelt antigén 28 5.2.2 A DPT fúziós antigén hatása egerekben 31 Összefoglalás 32 Summary 33 Hivatkozások 34 Köszönetnyilvánítás 37 Nyilatkozat 38
Bevezetés Évente 57 millió halálozásból a becslések szerint közel 15 millió ( 25%) köthető közvetlenül valamilyen fertőző betegséghez. Megelőzésükre a védőoltások jelentik a leghatékonyabb és leggazdaságosabb megoldás (Daniell és mtsai., 2009). A védőoltások alapelve, eltekintve a tagadhatatlan technikai fejlődéstől lényegében nem változott 1796 óta, amikor Edward Jenner kidolgozta az első vakcinát. A vírusok és baktériumok ellenni bejegyzett védőoltások többsége, melyeket döntően bőr alá vagy izomba injektálnak, legyengített vagy inaktivált/elölt patogént tartalmaznak. A legyengített kórokozók általában erős és hatásos immunválaszt váltanak ki, azonban előfordulhat, hogy előállításuk, alkalmazásuk során szennyeződnek vagy, hogy a beadás után a szervezetben visszanyerik virulenciájukat. Az elölt patogének nem képesek in vivo szaporodni használatuk biztonságosabb, de gyakran kevésbé immunogének és a szennyeződés veszélye ezek előállítása során is fennáll (Joensuu és mtsai., 2008). A molekuláris biológia 1980-as években bekövetkezett technikai fejlődése lehetővé tette az alegység vakcinák előállítását. Ezek nem a teljes patogént, hanem annak egy vagy két rekombináns technológiával előállított fehérjéjét tartalmazzák. A szervezetbe jutva ezek a fehérjék specifikus immunválaszt váltanak ki, mely később a valós patogén ellen is hatásos Ezek a vakcinák biztonságosabbak a klasszikus védőoltásoknál, mivel megfelelő tisztítás után nincsenek bennük fertőzést okozó vagy toxikus mikroorganizmus részek, ill. molekulák (Tiwari és mtsai., 2009). Alegység vakcinák előállítására több lehetőség is rendelkezésére áll a kutatóknak és az iparnak. A legelterjedtebb expressziós rendszerek az Escherichia coli, a Saccharomyces cerevisiae és különféle emlős sejttenyészetek, melyek segítségével biofermentorokban állítanak elő rekombináns fehérjéket. Rekombináns fehérje termelésre alkalmasak továbbá a transzgénikus növények, valamint a transzgénikus állatok is (Karg és Kallio, 2009). A transzgénikus növények többféle módon is alkalmazhatók rekombináns fehérje előállítására. Például a Chlorella és Chlamydomonas algák egy-sejt kultúrái, a magasabb rendű növények szuszpenziós sejtkultúrái, valamint az üvegházi vagy szabadföldi termesztésű haszonnövények (Rybicki, 2009). A növények felhasználása jóval egyszerűbb és költséghatékonyabb a többi expressziós rendszernél. A növényeknek mai ismereteink szerint nincsenek olyan patogénjei, melyek az állatokra vagy az emberre veszélyes lenne, ezért 3
biztonságosabbak, mint a többi expressziós rendszer, melyeknél a rekombináns fehérjét alaposan meg kell tisztítani a termelő szervezet anyagaitól, mert azok közt toxikus vegyületek vagy emberekre is veszélyes vírusok lehetnek (Karg és Kallio, 2009). A növényekben előállított vakcina antigének lehetőséget teremtenek egy alternatív immunizációs módszer számára, az antigének szájon át (per os) történő bejuttatására. Az ehető vakcina egy adott patogénre jellemző fehérjét termelő transzgénikus, ill. transzplasztomikus növény ehető része, mely elfogyasztva a szisztémás immunválaszon túl az emésztőrendszer védelméért is felelős mukózális immunrendszer általi védelmet vált ki (Tiwari és mtsai., 2009). A mukózális immunrendszer működése igen összetett, minden részlete ma még nem ismert (Neutra és Kozlowski, 2006). A nyers vagy porított formában alkalmazott ehető vakcinák segítségével szükségtelenné válik a rekombináns fehérje megtisztítása. Ez az alegység vakcinák előállítási költségének kb. 50%-át jelenti (Joensuu és mtsai., 2008). További előnyük, hogy szervezetbe juttatásukhoz nincs szükség steril eszközökre és képzett szakemberre, valamint szállításuk és tárolásuk bizonyos esetekben hűtési lánc nélkül megvalósítható (Daniell és mtsai., 2009). Az első, növényben termelt vakcina antigént 1992-ben állították elő dohányban, mely a hepatitis B vírusának egy felszíni fehérjéje volt (Mason és mtsai., 1992). Az első növényben termelt antigénnel végzett klinikai vizsgálatok eredményét 1998-ban publikálták (Tacket és mtsai., 1998). 2001-ben burgonyában már sikeresen termeltettek többkomponensű (kolera, rotavírus, enterotoxikus E. coli) antigént (Yu és Langridge, 2001). A plasztisz genomot magasabb rendű növényben először 1990-ben sikerült transzformálni (Svab és mtsai., 1990). 2001-ben sikeresen termelték meg a Vibrio cholerae toxinjának B alegységét dohányban (Daniell és mtsai., 2001). Mára közel ötven különböző humán vagy állati patogén fehérjéit szintetizáltatták transzgénikus növények segítségével, a citoplazmában vagy a plasztiszban (Joensuu és mtsai., 2008; Daniell és mtsai., 2009). Ehető vakcina előállításához első lépésben a növény genetikai állományának módosítására van szükség. A növények genomszerveződése miatt erre több lehetőség is van, mivel a növények teljes genetikai állományát a sejtmagi genom, valamint a plasztiszok és a mitokondriumok genomjának összessége alkotja. Genetikai módosításra a sejtmagi és kloroplasztisz genom esetében rendelkezünk hatékony módszerrel, melyek révén létrehozhatóak transzgénikus és transzplasztomikus növények. A sejtmagban és a 4
kloroplasztiszban kódolt gének expressziójában alapvető különbségek vannak, melyek főképp az eu- illetve prokarióta jellegekre vezethetőek vissza. Ezekből a különbségekből azonban eltérő lehetőségek is adódnak. Ehető vakcinák előállításakor a három legfőbb szempont, hogy az adott rendszerben milyen poszttranszlációs módosítások mennek végbe (ezek befolyásolhatják a fehérjék stabilitását és immunogén hatását), az hogy van-e lehetőség a génexpresszió specifikus szabályozására, valamint hogy milyen fehérjemennyiség állítható elő. Nem elhanyagolandó szempont továbbá, hogy milyen növények alkalmasak a sejtmagi, ill. a plasztisz transzformációra. A sejtmagban kódolt gének esetében a poszttranszlációs módosítások (zsírsav aciláció, foszforiláció, diszulfid hidak kialakulása, az N- és O-glikoziláció) az eukariótákra jellemző módon zajlanak, valamint a glikozilációs mintázat különféle genetikai eszközökkel módosítható (Karg és Kallio, 2009). A sejtmagban kódolt gének expressziója szövetspecifikus promóterekkel is szabályozható, így a kívánt fehérje célzottan termelhető kizárólag csak az ehető növényi részek egyes szöveteiben (Tiwari és mtsai. 2009). A magban kódolt génekről általában a teljes oldott fehérje (TSP Total Soluble Protein) 1-2%-át adó rekombináns fehérje arányt lehet elérni (Meyers és mtsai., 2010). Sejtmagi transzformációra számos ehető részekkel rendelkező egy- ill., kétszikű növény alkalmas. A kloroplasztiszban a poszttranszlációs módosítások nagy része, a zsírsav aciláció, a foszforiláció és a diszulfid hidak kialakulása megtörténik, a glikoziláció azonban nem. A kloroplasztiszban kódolt génekről általában nagy mennyiségű rekombináns fehérje termelhető (TSP 2-43%-a). Plasztisz transzformációra és az azt követő regenerációra csak kevés ehető növény, a saláta, a paradicsom és a répa alkalmas (Daniell és mtsai., 2009). A növények genetikai módosítására többféle transzformációs módszer is létezik, melyek közül kettőt alkalmaznak széles körben. Agrobacterium tumefaciens közvetítette géntranszferrel a sejtmagi, génpuska segítségével pedig a sejtmagi és a kloroplasztisz genomja egyaránt módosítható. Növénytranszformáció során érett vagy éretlen növényi szövetek sejtjeit transzformálják, majd a sikeresen transzformált sejtekből teljes növényt regenerálnak. A transzformáció nem 100%-ban eredményes, azaz a transzformálandó szövet sejtjei közt transzformált és nem transzformált sejtek egyaránt találhatóak. Ezen sejteket meg kell tudni különböztetni egymástól. E célra szelekciós markergéneket vagy riporter géneket használnak (Maliga, 2003). 5
1. Az emésztőrendszer immunvédelme 1.1 Az emésztőrendszerhez kapcsolódó nyirokszövetek szerkezete Az emésztőrendszer védelméért is felelős mukózális immunrendszer nevezéktana nem egységes a szakirodalomban. Célszerű ezt a rendszert felosztani induktív helyekre, ahol a nyálkahártya felszínről származó antigén stimulálja a B és T sejteket, valamint effektor helyekre, ahol a differenciálódott sejtek az érpályából kilépve végrehajtják feladatukat. Az emésztőrendszer esetében az induktív helyek közé tartozik a GALT (GALT Gut Associtaed Lymphoid Tissue) és az emésztőrendszer környéki nyirokcsomók. A GALT elemei: Peyer-plakkok (nyiroktüsző csoportosulás) a vékonybél alsó szakaszában elszórt nyiroktüszők (follikulusok) a féregnyúlványban, vastagbélben, végbélben (Brandtzaeg és Pabst, 2004). Azt induktív helyek tartalmazzák az adaptív immunválasz kiváltásához, szabályozásához és végrehajtásához szükséges elemeket, a B-sejtes tüszőket, T-sejtes zónát, az antigén bemutató sejteket (Antigen Presentig Cell-APC: makrofágok, dendritikus sejtek (Dendritic Cell-DC) és B-sejtek (Simecka, 1998). A nyiroktüszők jelenléte hatással van a felette húzódó epitéliumra, specializált tüsző-kapcsolt epitélium (FAE follicle-associated epithelium) differenciációját indukálja. A FAE-t túlnyomórészt enterociták alkotják, melyek közt elszórtan M-sejtek vannak (Neutra és Kozlowski, 2006). Az M-sejtek képesek makromolekulák vagy akár teljes mikroorganizmusok endocitózissal történő felvételére (l. 1. ábra). A felvett részecskék vezikuláris transzport révén sejt a bazális részére kerülnek. Itt az M- sejtek által formált intraepitéliális zsebekben limfociták, makrofágok és dendritikus sejtek találhatóak (Simecka, 1998). 6
1. ábra: Az emésztőcsatorna lumenéből származó antigéneket vagy teljes patogéneket az M- sejtek képesek felvenni majd az intraepitéliális zsebekben található makrofágok (M), dendritikus sejtek (DC) és limfociták (L) felé továbbítani (Simecka 1998). 1.2 Az adaptív immunválasz elemei Az adaptív immunválasz három szakaszra osztható. A kezdeti szakaszban a hivatásos antigén bemutató sejtek felveszik, feldogozzák és bemutatják a T-sejteknek az antigént. A centrális fázisban T- és B-sejtek aktiválódnak, osztódnak és differenciálódnak. A végrehajtási szakasznak két típusa van, a sejtes és a humorális. A sejtes válasz végrehajtói főképp a citotoxikus T-sejtek (Tc), melyek képesek elpusztítani a célsejteket. A humorális immunválasz jellemző molekulái az immunglobulinok, melyeket a plazmasejtté differenciálódott B-sejtek termelnek. Ezek a molekulák további antigén függő végrehajtó mechanizmusokat indítanak be. Az immunválasz első lépésében az M-sejtek felismerik az antigént és átszállítják az epitéliális határvonalon. Az antigén ezután főként a hivatásos APC-k közé tartozó dendritikus sejtekhez kerül, de az antigén bemutatásban szerepet kapnak a makrofágok és a B-sejtek is. Az antigén prezentáló sejtek három T-sejt típust aktiválhatnak, a citotoxikus T-sejteket (Tc), valamint a Th1 és Th2 típusú segítő T-sejteket. A segítő T-sejtek alpopulációi eltérő mediátorokat (citokineket) termelnek s ezek révén eltérő effektor mechanizmusokat váltanak ki. A Th1 sejteknek a sejt közvetítette válaszban van szerepe: a makrofágokat és a Tc-sejteket szabályozzák. A Th2 sejtek aktiválják a B-sejteket: hatással vannak ezen sejtek érésére és 7
immunglobulin termelésére (humorális válasz). Az immunválasz típusának befolyásolásában az APC-k is szerepet játszanak, a DC-k a jellemzően a Th2 sejteket, a makrofágok pedig Th1 sejteket aktiválják (Simecka, 1998). Az aktivált B és T-sejtek a follikulusokból a keringési rendszerbe kerülnek és a szervezeten belüli vándorlásba kezdenek. A limfocita migráció célja elsődlegesen az eredeti fertőzés helye és a GALT további részei, de az effektor sejtek akár távoli mukózális szövetekbe is eljuthatnak (mukózális immunválasz). Ezen kívül a keringésből a lépbe és a perifériás nyirokcsomókba kerülő sejtek szisztémás immunválaszt indukálnak. A mukózális immunrendszer jellemzője, hogy nem csak a fertőzés helyén, hanem távoli mukózális szövetekben (pl. légutak, mirigyek nyálkahártyája) is kialakulhat a specifikus immunválasz. Ennek az ún. közös mukózális immunrendszernek fontos szerep jut a mukózális, ill. ehető vakcinák által kiváltott immunválasz során: a HIV vírus például az ivarszervek nyálkahártyáján keresztül jut be a szervezetbe, ezután az emésztőrendszer nyálkahártyájában lappang, s innen indul ki a szervezetben való szétterjedése (Simecka, 1998, Neutra és Kozlowski 2006). A leghatásosabb védelem tehát az, ha mindkettő stratégiailag fontos helyen jelen vannak antigén specifikus effektor sejtek. A limfocita migráció irányításában a sejtfelszíni szövetspecifikus adhéziós molekulák és kemokin receptorok, más néven homing receptorok vesznek részt. Ezek expresszióját különféle sejtek által termelt citokinek befolyásolják. A GALT-ba irányuló vándorlás fő irányítói a limfociták felszínén megjelenő receptorok, az L-szelektin és α4β7 integrin, melyek liganduma a MadCAM-1. Utóbbi molekula megtalálható a posztkapilláris venulák (HEV High Endothel Venule) endotél sejtjein a Peyer-plakkokban, a mesenterium nyirokcsomóiban, valamint a lamina propriában. Nincsenek jelen viszont a perifériás nyirokcsomókban. A távoli migrációra példa az IgA-t termelő B-sejtek CCR10 receptora, melynek ligandumát a CCL28- at a vékony- és vastagbél, a nyálmirigyek, a mandulák, a légutak és a laktáló tejmirigyek epitélium sejtjei is termelik (Simecka, 1998; Neutra é Kozlowksi, 2006). Ezen molekulák révén akár közel a teljes mukózális rendszer immunológiai védelme kialakulhat. Az emésztőrendszerben az immunválasz jellemző végrehajtói elemei a differenciálódott B- sejtek által termelt immunglobulinok (főleg IgA és IgG, de megtalálható az IgE és IgM is), a fertőzött sejtek elpusztítására képes Tc sejtek, továbbá az immunglobulinok és a természetes ölősejtek összehangolt működésének eredménye, az antitest függő sejt közvetítette 8
citotoxicitás (ADCC-Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity). (1. 2. ábra) 2. ábra: Az antigén-specifikus B és T sejtek a magas endotélium borítású venulák (HEV) falán keresztül jutnak a nyálkahártyába, ahol a B sejtek IgA, vagy IgG termelő plazmasejtekké differenciálódnak. A fertőzött sejteket a citotoxikus T-sejtek (CTL) vagy pedig a természetes ölősejtek (NK) pusztítják el antigén függő sejt közvetítette citotoxicitás révén (ADCC). A lumen felőli védelmet az siga molekulák, az epitéliális sejtek és a mukózális felszínt bevonó nyálkaréteg látja el. (Neutra és Kozlowski 2006) A mukózális immunválasz legjellemzőbb vonása a helyi IgA termelés. Az IgA a többi immunglobulin izotípussal szemben jobban ellenáll a proteázok hatásának, melynek oka a molekula szerkezetében keresendő. Az IgA molekulák erősen glikoziláltak. A nyálkahártyában található IgA-k a vérben levőkkel szemben dimer szerkezetűek. Szintézis után az IgA maradhat az epitéliális sejtek vonalán belül, a mukózális szövetnedvben, ahol ADCC-ben vehet részt, illetve receptor közvetítette transzport révén bejuthat az epitéliális sejtekbe, ahonnan az emésztőcsatorna lumenébe kerül. A szekretált IgA (siga) stabilitását tovább növeli, hogy asszociálódik a szállításért felelős receptor egy részével, a szintén erősen glikozilált szekréciós komponenssel. A siga sokféle módon vesz részt az immunvédelemben. 9
Képes megakadályozni az antigének/mikrobák és a nyálkahártya felszíne közti direkt érintkezést azáltal, hogy a nyálkában tartja őket vagy, hogy elfedi a mikrobák adhézióért felelős sejtfelszíni molekuláit. Az IgA molekulák megakadályozhatják néhány vírus részecskéinek sejten belüli összeépülését, így gátolva a vírusok szaporodását. Továbbá szerepe lehet bizonyos bakteriális toxinok inaktiválásában (Simecka, 1998; Neutra és Kozlowski 2006). 1.3 A mukózális és a beinjektált védőoltások hatékonysága Mukózális immunválasz kiváltásának leghatékonyabb módja az antigén közvetlenül valamilyen nyálkahártyával bevont felületre történő juttatása. Az injekcióban adott védőoltások általában csak gyenge mukózális választ váltanak ki, amire pedig szükség lenne, mivel a patogének túlnyomó része valamilyen nyálkahártyával borított felszínen keresztül jut a szervezetbe. Mindezek ellenére ma még a vakcinák döntő többségét bőr alá vagy izomba adják. Ennek egyik oka, hogy a mukózális immunválaszról egyelőre korlátozottak az ismeretek. Másrészt pl. az ehető vakcinák esetében problémát jelent, hogy nehezen becsülhető az, hogy a per os beadott antigén dózis mekkora része jut el valójában az induktív helyek sejtjeihez. Ennek hátterében az áll, hogy az emésztőrendszerbe jutott antigének erőteljes proteáz aktivitásnak vannak kitéve, aminek erőssége személyenként változó is lehet (Neutra és Kozlowski, 2006). A mukózális adjuvánsok és hordozók erre a problémára megoldást jelenthetnek. 1.4 A vakcina antigén célsejtekhez juttatására alkalmas rendszerek és az adjuvánsok szerepe Hatásos ehető vakcina létrehozásához hatékony hordozó és adjuváns rendszerre van szükség. Ennek jellemzői: (1) védje az antigént a fizikai-, ill. enzimatikus lebontástól, (2) specifikusan célozza az induktív helyeket, ezen belül is az M-sejteket vagy az APC-ket (sejtkötődés), (3) megfelelően stimulálja a veleszületett immunrendszer elemeit, hogy kialakulhasson a későbbiekben a specifikus immunválasz (adjuváns funkció) (Holmgren és Czerkinsky, 2005). A növényekben történő vakcina fehérje termelés az első feltételnek további módosítások nélkül is megfelel. A növényi sejtfal, illetve az egyes kompartmentek membránja egyfajta ehető kapszulaként megvédi az antigént, ami így az emésztőcsatorna alsóbb részein felvételre 10
kerülhet (Tiwari és mtsai., 2009). A mukózális adjuvánsoknak három típusa van, a bakteriális toxinok, ill. származékaik, különböző citokin vagy kemokin molekulák és a CpGmotívumokat tartalmazó DNS fragmentek (Eriksson és Holmgren, 2002). Ehető vakcinák esetében az első kettőt lehet jól alkalmazni. Az antigént és az adjuvánst a legjobb hatás elérése érdekében össze kell kapcsolni. Erre két lehetőség adódik, a kémiai kapcsolás és a genetikai fúzió. Utóbbinál a két gén együtt transzkriptálódik, ill. transzlatálódik (Eriksson és Holmgren 2002). Az E. coli hőérzékeny enterotoxija (LT), valamint a kolera toxin (CT) nagyon hatásos adjuvánsok. A két toxin szerkezete hasonló, a célsejtekhez kötődésért felelős homopentamer B alegységből (LTB, ill. CTB) és a patogenitásért felelős A alegységből állnak. Ezek a toxinok tehát nem csak adjuvánsok, de B alegységük révén karrierként is szerepelhetnek: a B alegység képes kötődni az eukarióta sejtek jellemző sejtfelszíni molekulájához, a GM-1 gangliozidhoz. A natív toxinok (főleg a CT) erősen mérgezőek, ezért emberekben nem kívánatos az alkalmazásuk. Különböző módosításokkal azonban humán adjuvánsként is használhatóak (Eriksson és Holmgren, 2002): az A alegység célzott mutagenezissel létrehozott kevésbé vagy egyáltalán nem toxikus formáinak használata, azonban gyengébb adjuváns hatásuk van az A alegységet más sejtfelismerő fehérjéhez kapcsolják csak a B alegységet, mint karriert fúzionálják az antigénnel, mint pl. a sertésekben járványos hasmenést okozó PEDV koronavírus esetében (Oszvald és mtsai. 2007a). A célsejtekhez való kötődés további molekulákkal is elérhető, ilyenek a növényi lektinek, a Staphylococcus aureus-ból származó CTA1-DD fehérje, mely specifikusan a B-sejtekhez kötődik (Holmgren és Czerkinsky, 2005) valamint a Klebsiella pneumoniae külső membránjának P40-es fehérjéje, ami a mukózális dendritikus sejtekhez kötődik (Eriksson és Holmgren 2002). A legtöbb adjuváns hatásának legalább egy részét immunológiai mediátorok termelésének indukcióján keresztül váltja ki (Eriksson és Holmgren 2002). Ezen citokin, ill. kemokin molekulák génje beépíthető az ehető vakcina génkonstrukciójába, kiváltva a toxikus adjuvánsok használatát. A kolera toxinnal megegyező hatás váltható ki például, ha az antigénhez IL-1 és Th1 választ indukáló IL-12, IL-18 és GM-CSF-t (granulocita, makrofág kolónia stimuláló faktor) molekulákat adnak (Eriksson és Holmgren 2002). 11
1.5 Az orális tolerancia Orális toleranciának azt a jelenséget nevezzük, amikor egy antigén ismételt szervezetbe jutása nem vált ki immunválaszt (Simecka, 1998). Ez valójában nem az immunválasz hiánya, ide tartozik minden olyan mechanizmus mely a lehetségesen káros immunválaszt megelőzi, elnyomja vagy nem káros immunválasz irányába tolja el. Ilyen az anergia, a klonális deléció, valamint az immunválasz aktív szupresszálása. Anergia esetében a limfociták az antigént megkötve inaktiválódnak, azaz nem szabadítanak fel kemokin molekulákat, így nem következik be további immunválasz. Klonális deléció során az adott antigénre specifikus limfociták és klónjaik programozott sejthalál, apoptózis következtében elpusztulnak. A szupresszió során különböző mediátorok szabadulnak fel (pl. TTGF-β) melyek gátolják a T- sejtek proliferációját, így kevesebb effektor sejt keletkezik (Holmgren és Czerkinsky 2005). Egy patogén elleni védelem kiváltását célzó ehető vakcina az antigénnel szemben kialakuló tolerancia nem kívánatos. Az orális tolerancia általában elkerülhető hatásos adjuvánsok alkalmazásával. Az orális tolerancia jelensége felhasználható viszont immunrendszeri rendellenességből következő betegségek kezelésére. Ilyenek az autoimmun betegségek, az allergiák, ill. a krónikus emésztőrendszeri gyulladások melyek oka, hogy egy alapvetően ártalmatlan molekula túlzott immunválaszt vált ki (Simecka, 1998). 2. Növénytranszformáció A sikeres genetikai módosításhoz olyan növényfajok megfelelő szöveteire van szükség, melyek genetikai állománya nagy hatékonysággal módosítható valamilyen transzformációs módszerrel, valamint arra, hogy az adott szövetből nagy hatékonysággal lehessen teljes növényt regenerálni. A transzformálandó szövet vagy sejt lehet érett (pl. levél mezofillum), éretlen (pl.: embrió) vagy érett sejtek dedifferenciációja révén kialakuló kallusz tenyészetek. A három leghatékonyabb transzformációs módszer az Agrobacterium tumefaciens közvetítette géntranszfer, a biolisztikus eljárás (génpuska) és a polietilén-glikolos (PEG) ozmotikus sokkhatás. Előbbi csak a sejtmag, utóbbi kettő pedig a sejtmag és a kloroplasztisz genetikai módosítására egyaránt alkalmas. Attól függően, hogy a transzgén beépül-e a növényi genom valamely pontjára megkülönböztetünk stabil és tranziens genetikai módosítást (Maliga, 2003; Gleba és mtsai., 2005). 12
2.1 Agrobaktérium közvetítette géntranszfer Az Agrobacterium tumefaciens egy, a Rhizobiaceae családba tartozó, talajlakó, természetes növény patogén baktérium. Tumoros elváltozást okoz a legtöbb kétszikű, és néhány egyszikű fajban (Cleene és Ley, 1976).Ez a faj, pontosabban a virulens törzsei rendelkeznek egy kb. 200 kbp. méretű plazmiddal, azaz extrakromoszomális, cirkuláris DNS-el (szerkezetét l.3 ábra). 3. ábra: Az A. tumefaciens Ti plazmidjának szerkezete. A jobb és bal határszekvenciák (Left,Right Border) közt az auxin, citokinin és opin szintézisért felelős gének találhatóak. A replikációs origótól balra a fertőzésért felelős virulencia-régió, jobbra pedig az opin anyagcserében részt vevő gének vannak (http://en.wikipedia.org/wiki/file:ti_plasmid.jpg). Ennek a Ti (tumor indukáló) plazmidnak egy jobb és bal oldali határszekvenciák (left and right border LB, RB) által közrezárt szakasza a transzfer-dns (T-DNS) a fertőzést követően átkerül a gazdasejtbe, ahol a beépül a fertőzött sejt genomjába és ott megfelelő feltételek mellett expresszálódik (McCullen és Binns, 2006). Ezt a természetes génsebészt használják a növénytranszformáció során nagyon sok laboratóriumban és sok növény esetében. A T-DNS-en két fő géncsoport található. Az egyik a tumor kialakulásáért felelős enzimeket kódol, melyek növényi hormonok (auxin és citokinin) szintézisében vesznek részt. A másik csoportnak az opinszintézisben van szerepe. Az opinok olyan aminosav-cukor konjugátumok melyek az A. tumefaciens számára szén és nitrogén forrásul szolgálnak. Mivel csak kevés más baktérium törzs tudja ezeket hasznosítani, ez szelekciós előnyt jelent az A. tumefaciens sejtek számára. A T-DNS transzfer a transzformáció alapja, melyhez három fő elem szükséges, az 13
LB és RB által határolt T-DNS, a Ti-plazmidon található virulencia (vir) gének és különféle további, a baktérium kromoszómáján található gének (McCullen és Binns 2006). A vir-régió génjei által kódolt fehérjék szerepe: Érzékelik a sérült növényi sejtekből felszabaduló fenol típusú vegyületeket és közvetítik a szignált, melynek eredménye a vir gének fokozott expressziója (vira, virg). A virb operon 11 fehérjéje vesz részt a bakteriális sejtfalon kialakuló pórus létrehozásában, melyen keresztül a vir fehérjék és a T-DNS kijut a baktériumból a növényi sejtbe. Egy helikáz és egy endonukleáz aktivitású fehérje (VirD1, VirD2) hozzákötődik a határszekvenciához és kivágja a T-DNS-t. A VirD2 ez után az egyszálú T-DNS '5 végéhez kötődik, segíti a T-DNS sejtmagba jutását. További fehérjék (VirD2, VirE2, VirE3, VirF) vesznek részt a citoplazmában történő szállításban, a sejtmagba irányításban és a genomba épülésben (Lee és Gelvin, 2007). Kezdetben a transzgént közvetlenül a T-DNS régióba építették, ez volt a kointegrációs, vagy csere rendszer. Ez azonban technikai nehézségekbe ütközött, mert a Ti-plazmid igen nagyméretű és alacsony kópiaszámú, s emiatt különösen nehéz in vitro izolálni és genetikailag módosítani. Más szervezet, pl. az E. coli viszont nem alkalmas a Ti-plazmid felszaporítására, mivel nem képes ebben a baktériumban replikálódni (Lee és Gelvin, 2007). 1983 májusában két kutatócsoport (Hoekema és mtsai., de Framond és mtsai.) is kidolgozott egy új módszer, amivel a növénytranszformáció jóval egyszerűbben kivitelezhető. A módszer lényege, hogy a T-DNS és a virulencia régió két különböző plazmidon található (l. 4. ábra). A helper plazmidon a virulencia régió génjei vannak. A bináris vektor két részből áll, gerincrésze egy általános klónozó vektor, szelekciós markergént és kétféle replikációs origót tartalmaz, hogy mind az E. coli-ban, mind az A. tumefaciens-ben képes legyen replikálódni. A másik része a beépítendő génkonstrukciót tartalmazza, melyet az LB és RB szekvenciák határolnak. 14
4. ábra: A kettős vektor rendszer egy növényi sejtben. Bal oldalon a helper plazmid a virulencia régióval. Jobb oldalon a bináris vektor a két határszekvencia (LB, RB) között tartalmazza a szelekciós markergént és a transzgént (GOI) (Meyers és mtsai. 2010). Ha a két plazmid megtalálható egyazon Agrobaktérium sejtben a virulencia régióról expresszálódó fehérjék képesek kivágni, a sejtmagba szállítani, majd beépíteni a növény genetikai állományába a T-DNS-t. A bináris vektort a klónozási lépések után E. coli-ban szaporítják fel ahonnan könnyen átjuttatható bakteriális konjugációval vagy transzformációval megfelelő A. tumefaciens törzsbe, amiben a helper plazmid is jelen van, mellyel ezután növényi sejteket transzformálnak (Lee és Gelvin 2008). 2.2 Génmódosítás génpuskával kloroplasztisz transzformáció A biolisztikus eljárást 1988-ban Sanford dolgozta, azóta igen széles körben használják különféle szervezetek genetikai módosítására. Ezt a módszert növényekben főképp a kloroplasztisz transzformáció során alkalmazzák, továbbá olyan növények sejtmagi módosításánál, melyeknél az Agrobaktérium közvetítette géntranszfer nem, vagy csak nehezen alkalmazható. Az első magasabb rendű növény, aminek plasztisz genomját biolisztikus módszer segítségével módosították a dohány volt (Svab és mtsai., 1990). A biolisztikus eljárás lényege, hogy génpuska (l. 5. ábra) segítségével felgyorsítják az bejuttatandó DNS-el borított arany vagy wolfram mikrohordozó részecskéket, majd belövik őket a transzformálandó szövetbe (Sanford, 1988). 15
5. ábra: A génpuska szerkezete (http://mkk.szie.hu/dep/genetika/pdf/heszky/agroforum3%202011.pdf ) A plasztisz transzformációhoz használt vektorok tulajdonképpen E. coli plazmid származékok, melyben a markergént és a klónozó helyet 1-2 kbp hosszúságú, a kloroplasztisz szekvenciájával azonos cél szekvenciák határolják. Ezek a target szekvenciák teszik lehetővé a homológ rekombinációt (Maliga, 2003) (l. később: 3.1 fejezet, 6. ábra). A transzformálandó szövet lehet differenciált vagy embrionális szövet. Az, hogy melyiket használják, attól függ, hogy az adott növény regenerációja melyik szövettípusból oldható meg a legegyszerűbben és leghatékonyabban. Dohánynál levélkorongokat, gyapotnál vagy szójababnál pedig embrionális szöveteket használnak (Meyers és mtsai., 2010). A transzformáció eredményeként heteroplasztidikus sejtek keletkeznek, azaz egy növényi sejtben lesznek transzformált és nem transzformált kloroplasztiszok is. A növény regeneráció megkezdése előtt azonban ki kell válogatni a nem transzformált kloroplasztiszokat, azaz homoplasztidikus növényi sejteket kell létrehozni, mely igen hosszadalmas folyamat. Ezt a célt szolgálja a transzformációs kazettába épített rezisztencia gén és egy szelektív táptalaj, melyen csak azok a szelekciós markergént hordozó plasztisz genomok tudnak szaporodni (Maliga, 2003). 2.3 Tranziens expresszió Egy stabil transzgénikus növény létrehozása hónapokig tartó költséges folyamat, ezért érdemes a génkonstrukció működését és a termelt fehérje minőségét tranziens expresszió 16
segítségével megvizsgálni. Tranziens expresszió során a sejtbe juttatott DNS nem épül be a genomba és a bejuttatást követően igen hamar expresszálódik a gén által kódolt fehérje. Így megállapítható, hogy a génkonstrukció kialakítása megfelel-e az adott növényben történő fehérje termelésre (Meyers és mtsai., 2010). Különféle biokémiai vagy immunbiológiai vizsgálatokkal pedig ellenőrizhető, hogy a termelt fehérje térszerkezet és funkciója megfelel-e a célnak. Ehető vakcinák esetében vizsgálható a kiválasztott fehérje immunogén hatása is (Joensuu és mtsai., 2008). Tranziens expresszió kivitelezésére számos módszert dolgoztak ki, melyek közül a legelterjedtebb az agroinfiltráció, a virális vektorok használata és a két utóbbi ötvözése a magnifekció (Gleba és mtsai., 2005). Agroinfiltráció során vákuum segítségével rekombináns A. tumefaciens szuszpenzióval itatják át egy növény levelét. A sejtekben igen magas arányban lesz jelen a T-DNS, mely transzkripciójához nem szükséges a genomba épülés. A módszer eredményeként a célfehérje gyorsan, 1-4 napon belül kimutatható (Meyers és mtsai., 2010). Vírusok (pl. dohány esetében a dohány mozaik vírus és a burgonya X vírus) is jól használhatóak arra, hogy egy adott gént bevigyük a növényekbe anélkül, hogy az beépülne a genomba. Ezzel a módszerrel akár 17% célfehérje/tsp arányt lehet elérni. Limitálja a módszer alkalmazhatóságát, hogy csak kevés növényi vírus törzs használható vektorként és azok is gazda specifikusak. A vírus genomok igen érzékenyek a módosításokra, a transzgén mérete és a beépülés helye befolyásolhatja a vírus szaporodóképességét és stabilitását (Meyers és mtsai, 2010). Magnifekció során a T-DNS be olyan virális eredetű replikont építenek, mely hordozza a kívánt transzgént. Az A. tumefaciens felelős az elsődleges fertőzésért és a nagyobb távolságú szervezeten belüli terjedésért, a vírus replikon pedig a gyors szaporodásért és a sejtről-sejtre történő terjedésért. Ez a módszer nagyobb mennyiségű fehérje gyors előállítására alkalmas. (Gleba és mtsai., 2005). A kloroplasztisz tranziens módosítására egyelőre nincsen igazán megbízható módszer, ezért a génexpresszió tesztelését E. coli-ban végzik. Mivel a két rendszerben a transzkripció és a transzláció igen hasonlóan zajlik, a baktérium megfelelő erre a célra (Meyers és mtsai., 2010). 17
3. A Sejtmagban kódolt idegen fehérjék expressziójának jellemzői 3.1 A növényi gének promótereinek rövid jellemzése A génexpresszió első szabályozott lépése a transzkripció. Az mrns szintézis irányítója a promóter, mely meghatározza a transzkripció helyét, idejét az átírás hatását és aktivitását. A promóterek az alábbi csoportokba oszthatóak Datla és mtsai. (1997) szerint: konstitutív szövetspecifikus sejtspecifikus fejlődési állapot specifikus hormonális hatásra indukálódó külső környezeti tényezők által indukálható (fény, UV-, hő-, hideg-, patogén stressz és különböző kémiai ágensek) A gének eltérő szabályozásának a sejtek szervezetszintű összehangolásában van szerepe. A növény minden sejtje alapvetően azonos genetikai állománnyal rendelkezik, azonban az egyes sejtekben, adott időben a precíz szabályozás következtében a teljes génkészletnek csak egy jól meghatározott hányada aktív. A konstitutív promóterek minden sejtben, szövetben és szervben fejlődési állapottól függetlenül működnek. A korábbi transzgénikus növényi kutatásokban jellemzően ilyen promótereket alkalmaztak a rekombináns fehérje termeléshez. A kétszikű növények esetében a legelterjedtebb konstitutív promóter a karfiol mozaik vírus 35S promótere (CaMV 35S). Egyszikűekben gyakran nem elég hatékonyak a kétszikűeknél jól működő promóterek, ezért vagy módosítják az eredeti promótert például egy intron beépítésével (Stoger és mtsai., 2005), vagy valamilyen egyszikűből származó gén, mint a kukorica poliubiquitin-1 promóterét használják (Lau és Sun, 2009). A konstitutívan expresszálódó rekombináns fehérje problémákat okozhat a növény fejlődésében (Rybicki, 2009). Az ehető vakcina előállítására használt növénynél szükségtelen, hogy minden egyes sejt termelje a rekombináns fehérjét. Elegendő ha csak a későbbi fogyasztásra szánt szerv egyes szövetei tartalmazzák azt. Ezt a célt szövetspecifikus promóterekkel lehet megvalósítani. 18
3.2 A szövetspecifikus promóterek felhasználása ehető vakcina előállításához Az ehető vakcina előállítása szempontjából ideális növénynek öt kritériumnak kell megfelelnie: (1) a növény transzformálható legyen (2) a kívánt poszttranszlációs módosítások végbemenjenek benne és kialakuljon benn a fehérje megfelelő térszerkezete (3) a vakcina fehérjét kizárólagosan termelő része, nyers formájában is fogyasztható legyen, ne igényeljen hőkezelést (4) a célszövet fehérjében gazdag legyen, mert a teljes fehérjemennyiségnek csak kis hányada rekombináns fehérje (5) a célszövet ne tartalmazzon toxikus metabolitokat. A kezdeti tanulmányokban a jól transzformálható modell növényt, a dohányt (Nicotiana tabacum) használták, ami viszont nem felel meg a fenti elvárások mindegyikének (Tiwari és mtsai., 2009). A fő problémát a dohány alkaloidok jelentik. Azonban használata nem teljesen elvetendő, mint vakcina fehérje termelő növény, mivel nem használják élelmiszeripari vagy takarmányozási célra, nem valószínű, hogy bekerül a táplálkozási láncba. A dohány transzformációhoz és regenerációhoz jól kidolgozott módszerek állnak rendelkezésre, könnyű vele dolgozni. Léteznek alacsony nikotin tartalmú fajták, melyek a megtermelt antigén szájon át történő bevitelére is alkalmasak lehetnek, pl. állatok esetében (Joensuu és mtsai., 2008). Ma az ehető vakcinák előállítását célzó kutatásokban nagyrészt gazdasági jelentőséggel bíró, termesztéstechnikailag jól ismert növényeket használnak, melyek magas tápértékű részei, nyersen is fogyaszthatók, mint pl. a banán, paradicsom, répa, burgonya, szójabab, kukorica, árpa, rizs, káposzta, saláta és a spenót (Joensuu és mtsai., 2008, Tiwari és mtsai., 2009). A zöldségek és gyümölcsök gyors romlása miatt a hűtőházi tárolás, ill. a gyors feldolgozás járulékos költséget jelent. Ideális megoldást jelentenek a különféle mag, ill. szemtermések, mert ezek általában magas fehérje tartalmúak. A rekombináns fehérje megfelelő térszerkezetének kialakulását elősegítik a fejlődő magban nagy mennyiségben jelen levő diszulfid-izomerázok és chaperonok. A magban expresszált idegen fehérjék sokáig stabilak maradnak, ennek egyik oka az érés során bekövetkező vízvesztés, így a magok még szobahőmérsékleten is sokáig eltarthatóak. Rizsben termelt antitestek évekig megőrizték a biológiai aktivitásukat (Tiwari és mtsai., 2009, Rybicki 2009). A gabonafélék közé tartozó rizs, búza, árpa és kukorica jó terméshozamú, könnyen termeszthető növények, szemtermésük viszonylag magas fehérje tartalmúak (7-10%). A magfehérjék nagy része az endospermiumban raktározódik, mely a mag tömegének jelentős 19
hányada (Lau és Sun, 2009). A legelterjedtebb endospermium specifikus promóterek az alábbi fehérjéket kódoló gének promóterei: kukorica zein, rizs glutenin-1 és globulin-1, árpa D- hordein, búza magas és alacsony molekulasúlyú (HMW, LMW High/Low Molecular Weight) gluteninek (Stoger és mtsai. 2005). A szövetspecifikus promóterek genetikai módosításával tovább növelhető a megtermelhető a rekombináns fehérje mennyisége: Oszvald és mtsai. a rizs endospermiumában termeltek LTB-t (E. coli enterotoxinjának B alegysége) mely a TSP 2,7%-át adta. A búzából származó Bx17 HMW glutenin endospermum specifikus promótere és az LTB génje közé beépítették a rizs act-1-ének első intronját, ami jelentősen megnövelte a promóter erősségét (Oszvald és mtsai. 2007b). 2009-ig sejtmagban kódolt LTB esetében nem értek el ilyen magas fehérje arányt. A hüvelyesek (bab, szójabab és borsó) még a gabonaféléknél is magasabb fehérje tartalmúak (20-40%), emiatt ideálisak lehetnek ehető vakcina előállítására. A transzformáció alacsony hatékonysága és nehézsége miatt csak kevés kutatásban használják ezeket a növényeket. A veteménybab (Phaseolus vulgaris) arcelin-5 és β-phaseolin tartalékfehérjéinek promóterei számos más kétszikűben is megfelelően működnek, igen magas rekombináns fehérje arányt lehet velük elérni. Arabidopsis thaliana-ban a fenti, babból származó promóterek hatékonysága jóval nagyobb, mint a konstitutív CaMV 35S promóternek. A rekombináns fehérje/teljes oldott fehérje arány (TSP-Total Soluble Protein) CaMV 35S promótert használva alacsony, csupán 1%. A két bab promóterrel szabályozott expresszió során viszonyt nagyon magas 12,5% valamint 36,5%. Vagyis a megfelelően kiválasztott szövetspecifikus promóterek a specifikus szabályozáson kívül a rekombináns fehérje mennyiségének növelésére is alkalmas (Lau és Sun 2009). 3.3 Fehérje transzport, akkumuláció és glikoziláció A transzlációt követően a fehérjék maradhatnak a citoplazmában, bekerülhetnek a mitokondriumba vagy a kloroplasztiszba, valamint beléphetnek a szekréciós útvonalba, melynek elemei az endoplazmatikus retikulum (ER), a Golgi-ciszternák, a protein- és olajtestek, vakuólumok és az apoplaszt. A szekréciós útvonal valamely állomásán történő felhalmozódása jótékony hatással van a rekombináns fehérje mennyiségére. Összehasonlítva az ER-ben történő akkumulációt a citoplazmában történővel, általában tízszeres a megtermelhető fehérje mennyiség, az ER javára. Ennek oka, az ER neutrális, oxidatív 20
környezete és az itt található chaperonok, melyek elősegítik a fehérjék stabil térszerkezetének kialakulását. A sejten belüli transzportért a fehérjék N- vagy C-terminálisán levő szignál peptidek felelősek. Ha a transzgén szekvenciáját módosítják ezekkel a szignálszekvenciákkal, irányíthatóvá válik a fehérje transzport (Lau és Sun 2009). Az endoplazmatikus retikulumban és a Golgi-apparátusban zajlik a glikoziláció, az eukarióták egyik jellemző poszttranszlációs módosítása. Ennek során a fehérjékre kovalens módon különböző cukor oldalláncok kapcsolnak a glikozil-transzferázok. A vakcina antigének közül a virális és a bakteriális fehérjék stabilitásához nem szükséges a glikoziláció, hiszen ezek natív formájukban sem glikoziláltak. Az eukarióta protozoák (pl. malária) fehérjéinek megfelelő térszerkezetének kialakulásához viszont szükséges lehet a megfelelő glikoziláció. Ilyen antigéneket viszont sikeresen termeltek meg kloroplasztiszban is, ahol nem történik glikoziláció (Daniell és mtsai., 2009), így valószínűsíthető, hogy a glikoziláció nem létfontosságú minden fehérje esetében. A növények glikozilációs mintázata eltér az emlősökre, s így az emberekre jellemző glikozilációtól, ami viszont bizonyos esetekben allergiás reakciót okozhat, így kialakulása kerülendő. A glikoziláció két típusa az N- és O glikoziláció, melyek közül főleg az előbbiben vannak nagy különbségek az emlősök és növények közt. Az N-glikoziláció kezdeti, ER-ben zajló lépései megegyeznek a növényekben és az emlősökben, azonban későbbiekben (Golgiapparátusban) már eltérések figyelhetőek meg. A két fő különbség az, hogy a fukóz a növényekben α(1,3) kötéssel, az emlősökben pedig α(1,6) kötéssel kapcsolódik. A másik, hogy a xilóz az emlősökkel szemben a növényekben részt vesz a cukor-oldalláncok kialakításában. A növényi glikoziláció több módon is megváltoztatható. A fehérjék C- terminális KDEL és HDEL szignál szekvenciái az ER-ben tartásért (retenció) felelősek, így az ilyen szekvenciákkal rendelkező fehérjék nem esnek át a későbbi, csak a növényekre jellemző glikoziláción. A glikozil-transzferázok inaktiváláhatóak, így szintén elkerülhető a növényi glikozlációs mintázat kialakulása. Erre két módszer is van, a poszttranszkripciós géncsendesítés RNS-interferencia révén és a knock-out mutáns növények használata (Karg és Kallio, 2009). 21
4. A kloroplasztiszban kódolt idegen fehérjék expressziójának jellemzői 4.1 A plasztisz genom szerveződése és a homológ rekombinációhoz szükséges célszekvenciák A cirkuláris plasztisz genom kb. 120 gént tartalmaz, mérete átlagosan 120-180 kbp. Plasztiszonként ez a genom 50-200 példányban van jelen, így egyetlen növényi sejt akár 10 000 kópiát is tartalmazhat. (Bendich, 1987; Maliga, 2003). A magas kópiaszám következtében a plasztisz segítségével igen nagy mennyiségű rekombináns fehérjét lehet előállítani. A plasztiszban kódolt géneknél a rekombináns fehérje aránya 2-43% közé esik (Daniell, 2009), ami jóval magasabb arány, mint amit a sejtmagban kódolt gének esetében el lehet érni (átlagosan 1,5-2% Meyers és mtsai., 2010). A plasztisz genetikai módosításának nagy előnye, hogy homológ rekombináció révén a transzgén célzottan építhető a genomba (l. 6. ábra). 6. ábra: A plasztisz genomba a jobb és bal célszekvenciák (LTR és RTR Left and Right Targeting regions) segítségével két rekombinációs lépés során épülnek be a kívánt gének (Maliga 2003). Ehhez olyan célszekvenciákat használnak, melyek 1-2 kbp. hosszan homológok a célzott genom régió szekvenciájával. A létfontosságú génekbe történő beépülés s így azok funkció vesztése elkerülhető, ha célszekvenciák intergénikus régiókból származnak (Maliga, 2003) A már 2004-ig sikeresen alkalmazott 16 célszekvencia közül három terjedt el. Ezek a trnfm/trng, trnv/rps12 és trni/trna gének közt levő régiót célozzák. A genom LSC (Large Single Copy) régiójában van a trnfm/trng, a trnv/rps12 és trni/trna pedig a genom IR (Inverted Repeat) régiójában található (Wang és mtsai., 2009). Az IR a genomban két példányban is jelen van (IR A és B), csak az irányultságukban van különbség. Az IR régió különlegessége, hogy az egyik IR-be épült transzgén a kópia korrekció jelenség 22
következtében megjelenik a másik IR-ben is, azaz duplikálódik (Maliga, 2003). Így még tovább növelhető a transzgén kópiaszáma. 4.2 Prokarióta jellegek és következményeik A kloroplasztisz eredete egy ősi cianobaktérium típusú szervezet endoszimbiogenezisére vezethető vissza, ezért számos prokarióta jelleggel rendelkezik. Az ehető vakcinák szempontjából ezek közül a legfontosabb a glikoziláció hiánya és, hogy a plasztiszban kódolt gének operonokban expresszálódnak. Az operon olyan genetikai egység melyben több gén tartozik egy leolvasási keretbe, a transzkripció eredménye pedig egyetlen policisztronos RNS. Így plasztiszban lehetőség van arra, hogy több gént (akár 20-30-at) is beépítsenek egy promóter és egy terminátor régió közé, ami alkalmasság teszi a plasztiszt több alegységes fehérjék, valamint több komponensű vakcinák előállítására (Maliga 2003, Daniell 2009). A kloropasztiszban kódolt fehérjék jelenlegi tudásunk szerint nem glikozilálódnak, bár 2009- ig még nem termeltek transzgénikus kloroplasztisz segítségével glikoproteineket. Mivel az N- és O-glikozilációnak fontos szerepe van számos fehérje stabilitásában és funkciójában (Wang és mtsai. 2009), a plasztisz olyan fehérjék előállítására alkalmas, melyeknél a glikoziláció nem szükséges a megfelelő térszerkezet kialakulásához, vagy a fehérje megfelelő biológiai funkciójához (Joensuu és mtsai. 2008). Ilyenek a bakteriális vagy virális antigének, melyek natív formájukban sem glikoziláltak. 5.Növényekben termelt vakcina antigének alkalmazása 5.1 Példák a sejtmagban kódölt vakcina fehérjék alkalmazására 2009-ig 16 különböző, emberi patogénből származó fehérjét állítottak elő transzgénikus növények segítségével. Ebből 3 bakteriális kórokozó (enterotoxikus E. coli, Vibrio cholerae, Bacillus anthracis), 12 virális patogén (pl. hepatitis B, Norwalk vírus, HPV, HIV, japán enkefalitisz vírus, himlő, veszettség) és egy protozoa (Plasmodium yoelii - malária modellezésére használják). A legtöbb konstrukciót dohányban, burgonyában vagy paradicsomban expresszálták, továbbá használták a rizst, kukoricát, salátát, szóját, A. thaliana-t, banánt, lucernát, spenótot, csillagfürtöt, kelt és karfiolt is a rekombináns fehérje megtermelésére (Daniell és mtsai., 2009, online melléklet). A legtöbb esetben igen alacsony rekombináns fehérje arányt értek el (0,1% vagy még 23
alacsonyabb) és jellemzően CaMV promótert alkalmaztak a transzgén expressziójához. Magspecifikus promóterekkel ezzel szemben jóval magasabb fehérje arányt értek el: glycinin promótere (szójababban 1,8-2,4%), a Bx17 HMW glutenin módosított promótere (rizsben 2,1%), glutenin B promótere (rizsben 2,1%) (Daniell és mtsai., 2009; Tiwari és mtsai., 2009). Növényi vírusok által tranziens módon a fentieken kívül további 4 baktérium (Mycobacterium tuberculosis, Yersinia pestis, Staphylococcus aureus, Pseudomona aeruginosa) és két vírus (humán rhinovírus és a H5N1 madárinfluenza) fehérjéjét állították elő. Ezeket az antigéneket is a legtöbb esetben dohányban, ezen kívül tehénborsóban és spenótban és paradicsomban termelték. A rekombináns fehérje/tsp arány 0,1-2% közti. A tranziensen előállított antigénekkel csupán két esetben végeztek olyan vizsgálatokat, melyeknél szájon át adták be az antigént. Az egyes típusú HIV vírus egy transzmembrán fehérjéje immunválaszt váltott ki egerekben, szájon át, orrnyálkahártyára és bőr alá juttatva is. A veszettség vírusának fehérjéi emberekben is immunogénnek bizonyultak (Daniell és mtsai. 2009). Az ehető vakcinák immunogén hatását már 1998-ban bizonyították. Az enterotoxikus E. coli toxinjának B alegységét termelő transzgénikus burgonyát nyersen fogyasztva, egerekben és emberben is specifikus immunválaszt váltott ki. A 2000-es évek elején további kis létszámú humán klinikai vizsgálatokat (fázis 1.) végeztek: a heveny bélhurutot okozó Norwalk vírus antigénjével (burgonyában termelve) a veszettség vírusának (Rabies lyssa) antigénjével (burgonyában termelve) az E. coli toxin B alegységével (kukoricában termelve) a Hepatitis B sejtfelszíni antigénjével (burgonyában termelve) Ezek vizsgálatok azonban nem bizonyultak kellően reprezentatívnak ahhoz, hogy a további klinikai vizsgálati fázisokba lépjenek. Az utóbbi évek sejtmagban kódolt vakcina jelöltjei hatásának vizsgálata különböző fázisokban van, az in vitro esszéktől kezdve a szájon át bejuttatott vagy bőr alá injektált antigén immunogén hatását vizsgáló állatkísérletekig (Daniell és mtsai. 2009). Oszvald és mtsai. által rizsben előállított kolera toxin (B-alegység, CTB) nagy affinitással kötődik a GM1-gangliozidhoz, mely az eukariótákra jellemző sejtfelszíni glikolipid, a CTB egyik természetes receptora. Búzából származó módosított endospermium specifikus promóter és ER-retenciós szignál révén kiemelkedően magas fehérje arányt értek el (TSP 2,1%-a). Ez átlagosan 1,5-2 mg CTB-t jelent grammonként (Oszvald és mtsai., 2008). 24
A CTB hatását más kutatócsoport egereken vizsgálták, répában termelt antigén (TSP 0,3%) olyan hatásos immunválaszt váltott ki, hogy az egerek az ismételt toxinbevitelt is túlélték. Specifikus immunválaszt váltott ki egerekben továbbá több vírus (japán enkefalitisz v., légúti óriássejtes vírus, SARS-koronavírus, kanyaró vírusa, rotavírus) és a HIV/Hepatitis B vírusok fúziós antigénje (Daniell és mtsai., 2009). Ma csupán két növényi eredetű vakcina fehérje van mely megkapta a megfelelő engedélyeket, azonban mindkettőt a rekombináns fehérje kinyerése után, beinjektálva alkalmazzák. Az első ilyen készítményt 2005-ben engedélyezték Kubában, transzgénikus dohányban termelt hepatitis B vírus elleni monoklonális ellenanyagot tartalmaz (Rybicki 2009). Ennek magyarázata az, hogy a vakcinák engedélyeztetését hosszadalmas és igen költséges klinikai vizsgálatok előzik meg. A humán patogéneken kívül 7 bakteriális és 20 virális állati kórokozó számos fehérjéjét termelték meg transzgenikus növényekben, növényi sejtkultúrákban, vagy növényi vírusok révén tranziens expresszióval. Állati használatra készült a világon másodikként engedélyezett növényben előállított vakcina fehérje. A baromfipestist okozó Newcastle vírus elleni vakcina 2006-ban az USA-ban kapta meg a hatósági engedélyeket (Center for Veterinary Biologics), azonban kereskedelmi forgalomba nem került. Az antigént szuszpenziós dohány sejtkultúrában termelik, majd tisztítást követően injekcióval juttatják a szervezetbe (Joensuu és mtsai., 2008). Az állati vakcinákkal szemben valamivel gyengébbek a szabályozási protokollok így ezek hatósági és társadalmi elfogadása valószínűleg hamarabb bekövetkezik, mint a humán vakcináké. 5.1.1 Az LTB fehérjét termelő transzgénikus kukorica hatása emberekben Az enterotoxikus E. coli hasmenést okoz gyermekeknél a fejlődő országokban, valamint gyakran az oda utazóknál is. A tüneteket a baktérium toxinja (LT) okozza, melynek B alegysége képes az emésztőcsatorna epitéliális sejtjeihez kötődni. Az enterotoxin A alegysége felelős a tünetekért, ez képes ADP ribozilálni az adenilát-cikláz szabályozó fehérjéjét. A c- AMP szint emelkedése végeredményben a sejtekből történő vízkiáramláshoz és így hasmenéshez vezet. LTB-t termelő burgonya immunogén hatását emberekben már 1998-ban bizonyították (Tacket és mtsai., 1998), 2004-ben hasonló vizsgálatot végeztek transzgénikus kukoricával. 25