Lumineszcencia spektrometria összefoglaló Ismétlés: fény (elektromágneses sugárzás) elnyelés: abszorpció elektron gerjesztés: excitáció alap és gerjesztett állapot atomi energiaszintek, energiaszintek energia különbsége, foton energia, rezonancia feltétel elektromos, vibrációs, rotációs energiaszintek és azok függetlensége Jablonsky diagram (termséma) szinglet és triplet állapot, multiplicitás Lumineszcencia jelensége: lumineszcencia típusok gerjesztés típusa szerint fluorofór = fluoreszcens molekula / jelölő jelenségek összekapcsolása: abszorpció emisszió, gerjesztés visszagerjesztés (excitáció deexcitáció), foton és elektron kölcsönhatása gerjesztés és emisszió jelenségének értelmezése a Jablonsky diagram segítségével, spontán emisszió tulajdonságai időbeliség, koherencia irány, divergencia hullámhossz polarizáltság Lumineszcencia típusok triplet és szinglet állapotok szerint: fluoreszcencia és foszforeszcencia összehasonlítása S 1 S 0 és T 1 S 0 átmenet, spinátfordulás, tiltott és engedélyezett átmenetek időbeliség, átlagos élettartam foton energia, emissziós spektrumok az elektromágneses spektrumon
Lumineszcencia típusok értelmezése a Jablonski diagram segítségével Kasha szabály sugárzásos és nem sugárzásos átmenetek tükör szimmetria, Stokes féle eltolódás (vörös eltolódás) fluoreszcencia átlagélettartam, kvantumhatásfok polarizáció, polarizált fény, abszorpciós és elektromos vektor, fotoszelekció jelensége Fluorofórok: intrinsic és extrinsic fluorofórok fluoreszcencia (és fluorofórok) alkalmazási lehetőségei Lumineszcencia spektroszkópia fluoriméter: egységek és geometria: fényforrás, monokromátor(ok), minta, detektor (PMT), adatgyűjtő és kiértékelő egység (PC) működési elv: merőleges elrendezés, gerjesztési és emissziós ág
Lumineszcencia spektroszkópia Elektron+vibrációs+rotációs-spektroszkópia alapjai Fizika-Biofizika II. szemeszter 2012. február Orbán József PTE ÁOK Biofizikai Intézet Kengurupatkány vese epitéliumsejt mitotikus osztódása DNS Mikrotubulus Mitokondrium forrás: http://micro.magnet.fsu.edu/cells/fluorescencemitosis/index.html3 1
Lumineszcencia tulajdonságok Szinglet/triplet állapot Energetika Időbeliség, koherencia Irány (divergencia) Polarizáltság 0 Szinglet és triplet állapot (molekulák) Eredő spin? s =S=? = Multiplicitás: =2S+1 2 S+1 Energia h S = 0 M = 1 S = 1 M = 3 S 1 T 1 Abszorpció S 0 Pauli elvnek megfelel engedélyezett átmenet S 0 Pauli elvnek ellentmond tiltott átmenet 2
Molekula orbitál elmélet Hidrogén H 2 1 p +, 1 e - 1s energia H atom H gáz (H 2 ) Eredő spin? s = S =? H atom s: bonding molecular orbital s*: antibonding molecular orbital Molekula orbitál elmélet Hélium He 2 2 e - He molekula l (He 2 ) He atom He atom 1s energia Eredő spin? s = S =? 3
Oxo-/karbonil csoport >C=O energia Molekula orbitál elmélet C atom C, O kettős kötés Eredő spin? s = S = 0 Multiplicitás: M = 2S+1 n O atom Molekula orbitál elmélet energia C atom Nincs eredő spin változás! n O atom LUMO: Lowest unoccupied MO (legalacsonyabb betöltetlen MO) HOMO: Highest occupied MO (legmagasabb betöltött MO) n n 4
Jablonsky-féle termséma molekuláris rendszerre 0 Energia h 1. Excitáció (gerjesztés) S 2 Abszorpció (elnyelés) Energiafelvétel közben az e - egyik szintről a másikra jut. Fotont nyel el a rendszer. S 1 Abszorpció Emisszió h S 0 2. De-excitáció Emisszió (kibocsátás) Energialeadás közben az e - egyik szintről a másikra jut. Fotont bocsát ki a rendszer. A lumineszcencia típusai A gerjesztés módja szerint: EM sugárzás elnyelése kémiai reakció termikusan aktivált ion rekombináció töltés által indukált nagy energiájú részecske v. sugárzás mechanikai (súrlódás) hanghullámok fotolumineszcencia kemi-, biolumineszcencia termolumineszcencia elektrolumineszcencia radiolumineszcencia tribolumineszcencia sonolumineszcencia A gerjesztett állapot szerint: szinglet állapot triplet állapot fluoreszcencia foszforeszcencia A termolumineszcencia nem azonos a (fekete test) hősugárzással! 5
Milyen időskálán zajlanak a folyamatok? gerjesztés Fluoreszcencia 10-9 s Foszforeszcencia 10-3 s 10-15 s alapállapot relaxáció gerjesztett állapot fluoreszcencia kioltás, FRET Belső átalakulás (Internal conversion, hő) Abszorpció (t ~ 10-15 s) S 0 S n Sugárzásos (radiatív) átmenetek Lumineszcencia S 2 szinglet IC VR triplet T 2 Fluoreszcencia (F) S 1 S 0 Foszforeszcencia (P) T 1 S 0 Sugárzás nélküli (nonradiatív) átmenetek: Belső konverzió (IC) S 1 IC VR ISC VR ISC IC A T T 1 Intersystem crossing (ISC) Vibrációs relaxáció (VR) A S F IC P IC A X VR S 0 Kasha-szabály (kivéve foszforeszcencia esete): minden radiatív lecsengés csakis az első gerjesztett állapot (S 1 ) legalsó vibrációs szintjéről indulhat (földi körülmények között). 6
Jabłonsky-féle termséma molekuláris rendszerre 0 Energia h 1. Excitáció (gerjesztés) S 2 Abszorpció (elnyelés) Energiafelvétel közben az e - egyik szintről a másikra jut. Fotont nyel el a rendszer. S 1 Abszorpció Emisszió h S 0 2. De-excitáció Emisszió (kibocsátás) Energialeadás közben az e - egyik szintről a másikra jut. Fotont bocsát ki a rendszer. SPONTÁN EMISSZIÓ! Jabłonsky-féle termséma molekuláris rendszerre 0 Energia h S 2 S 1 Abszorpció Emisszió h IC: internal conversion Belső átrendeződés VR: vibrációs relaxáció Termikus relaxáció ISC: intersystem crossing Rendszerek közti átmenet T 1 S 0 fluoreszcencia foszforeszcencia 7
FLUORESZCENCIA Gerjesztés Termikus relaxáció (Kasha-szabály) Emisszió S 1 -S 0 átmenet: szinglet-szinglet nincs spinátfordulás t = 10-9 s (ns) Reakcióséma S 0 + h S 1 S 1 S 0 + h fluor FOSZFORESZCENCIA Gerjesztés Termikus relaxáció Intersystem crossing (S-T) Termikus relaxáció Emisszió T 1 -S 0 átmenet: triplet-szinglet spinátfordulással (!) t = 10-6 10 s (µs s) S 0+ h T 1 T 1 S 0 + h foszf Emisszió típusok tulajdonságai Indukált A beérkező fotonnal Egy időben (azonnal) koherens Egyező irányban (kis divergencia) Azonos hullámhossz monokromatikus Spontán (a foton abszorpcióhoz képest) Időben késleltetve nem koherens Minden irányban (3D) nem azonos nem monokrom. Kisebb energiájú 8
Fluoreszcencia spektrum: tükörszimmetria, Stokes féle eltolódás () Int. f : 10-9 10-6 s p : 10-6 10 s absz. gerj. fluor. foszfor. Fluoreszcencia spektrum: tükörszimmetria, Stokes féle eltolódás 9
Tükörszimmetria oka Source: http://www.olympusfluoview.com/theory/fluoroexciteemit.html Fluoreszcencia élettartam () A molekula gerjesztett állapotból fotonemisszióval kerül vissza alapállapotba. A fluoreszcencia-élettartam az az idő, amely alatt a gerjesztett állapotban levő molekulák száma az e-ed részére csökken. τ= 1 / (k f + k ic + k isc )= 1 / (kf + knr ) ns-os tartomány ahol k nr = k ic + k isc kf - a fluoreszcencia-átmenet valószínűsége ic - internal conversion (belső konverzió) isc - intersystem crossing (rendszerek közti átmenet) nr - nonradiativ (sugárzás nélküli átmenet) 10
Fluoreszcencia kvantumhatásfok Q = N emit. / N abs. < 1 Q = k f / (k f + k ic + k isc )= k f Polarizált fény, abszorpciós vektor, elektromos vektor Elektromos dipolmomentum Elektromágneses hullám elektromos térerősség vektora, rezgési sík 11
Síkban ill. lineárisan polarizált fény Az animáció egy függőleges síkban polarizált hullámot mutat be. A metszősíkot szemből nézve az alábbi kép tárul elénk: Ha az elektromos térerősség vektora a tér valamely, a fénysugár vonalában lévő, rögzített pontjában egy egyenes mentén rezeg, akkor síkban vagy lineárisan polarizált hullámról beszélünk. http://esr.elte.hu/~noemi/labor/cd/demo0.html Az alábbi animáció egy vízszintes síkban polarizált hullámot mutat be. A metszősíkot szemből nézve http://esr.elte.hu/~noemi/labor/cd/demo0.html 12
Elektromos és abszorbciós vektorok forgáskúp!!! Elektromos térerősség vektor Abszorbciós vektor meghatározza az abszorbció valószínűségét A kúpon belüli abszorpciós vektor esetén a fluorofor gerjesztésének valőszínűsége nagyobb, mint 50%. (függőleges polariáció esetén) Abszorpció maximális, ha az abszorpciós vektor és a fény elektromos térerősség vektora párhuzamos. Abszorpció képessége függ cos 2 θ-tól (θ az absz. vektor és a fény elektromos térerősség vektora közötti szög). Fotoszelekció Véletlenszerű, izotróp eloszlás polarizálatlan fény Anizotróp eloszlás fluoroforok random orientációjú populációja izotróp: irányfüggetlen Minden irányban azonos. vertikálisan polarizált fény fotoszelekció = rendezett orientációjú szubpopuláció szelektálódik 13
Fluorofórok Ismétlés: Fehérjék abszorpciója - aminosavak A három fontos aminosav, amelyek UV-ban abszorbeálnak, azaz gerjeszthetők. extinkció hullámhossz 14
Fluorofórok fluoreszcenciára alkalmas kémiai anyagok 1. Intrinsic, natív (belső) fluorofórok Fehérjékben: aromás aminosavak Előny: Nem kell módosítani a vizsgált biológiai rendszert. Élő sejtek saját fluoreszcenciája Aequorea victoria GFP (green fluorescent protein) szalagdiagrammja 15
Kémiai módosításokkal egy alapvegyület abszorpciója és emissziója hangolható! 2. Extrinsic (külső) fluorofórok - fluoreszcens festékek A jelölő kémiai anyagok minősége és elhelyezkedése tervezhető. A fluorofórokat specifikus kötőhelyekhez köthetjük. (pl.: cisztein, glutamin, lizin) A fehérje aktivitását tesztelni kell. IAF IAEDANS PIRÉN példák: IAEDANS-IAF: FRET donor-akceptor pár Pirén: aktin polimerizáció fluoreszcein, dansyl, rhodamine száramzékok... Aktin monomer szalagdiagramja 16
Kémiai háttér Könnyű gerjeszteni az elektronokat, ha Aromás gyűrűben, vagy Konjugált kettős kötésű rendszerben találhatók. R Minél több kettős kötés van a molekulában, annál kisebb energia kell a gerjesztéshez! Hangolható, tervezhető! Külső (extrinsic) fluorofór alkalmazásakor: fluorofór makromolekula A kromofór (fluorofór) lokális mozgása elkülöníthető a molekula egészének mozgásától. Térszerkezeti változás a makromolekulában hat a kromofór mozgására is. Ez a változás mérhető. 17
Fluoreszcencia alkalmazási lehetőségei Jól detektálható jel (alacsony koncentrációjú minták esetén is). A fluoreszcencia paraméterek érzékenyek a környezeti tényezők megváltozására. A molekuláris szintű vizsgálatok fontos eszköze Szerkezeti és dinamikai információt ad a vizsgált rendszerről. Biológiai rendszerek vizsgálata (nem károsítjuk a vizsgálandó rendszert). Molekulák közötti és molekulán belüli kölcsönhatások tanulmányozása. Molekuláris mozgások vizsgálata (polarizáció, anizotrópia). Molekuláris szintű távolságmérés (FRET). Molekulák rugalmasságának jellemzése (FRET). Molekula szerkezeti részleteinek, és az egyes csoportok elérhetőségének feltérképezése (quenching). További alkalmazások: Szerkezeti tulajdonságok vizsgálata Fehérje denaturáció nyomonkövetése Protein-ligand kapcsolat vizsgálata Szerkezet vizsgálata a környezeti paraméterek (ph, ionok) változásának függvényében Dinamikus tulajdonságok vizsgálata Membránhoz kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a membrán belsejében lévő viszkozitásról Fehérjékhez kötött fluorofórok anizotrópiája informálhat a fehérjemátrix flexibilitásáról 18
Mikroszkópia fluoreszcens jelöléssel Aktin filamentum Mikrotubulus DNS Hogyan mérjük a fluoreszcenciát? Egy fluoriméter működésének elméleti sémája fényforrás gerjesztési monokromátor Minta Fény (gerjesztés) Fény (emisszió) Elektromos jel emissziós monokromátor Detektor Kiértékelés (PC) 19
Fluoreszcencia mérése spektrofluoriméter steady state Fényforrás Lámpa lézer Detektor Polarizátorok / Szűrők Gerjesztési monokromátor (λ gerjesztési ) Minta küvetta Emissziós monokromátor (λ emissziós ) A fluoreszcencia élettartam Fluoreszcencia lecsengési görbe A fluorofórok sajátsága, jele: 20
Fázis fluorimetria Intenzitás Idő (ns) Fény-anyag kölcsönhatás: hullámhossz - energiaszintek 21