hatóanyag-tartalmú gyógyszer készítmény radiokémiai tisztaság vizsgálata radio-tlc eljárással

A 2-[ 18 F]fluoro-2-deoxi-D-glükóz ([ 18 F]FDG) hatóanyag-tartalmú gyógyszer készítmény radiokémiai tisztaság vizsgálata radio-tlc eljárással Oktatási segédanyag a Jelzett vegyületek elválasztástechnikája (TKML0431) gyakorlathoz radiokémikus szakirányú vegyész MSc hallgatók számára Összeállította: Jószai István Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum Nukleáris Medicina Intézet Debrecen 2013

Tartalomjegyzék 1. A gyakorlat célja...3 2. Elméleti áttekintés...3 2.1. Pozitronemissziós tomográfia (PET)...3 2.2. 18 [ F]FDG...4 2.2.1. Általános információ...4 2.2.2. Előállítás...4 2.2.3. Minőségellenőrzés...6 2.3. Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia...8 3. A gyakorlaton alkalmazott HPLC rendszer leírása... 11 4. A gyakorlaton elvégzendő feladatok... 13 4.1. Az alkalmazott Silica gel 60 típusú VRK lap megfelelőségi vizsgálata... 13 4.2. Az alkalmazott radio-tlc rendszer alkalmassági vizsgálata... 13 4.3. A 18 [ F]FDG tartalmú minta radiokémiai tisztaság vizsgálata... 14 5. Kérdések önálló felkészüléshez... 15 6. Felhasznált és ajánlott irodalom... 16 2

1. A gyakorlat célja A [ 18 F]FDG tartalmú készítmény radiokémiai tisztaságának vizsgálata vékonyréteg kromatográfiás (VRK,TLC) eljárással. A kromatográfiás vizsgáló rendszer alkalmassági vizsgálata az eljárás eredményes kivitelezése szempontjából. 2. Elméleti áttekintés 2.1. Pozitronemissziós tomográfia (PET) A PET az egyik legmodernebb funkcionális képalkotó eljárás a gyógyászatban. Műtéti beavatkozást nem igénylő (non-invazív) eljárás, melynek segítségével háromdimenziós képet nyerhetünk a test egy adott területéről. A CT-vel kombinált PET berendezés jelenti ma a képalkotó diagnosztika egyik legfejlettebb technikáját. A PET és más hagyományos képalkotó eljárások (pl. fmri, SPECT) sajátossága, hogy nem az anatómiai viszonyokat, hanem a szervek, szövetek különböző funkcionális jellemzőjét (pl. véráramlás, anyagcsere) jelenítik meg egy adott pillanatban. Mivel a betegség kialakulása először a szervek, szövetek funkcionális jellemzőiben okoz elváltozást, és ezt általában másodlagosan kíséri az anatómiai megváltozás, így érthető, hogy a funkcionális képalkotó eljárások jóval hamarabb, még az anatómiai elváltozások kialakulása előtt képesek jelezni a betegséget, azaz a betegség nagyon korai stádiumában nyújtanak hasznos információt. A pozitronemissziós tomográfia működése azon alapul, hogy pozitront sugárzó izotópokkal jelölt molekulák segítésével képes a szervezet biokémiai folyamatait ábrázolni. Ma már a PET-kamerát CT-készülékkel egybe is tudják építeni, így teremtve meg a lehetőségét annak, hogy a PET-tel nyert funkcionális képek és a CT morfológiai információkat azonos anatómiai szeletekben, egymásra tudják vetíteni. A PET/CT kombinációs technológia forradalmi változásokat hozott az onkológiai, kardiológiai és neurológiai diagnosztikában. Az eljárás lényege, hogy a vizsgált szervbe pozitron kibocsátással bomló radioaktív izotópot tartalmazó molekulát juttatnak (a leggyakrabban használt izotópok: 18 F, 15 O, 13 N, 11 C). A különböző radiofarmakonokkal különböző funkciók működése mérhető fel, attól függően, hogy az illető molekula a szervezeten belül milyen folyamatokban vesz részt. Elméletileg az élő szervezet anyagcseréjében résztvevő bármilyen szerves molekula jelölhető PET izotóppal, és a módszer segítségével szinte mindegyik biokémiai, élettani folyamat leképezhető, illetve aktivitása mérhető. A leggyakrabban használt radiofarmakon a [ 18 F]FDG, ami a fokozott glükózmetabolizmusú sejtekben (agy, szívizomzat, rosszindulatú tumorok, aktivált granulociták és limfociták) halmozódik fel, s mivel nem metabolizálódik, ezért ugyanebben a formában a vesén keresztül a vizeletbe választódik ki (ellentétben a glükózzal). A szervezetbe juttatott marker szöveti eloszlását a PET kamera (egy gyűrű alakú detektor) segítségével lehet detektálni a pozitron-kibocsátást kísérő gamma sugárzás észlelésén keresztül. A vizsgálat során nyert adatokból számítógép segítségével történik a képek rekonstruálása. A vizsgálattal elsődlegesen a test hossztengelyére merőleges szeletek nyerhetők (a CT-hez hasonlóan), akár az egész testről. Később a szeletekből tetszőleges 3

irányú, akár háromdimenziós képek állíthatók elő. A bejuttatott radiofarmakon szöveti eloszlása a különböző (fiziológiás, illetve kóros) funkcionális állapotokban egymástól jelentős mértékben eltér, így ennek alapján a kóros folyamatok felismerhetők és lokalizálhatók. A PET izotópok jellemzője, hogy fizikai felezési idejük nagyon rövid (2-110 perc), 90 perccel a beadást követően az injektált aktivitás 40%-a már távozott a vizelettel, így alkalmazásuk a beteg számára kisebb sugárterheléssel jár. Emellett nagy hátránya az eljárásnak, hogy a használt radioaktív izotópok olyan gyorsan elbomlanak, hogy közvetlenül a vizsgálat előtt, a helyszínen kell őket előállítani, ami jelentősen növeli a berendezés árát. [1] Tipikus PET/CT kamera PET felvétel az emberi agyról 2.2. [ 18 F]FDG 2.2.1. Általános információ Kémiai név: 2-[ 18 F]fluoro-2-deoxi-β-D-glükóz Struktúra: Molekulaképlet: C 6 H 11 FO 5 Molekulatömeg: 181 g/mol A [ 18 F] radionuklid fizikai jellemzői: felezési idő: 109,7 perc a bomlás pozitron kibocsátásával (p + =97%) vagy elektronbefogással (ec=3%) megy végbe A γ-sugárzás energiája: 511 kev (p + -részecske energiája: 635 kev) 2.2.2. Előállítás A DEOEC Nukleáris Medicina Intézet Radiokémiai Központjában rutinszerűen gyártott [ 18 F]FDG előállítási, tisztítási lépéseit, illetve a minőségellenőrzést az alábbiak tartalmazzák. 4

A gyógyszerhatóanyag prekurzorának [ 18 F]fluorral történő jelölése nukleofil szubsztitúcióval valósul meg. A [ 18 F]fluorid-ion radionuklid előállítása 18 O(p,n) 18 F magreakcióval történik ciklotronban. A célanyag nagy dúsítási fokú [ 18 O]H 2 O (>98% tisztaságú). A besugárzott 18 F - - iont tartalmazó [ 18 O]H 2 O vizet a ciklotron target helyéről közvetlenül a felhasználás helyére, az automatizált FDG gyártó panel erre a célra kialakított ún. dúsított vizes edénybe juttatják 0,8 mm belső átmérőjű PEEK vezetéken keresztül. A 18 F - -iont anioncserélő (fluor szeparációs oszlop) segítségével választják el a besugárzott targetanyagtól. Az oszlopra adszorbeálódott 18 F - -iont nagytisztaságú hélium gáz segítségével szárítják. A 18 F - -iont kálium-karbonát oldatával eluálják le az oszlopról. Az elúciós oldat a vízben oldott kálium-karbonáton kívül fázistranszfer katalizátort (kriptofix 2.2.2.) és acetonitrilt tartalmaz. Az eluátum a reakcióedénybe kerül, ahol a viz-acetonitril elegyet azeotróp bepárlással szárítják. Az azeotrópos bepárlás előnye az, hogy a vizes elegy alacsonyabb hőmérsékleten és gyorsabban szárad be. A radiokémiai szintézist a széles körben alkalmazott nukleofil szubsztitúcióval (S N N2) végezik. A szubsztitúciót vízmentes közegben kell végezni a megfelelő reakció hozam elérése végett. Amennyiben víz marad a reakció elegyben, úgy a 18 F - -kriptofix 2.2.2.-K + komplex nem vagy nem kellő mennyiségben alakull ki, következésképpen a szubsztitúció nem vagy alacsony hatásfokkal játszódik le. A fázistranszfer katalizátor vízmentes acetonitril közegben növeli a [ 18 F]fluorid nukleofilicitását, ami kulcsfontosságú az izotópjelzés sikeressége szempontjából. A szubsztitúció kezdetén a vízmentes acetonitrilben oldott prekurzort (1,3,4,6-tetraóz (TATM)) hozzáadják a beszárított komplexhez. Magasabb -O-acetil-2-O- trifluormetánszulfonil-β-d-mannó hőmérsékleten (85ºC) könnyen végbemegy a [ 18 F]fluorid reakciója a TATM-al: TATM TA-[ 18 F]FDG A nukleofil szubsztitúció terméke a 1,3,4,6-tetra-O-acetil-2-[ 18 F]fluor-dezoxi-glükóz (TA-[ 18 F]FDG). A védő acetil-csoportokat savas közegű hidrolízissel távolítják el a molekuláról, amihez sósavat használnak. A hidrolízist magasabb hőmérsékleten (121ºC) és nyomás alatt (zárt reakcióedény) végezik. A lejátszódó reakció: TA-[ 18 F] ]FDG [ 18 F]FDG A reakció végterméke, a 2-[ 18 F]fluor-β-D-deoxi-glükóz, ami a készítmény hatóanyaga. 5

A szubsztitúciót és a hidrolízist követően a reakció elegyet a tisztító oszlopsor neutralizáló AG 11 oszlopára vezetik, ahol a savas elegy semlegesítése történik meg. A reakcióedényt injekcióhoz való desztillált vízzel átmossák és szintén a tisztító oszlopsorra vezetik, ahol az előzetesen felvitt reakcióelegyet tovább mosva a tisztító oszlopokon keresztül a gyűjtőampullába juttatják. A tisztító oszlopsor AG 11 ioncserélő gyantát tartalmazó oszlopból, C-18 SepPak Plus -ból, valamint Alumina SepPak Plus -ból áll. A szilárd fázisú oszlopon átjutó oldat a kémiai és radiokémiai szennyező anyagok megkötődése következtében kémiailag és radiokémiailag tisztul. Az AG 11 töltetű oszlop az oldat semlegesítésén kívül az acetátot és a fázistranszfer katalizátort, a kriptofix 2.2.2.-t köti meg, a C-18 SepPak Plus a TA-[ 18 F]FDG-t, illetve az Alumina SepPak Plus a szabad 18 F - -ionokat tartja vissza. A gyártás terméke a 2-[ 18 F]fluor-β-D-deoxi-glükóz tisztított oldata, ami a tisztítás hatékonyságától függően kis mértékben tartalmazhatja a radiokémiai- és kémiai szennyezőket. A szennyezők minőségi- és mennyiségi paraméterei a radiogyógyszer minőségellenőrzése során adható meg. 2.2.3. Minőségellenőrzés A [ 18 F]FDG tartalmú injekciós készítmény minőségellenőrzése a hatóanyag radiokémiai- és radionuklidos azonosításán túlmenően, elsődlegesen a potenciális szennyeződések azonosítását, részarányuk és koncentrációjuk megállapítását jelenti. Ezen kívül vizsgálják az injekciós oldat kémhatását és szálmentességét. A 18 F[FDG] gyártási lépéseit követve feltérképezhető mindazon radiokémiai-, kémiai- és izotópszennyeződés, amely a minőségellenőrzési vizsgálatok tárgyát képezhetik. A radiokémiai szintézis megkezdése előtt szükséges a szintetizáló berendezés (automatizált szintézispanel) tisztítása és előkészítése. Ez a lépés a reakcióedények és a reagens tartályok acetonos és etanolos átmosását, illetve a tisztítóoszlopok etanollal való aktiválását jelenti. Értelemszerűen várható e két oldószer maradványainak, mint szennyezők megjelenése az injekciós készítményben. Továbbá a szintézishez szükséges 18 F izotópot ciklotron segítségével állítják elő. A 18 O(p,n) 18 F folyamathoz kiindulási anyagként H 18 2 O-t (>98% dúsítású) bombáznak protonnal. A besugárzás során a ciklotron céltárgyában található ezüst targetfólia 48 V izotópok keletkezését idézheti elő, a normál H 16 2 O ilyen körülmények között 13 N izotópot eredményez. A radionuklidos tisztaság vizsgálatra ezért feltétlenül szükség van. A radiokémiai szintézis során a prekurzor triflát csoportja (CF 3 SO 3 - ) [ 18 F]-ra cserélődik, majd ezután következik a védő acetilcsoportok savas hidrolízise. A folyamat során nem teljes a 18 F izotóp beépülése, és a tisztítási folyamatok ellenére visszamarad a készítményben. Másik radiokémiai szennyezőnek a TA-[ 18 F]FDG tekinthető. A szintézis reakcióközege acetonitrilt tartalmaz, így maradványaira számítani lehet a végtermékben, ugyanúgy ahogyan a Kriptofix 2.2.2. fázistranszfer katalizátor is szennyezheti a készítményt. 6

A 18 F[FDG] gyártása során az előkészítési folyamatok és a radiokémiai szintézis alkalmával számos potenciális szennyező kerülhet az injekciós oldatba. A pontos analitikai módszerek kidolgozása és a vizsgálatok precíz kivitelezése elsődleges fontosságú a készítmény minőségének biztosítása végett. A készítmény radiokémia tisztaságának meghatározása radio-tlc módszerrel A radiokémiai szintézis során a [ 18 F]FDG készítményt a be nem épült, szabad 18 F és a nem hidrolizált, acetilezett TA-[ 18 F]FDG származékok szennyezhetik. A radiokémiai szennyeződések és a hatóanyag részarányának meghatározására radio-tlc eljárás áll a rendelkezésre. Figyelembe véve a 18 F izotóp gyors bomlását (felezési idő: 109,7 perc) a készítmény mielőbbi vizsgálata és felszabadítása a cél. Ezért a készítmény esetében úgynevezett parametrikus felszabadítási eljárás alkalmazható, mely értelmében meghatározott vizsgálati eredmények birtokában diagnosztikai célra felhasználhatóvá nyilvánítható a készítmény (természetesen a teljes felszabadításhoz a minőségellenőrzési vizsgálatok maradéktalan elvégzése szükségeltetik). A radiokémiai tisztaság meghatározására szolgáló radio-tlc vizsgálat teljes képet ad a [ 18 F]FDG hatóanyag százalékos részarányáról, hiszen ebben az esetben nemcsak az acetilezett származékok mutathatók ki, hanem a szabad 18 F is. A módszer azonban 45 perces kifejlesztést igényel acetonitril:víz 95:5 V/V% eluenssel. Követelményként a [ 18 F]FDG 95% aránya tekintendő. Az eddig elvégzett több mint kétezer legyártott sarzsból elenyésző esetben tapasztaltunk 95% alatti arányt. A kromatográfiás módszer segítségével a specifikusság (R S ) 2,30-5,56 között mozog, a kifejlesztő eluens összetételének 10%-os változásával a felbontás 1,23-ra csökken, így elmondható, hogy a módszer robosztus. 7

2.3. Vékonyréteg kromatográfia A műszeres analízis kromatográfiás módszereinek feladata, hogy a minta komponenseit legtöbbször szerves vegyületekett egymástól elválassza. A módszer működésének alapja az, hogy a mozgófázisba (amely gáz vagy folyadék lehet) kevert mintaelegyet szoros kontaktusba hozzuk egy azzal nem elegyedő másik fázissal, amelyet állófázisnak hívunk (egy lapra felvitt, vagy cső belsejében rögzített folyadék vagy szilárd halmazállapotú anyag). A mozgófázist (eluens) állandóan mozgásban tartva a mintaelegy komponensei az állófázissal való kölcsönhatásuk különböző mértéke miatt megfelelő kontaktidő után elkülönülnek egymástól. Amennyiben a rendszerben egy detektort helyezünk el, amely a mintakomponenseket képes megkülönböztetni a minta oldószerétől, akkor a detektorjel idő függvényében való ábrázolásakor a mintakomponenseket reprezentáló csúcssorozatot fogunk észlelni. Ezt a grafikont hívjuk kromatogramnak, a berendezést pedig kromatográfnak. [2] A vékonyréteg kromatográfia régi neve papír kromatográfia (paper chromatography) PC. Ma vékonyréteg kromatográfia (thin layer chromatography) TLC, nagy felbontású vékonyréteg kromatográfia HPTLC, túlnyomásos vékonyréteg kromatográfia: OPLC néven van a szakmai köztudatban. A VRK különböző szempontok alapján csoportokba sorolható. Térbeli elrendezés alapján lehet vertikális vagy horizontális. A hajtóerő típusa alapján: kapilláris erő, centrifugális kényszererő vagy nyomásból származó erő által végrehajtott. A fázis típusa alapján: normál (szilika), fordított (C8, C18, poliamid, dimetil-amino-propil) vagy ioncserélő VRK-ról beszélhetünk. A VRK réteg anyaga lehet: szilikagél, cellulóz, C8, C18, poliamid, funkcionalizált polisztirol. A réteg optikai érzékenyítése alapján: nem fluoreszkáló, fluoreszkáló 254 nm vagy 366 nm hullámhosszon, fluoreszkáló 254 + 366 nm hullámhosszon. Az elválasztható minta tömege alapján a VRK lehet analitikaii 0,1-0,2 mm, félpreparatív 0,2-0,5 mm, preparatív 0,5-10 mm. A vékonyréteg kromatográfia megvalósításához az alábbi eszközökre lehet szükség: réteglap, felcseppentő kapilláris vagy automata cseppentő/szóró készülékk 8

futtatókád mauális vagy automata) szárítóberendezés előhívó reagensek és szóróberendezések, merítőkádak, UV lámpa digitális dokumentációs rendszer, kiértékelő szoftver A legáltalánosabban használt kromatográfiás réteg a szilikagél, normál TLC, illetve HPTLC minőségben. Minden réteget a laboratóriumi gőzöktől elzárva, tiszta levegőjű helyiségben, szorosan lezárt dobozban tároljuk. Célszerű a rétegeket ellenőrzött páratartalmú tároló szekrényben tartani. A normál TLC réteg 10-60 mikrométeres diszperz, a HPTLC réteg 5-20 mikrométeres szűk frakciójú szemcsékből áll. A HPTLC réteg kisebb mintamennyiség nagyobb felbontású elválasztására alkalmas, de költségesebb, mint a hagyományos réteg. A kifejlesztési távolság normál TLC esetén 10-15 cm, míg HPTLC esetében 5-8 cm. A hordozó lap anyaga lehet üveg, alumínium, műanyag. A rétegek tipikus mérete: 20 cm x 20 cm (TLC) 10 cm x 20 cm (TLC, HPTLC) 10 cm x 10 cm (HPTLC) 5 cm x 20 cm (TLC) 5 cm x 7,5 cm (HPTLC, TLC) Minden réteg kapható normál és koncentráló zónás kivitelben. A mintafelvitel legyeszerűbb a kézzel, házilag húzott kapillárissal történő felcseppentés, de az így kapott kromatogram csak gyors, kvalitatív vizsgálatra alkalmas. Komolyabb minőségi és mennyiségi vizsgálatokhoz minősített, kalibrált kapilláris használata szükséges. A lap szélére nem cseppentünk (perem hatás)! Komoly mérésnél biztosítani kell a minták teljes elkülönülését, ezért a foltok a felcseppentéskor kb. 10 mm távolságra legyenek. A felcseppentett foltok a futtatószer szintje fölött legyenek. Tipikus felcseppentési koncentráció: kb. 1-20 mg/ml, tipikus felcseppentett térfogat: 0,50 5,0 mikroliter. Normál rétegnél a felcseppentés mérete 3-5 mm legyen, HPTLC-s rétegnél a cseppek kétszer olyan közel kerülhetnek egymáshoz, de csak 1-2 mm átmérőjűek lehetnek. Nagyobb mennyiségű minták csíkszerű felvételére, különösen a vastagabb, preparatív rétegeknél szinte nélkülözhetetlen az erre a célra kifejlesztett speciális mintafelvivő berendezés. A legegyszerűbb futtatókádként jól használható lehet pl. egy jól záró, alacsony, széles szájú befőttes üveg. Az oldószerelegy párolgása és adszorpciója a réteg felületén jól látható a jobb oldali képen. 9

A megbízható és reprodukálható futtatáshoz feltétlenül szükséges a gőztér futtatás előtti telítése. HPTLC rétegekhez használható horizontális futtatókádak, telített és telítetlen gőztérrel történő futtatásra egyaránt alkalmas. Egyidejűleg két különböző összetételű futtatószerrel, egymással szemben futtatva két mintasorozatot is lehet analizálni. A horizontális kádban kapott futási kép a futás típusától függően akár nagyon jelentősen is különbözhet a hagyományos kádakban kapott képtől, de lehet közel azonos is. Automata futtató kádak: a gőztér előzetes telítését és a lemez bemerítését, majd a beállított oldószerfront magasság elérésekor a futás megszüntetését és a lemez megszárítását automatikusan végzi. Reprodukálhatóbb a futási kép, de sokkal nagyobb a készülék bekerülési költsége. Szendvics kádak: a réteglapot egy tőle 1-3 mm távolságra lévő üveglappal zárjuk le. A gőztér telítését a rétegen történő párolgás biztosítja. A szendvicskádakban kapott futási kép (kromatogram) nagyon jelentősen eltér a hagyományos kádakban kapottaktól! A módszerek nem vihetők át közvetlenül! A lemezek szárítása, hőkezelése során egyszerű esetben csak szárításra van szükség, amit hajszárítóval lehet a legegyszerűbben elvégezni. Más esetekben a hőkezelés (hevítés) az előhívási folyamat része. Erre a célra speciális állandó (szabályozható) hőmérsékletű, hevítő asztal is használható amely esetében a szárítólemez felületéről az oldószer és a minta egy része is elpárolog, a hevítéskor pedig megfelelő elszívásról gondoskodni kell. A VRK vizsgálat fontos eleme az előhívás vagy láthatóvá tétel. Alapvető típusai: bemártás/szárítás/hevítés szóró (spray) reagensek használata, majd szükség esetén hőkezelés 254 nm és/vagy 366 nm UV fény alkalmazása Az általános előhívószerek általában erősen oxidálnak vagy roncsolnak, pl. foszformolibdénsav vagy tömény kénsav. Valamilyen színreagens alkalmazásával csoportvagy vegyület-specifikusan tudunk megjeleníteni foltokat. [2] A kiértékelés, mennyiségi elemzés alkalmával minıségi információk a retenciós faktor (R f ) értékének azonossága alapján nyerhetők. Az R f változását egy ismert belső standardra (R std ) vonatkozó relatív futási index értékkel (R x ) lehet valamelyest kiküszöbölni. Az R f értékek 10

csak az azonos lapon, azonos körülmények között futtatott minták esetében össze! hasonlíthatók ahol f a folt távolsága a felcseppentés helyétől, old az oldószerfront távolsága a felcseppentés helyétől. Az Rf értékét a vékonyréteg anyagi minősége, szemcsemérete, porozitása, a réteg vastagsága, az oldószer jellege és minősége, a kád telítettségi foka, a hőmérséklet, az oldószerfront úthossza, a start távolsága a mozgófázis felszínétől, a felvitt minta mennyiségee és az oldott anyag kémiai természete befolyásolja. Reprodukálható R f értékeket csak standard körülmények között kaphatunk. A rétegkromatográfiás elválasztások eredményének dokumentálásánál az R f értékétt befolyásoló tényezők mellett meg kell adni a detektálás körülményeit is.[3] Mennyiségi meghatározást legegyszerűbben a foltterület kézi mérésével (kör vagy ellipszis területének számításával), több ponthoz tartozó kalibráló görbe felvételével,majd abból visszakereséssel végezhetünk (kis koncentráció tartomány, kis érzékenység). További lehetőség a digitális kameraa képének elemzése, fizetős vagy ingyenes szoftver felhasználásával (közepes érzékenység). Professzionális méréseket denzitométeres kiértékeléssel végeznek. (UV-VIS 190-900 nm), nagy érzékenység, de rendkívül költséges. A kétdimenziós vékonyréteg kromatográfia nagyon összetett, egyedi minta komponenseinek minőségi vizsgálatára használják, mennyiségi meghatározásra nem alkalmas. 3. A gyakorlaton alkalmazott TLC rendszer leírása A raytest minigita Star_2 radio-tlc rendszer a Nukleáris Medicina Intézett Radiokémiai Központjának Szerves laboratóriumában van elhelyezve (10. szoba). A TLC rendszer elsődleges alkalmazási területe a GLUCO-PET oldatos injekció elnevezésű PET diagnosztikum radiokémiai tisztaságának meghatározása. A TLC rendszer fő komponense a szkenner, ami egy elektromosan mozgatható tálcából áll. Ennek a felületére megfelelő pozicionálással kell felragasztani a kifejlesztett és előzőleg megszárított VRK lemezt. A TLC rendszer másik fontos eleme az a speciális detektor, amely pozitron és gammaa részecskékre érzékeny. Ez azt jelenti, hogy ha szkennelés közben a stabil pozíciójú detektor látómezejébe a VRK lap azon része kerül, ahol radioaktív anyag koncentrálódott a detektorfejben fotoelektronok indukálódnak, amelyek elektromos jelet generálnak, ami a jelfeldolgozó egység felé továbbítódik. Az aktivitás nagysága egy adott tartományon belül egyenesen arányos a detektorválasz értékével. A rendszer egységeit és tartozékait az alábbi táblázat foglalja össze. 11

Egységek Típus Gyári szám radio-tlc szkenner minigita Star (raytest)5 B00002140 GMC béta detektor Beta Detector GMC (raytest) VAC 06358 Kiértékelő szoftver GINA Star TLC Version 5.01 Vezérlő szoftver TLC Control Version 2.11 Számítógép Dell Optiplex 780 4C3605J Nyomtató HPLaserjet M1120n MFP CND8832R5S A rendszer működtetése A minigita radio-tlc rendszer elindítása előtt ellenőrizzük a rendszer összetevői közötti elektromos kapcsolatok meglétét, majd bekapcsoljuk a radio-tlc szkennert az előlapján lévő POWER kapcsoló benyomásával, illetve a számítástechnikai eszközöket. A minigita radio-tlc rendszer vezérlése és a mérési fájlok kiértékelése két program segítségével oldható meg, amelyek a GINA Star kiértékelő szoftvercsomag részét képezik. A radio-tlc szkenner működtetése kizárólag számítógépes vezérléssel történik. Ehhez a Windows felületen lévő MiniGita Control ikonra kell klikkelni. A feljövő vezérlőpanelen a MEASUREMENT/NEW parancssoron keresztül be lehet hozni a használni kívánt kromatográfiás módszert, amelyben meg lehet adni a mérési fájl nevét, a mentési helyét, a mérési időt, a szkennelési tartományt, a TLC lemez startpontját és az oldószerfront helyét, illetve a kapott kromatogramok integrálásának módját (nincs integrálás, kézi és automatikus integrálási módok közül válaszhatunk). A mérés végeztével a kapott kromatogramok kiértékelését a GINA-Star TLC ikonra klikkelve, a megjelenő kiértékelő panel segítségével valósíthatjuk meg. A kívánt mérési fájlt, a FILE/OPEN parancssort követően, a megfelelő STUDY és METHOD-hoz tartozó rta 12

kiterjesztésű fájl kiválasztásával nyithatjuk meg. A kiértékelő felületen megjelenő kromatogram csúcsait a BB és/vagy DD ikonok aktiválását követően a csúcsok kezdetének és végpontjának kijelölésével értékelhetjük ki. A kiértékelt kromatogramokhoz tartozó csúcstáblázatot a REPORT ikon aktiválása után megjelenő ablakban nézhetjük meg, módosíthatjuk és nyomtathatjuk ki egyben (User Manual GINA-Star TLC). A mérések végeztével a minigita radio-tlc rendszer egységeit egyenként kikapcsoljuk. 4. A gyakorlaton elvégzendő feladatok 4.1. Az alkalmazott Silica gel 60 típusú VRK lap megfelelőségi vizsgálata A vizsgálathoz szükséges anyagok és eszközök radio-tlc rendszer (minigita Star_2) Referencia oldat: 30 mg 1,2,3,4-tetra-O-acetil-β-D-glükopiranózt és 20 mg glükózt enyhe melegítéssel 1 ml vízben oldunk Silica gel 60 típusú kromatográfiás vékonyréteg Kifejlesztőszer: acetonitril - víz (95+5 V/V) Tömény kénsav metanollal készített 75 g/l töménységű oldata 0,5-10 µl digitális pipetta Fedőlappal ellátott, szűrőpapírral bélelt kromatografáló-kamra. Rögzítésre alkalmas ragasztószalag A rendszer alkalmassági vizsgálathoz az összehasonlító oldat kb. 2 µl térfogatát visszük fel egy 20 cm hosszússágú és legalább 1,5 cm szélességű TLC csík startpontjára. A startpont a lemez aljától 1,5 cm-re legyen, valamint a csepp átmérője ne legyen nagyobb, mint 5 mm. Cseppentés után megvárjuk, amíg az oldószerfolt megszárad. A kromatografáló-kamrát a falai mentén szűrőpapírral béleljük. Ezután a kifejlesztőszerből annyit töltünk a kamrába, hogy 0,5 cm magas réteget képezzen. A kamrát lefedjük és 1 órán át állni hagyjuk, hogy telítődjék. A felvitt minta beszáradása után a lemezt közel függőleges helyzetben a kromatografáló-kamrába állítjuk úgy, hogy a folt a kifejlesztőszer fölé kerüljön. A kamrát lefedjük és 19 cm fronttávolságig fejlesztjük ki. Ekkor a lemezt kiemeljük és levegőn szárítjuk. A kifejlesztés és szárítás után a lemezt tömény kénsav metanollal készített 75 g/l töménységű oldatába merítjük, és onnan kiemelve meleg légárammal, vagy 150ºC-on addig szárítjuk, amíg a kromatogramon az összehasonlító oldat sötét foltjai meg nem jelennek. Kövtelmény: a kromatogramon két egymástól jól elkülönülő folt látható. 4.2. Az alkalmazott radio-tlc rendszer alkalmassági vizsgálata A radio-tlc rendszer alkalmassági vizsgálatának elvégzéséhez egy 3x10 cm Silica gel 60 típusú TLC lapot használunk fel, amelyen kijelölünk egy minta vonalat 20 mm távolságra a lap szélétől. A vonalakra 10, 50 és 70 mm távolságokra a lap aljától három mintapontot veszünk fel, ahová a megfelelő aktivitás koncentrációjú [ 18 F]FDG tartalmú injekció mintái kerülnek. A törzsoldat 100-500 kbq/µl között legyen. A törzsoldat 5 µl-ét 200 µl vízzel 13

keverjük össze ez adja a másik [ 18 F]FDG tartalmú injekció mintát. A törzsoldatból a TLC lap 50 mm pozícióira 5 µl térfogatot viszünk fel. A higított radioaktív mintából ugyancsak 5 µl-t viszünk fel mind a 10 mm, mind a 70 mm pozíciókra. A TLC lapot hagyjuk 10 percig száradni. A mérést az alábbi paraméterekkel végezzük el a TLC szkenner segítségével: 0-100 mm mérési hossz, oldószer kezdet 10 mm, oldószerfront 90 mm, 3 perc mérési idő, 2 binning faktor. A szkennelést követően a kapott kromatogramból meghatározzuk a megjelent csúcsok százalékos arányát. A kapott értékeket összevetjük az előírásként elfogadott értékekkel. A mérési adatokat, az eredményeket és azok eltérését a követelményként megadott értékektől szövegesen értékeljük. Sorszám Csúcspozíció Százalékos arány, (%) Követelmény 1 10 mm min 1,84%; max 2,83% 2 50 mm min 94,84%; max 95,84% 3 70 mm min 1,84%; max 2,83% 4.3. A [ 18 F]FDG tartalmú minta radiokémiai tisztaság vizsgálata A vizsgálathoz szükséges anyagok és eszközök radio-tlc rendszer (minigita Star_2) A [ 18 F]FDG tartalmú minta Silica gel 60 típusú kromatográfiás vékonyréteg Kifejlesztőszer: acetonitril - víz (95+5 V/V) 0,5-10 µl digitális pipetta Fedőlappal ellátott, szűrőpapírral bélelt kromatografáló-kamra. Rögzítésre alkalmas ragasztószalag A vizsgálathoz a FID-F oldatos injekcióból maximum 2,5 MBq aktivitásnak megfelelő térfogatú mintaoldatot használunk, amit egy 20 cm hosszússágú és legalább 1,5 cm szélességű TLC csík startpontjára cseppentünk. A megfelelő térfogatot az adott gyártási tétel radioaktív koncentráció étrtékéből számoljuk. A startpont a lemez aljától 1,5 cm-re legyen, valamint a csepp átmérője ne legyen nagyobb, mint 5 mm. Cseppentés után megvárjuk, amíg az oldószerfolt megszárad. A kromatografáló-kamrát a falai mentén szűrőpapírral béleljük. Ezután a kifejlesztőszerből annyit töltünk a kamrába, hogy 0,5 cm magas réteget képezzen. A kamrát lefedjük és 1 órán át állni hagyjuk, hogy telítődjék. A felvitt minta beszáradása után a lemezt közel függőleges helyzetben a kromatografáló-kamrába állítjuk úgy, hogy a folt a kifejlesztőszer fölé kerüljön. A kamrát lefedjük és 19 cm fronttávolságig fejlesztjük ki. Ekkor a lemezt kiemeljük és levegőn szárítjuk. 14

A kifejlesztést követően a VRK lemezt a radio-tlc szkennerre helyezzük, ügyelve a megfelelő pozícionálásra. A szkennelés során az alábbi paramétereket állítjuk be: Counting time: 3 min. Max. Counts: 0. Scan range: 0-100 mm. Energy range: 30-750 kev. Binning faktor: 2. Origin: 15 mm. Solvent front: 95 mm. A kapott kromatogramokat a GINA-Star TLC szoftverrel értékeljük ki. A mintában lévő radioaktív komponensek százalékos arányának pontos meghatározása végett a [ 18 F]FDG-hez tartozó csúcs kiértékelésénél a DD, a 18 F és az TA-[ 18 F]FDG csúcsok esetében pedig a BB integrálási módot válasszuk! A ROI-k meghatározása után a kromatogramot a csúcstáblázattal együtt nyomtatjuk ki vizsgálati jelentés formájában, amely tartalmazza a ROI nevét, területét és relatív százalékos terület arányát, amely megadja a minta radiokémiai tisztaságát. Retenciós faktorok: R/F Komponens Jelölés R/F = (-0,1) 0,1 [ 18 F]-fluorid 18 F R/F = 0,3 0,4 2-[ 18 F]fluor-2-dezoxi-D-glükóz [ 18 F]FDG R/F = 0,5 0,6 A 2-[ 18 F]fluor-2-dezoxi-D-glükóz és TA-[ 18 F]FDG Követelmények A vizsgálati minta radiokémiai tisztasága 5%-os pontossággal fogadható el. Magyarázzuk meg az állófázis természetének, a mozgófázis összetételének és a radioaktív vegyületek kémiai tulajdonságai ismeretében a komponensek kromatográfiás viselkedését! 5. Kérdések önálló felkészüléshez A PET elve A [ 18 F]FDG szintézise és minőségellenőrzése a DEOEC NMI-ben A TLC vizsgálat kivitelezése Minőségi és mennyiségi analízis TLC-vel Radioaktív izotóppal jelzett hatóanyag azonosítása TLC-vel 15

6. Felhasznált és ajánlott irodalom [1] http://en.wikipedia.org/wiki/pet [2] Dr. Lázár István: Nagynyomású folyadékkromatográfia (Elválasztástechnika segédanyag) [3] Oláh Zita, Dóczi Rita: A vékonyréteg kromatográfia alkalmazása a minőségellenőrzésben és az orvosi izotópgyártásban.hallgatói gyakorlat mérési útmutatója. BMGE, 2011. 16