Tudományos Diákköri Dolgozat Enyedi Kata Nóra Urokináz plazminogén aktivátor receptor blokkoló peptidek szintézise és konjugálása. Témavezetı: Dr. Mezı Gábor tudományos tanácsadó Szerves Kémiai Tanszék Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2010
Tartalomjegyzék TARTALOMJEGYZÉK... 1 KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS... 3 1. BEVEZETÉS... 4 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS... 6 2.1 A METASZTATIZÁLÓ SEJTEK INVÁZIÓT SEGÍTİ RECEPTORAI... 8 2.1.1 Az urokináz plazminogén aktivátor rendszer... 9 2.1.2 Az malignus invázió adhéziós molekulái: az integrinek... 11 2.1.3 Az integrinek és az urokináz plazminogén aktivátor rendszer kapcsolata... 13 2.2 UROKINÁZ PLAZMINOGÉN AKTIVÁTOR ANTAGONISTA PEPTIDIEK... 14 2.2.1 Az Å6 urokináz plazminogén aktivátor antagonista... 14 2.2.2 Az WX-360 urokináz plazminogén aktivátor antagonista... 15 2.3 INTEGRIN ANTAGONISTA MOLEKULÁK: RGD PEPTIDEK... 16 3.ELMÉLET... 17 3.1 SZILÁRDFÁZISÚ PEPTIDSZINTÉZIS (SPPS)... 17 3.1.1 A szilárdfázisú peptidszintézis startégiái... 19 3.1.2 Gyanták... 20 3.1.3 A kapocsolás követése... 21 4. CÉLKITŐZÉSEK... 22 4. CÉLKITŐZÉSEK... 22 5. EREDMÉNYEK... 23 5.1 PEPTIDEK SZINTÉZISE... 24 5.1.1 Ciklo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys] szintézise... 24 5.1.2 Az Ac-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-NH 2, Ac-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-NH 2 valamint a 7- dietilamino-kumarin-lys-pro-ser-ser-pro-pro-glu-glu-nh 2 és a 7-dietilamino-kumarin-Pro-Ser-Ser-Pro- Pro-Glu-Glu-NH 2 szintézise... 24 5.1.3 7-dietilamino-kumarin-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Lys(ClCH 2 - CO)-NH 2 és 7-dietilamino-kumarin-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly- Lys(ClCH 2 -CO)-NH 2 szintézise... 25 5.2 BIOKONJUGÁTUMOK ELİÁLLÍTÁSA... 26 5.2.1 7-dietilamino-kumarin-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly- Lys(ciklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)-CH 2 -CO)-NH 2 és 7-dietilamino-kumarin-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu- Glu-Gly-Gly-Gly-Lys- Gly-Gly-Gly-Lys(ciklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)-CH 2 -CO)-NH 2 elıállítása... 26 A konjugálást mindkét esetben TRIS (2-amino-2-hidroximetil-propán-1,3-diol) pufferben (ph 8,1) végeztem. A reakciók során a 7-dietilamino-kumarin-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly- Gly-Lys(CO-CH 2 -Cl)-NH 2, illetve a 7-dietilamino-kumarin-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly- Lys-Gly-Gly-Gly-Lys(CO-CH 2 -Cl)-NH 2 peptidekbıl készített oldatokhoz adagoltam apránként a ciklo(rgdfc) peptidet. A kemoszelektív ligáció lejátszódását analitikai HPLC-vel követtem, majd pedig szemipreparatív HPLC-vel tisztítottam az elegyeket. A várt végterméket tömegspektrometriai mérések alapján azonosítottam... 26 5.3 BIOLÓGIAI VIZSGÁLATOK: THP-1 SEJTEK KEMOTAXIS VIZSGÁLATA... 26 6. KÍSÉRLETI RÉSZ... 31 6.1 PEPTIDEK SZINTÉZISE... 31 6.1.1 Ciklo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys] szintézise, tisztítása és analízise... 31 6.1.2 Az Ac-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-NH 2, Ac-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-NH 2 valamint a 7- dietilamino-kumarin-lys-pro-ser-ser-pro-pro-glu-glu-nh 2 és a 7-dietilamino-kumarin-Pro-Ser-Ser-Pro- Pro-Glu-Glu-NH 2 szintézise, tisztítása és analízise... 34 6.1.3 7-dietilamino-kumarin-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Lys(CO- CH 2 -Cl)-NH 2 és 7-dietilamino-kumarin-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly- Lys(CO-CH 2 -Cl)-NH 2 szintézise, tisztítása, analízise... 37 6.2 KONJUGÁTUMOK SZINTÉZISE... 39-1 -
6.2.1 A 7-dietilamino-kumarin-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly- Lys(ciklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)-CH 2 -CO)-NH 2 és 7-dietilamino-kumarin-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu- Glu-Gly-Gly-Gly-Lys- Gly-Gly-Gly-Lys(ciklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)-CH 2 -CO)-NH 2 szintézise, tisztítása és analízise... 39 6.3 KEMOTAXIS VIZSGÁLATOK BOYDEN-KAMRA ALKALMAZÁSÁVAL... 42 7. ÖSSZEFOGLALÁS... 43 8. FÜGGELÉK... 44 9.FELHASZNÁLT IRODALOM... 54-2 -
Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom Dr. Perczel András és Dr. Hudecz Ferenc tanszékvezetı egyetemi tanároknak, hogy munkámat az ELTE Szerves Kémiai tanszékén, valamint az ELTE-MTA Peptidkémiai Kutatócsoportban lehetıvé tette. Hálásan köszönöm témavezetımnek, Dr. Mezı Gábor tudományos tanácsadónak, hogy segítségével támogatott és munkámat végig nagy figyelemmel és türelemmel kísérte, irányította. Köszönettel tartozom Dr. Kıhidai Lászlónak a biológiai vizsgálatok elvégzését és Dr. Kele Péternek a fluoreszcens festékért. - 3 -
1. Bevezetés Statisztikai adatok alapján a daganatos megbetegedések a második helyen állnak a halálozási okok között [1]. A rákos halálozások elsıdleges oka azonban nem a primer tumorokban keresendı, hanem a betegség során kialakult áttétekben. Gyakran elıfordul ugyanis, hogy bár a beteg primer daganatát sikeresen kezelik pl. sebészeti beavatkozás vagy sugárkezelés útján, mégis a mikrometasztázisokat képzı rákos sejtek túlélik a terápiás kezeléseket, és láthatatlanok maradnak a különbözı klinikai képalkotó eljárások számára. Késıbb, bizonyos külsı behatások révén, vagy a mikrokörnyezet hatására ezek a nyugvó, szétszórt mikrometasztázisok makrometasztázisokká fejlıdhetnek, majd proliferálni kezdenek és genetikailag tovább mutálódnak. Ennek eredményeként az áttétet létrehozó rákos sejt(ek) különbözı fenotípusai jelennek meg, és a betegség kiújul. A különbözı rákos megbetegedések kezelésére számos lehetıség nyílik, mint például a sebészi beavatkozás vagy a sugárkezelés, azonban mindez gyakran kevésnek bizonyul olyan betegek esetén, akiknél már megtörtént az áttétképzıdés. Ilyen esetekben a hagyományos kezelési módszerek önmagukban nem célravezetıek és kombinált terápiák alkalmazása válik szükségszerővé, azaz a hagyományos eljárás mellett gyógyszeres kezelést (kemoterápia) is alkalmaznak. Ekkor azonban figyelembe kell venni, hogy a kemoterápiás gyógyszerek döntı többsége nem elég szelektív. Ez nem csak a súlyos mellékhatásokban nyilvánul meg, hanem abban is, hogy az áttétek esetében közel sem lesz olyan hatékony, hiszen a nyugvó mikrometasztázisok, vagy akár a már kialakult szekunder tumorok genetikailag jelentısen eltérhetnek nemcsak a primer tumortól, de egymástól is. A metasztázisok megjelenésének valamint a rákos megbetegedés kiújulásának megelızéséhez újabb, hatékonyabb eljárásokra van szükség. Ilyen lehetıséget kínálnak azok a peptid antagonisták, amelyek a sejtmigrációban kulcsszerepet játszó receptorokat, molekulákat szelektíven képesek gátolni. Ezek az antagonisták az áttétképzés korai stádiumában, az extracellulás mátrixba (ECM) történı inváziókor kifejezıdı proteáz rendszereket vagy a sejtadhéziós molekulákat gátolják célzottan. Dolgozatom körvonalazni szeretné az urokináz plazminogén aktivátor receptor áttétképzésben játszott szerepét, kapcsolatát a sejtadhéziós integrin molekulákkal, és a két receptor együttes - 4 -
gátlásának lehetıségeit. Vizsgálatom egy jelenleg már ismert urokináz plazminogén aktívátor antagonistára és egy olyan új peptid-peptid konjugátum szintézisére és in vitro vizsgálatára tér ki, amely egyszerre lehet képes mind az integrinek mind az urokináz plazminogén aktivátor receptor blokkolására. - 5 -
2. Irodalmi áttekintés A metasztázis olyan folyamat, melynek során a malignus sejt(ek) elhagyják a primer tumort, majd pedig a keringési vagy a nyirokrendszeren keresztül távolabbi szervekbe, szövetekbe eljutva, szekunder tumorokat hoznak létre. Mindez nem véletlenszerően játszódik le, inkább olyan egymást követı és egymáshoz szorosan kapcsolódó lépések láncolatának tekinthetı, amit a rákos sejteknek teljesíteniük kell, hogy szekunder tumorokat hozhassanak létre. Természetesen nem minden rákos sejt képes az áttétképzésre, csupán a neoplazma elenyészıen kis szubpopulációja, amelyek lényegesen kevésbé differenciáltak társaikhoz képest. A metasztatikus kaszkád rendszer lépcsıfokait az 1.ábra mutatja be. Neoplasztikus transzformáció Tumor neoangiogenezis/ limfangiogenezis és proliferáció Lokális sejtadhéziós kapcsolatok elvesztése, elszakadás a primer tumortól Lokális invázió az extracelluláris mátrixba Invázió a keringési- vagy nyirokrendszerbe A vándorlási folyamat átvészelése a keringési rendszerben Eljutás az áttétképzésre alkalmas, tumorspecifikus szövetekhez Extravazáció és szekunder tumorok kialakítása 1. ábra. A metasztázis lépései. A neoplasztikus transzformáción átesett sejtek kezdetben csak ún. in situ carcinomát képesek létrehozni, aminek maximális átmérıje kb. 2 mm. Ennek oka, hogy nem rendelkeznek még kialakult érhálózattal, így egy adott méret fölé növekedve oxigén és táplálékhiány lép fel. A fellépı hypoxia vagy az ún. nyugvó állapotba kényszeríti az in situ carcinomát, vagy angiogenezist idéz elı, és új hajszálerek épülnek ki. - 6 -
Angiogenezis során a rákos sejtekben, ún. hypoxia indukált faktorok (HIF) szabadulnak fel intracellulárisan. Ezek a faktorok normál szövetek sérülésekor is kifejezıdnek és két feladatot látnak el: a DNS sérüléseinek javítását és olyan fehérjék expresszióját, amelyek az endotélsejtek stimulálásán keresztül új hajszálerek kialakulását érik el. A DNS reparációja rákos sejtek esetén méginkább hozzájárul a meglévı genetikai instabilitáshoz, és a HIF-ek által elindított génexpresszió gyakran ún. epitél-mezenchimális transzformációhoz hasonló átalakuláshoz vezethet egyes rákos sejtek esetében. A transzformáció során a sejt-sejt adhéziós kapcsolatok felbomlanak, a rákos sejt orsószerő alakot vesz fel és fokozott migrációs és inváziós képességre tesz szert [2]. Arra vonatkozólag, hogy az elsı metasztázisra alkalmas sejtek megjelenésének ideje mikorra tehetı, jelenleg két elmélet ismert. Az ún. klasszikus modell szerint a kialakult daganat számos genetikai változáson esik át, mire megjelennek az evolúciós szempontból magasabb rendő metasztatikus sejtek. A másik, nem régen kialakult nézet szerint, a primer tumor megjelenését követıen nem sokkal már megjelenik az áttétképzésre alkalmas sejtek kicsiny szubpopulációja, és már ekkor megindul az áttétképzés hosszadalmas folyamata [3]. A tumorról levált invazív sejt ezután proteolitikus enzimekkel, enzim-rendszerekkel (pl. mátrix-metalloproteázok és urokináz plazminogén aktivátor rendszer) degradálja a környezı extracelluláris mátrixot és a bazális laminát. Ezzel párhuzamosan speciális adhéziós receptorok integrinek adott típusai fejezıdnek ki a sejteken, amelyek a sejt mozgását, vándorlását teszik lehetıvé. Végül a migráló sejt kilép a nyirokrendszerbe vagy a vérkeringésbe [4]. Amennyiben az intravazált sejt nem esik áldozatul az immunrendszernek, vagy nem pusztul el a vér ármalásából fakadó turbulencia miatt, akkor távolabbi szövetek, szervek kapilláris ereiben megrekedhet és kölcsönhatásba léphet az ér falát képzı endotél sejtekkel. Az áttétképzés szempontjából ez a lépés döntı fontosságú, mivel csakis endotél sejtekhez kötött rákos sejtek képesek a környezı szövetekbe kilépni [5,6]. A keringési- vagy a nyirokrendszerben eltöltött idıt azonban a metasztatizáló sejtek kevesebb mint 1%-a éli túl, és még kevesebb rendelkezik olyan fenotípussal amely lehetıvé teszi a kapcsolatteremtést az endotél sejtekkel [7]. Az extravazált rákos sejt sorsa az új mikrokörnyezettıl függıen három féle lehet: vagy elpusztul, vagy nyugvó makrometasztázisokat hoz létre, vagy szekunder tumort alakít ki. Arra, hogy a rákos sejt milyen szövetekben képes áttéteket létrehozni az ún. modern seed and soil elmélet ad bizonyos mértékő magyarázatot [8]. - 7 -
A hipotézis szerint az eredeti, primer tumor több, heterogén rákos sejt szubpopulációnak ad otthont, melyek angiogén, inváziós és metasztatikus képességeikben különböznek. A migráló tumorsejtek sikeressége nemcsak attól függ, hogy túlélik-e a keringési rendszerben való vándorlást, hanem extravazálva milyen módon és mennyire tudják formálni, kihasználni mikrokörnyezetüket, illetve maszkírozni magukat az immunrendszer támadásaival szemben. Bizonyos esetekben tehát a környezet által kibocsájtott faktorok a tumorsejt azonnali pusztulását idézik elı, más esetekben pedig az angiogenezis folyamata gátolt az áttétképzı sejt számára, ezért nyugalmi állapotba kerül, és nem növekszik tovább. Az ilyen mikrometasztázisok akár évtizedekig nem növekednek, míg végül jelenleg még nem teljesen ismert okokból kifolyólag megindul a proliferáció, valamint az angiogenezis és kialakul a szekunder tumor, amely a további áttétképzésre alkalmas sejtek szubpopulációját tartalmazza. 2.1 A metasztatizáló sejtek inváziót segítı receptorai A magasabb rendő, többsejtő sejtes szervezıdések létrejöttének alapvetı feltétele, hogy a sejtek képesek legyenek információcserére és kapcsolatteremtésre egymással illetve a környezetükkel. Ennek teljesülését a sejt-sejt vagy sejt-extracelluláris mátrix (ECM) kapcsolatok teszik lehetıvé, melyek kialakításáért a sejtfelszínen található ún. adhéziós receptorok integrinek, szelektinek, cadherinek felelısek. Ezen adhéziós receptorok megfelelıen ellenırzött és koordinált expressziója elengedhetetlen az egészséges sejtek számára. Közvetett módon ugyanis befolyásolják az intracelluláris kohéziós folyamatokat, a sejt-szubsztrát interakciókat, és a sejtfelszíni proteáz rendszereket, melyek lehetıvé teszik a letapadást vagy a migrációt. A malignus tumorok extracelluláris mátrixba történı inváziójának alapvetı feltétele ezen sejtsejt és sejt-ecm kapcsolatok dinamikus megbontása, majd egyes kapcsolatok újbóli kialakítása, valamint a migrációt/inváziót gátló ECM és a alaphártya degradációja. Bár az ECM részleges proteolízise csak az elsı lépés, ám mégis nélkülözhetetlen a malignus sejtek vándorlásának megindulásában. A degradációs folyamatot alapvetıen három, egymással szoros kapcsolatban álló proteáz család viszi véghez. Ezek a szerin proteázok közöttük is elsısorban az urokináz-típusú plazminogén aktivátor (upa), a metalloproteázok családjába tartozó matrix-metalloproteázok és a papain-típusú cisztein proteáz katepszin B és katepszin L. - 8 -
Ezen proteázok receptorai a migráló sejt haladó élén fokális adhéziós plakkokba rendezıdnek az adhéziós receptorokkal. A fokális adhéziós plakk tömör, ugyanakkor dinamikusan változó szervezıdés, így lehetıség nyílik arra, hogy egyes proteáz-receptorok és az adhéziós receptorok kapcsolatba lépjenek egymással, egyfajta receptor-komplexet képezve. A komplex révén a proteáz receptorok befolyásolhatják az adhéziós receptorok szignál transzdukciós útvonalait, ezáltal pedig a citoszkeleton mozgását. Ilyen migrációt befolyásoló komplex rendszer kialakítására képes az urokináz plazminogén aktivátor receptor (upar) és az azzal szorosan együttmőködı adhéziós integrin fehérjék. Bár kölcsönhatásuk nem teljes mértékig tisztázott, azonban jelentısségük a rákos sejtek extracelluláris mátrixba történı inváziója, migrációja során tagadhatatlan. 2.1.1 Az urokináz plazminogén aktivátor rendszer A szők értelemben vett urokináz plazminogén aktívátor rendszer háromtagú: a proteáz urokináz plazminogén aktivátor (upa), ennek receptora az urokináz plazminogén aktívátor receptor (upar), valamint a plazmin. A rendszer vázlatos felépítését a 2. ábra mutatja be. ECM degradáció pro-upa Plazmin, Katepszin B/L upa Plazmin Plazminogén upar upar GPI GPI PAI-1, PAI-2, PN-I Extracelluláris tér Intracelluláris tér 2. ábra. Az urokináz plazminogén aktivátor rendszer. Az upa egy 411 aminosavból álló zymogén formájában (pro-upa) szekretálódik. Aktív formáját receptorához, az urokináz plazminogén aktivátor receptorhoz (upar) való kötıdése - 9 -
után, a Lys 158 -Ile 159 aminosavak közötti proteolízise során éri el. Így két lánc jön létre, az N- terminális lánc, amit a 1-135-ös aminosavak alkotnak, és a C-terminális lánc, az ún. urokináz, amely a 135 411-es aminosavakat foglalja magába. A két lánc továbbra is egy diszulfidhídon keresztül kapcsolódik egymáshoz [9]. Az N-terminális lánc tovább tagolódik az epidermális növekedési faktort kötı- és a Kringle doménekre, melyek feladata az upa-t a receptorához kötni. A C-terminális lánc a plazminogén plazminná alakításában játszik fontos szerepet [9]. Az upa aktiválását véghezvivı proteáz lehet a katepszin B, katepszin L, de ezt a szerepet elsısorban a plazmin látja el [10]. Az ekkor már aktivált upa-upar komplex többek között a plazminogén plazminná való aktiválását is véghezviszi, ezzel lényegében egy pozitív visszacsatolású rendszert hozva létre. A létrejött plazmin a továbbiakban nem csak az újabb upa aktiválását viszi véghez, hanem számos egyéb, az ECM komponenseinek proteolízisben szerepet játszó enzimet aktivál, úgymint a mátrix-metalloproteáz-2-t (MMP-2) és a mátrixmetalloproteáz-9-et (MMP-9) [11]. Az upa receptora az upar egy 283 aminosavból álló, glikozilált, 3 homológ doménre (DI, DII és DIII) felosztható fehérje, amelyet egy glikozil-foszfatidil-inozotol (GIP) molekula horgonyoz a plazmamembránhoz. Expresszióját forbol-észterek, növekedési faktorok, és integrin szignálok is képesek megindítani [12]. Egészséges szervezetben az upar elhanyagolható mértékben expresszálódik a tüdıben, vesékben, májban, szívben és az erekben. Nagymértékő kifejezıdése csak sebek szélénél vagy embriogenezis során tapasztalható, valamint a malignus tumorok többségénél [13] és fertızések vagy gyulladások esetén. Az upar elsıdleges feladata a pro-upa megkötése, és ezzel a plazminogén sejtfelszíni aktiválása, ezáltal közvetett módon a proteolítikus folyamatok elindítása [14]. Az upar az extracelluláris proteolítikus folyamatok mellett egyéb reakciókban is képes részt venni, akár az upa hiányában is. Ezek a nem proteolitikus funkciók általában a sejt és ECM közötti kölcsönhatások szabályozásához köthetıek. A szabályozás a környezı mátrix vitronektin molekuláihoz való kötıdéssel, vagy az integrin receptorokra gyakorolt hatáson keresztül történik. Az integrin receptorokkal való kölcsönhatás a migráló sejtek (pl. monociták, melanómák, MCF-7 típusú emlı tumor sejtek) esetében domináns [15]. A legtöbb malignus tumorsejt esetében az upar túlzott expressziója tapasztalható, ami a migrációt a nem csak az upa-hoz, de a vitronektinhez való kötödése révén is elıidézi. A túlzott kifejezıdés emellett a sejtproliferációt is befolyásolja. - 10 -
Az upa/plazmin rendszer szempontjából három fontos inhibitort különböztethetünk meg, melyek mindegyike a szerpinek családjába tartozik. A három inhibitor közül a szervezetben a legfontosabb szerepet a plazminogén aktivátor inhibítor-1 (PAI-1) tölti be. A PAI-1 aktív formában szekretálódik a sejtekbıl, de hamar inaktív formát vesz fel, ha nem képes kötıdni a pro-upa/upar komplexhez, vagy az ECM egy fontos komponenséhez a vitronektinhez (VN). Amennyiben nem tudott kötıdni sem az upa-hoz sem a VN-hez, destabilizálódik és inaktiválódik. A reaktivációt ekkor bizonyos foszfolipidek képesek újra elıidézni, de ennek a pontos mechanizmusa még nem ismert [16]. A másik fontos upa inhibitor a plazminogén aktívátor inhibítor-2 (PAI-2). Mind a citoszolban, mind az extracelluláris térben kimutatható jelenléte. Mivel nem olyan gyorsan képes az upa blokkolására, mint a PAI-1, ezért még mindig nyitott a kérdés, hogy más, eddig még nem azonosított enzimeket is kontrollál-e [16]. A proteáz nexin-i (PN-I) lényegesen kevésbé specifikus inhibítor. Egyaránt kötıdik a plazminhoz, a trombinhoz és az upa-hoz. Mivel befolyásolja a fibrinképzıdést és elbomlást, ezért feltételezhetıen számos egyéb jelenleg még nem igazán ismert, extracelluláris enzimre is kihat [16]. 2.1.2 Az malignus invázió adhéziós molekulái: az integrinek A sejt és környezete közti kapcsolatot, kommunikációt az ún. adhéziós receptorok teszik lehetıvé. Ezek a fehérjék egyfajta mátrix receptoroknak tekinthetıek, amelyek megteremtik a mátrix komponensei és a citoszkeleton közötti kapcsolatot. Bár számos transzmembrán proteoglikán ismert melyek képesek ellátni ezt a feladatot, a legjelentısebb ezek közül mégis az integrin. Az integrinek, funkciójuktól eltekintve, abban térnek el az átlagos sejtfelszíni receptoroktól, hogy lényegesen nagyobb számban fejezıdnek ki (10-100-szor) és kisebb affinitással kötik meg ligandumaikat. Ez utóbbi magyarázata az, hogy amennyiben erıs affinitással kötnék ligandumaikat, a sejtek gyakorlatilag helyhezkötöttek lennének, képtelenek lennének a mozgásra [17]. - 11 -
Az integrinek két, egymással nem kovalensen kapcsolt, ún. α- és β- láncból álló heterodimerek. Mind az alfa, mind a béta alegység rendelkezik transzmembrán résszel, rövid, doménnel a citoplazmában és kiterjedt intracelluláris szakasszal. Ember esetében 24 α és 9 β alegység ismert jelenleg, azonban ez a szám még nagyobb, ha figyelembe vesszük, hogy emelett mindegyik alegységnek RNS splicingból fakadóan számos alvariációja is lehetséges [18]. A lehetséges alegység párokat a 3. ábra mutatja. 3. ábra. Az integrinek családfája. Hogy adott integrin esetében milyen ligandum preferált, csakis a receptort felépítı α és β alegységtıl függ. Az extracelluláris mátrix komponensei közül a leggyakoribb ligandumok a fibronektin, vitronektin, kollagén és a laminin. Az integrinek ligandum kötése jelentısen függ az extracelluláris térben található Ca 2+ és Mg 2+ -ionoktól. Ez azzal magyarázható, hogy mind az α, mind a β alegység extracelluláris szakasza Ca 2+ illetve Mg 2+ kötı doménekben gazdag. A kétszeresen pozitív töltéső ionok doménekhez való koordinálódásával az alegységek térszerkezete stabilizálódik, és az integrin képessé válik a ligandum kötésére. A kötött ion típusa továbbá befolyásolhatja a ligandumhoz való affinitást, specifitást [19]. - 12 -
A ligandum bekötését követıen konformációváltozás megy végbe az integrinben, aminek következtében a β lánc citoplazmikus farka intracelluláris proteineket köt meg, mint pl. talin vagy α-actinin. Ezek egyfajta horgonyként viselkedve vagy közvetlenül, vagy közvetve, más molekulák közrejtszásával (pl. vinkulin) aktin filamentumokhoz kapcsolódnak, így kötve az integrint a citoszkeletonhoz [19]. Mindazonáltal, mint a legtöbb adhéziós molekula, az integrinek is több funkcióval rendelkeznek. A sejtfelszínen lévı számos receptorral képesek együttmőködni - fıként migráló sejtek haladó élén - különbözı sejtszintő válaszokat váltva ki. Ezért fontos szerephez jutnak olyan a jelátviteli folyamatokban, amelyeken keresztül például a sejtek alakját és mobilitását szabályozák. 2.1.3 Az integrinek és az urokináz plazminogén aktivátor rendszer kapcsolata A korábbiakban már megemlítettem, hogy az upar proteolítikus funkciója mellet egyéb, nem proteolítikus funkciókkal is bír, melyek szintén fontos szerephez jutnak a sejtmigrációban. Ilyen migrációt/inváziót elısegítı folyamat az integrinekkel való kölcsönhatás, amely a sejt haladó élén jön létre [20]. A kutatók a kölcsönhatás mibenlétének feltérképezésekor abból a ténybıl indultak ki, hogy az upar egy GPI-kötött protein, nincs citoplazmikus farka, tehát az integrinnel való kölcsönhatás elengedhetetlen a citoszkeleton átrendezéséhez, a migráció elindításához. A migráló sejteken található integrin receptorok (legjellemzıbbek az α v β 3, α v β 5, α5β1) azonban az ECM olyan komponenseihez kötıdnek, amelyek részben tartalmaznak ún. RGD szekvenciát. Ilyen fehérjék a mátrixban például a vitronektin és a fibronektin. Azonban az upar nem tartalmaz sem fibronektinre sem vitronektinre jellemzı szekvenciát [21,22]. A választ az a megfigyelés adta, hogy az integrin/upar komplex által elıidézet sejtvándorlás mindig upa függıséget mutatott. Figyelembe véve, hogy az upa/upar komplex nagy affinitással tud vitronektinhez vagy fibronektinhez kötıdni, ezért a kutatók feltételezték, hogy ezeken a mátrix komponenseken keresztül jön létre az upa/upar/integrin kölcsönhatás. Vizsgálat során kiderül, hogy az upar vitronektin ún. szomatosztatin-kötı doménjéhez (SMB domén) kapcsolódik. Mivel a vitronektin tartalmaz RGD szekvenciákat is, ezért az integrin képes bekötni, és így létrejöhet az upa/upar/vitronektin/integrin komplex és konformációváltozások révén pedig sejtmigrációhoz vezetı szignáltranszdukciós útvonal - 13 -
indul el. Az upa/upar/vitronektin/integrin komplex létrejötte két ponton is gátolható: vagy az upa bekötése gátolt, vagy olyan RGD-szekvencia jelenlétével, amelyhez az integrin receptor nagyobb affinitással kötıdik, mint a vitronektinhez vagy fibronektinhez [21,22]. A kölcsönhatás létrejöttét a 4. ábra mutatja be. upa Vitronektin AntiuPA Integrin β α upa α upar upar RGD β Extracelluláris tér GPI RGDpeptid GPI SMB Intracelluláris tér Sejtmigráció 4. ábra. Integrin kapcsolódása az upar-hoz. 2.2 Urokináz plazminogén aktivátor antagonista peptidiek 2.2.1 Az Å6 urokináz plazminogén aktivátor antagonista Az Å6 peptidet (Ac-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-NH 2 ) és változatait (Å7, Å8, Å9 stb) Guo és munkatársai alkalmazták elısször upa anatagonistaként. Ez az oktapeptid bár nem az upa elsıdleges receptorkötı szakaszából származtatható, mégis rendkívül aktív ligandumnak bizonyult az upar számára [23,24]. Elınye, hogy nem tartalmazza az upa azon szakaszait melyek proteáz vagy egyéb funkciókat látnak el. Mőködésének pontos mechanizmusa jelenleg még vizsgálat tárgyát képzi, azonban feltételezhetı, hogy mint antagonista gátolja az upa/upar komplex létrejöttét és ezzel a - 14 -
plazmin és egyéb ECM degradáló enzimek aktíválódását. Mindezt alátámasztják az in vitro kísérletek adatai. Az Å6 ezekben a vizsgálatokban azokat a hatásokat mutatta, amelyeket az upa/upar komplex leszabályozódása (endocitózisa és proteolízise) esetén várhatunk: antiangiogénnek, anti-invazívnak bizonyult, ugyanakkor nem volt citotoxikus [23,24]. Az Å6 in vivo monoterápiás alkalmazása során [23] valamint tamoxifénnel [25] illetve cisplatinnal [26] kombinálva szintén rendkívül aktív antitumor hatást mutatott mell- és petefészekrák tumoroknál. 2.2.2 Az WX-360 urokináz plazminogén aktivátor antagonista Apella és munkatársai a 80-as évek végén határozták meg az upa receptorához való kötıdésért felelıs epitópját, amely az upa 19-31 szakasz volt [27]. Ez a szekvencia egy flexibilis ún. Ω-hurok részét képezte a fehérjének, melyet a Cys 19 és a Cys 31 diszulfidhídon keresztül kapcsolt össze. A WX-360 (ciklo 21,29 [NH 2 -D-Cys 21 -Asn-Lys-Tyr-Phe-Ser-Asn-Ile-Cys 29 -Trp-COOH]) upa antagonista kifejlesztésénél Sato és munkatársai ezt a győrős upa 19-31 szakaszt választották vezérmolekulának. Vizsgálatuk során a szekvencia minden egyes L-aminosav tagját szisztematikusan kicserélték D-aminosavra, és vizsgálták a cserék aktivitásra gyakorolt hatását. Mivel a kísérletek nem nyújtottak elég ígéretes eredményt, ezért következı lépésként a győrő szőkítését is célul tőzték ki. Az optimalizálás eredményeként kapták meg végül a ciklo 21,29 [D-Cys 21 ]-upa 21 30 peptidet, amelyet WX-360-ként jelöltek. A ciklopeptidet ezek után a proteolitikus degradációval szemben kívánták elleánállóbbá tenni. Ennek érdekében vizsgálták az aminosav-oldalláncok módosításával a proteázokkal szembeni ellenállóképesség változását, valamint ezek befolyását a kötıdési képességre. Azt találták, hogy mind a Lys 3 Nle-ra való cseréjével növekedett a stabilitást, és csak kis mértékben rontotta a kötıdési képességet [28]. Mind a WX-360, mind a WX-360-Nle ciklopeptid biológiai hatását vizsgálták tumorokon. In vivo és in vitro kísérletekben egyaránt azt az eredményt kapták, hogy a peptidek - petefészek és mellrák esetében gátolták a további áttétképzıdést és a primer tumor növekedését az upa/upar komplex gátlásán keresztül [28]. - 15 -
2.3 Integrin antagonista molekulák: RGD peptidek Bár néhány integrin ligand szelektivitása igen specifikus, általában többféle ligandot is képesek megkötni. Az integrinek legtöbbje az RGD (arginil-glicil-aszparaginsav) tripeptid szakaszhoz kötıdik. Ez a tripeptid nemcsak ECM makromolekulákban fordul elı, hanem megtalálható plazmafehérjékben és sejtfelszíni proteinekben is. Az RGD szekvenciát tartalmazó peptid integrinhez való kötıdésének erısségét a környezı aminosavak határozzák meg. Ezek a szegélyezı aminosavak befolyásolják a peptid konformációját az RGD szekvencia körül, ami pedig megszabja hogy melyik integrin liganduma lehet. Adott konformáció esetén ugyanis csak adott integrinhez vagy integrinekhez való kötıdés lesz preferált. Lineáris peptidek esetén ilyen fontos szerepet a negyedik aminosav (RGDX) tölt be. Azonban a lineáris RGD peptideket fokozatosan felváltották a ciklikus RGD peptidek. A ciklizálással ugyanis a peptidek konformációja stablilizálódott, ami jelentıs aktivitásnövekedéshez (10-100-szoros) vezetett, ezáltal pedig lehetıség nyílt specifikusabb sejtes válaszok elıidézésére [29]. A ciklikus RGD peptidek esetében az öttagú győrők bizonyúltak a leghatékonyabbnak. Ezekben a győrőrendszerekben az RGD szekvencia két aminosavval van szegélyezve, amik megfelelı megválasztásával bizonyos határok között a konformáció szabályozható, ezzel pedig az integrinspecifitás. A ciklikus RGD peptidek nagy elınye a lineáris társaikkal szemben nem csak az aktivitásban jelentkezik, hanem a proteolízissel szembeni ellenállásban is. Azonos körülmények között a ciklikus változatok kb. 30-szor stabilabbnak bizonyultak [30]. - 16 -
3.Elmélet 3.1 Szilárdfázisú peptidszintézis (SPPS) A peptidek aminosavakból történı elıállításának két formája ismeretes, az oldatban történı és a szilárdfázisú szintézis. Az oldatban végzett peptidszintézis, melyet ma már egyre ritkábban alkalmaznak, kis peptidek lépésenkénti szintézisére illetve nagyobb tagszámú peptidek fragmenskondenzációjakor alkalmazható, kevésbé hatékony, idıigényes eljárás. A technika továbbfejlesztését az 1962-63-ban Merrifield által javasolt szilárdfázisú peptidszintézis jelentette, mely lehetıvé tette a közepes és nagy tagszámú peptidek hatékony elıállítását [31]. Napjainkra ez az eljárás jelentıs mértékben továbbfejlıdött, automatizálhatóvá vált, ennek köszönhetıen pedig széles körben elterjedt. A szilárd hordozón, ún. gyantán, végrehajtott peptidszintézis alapelve, hogy a peptid C- terminálisán lévı aminosav karboxilcsoportját a szintézis kezdetén kovalens kötéssel a gyantához kapcsolják. A peptid felépítése, az oldatban végzett szintézishez hasonlóan, történhet aminosavanként (stepwise), vagy a konvergens szintézis módszerével, amikor is hosszabb, védett, vagy részlegesen védett peptidláncokat kapcsolnak össze a gyantán fragmenskondenzációval. Lépésenkénti szintézis során lényegében két mőveleti elem ismétlıdik minden hosszabbítási ciklusban. Az elsı lépés során eltávolításra kerül az oldalláncain védett, hosszabbítandó peptid N-terminálisán lévı védıcsoport, majd második lépésben megtörténik az N- terminálisán védett, aktivált aminosav hozzákapcsolása a peptid szabaddá vált aminocsoportjához. A növekvı peptidlánc a szintézis során végig a gyantához kötve marad, így az elreagált kapcsolószerek és oldószerek feleslege egyszerő szőréssel eltávolítható a gyantához kötött peptid mellıl. A folyamatot az 5. ábra szemlélteti: - 17 -
5. ábra. A szilárdfázisú peptidszintézis folyamatának vázlata. A módszer hátránya, hogy bár a reagens feleslegek könnyen eltávolíthatóak, az elıállított peptid izolálására csak a gyantáról való hasítás után nyílik lehetıség. Tehát a szintézis során nincs mód az intermedierek tisztítására. Ezért a hibás szekvenciák számának minimalizálása érdekében az egyes kapcsolási lépéseknek közel 100%-os kitermeléssel kell lejátszódniuk. Ez a kapcsolószereknek és egyéb reagenseknek a gyantakapacitáshoz viszonyított, 3-5 ekvivalensnyi feleslegének alkalmazásával érhetı el, valamint szükség esetén a kapcsolásokat megismételik. A reagensek nagy feleslege azonban elkerülhetetlenné teszi az oldalláncban funkciós csoportot tartalmazó aminosavak oldalláncának védelmét. Kifejlesztettek olyan eljárásokat, melyek során a gyantához az aminosavat aminocsoportján keresztül kapcsolják, és a C-terminális irányában építik tovább a peptidet. Ebben az esetben viszont, a racemizáció veszélye jelentıs, így ez a módszer nem terjedt el igazán [32]. A szintézis befejeztével lehetıség szerint úgy kell a gyantáról lehasítani a peptidet, hogy azzal az olalláncokat védı csoportokat is el lehessen távolítani. - 18 -
A hasítás után kapott anyagkeverékben a várt terméken kívül egyaránt megtalálhatóak hibás szekvenciájú peptidek is, melyek fiziko-kémiai tulajdonságai hasonlíthatanak az elıállítani kívánt peptidhez. Ezért a tisztítási folyamatban fontos szerep jut a nagyhatékonyságú elválasztástechnikai eljárásoknak, mint például a HPLC-nek. 3.1.1 A szilárdfázisú peptidszintézis startégiái A szilárdfázisú peptidszintézisnek két alapmódszerét különböztetjük meg [33,34]: Boc/Bzl stratégia: amelyben az aminosavszármazékok α-aminocsoport védelmére terc-butiloxikarbonil-csoportot alkalmazunk. Fmoc/ t Bu stratégia: amelyben az aminosavszármazékok α-aminocsoport védelmét 9- fluorenilmetoxikarbonil-csoport látja el. Mindig az elıállítani kívánt peptid szekvenciája határozza meg, hogy a lehetséges stratégiák közül melyiket célszerő alkalmazni. A Boc/Bzl stratégia esetén az N-terminális védıcsoportja, a terc-butiloxikarbonil-csoport. Lúgokkal és nukleofil vegyületekkel szemben stabil, ám rendkívül savérzékeny, ezért eltávolítása közepesen erıs savas közegben - 30-50 tf%-os TFA/DCM oldatban - véghezvihetı. A hasítás után az α-aminocsoport a trifluoracetáttal sót képez, ezért a közeget az átmeneti védıcsoport hasítása után semlegesíteni kell. Erre a célra 5-10 tf%-os DIEA/DCM oldatát alkalmazzák. Mivel az N-terminális védıcsoportjának eltávolítását savas közegben végzik, ezért a peptidgyanta között kialakuló kötést úgy kellett megválasztani, hogy stabil maradjon a szintézis során. Ennek megfelelıen a peptidet a gyantáról csak erıs savval (HF, TFMSA, TMSOTf) tudjuk hasítani, amelynek során az oldallánc védıcsoportok is lehasadnak. Azonban a savas környezetre érzékeny aminosavak (Trp, Met, Cys, Tyr) esetében a módszer csak korlátozottan, gyökfogók és redukálószerek használata mellett, alkalmazható, és így sem mindig kerülhetık el a mellékreakciók. Az Fmoc/ t Bu stratégia elınye - ellentétben a Boc/Bzl módszerrel -, hogy olyan aminosavak esetében is különösebb megszorítások nélkül alkalmazható, amelyek hajlamosak az oxidációra vagy alkilezıdésre (Trp, Met, Cys, Tyr). A módszer során az N-terminálison található átmeneti védıcsoportot, 9-fluorenilmetoxikarbonil (Fmoc), elsısorban szerves szekunder aminokkal hasítják. Ez történhet pl. 20-55 tf%-os piperidin-dmf elegyével. - 19 -
A stratégia nagy elınye még, hogy a gyantáról való hasítás és az oldallánc védıcsoportok eltávolítása során elkerülhetjük a HF használatát. Az állandó oldallánc védıcsoportok eltávolítását általában a gyantáról történı hasítással (80-95% TFA oldattal) egy idıben végzik. A hasítás során keletkezı reaktív karbokationok miatt gyökfogókat kell alkalmazni. A Boc/Bzl, valamint az Fmoc/ t Bu technika esetében is a felkapcsolni kívánt védett aminosavszármazékokat aktiválni kell. Erre a leggyakrabban in situ aktív észteres aktíválást alkalmazunk. Boc/Bzl stratégia esetén az in situ aktív észteres aktíválást leggyakrabban DCC és HOBt elegyével, míg Fmoc/ t Bu technika esetében DIC és HOBt keverékével alakítják ki az aktív észtert. 3.1.2 Gyanták Biológiai vizsgálatok számára sok esetben elınyösebb, ha a vizsgált peptid minta C- terminálisa amidált. A szilárd hordozó megválasztásával lehetıség nyílik a peptidet amidált C-terminálissal, vagy karbonsav funkcióval szintetizálni. A hordozókkal, mint polimerekkel szemben elvárás, hogy jól duzzadjanak az alkalmazott oldószerekben, optimális legyen a szőréssebességük, ne lépjenek reakcióba az oldószerekkel, a reagensekkel vagy akár az épülı peptidlánccal. A gyanta fontos jellemzıje a kapacitás. Az 1,0 mmol/g kapacitású gyanták a viszonylag rövid peptidek szintézisére alkalmasak, míg az alacsonyabb szubsztitúciójú gyanták az elágazó, illetve hosszú láncú peptidek szintézisénél használják a kialakuló térgátlás miatt. A Merrifield által kezdetben alkalmazott gyanta klórmetil funkciós csoportokat tartalmazó polisztirol-1,4-divinilbenzol (1-2%) kopolimer volt. Az azóta eltelt több mint négy évtized során nem csak a szilárdfázisú peptidszintézis módszere, de az alkalmazott gyanták is jelentıs fejlıdésen mentek keresztül, számuk a mai napig is folyamatosan bıvül. A Boc/Bzl módszernél alkalmazott gyanták, melyekrıl savas hasítással szabad C-terminálisú peptidek keletkeznek (Merrifield- és PAM-gyanta), nukleofilekkel történı reakció után pedig peptidamidok, peptidhidrazidok valamint pepid-észterek állíthatóak elı. Azonban a peptidamidok elıállítására leggyakrabban a BHA (benzhidril-amin) és az MBHA (4-metilbenzhidril-amin) gyantákat használják [35]. Az Fmoc/ t Bu módszernél leggyakrabban alkalmazott gyanták melyek szabad karboxil terminálisú peptideket eredményeznek, a polisztirol alapú 4-benziloxi-benzilalkohol vagy a 4- - 20 -
hidroximetil-fenoxi-ecetsav funkciós csoportot tartalmazók. Ezen kívül elterjedt még a [4- (2',4'-dimetoxi-fenil-aminometil)-fenoxi] ún. Rink-Amide MBHA gyanta, amely esetében a hasítási reakció peptidamidot eredményez [36]. Szintéziseim során MBHA gyantát alkalmaztam Boc/Bzl technikához, és Rink-Amide MBHA gyantát pedig Fmoc/ t Bu módszerhez. 3.1.3 A kapocsolás követése A szabad aminocsoporttal rendelkezı peptidek ninhidrinnel jellegzetes kék színreakciót adnak. Ez az ún. Kaiser- vagy ninhidrin teszt mely alkalmazható mind kvalitatív, mind kvantitatív mérésekre [37]. A módszer érzékenységét mutatja, hogy már 1% szabad aminocsoport kimutatására is képes. Amennyiben a szabad aminocsoportok mennyisége 1% alatt van, úgy az oldat zöldes-sárga elszínezıdést mutat. A szín kialakításához 104 0 C-os hımérsékleten 3-5 perc szükséges (6. ábra). 6. ábra. Egy α-aminosav reakciója ninhidrinnel. A Kaiser-teszt a prolin kivételével az összes aminosav esetén jól alkalmazható. A prolin iminosav, aminocsoportjának nitrogénje győrőbe zárt, és bár képez adduktot ninhidrinnel, annak színe nem különbözik a kiindulási oldat színétıl. Ezért a prolint követı aminosav felkapcsolódásának sikerességérıl izatin teszttel kell megbizonyosodni [38]. Pozitív teszt esetén a gyantaszemek barna színőek, míg ha a reakcióelegy tartalmazza a Kaiser-teszt reagenseit is, akkor vöröses barna gyantaszemeket kapunk. - 21 -
4. Célkitőzések Munkám során olyan peptid konjugátumok szintézisét tőztem ki célul, melyek a malignus tumorok további áttétképzésének megakadályozásában kapnának szerepet. TDK munkám során ezért olyan peptid-kimérák elıállítását terveztem, amelyek egyszerre lehetnek képesek megakadályozni az upa ECM degradációban való résztvételét, valamint kölcsönhatásba lépését a migrációt elısegítı integrinekkel. Ennek érdekében az irodalmi adatok alapján upa antagonistaként az Å6-ot és egy kevésbé hatékony származékát, az Å8-ot választottam. Mivel számos integrin lehet célpont, ezért a kiméra peptid másik komponenseként egy olyan nagy aktivitású, ugyanakkor a migrációt elısegítı integrinekre (α v β 3, α v β 5, α 5 β 1 ) viszonylag specifikus peptid antagonistát kerestem. Választásom ezért a ciklo[rgdfc] ciklopeptidre esett. Célom volt: Å6 (Ac-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-NH 2 ) és Å8 (Ac-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu- Glu-NH 2 ) upa antagonista peptidek és 7-dietilamino-8-kumarin származékaik (7- dietilamino-kumarin-lys-pro-ser-ser-pro-pro-glu-glu-nh 2 és 7-dietilaminokumarin-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-NH 2 ) szintézise. Ez utóbbiak alkalmasak lehetnek a peptidek sejtekhez kötıdésének vizuális vizsgálatára. Az Å6 és Å8 peptidek flexibilis távtartó szekvenciával (spacerrel) ellátott származékainak (7-dietilamino-kumarin-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Gly-Gly- Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Lys(CO-CH 2 -Cl)-NH 2 és 7-dietilamino-kumarin-Pro-Ser-Ser- Pro-Pro-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Lys(ClCH 2 -CO)-NH 2 ) szintézise, amelyek alkalmasak a ciklo-rgd peptid kemoszelektív ligációval történı kapcsolására. Ciklo[RGDfC] peptid szintézise és konjugálása Å6 és Å8 peptidek spacerrel állított származékaihoz tioéter-kötésen keresztül. Az elıállított peptid konjugátumok in vitro sejtmigrációra gyakorolt hatásának vizsgálata Boyden-kamrás kísérlettel. - 22 -
5. Eredmények Célkitőzésemnek megfelelıen peptid-peptid konjugátumokat állítottam elı, melyek egyszerre tartalmaztak upa és integrin antagonistát. A konjugátumok elıállítása és vizsgálata négy részbıl tevıdött össze: Å6 és Å8 upa antagonista referencia peptidek illetve spacerrel ellátott származékainak valamint a ciklo[rgdfc] peptid szintézise; Peptid-peptid konjugátumok kialakítása; A vegyületek tisztítása; Az elkészült konjugátumok in vitro biológiai vizsgálata A konjugációhoz szükséges peptideket szilárdfázisú peptidszintézissel (SPPS) manuálisan, építettem fel. A peptidek aminosav szekvenciája miatt az SPPS Fmoc/ t Bu stratégiáját alkalmaztam. - 23 -
5.1 Peptidek szintézise 5.1.1 Ciklo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys] szintézise Az RGD-ciklopeptid szintézisét Fmoc/ t Bu-technika felhasználásával készítettem 2-klórtritil gyantán. Az elsı aminosav (Fmoc-Gly-OH) felkapcsolásához DIEA/DMF elegyét használtam. A gyanta elreagálatlan funkciós csoportjait ezután MeOH-lal blokkoltam. Az aminosavszármazékok Fmoc védıcsoportjának lehasítását 2% piperidin, 2% DBU/DMF eleggyel végeztem, és az aminosavak kapcsolásakor DIC/HOBt elegyét használtam. A védett aminosavszármazékokból és a kapcsolás során használt reagensekbıl a gyantakapacitásra számolva három ekvivalens mennyiséget használtam, így nem volt szükség újrakapcsolásra. A szintézis végeztével a peptidet a gyantáról DCM/ MeOH/ CH 3 COOH keverékével hasítottam, így az oldallánc-védıcsoportok továbbra is a peptiden maradtak. A reakció letelte után a kicsapatott, szárított peptiden sócserét végeztem Pyr HCl/MeOH (piridíniumhidroklorid) segítségével. A kinyert anyag ún. head-to-tail (fej-farok) ciklizálását BOP/HOBt/DIEA/DMF elegyével végeztem, a reakció lejátszódását analitikai HPLC-vel követtem. A ciklizálás befejeztével a peptid oldallánc védıcsoportjait hasítottam TFA/ EDT/ /tioanizol/ TIS/ fenol/ H 2 O eleggyel. A szabad peptidet éterrel csaptam ki a hasító elegybıl, majd a centrifugálással elkülönített anyagot híg ecetsavban oldottam. A kapott ciklo(rgdfc) peptid-oldatot liofilizáltam, majd az így nyert nyers peptidet RP-HPLC-vel tisztítottam. A kapott tiszta frakció tisztaságát analitikai HPLC-vel és tömegspektrométerrel (ESI-MS) ellenıriztük. 5.1.2 Az Ac-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-NH 2, Ac-Pro-Ser-Ser-Pro- Pro-Glu-Glu-NH 2 valamint a 7-dietilamino-kumarin-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro- Pro-Glu-Glu-NH 2 és a 7-dietilamino-kumarin-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu- NH 2 szintézise Mind a négy peptid szintézisét Fmoc/ t Bu technikával végeztem, Rink Amide MBHA gyantán. Az Fmoc/ t Bu módszer alkalmazását elsısorban azok a szekvenciák indokolták, amelyek 7- dietilamino-kumarint tartalmaztak, mivel ez a jelölıvegyület érzékeny a HF-es hasításra. Az Fmoc csoport lehasítása ebben az esetben is 2% piperidin, 2% DBU/DMF eleggyel történt. Az védett aminosavszármazékok kapcsolásakor DIC/HOBt elegyét használtam, mindegyikbıl a gyantakapacitásra számolva három ekvivalens mennyiséget. - 24 -
A peptidet az Fmoc-Pro-Ser( t Bu)-Ser( t Bu)-Pro-Pro-Glu(O t Bu)-Glu(O t Bu)-Rink-Amid MBHA szekvenciáig építettem majd az alább ábrázolt módon (7. ábra) négyfelé osztottam és az elıállítani kívánt szekvenciáknak megfelelı módon fejeztem be az építésüket. Fmoc-Pro-Ser( t Bu)-Ser( t Bu)-Pro-Pro-Glu(O t Bu)-Glu(O t Bu)-Rink-Amid MBHA gyanta 4-dimetilamino-3-karboxi- -kumarin kapcsolása Acetilezés Fmoc-Lys(Boc)- NH 2 kapcsolása 4-dimetilamino-3-karboxi- -kumarin kapcsolása Acetilezés 7. ábra. A szintézis befejezı lépései. A szekvenciák befejezése után a peptidek oldallánc-védıcsoportjait, illetve magát a peptidgyanta kötést hasítottam desztillált víz és EDT gyökfogókat (kationfogókat) tartalmazó TFA oldattal a gyantáról. A peptideket éterrel csaptam ki a reakció elegyekbıl, majd centrifugálással izoláltam azokat. Végül a peptideket híg ecetsavban oldottam. A kapott peptid-oldatokat liofilizáltam, majd az így nyert nyers peptideket RP-HPLC-vel tisztítottam. A kapott frakciók tisztaságát analitikai HPLC-vel és tömegspektrométerrel (ESI-MS) ellenıriztük. 5.1.3 7-dietilamino-kumarin-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Gly-Gly- Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Lys(ClCH 2 -CO)-NH 2 és 7-dietilamino-kumarin-Pro- Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Lys(ClCH 2 -CO)-NH 2 szintézise A két peptidet végig Fmoc-technikával készítettem el Rink-Amide MBHA gyantán. Elıször felépítettem a peptidláncot a Pro 2 aminosavig, majd feleztem a gyantámat, és a két különbözı szekvenciának megfelelıen külön-külön fejeztem be a szintézist. Ezután mindkét esetben a szekvencia C-terminálisát adó lizin oldallánc Mtt-védıcsoportját hasítottam 2% TFA / 2% TIS / DCM oldattal, majd 10% DIEA / DCM oldattal semlegesítettem. Ezután klórecetsav - 25 -
pentaklór-fenil-észter /DMF oldatával klóracetileztem a lizin oldalláncát. A gyantáról a peptideket valamint az oldallánc védıcsoportokat 95 % TFA / 5 % deszt. víz eleggyel hasítottam le. A peptideket liofilizáltam, RP-HPLC-vel tisztítottam, és a kapott tiszta frakciót mind analitikai HPLC-vel, mind pedig tömegspektrometriával (ESI-MS) ellenıriztük. 5.2 Biokonjugátumok elıállítása A peptid-peptid konjugátumok elıállítását oldatfázisban végeztem. A reakciók során a 7- dietilamino-kumarin-lys-pro-ser-ser-pro-pro-glu-glu-gly-gly-gly-lys-gly-gly-gly- Lys(ClCH 2 -CO)-NH 2, illetve a 7-dietilamino-kumarin-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Gly- Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Lys(ClCH 2 -CO)-NH 2 peptidekhez tioéter-kötés kialakításán keresztül mindkét esetben a ciklo(rgdfc) peptidet kapcsoltam. 5.2.1 7-dietilamino-kumarin-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Gly-Gly- Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Lys(ciklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)-CH 2 -CO)-NH 2 és 7-dietilamino-kumarin-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys- Gly- Gly-Gly-Lys(ciklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)-CH 2 -CO)-NH 2 elıállítása A konjugálást mindkét esetben TRIS (2-amino-2-hidroximetil-propán-1,3-diol) pufferben (ph 8,1) végeztem. A reakciók során a 7-dietilamino-kumarin-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu- Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Lys(CO-CH 2 -Cl)-NH 2, illetve a 7-dietilamino-kumarin-Pro- Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Lys(CO-CH 2 -Cl)-NH 2 peptidekbıl készített oldatokhoz adagoltam apránként a ciklo(rgdfc) peptidet. A kemoszelektív ligáció lejátszódását analitikai HPLC-vel követtem, majd pedig szemipreparatív HPLC-vel tisztítottam az elegyeket. A várt végterméket tömegspektrometriai mérések alapján azonosítottam 5.3 Biológiai vizsgálatok: THP-1 sejtek kemotaxis vizsgálata Az elıállított peptidek vizsgálatát THP-1 (humán akut monocitás leukémia) sejtvonalon végezték egy 96-lyukú módosított Boyden-kamrában. Ennek során a vizsgálni kívánt anyagokat 10-5,10-6 és 10-7 mol/dm 3 koncentrációban inkubáltatták a sejtekkel. Az 5 µm pórusátmérıjő polikarbonát szőrın átvándorolt sejtek mennyiségét MTT-teszttel határozták - 26 -
meg. Az 540 nm és 620 nm hullámhosszon mért abszorbancia különbségét ábrázolva a peptidkoncentrációk függvényében 7-dietilamino-kumarin-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu- Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Lys(ciklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)-CH 2 -CO)-NH 2, ciklo[arg-gly-asp-d-phe-cys], 7-dietilamino-kumarin-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu- NH 2 peptidekre kapott eredményeket az alábbi diagrammok foglalják össze. 4-metilamino-kumarin-A6 (4-metilamino-kumarin-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-NH 2 ) Sejtszám/ % 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 K -8-7 -6-5 Koncentráció/ log M 8. ábra. 7-dietilamino-kumarin-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-NH 2 kemotaxis vizsgálatából származó eredmények. - 27 -
Ciklo [RGDfC] (Ciklo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys]) 100 80 Sejtszám/ % 60 40 20 0-8 K -7-6 -5 Koncentráció/ log M 9. ábra. Ciklo[Arg-GlyAsp-D-Phe-Cys] kemotaxis vizsgálatából származó eredmények. 4-dietilamino-kumarin-A6-(Gly) 3 -Lys-(Gly) 3 - -Lys(ciklo[RGDfC]-CH 2 -CO)-NH 2 (4-dietilamino-kumarin-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu- -Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Lys(ciklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)-CH 2 -CO)-NH 2 ) 100 80 Sejtszám/ % 60 40 20 0-8 K -7-6 -5 Koncentráció/ log M 10. ábra. 7-dietilamino-kumarin-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly- Lys(ciklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)-CH 2 -CO)-NH 2 kemotaxis vizsgálatábó származó eredmények. - 28 -
4-dietilamino-kumarin-A6 Ciklo [RGDfC] 4-dietilamino-kumarin-A6-(Gly) 3 -Lys-(Gly) 3-80 -Lys(ciklo[RGDfC]-CH 2 -CO)-NH 2 Sejtszám a kontrolhoz képest/ % 60 40 20 0-20 -7-6 -5 Koncentráció/ log M 5. ábra. A vizsgált peptidek kemotaxisának összehasonlítása. A kapott eredményekbıl kitőnik, hogy: Az Å6 szekvenciának nincsen gátló hatása 10-7 mol/dm 3 koncentráció felett THP-1 sejtek esetében. A ciklo[arg-gly-asp-d-phe-cys] peptid jelentıs gátló hatással elsısorban 10-7 és 10-5 mol/dm 3 koncentrációban rendelkezik. A konjugátum esetében mindhárom koncentrációtartományban a ciklo[arg-gly-asp- D-Phe-Cys] peptid hatása érvényesül. Ugyanakkor 10-6 mol/dm 3 tartományban jobbnak bizonyul, mint a két referencia peptid. A lehetséges magyarázatok közül legvalószínőbb, hogy a konjugátum sikeresen kapcsolódott integrinhez és upar-hoz egyszerre, ezáltal kettıs receptorblokkolás ment végbe. Ezt igazolja az is, hogy 10-5 mol/dm 3 koncentrációban bár a konjugátum hasonló értékeket mutat, mint a ciklopeptid, azonban ebben a koncentrációban a upa antagonista sejtigrációt erısítı hatása is jelentısen érvényesül. Teljes biztonsággal azonban csak abban az esetben lehet igazolni ezt a feltevést, amennyiben a referenciapeptidek fizikális keveréke is hasonló eredményeket mutat. - 29 -
Bár a biológiai vizsgálatok még zajlanak, mégis elmondható, hogy a vizsgált peptid-peptid konjugátum megfelelı optimalizálás esetén versenytársa lehet a jelenleg alkalmazott metasztázist gátló drogmolekuláknak. - 30 -
6. Kísérleti rész A dolgozatomban szereplı peptideket elıállításakor a szilárdfázisú peptidszintézis egyik leggyakoribb stratégiáját, az Fmoc/ t Bu technikát, alkalmaztam. Protokolját az alábbi táblázat tartalmazza. Mővelet Reagens/oldószer Idıtartam (min) Ismétlések száma Mosás DMF 1 3 Fmoc-csoport hasítás 2% piperidin, 2% DBU/DMF 2+2+5+10 1+1+1+1 Mosás DMF 1 8 Kapcsolás 3 ekv. Aminosavszármazék/DMF +3 ekv. DIC,HOBt/DMF 60 1 Mosás DMF 1 3 Mosás DCM 1 2 Kaiser-teszt Ninhidrin oldat, KCN oldat, fenol oldat,(izatin oldat) 3-5 1 1. táblázat. Az Fmoc/ t Bu technika protokollja. Amennyiben a Kaiser-teszt pozitív színreakciót mutatott, a DMF-es mosás után a kapcsolási lépést megismételtem. 6.1 Peptidek szintézise 6.1.1 Ciklo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys] szintézise, tisztítása és analízise A szintézist Fmoc/ t Bu technikával végeztem, 1 g 0,6 mmol/g kapacitású 2-klór-tritil gyantán. Az aminosav származékokból és a kapcsolási reagensekbıl egyaránt a gyanta kapacitásra számolt három ekvivalensnyi mennyiséget használtam fel. Jelen esetben ez 0,9 mmol-nyi anyagmennyiséget jelent. - 31 -