In Situ Hibridizáció a pathologiai diagnosztikában és ami mögötte van. Kneif Józsefné PTE KK Pathologiai Intézet Budapest 2017. 05. 26
Kromoszóma rendellenesség kimutatás PCR technika: izolált nukleinsavak (RNS, DNS), morfológia nélkül Konvenciónális citogenetika: metafázis tenyésztés, kromoszóma preparátum In situ hibridizáció (ISH): gén lokalizációja, aktivításának feltérképezése Interfázis citogenetika (IPC): interfázisban lévő sejtek in situ hibridizációval történő vizsgálata
ISH-IPC alkalmazása, diagnosztikai jelentősége Számbeli kromoszóma eltérések azonosítása Diploid Pszeudodiploid Aneuploid hiperdiploid hipodiploid Strukturális kromoszóma rendellenességek kimutatása Deléció Inszerció Inverzió Transzlokáció Diagnózis megerősítése Genotípus szerinti identifikálás Szubtípusba való besorolás Prognosztikai és terápiás faktor Reziduális betegség nyomonkövetése
In Situ Hibridizáció elve Komplementaritás másodlagos kötések (H-híd kötés) Denaturáció kötések felszakíthatók hővel, kémiai anyagok Renaturáció eredeti szerkezet visszaalakulása
Olvadási hőmérséklet Tm=81,5+0,41x(%GC)+16,6log(Na + )-0,63x (%formamid)- (300+2000X(Na + )/d %GC= guanin+citozin arány (Na + )= nátrium ion molaritása (%formamid=formamid %-os aránya d= kettösszálú DNS fragmenthossza
Hibridizációt befolyásoló tényezők Hőmérséklet Formamid koncentráció Monovalens kation (Na + ) DNS fragmentumok hossza ph Próba koncentráció Dextrán-szulfát Bázispár mismatch
Alkalmazott DNS próbák lokalizációja
ISH általános metodikája Preparátum készítés Fixálás - p.vér, cs.velői sejtek, lenyomati preparátum, fagyasztott metszet, formalim fixált paraffinos blokkból metszet - struktúra rögzítés (70% EtOH, Carnoy, formalin)
Paraffinos metszet készítés trunkációs effektus A hibridizálás vastag metszeten történik, a kiértékelés konfokális pásztázó lézermikroszkóppal Paraffinos blokkból magszuszpenzió, majd citológiai preparátum készül Részleges információ vesztés, morfológia megtartása
ISH általános metodikája Preparátum készítés Fixálás Előkezelés - p.vér, cs.velői sejtek, lenyomati preparátum, fagyasztott metszet, formalim fixált paraffinos blokkból metszet - struktúra rögzítés (70% EtOH, Carnoy, formalin) - proteáz emésztés (Proteináz K, pepszin, mikrohullám, vízfürdő)
DNS szerkezete
ISH általános metodikája Preparátum készítés Fixálás Előkezelés Denaturálás Hibridizálás Poszthibridizációs mosás - p.vér, cs.velői sejtek, lenyomati preparátum, fagyasztott metszet, formalim fixált paraffinos blokkból metszet - struktúra rögzítés (70% EtOH, Carnoy, formalin) - proteáz emésztés (Proteináz K, pepszin, mikrohullám), feltárás - 75-95 C közt - 37-45 C közt, 4-16 órán keresztül - háttérzaj csökkentése, aspecifikus kötődések eltávolítása
Tm=81,5+0,41x(%GC)+16,6log(Na + )-0,63x (%formamid)- (300+2000X(Na + )/d %GC= guanin+citozin arány (Na + )= nátrium ion molaritása (%formamid=formamid %-os aránya d= kettösszálú DNS fragmenthossza
ISH általános metodikája Preparátum készítés Fixálás Előkezelés Denaturálás Hibridizálás - p.vér, cs.velői sejtek, lenyomati preparátum, paraffinos blokk, metszet - struktúra rögzítés (70% EtOH, Carnoy, formalin) -proteáz emésztés (Proteináz K, pepszin, mikrohullám) - 75-95 C közt - 37-45 C közt, 4-16 órán keresztül Poszthibridizációs mosás - háttérzaj csökkentése, aspecifikus kötődések eltávolítása Hibridek láthatóvá tétele direkt jelölt próba indirekt jelölt nukleotidok Mikroszkópia - fluoreszcens - izotóppal - fluorokrommal, - enzimmel - fény-, vagy fluoreszcens
Számbeli kromoszóma eltérések vizsgálata Centromer-specifikus Diploid Pszeudodiploid Aneuploid hiperdiploid hipodiploid FITC, Rhodamin, Gold, Aqua Ismétlődő szekvenciákhoz kapcsolódó próbák alkalmazása
Lókusz-specifikus próbák Egyedi szekvenciákhoz kapcsolódnak. Alkalmazás: strukturális eltérések kimutatásához Amplifikáció Deléció Inverzió Transzlokáció
Transzlokáció jelenlétének kimutatása
Értékelés
FISH Kromoszóma preparátumon. G-sávozás t(8;21)
ISH alkalmazások CEP-t(BCR-ABL) transzlokáció Biotinnal jelölt próba SABC-PO DAB
ISH Formalin fixált paraffinos metszeten
ISH Formalin fixált paraffinos metszeten
Vírus kimutatás in situ hibridizációval Epstein-Barr vírus - (EBER) Humán papillóma vírus (HPV)
Összefoglalás ISH-IPC kromoszóma rendellenesség kimutatására alkalmas rutindiagnosztikai vizsgáló módszer. Célkérdésekre ad választ. Az ISH metodika során bizonyos lépések egyedi beállítást igényelnek. A módszert befolyásoló paraméterek változtatásával lehetőség adódik a patológiában előforduló különböző típusú minták vizsgálatára. Az így kimutatott citogenetikai eltéréseknek a klinikai gyakorlat számára diagnosztikai, prognosztikai és terápiás jelentőséggel bírnak.
Köszönöm a figyelmet!