Kalorimetriás módszerek a liposzómák vizsgálatában DSC : differential scanning calorimetry ITC : isothermal titration calorimetry 1 DSC: differential scanning calorimetry differenciális pásztázó kalorimetria dq S /dt pásztázó (szkening) Kétféle készülék típus: minta T = T R T S referencia H S T dq R /dt kalorimetria = hőmennyiség mérés differenciális mért mennyiség: T fűtőteljesítmény szabályozása, hogy T = 0 legyen mért mennyiség: dq S /dt dq R /dt = dq/dt 1 2 mért mennyiség: T számolás: dq/dt 2 Termogram: Példa: DPPC multilamelláris liposzóma T T végső referencia T ~ ~ dq/dt 1 entalpia változás Q H ENDO T c EXO T kezdő minta 0 t 2 T c kritikus hőmérséklet T S dq/dt H S T alapvonal eltolódás 3 S entrópia változás c hőkapacitás (fajhő) változás 4 3 T p T m 4 1
Példa: koleszterin hatása DPPC liposzóma termogramjára T < T m T m < T T p T m Tm T p 5 6 Példa: Acetazolamid formulázása Glaukómában szem belnyomásának csökkentésére. Mellékhatások: depresszió, veseelégtelenség, hányás, anorexia,... Lokális alkalmazás problémái: rossz vízoldékonyság, kicsi permeabilitási együttható liposzóma ITC: isotherm titration calorimetry izoterm titrációs kalorimetria 7 8 2
Felépítés: ITC név magyarázata: titrációs adagoló és keverő fecskendő B molekula A molekula izoterm T = állandó Az A molekulához kis adagokban adjuk hozzá a B molekulát. Mért mennyiségek: A és B aránya fűtőteljesítmény referencia cella hőszigetelt ház minta cella állandó fűtőteljesítmény visszacsatolással szabályozott fűtőteljesítmény 9 szabályozott fűtőszál T = konstans a cellában fellépő hővel azonos mértékben változik a fűtőszál teljesítménye. kalorimetria 10 dq/dt ENDO szimuláció idő (perc) EXO dq/dt (mcal/s) 1 2 3 Q (kcal/mol) kötési állandó: K ( meredekség) kötőhelyek száma: N kötési entalpia: H ligand/protein vagy B/A 1 kötőhelyek száma 2 kötési állandó 3 kötési entalpia 11 12 3
Meghatározható mennyiségek: N, K, H + G RT ln K G H T S 4 S kötési entrópia Példa: fájdalomcsillapító és liposzóma kölcsönhatása indometacin Példák orvosi/biológiai alkalmazásra: fehérje-fehérje kölcsönhatás nukleinsav-fehérje kölcsönhatás fehérje-ligandum kölcsönhatás nukleinsav-membrán kölcsönhatás enzim-szubsztrát kötődés enzim-inhibitor kötődés oligomerizáció/disszociáció micella képződés kétfázisú kötődés lipid-lipid kölcsönhatás fehérje-lipid kölcsönhatás gyógyszer-lipid/fehérje kölcsönhatás gyógyszer-felületaktív anyag khatás nem-szteroid antireumatikum Mellékhatások: gyomor-bél problémák (hányás, gyomorvérzés,...) liposzóma 13 14 Példa: Béta-receptor blokkolók kölcsönhatása liposzómával Példa: nem-szteroid gyulladásgátlók hatása a membránra ibuprofen Nem-szteroid gyulladásgátlók: pl. ibuprofen, diklofenak, naproxen Liposzóma: DMPC DSC diklofenak + Vizsgálták: DMPC:ibuprofen DMPC:diklofenak Liposzóma: POPC+POPG 25 C 37 C koncentráció ionerősség hőmérséklet liposzóma méret hatását. kölcsönhatás 15 16 4
ITC Példa: DNS és liposzóma kölcsönhatása DNS transzfer Liposzóma: dic14-amidin kationos liposzóma előnyök: gyengébb immun válasz, nagy méretválaszték, sejt specifikus liposzómák,... + plazmid DNS nincs kölcsönhatás fluoreszcencia spektroszkópia 17 18 ITC DSC liposzóma átrendeződés? Szerkezet változás van. De az miben áll? kötődés fluoreszcencia spektroszkópia 19 20 5
Fluoreszcencia fluoreszcencia lumineszcencia Lumineszcencia: hőmérsékleti sugárzáson felüli többlet sugárzás. Fluoreszcenciás módszerek a liposzómák vizsgálatában Megfigyelések: gyenge kapcsolat a test hőmérsékletével vonalas, ill. sávos spektrum hideg fény elektrongerjesztés 21 22 Gerjesztés szerint: gerjesztés módja elnevezés példa fény fotolumineszcencia kinin-szulfát, (fluoreszcencia) foszfor, röntgensugárzás. röntgenolumin. NaI (Tl) radioaktív sugárzás. radiolumin. NaI (Tl) Lumineszcencia mechanizmusa atom: E E el molekula: E E gerjesztés emisszió el E E v r vonalas spektrum (pl. Na) elektromos tér elektrolumin. higanygőzlámpa mechnikai hatás tribolumin. kockacukor kémiai reakció kemolumin. szentjánosbogár (biolumin.) hő termolumin. CaSO4 (Dy) sugárzás nélküli átmenet sugárzásos átmenet abs Stokeseltolódás: lumin lumin abs vonalas/sávos spektrum (pl. fluoreszcein) 23 24 6
fenilalanin tirozin Lumineszcenciafény jellemzése vonalak, sávok helyzete, alakja, intenzitása Stokes-féle eltolódás kvantumhatásfok: Q = emittált fotonok száma/abszorbeált fotonok száma( < 1) élettartam: 0 0 e t anizotrópia: r 0 e t t lumin abs t : élettartam molekulák közötti energia átadás (FRET) t Fluoreszcencia és foszforeszcencia gerjesztés fluoreszcencia foszforeszcencia phos abs fluo fluo t fluo t phos abs phos metastabil állapot kis valószinűségű átmenet pl. triptofán: fluo 340 nm phos 440 nm t fluo 0,1 5 ns t phos 0,001 5s 25 26 Példák: Mérés luminométer felépítése detektor fluoreszcein emissziós monokromátor I triptofán fluo fosz fényforrás analizátor minta 250 300 350 400 450 (nm) 27 gerjesztési monokromátor polarizátor 28 7
Példák: liposzóma + fluorofór DNS és liposzóma kölcsönhatása (folyt.): liposzóma + Ca Fluorofór: pirén Pirén excimer ( koncentráció): gerj = 330 nm em = 477 nm fúzió után pirén fluoreszcenciája csökken fúzió 29 30 Fluorofór: Anizotrópia mérése FITC-vel jelzett dextrán (FITC: fluoreszcein-izotiocianát) lineárisan polarizált fény v gerjesztő fény minta polarizátor emittált fény v analizátor h Mért intenzitásértékek: vv és vh DNS destabilizálja a liposzómákat dextrán kiáramlás, fúzió anizotrópia (r): r vv vh 2 vv vh vv vh 0 r 1 1 helyett a maximális érték r 0 31 32 8
Perrin-egyenlet: r0 r 1t / V kt : rotációs diffúzió korrelációs ideje : viszkozitás V : molekula(rész) térfogata k : Boltzmann-állandó T : hőmérséklet Liposzóma mikroviszkozitása a hőmérséklet függvényében: Liposzóma: DPPC DPPC: dipalmitoil foszfatidilkolin Fluorofór: DPH DPH: difenil hexatrién : mikroviszkozitás (1/ : mikrofluiditás) Az anizotrópia értékek átszámolhatók mikroviszkozitásra. Nagyobb anizotrópia nagyobb mikroviszkozitást jelent. A fázisátalakulási hőmérséklet fölött jelentősen lecsökken a lipidréteg mikroviszkozitása. 33 34 Alkánok és nyomás hatása a liposzóma mikroviszkozitására: Liposzóma: DPPC DPPC: dipalmitoil foszfatidilkolin Fluorofór: DPH DPH: difenil hexatrién Förster-féle rezonancia energiatranszfer (FRET) donor molekula gerjesztő fény donor emisszió energia átadás akceptor molekula akceptor emisszió Mért mennyiség: donor/akceptor intenzitásarány Nagyon erősen függ a távolságtól! molekuláris mérőszalag 35 36 9
Példa: nem-szteroid gyulladásgátlók (ibuprofen, diklofenak, naproxen) hatása a membránra (folytatás) FRET Magnetoliposzómák Liposzóma: DPPC+koleszterin Mágnes: Fe 3 O 4 nanorészecskék 2011 nincs változás A vizsgált molekulák nem hatolnak be a lipid (TEM felvételek) molekulák közé. 37 38 Melegítés rádióhullámokkal Példa: hőmérséklettel aktivált liposzóma tervezése f = 281 khz Fluorofór: DPH Doxorubicin (Dox) citosztatikum, a szokásos mellékhatásokkal Célkitűzés: liposzómás bejuttatás, de úgy, hogy az egészséges szövetben minél kevesebb, a daganatban minél több hatóanyag jelenjen meg. Van saját fluoreszcenciája 39 40 10
Elv: 1. Daganat lokális felmelegítése 39-41 C-ra (T R ), pl. MRIgHIFU technikával 2. Hatóanyag bezárása olyan liposzómába melynek, a) gélfluid átmeneti hőmérséklete T R közelében van, b) hatóanyag kieresztése T R alatt minél kisebb, T R közelében minél nagyobb. Liposzóma tervezése: új tervezésű liposzóma korábban használt liposzóma új tervezésű liposzóma tartomány, ahol a liposzóma ereszt hidrofil hidrofil 41 42 DSC: Fluoreszcencia: Fluoreszcencia: korábban használt liposzóma új tervezésű liposzóma Különböző új tervezésű liposzómák 43 44 11
anizotrópia - r intenzitás epidermális növekedési faktor (EGF) Epithelsejteket modellező liposzóma: DSC termogram 1. minta PG 2. minta +PC+PE 3. minta +20%Chol 4. minta +30%Chol 15 20 25 30 35 40 45 hőmérséklet ( C) 45 46 EGF kötődése steady-state anizotrópia mérések 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 20 40 60 80 100 lipid koncentráció (μmol/l) EGF emissziós spektruma 355 nm 50000 40000 30000 20000 10000 347 nm 0 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 hullámhossz (nm) szabad EGF kötött adszorbeált EGF EGF 47 48 12