Agrobacterium rezisztencia térképezése szőlőben

Agrobacterium rezisztencia térképezése szőlőben DIPLOMAMUNKA Készítette: HORVÁTH SZABINA Biológus MSc szakos hallgató Témavezetők: KUCZMOG ANETT, Dr. PUTNOKY PÉTER PTE TTK Biológia Intézet Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék Pécs, 2011.

2 Tartalomjegyzék 1. Bevezetés... 3 2. Irodalmi áttekintés... 4 2.1. Agrobacterium, mint kórokozó... 4 2.2. Az Agrobacterium által indukált tumorképződés... 4 2.3. A szőlő Agrobacterium-os golyvásodása... 6 2.4. Genetikai térképek... 7 2.5. DNS markerek a genetikai térképezésben... 8 2.5.1. RAPD markerek... 9 2.5.2. SCAR markerek... 9 2.5.3. A mikroszatellita vagy SSR markerek... 10 2.5.3.1. SSR markerek szőlőben... 10 2.6. Szőlő genetikai térképek és a genomszekvencia... 11 3. A munka előzményei... 13 3.1. Az utódpopuláció előállítása... 13 3.2. Az utódpopuláció jellemzése... 13 3.3. Rezisztenciához kapcsolt markerek keresése... 14 4. Célkitűzések... 16 5. Alkalmazott anyagok és módszerek... 17 5.1. Szőlő DNS izolálása... 17 5.2. Polimeráz láncreakció... 17 5.3. Agaróz gélelektroforézis... 18 5.4. Fragment izolálás... 18 5.5. DNS ligálás, transzformálás... 19 5.6. Plazmid DNS izolálás... 19 5.7. DNS szekvencia meghatározás és értékelés... 20 5.8. Primerek tervezése... 20 6. Eredmények és megvitatásuk... 22 6.1. OPQ-15 RAPD marker jellemzése... 22 6.2. A VVIV67 mikroszatellita marker is kapcsolt a rezisztenciához... 23 6.3. Célzott polimorfizmus keresés a 15. kromoszóma mentén... 24 6.4. Az 1M6igr PCR fragmentek szekvenciájának elemzése... 26 6.5. Az 1M6igr marker kapcsolt az Agr1 lokusszal... 28 6.6. További SCAR markerek azonosítása a 15. kromoszómán... 29 6.7. Következtetések és jövőbeni munkák... 31 7. Összefoglalás... 33 8. Irodalomjegyzék... 35 9. Köszönetnyilvánítás... 40 10. Függelék... 41

3 1. Bevezetés Munkánk hosszú távú célja egy Agrobacterium rezisztenciát meghatározó Vitis amurensis gén térképezése, izolálása és a rezisztencia molekuláris biológiai hátterének feltárása. Ezzel az alapkutatás és a gyakorlat szempontjából egyaránt fontos ismeretekre tehetünk szert, hiszen az eredmények az Agrobacterium fertőzés, a T-DNS bejutásának érdekes részleteire világíthatnak rá, másrészt lehetővé tehetik ellenálló szőlőfajták és talán más mezőgazdasági szempontból fontos növények létrehozását. A szőlő (Vitis sp.) ma is a legfontosabb, széles körben termesztett gyümölcsfajok egyike a világon. Sajnos igen sok betegségre fogékony, így az Agrobacterium által okozott gyökérgolyvásodásra is. A betegség Magyarországon dokumentálhatóan az 1960-as évektől kezdve rendszeresen fellép (LEHOCZKY, 1968; SÜLE, 1978), és súlyos károkat okoz. Hazánkon kívül is szinte mindenütt előfordul, ahol szőlőt termesztenek. A betegség ellen, szisztematikus jellege miatt hagyományos (kémiai) úton nem lehet védekezni, és annak ellenére, hogy a fertőzés molekuláris vonatkozásai már alapjaiban ismertek, mind a mai napig nem tudunk hatásosan védekezni. A környezetvédelem szempontjait is figyelembe véve, a legkézenfekvőbb, hosszú távú megoldást a betegséggel szemben ellenálló fajták létrehozása jelentené.

4 2. Irodalmi áttekintés 2. 1. Az Agrobacterium, mint kórokozó A golyvásodás bakteriális hátterét, eredetét Smith és Townsend írták le először 1907- ben, és tőlük származik a baktérium elnevezése és ismertetése. A patogén ma is használatos nevét [Agrobacterium tumefaciens (Smith et Townsend)Conn] többszöri változtatás után, 1942-ben kapta meg (ALLEN AND HOLDING, 1974). Az Agrobacterium-ok a Rhizobiaceae családba tartozó, talajban élő Gram-negatív, spórát nem képző, aerob mikroorganizmusok. A nemzetségbe patogén (A. tumefaciens, A. vitis, A. rhizogenes, A. rubi) és nem patogén (A. radiobacter) fajok is tartoznak. A baktériumok gazdanövényköre rendkívül széles, a nyitvatermők és a kétszikűek mintegy 60 %-án képesek tumort indukálni (DECLEENE AND DELEY, 1976). Az A. rhizogenes főleg az almatermésű gyümölcsfajokon idéz elő gyökérburjánzást, az A. rubi a Rubus fajokon, az A. vitis pedig a szőlőn okoz vesszőgolyvát (FOLK AND GLITS, 1993). Az általuk képzett tumorok mérete és morfológiája függ a gazdanövény és a baktérium fajtájától, valamint a tumorok pozíciójától. A fertőzési folyamat a növény és a baktérium közötti jelzések és kapcsolatok során jön létre, melynek eredményeként a növényen tumorok fejlődnek ki. A baktériumos fertőzés általában a földfelszínhez közeli növényrészeken (pl. gyökérnyak) következik be, ahol a szél vagy mechanikai sérülések következtében sebek alakulnak ki. 2. 2. Az Agrobacterium által indukált tumorképződés Az Agrobacterium fajok egyedülállóan rendelkeznek azzal a képességgel, hogy a növényi genomba géneket juttassanak be. A baktériumok tehát képesek transzformálni és speciális tápanyagok (opinok) szintézisére kényszeríteni a növénysejteket, amelyeket aztán a baktérium szén- és nitrogénforrásként használhat. A patogén Agrobacterium törzsek egy nagyméretű (180-260 kb) plazmidot tartalmaznak. Ez felelős az opin szintézisért és a tumor képződésért, ezért nevük tumor indukáló plazmid vagy Ti-plazmid (ZAENEN ET AL., 1974). A patogenitás meghatározásában kromoszómális, és plazmid kódolt gének egyaránt szerepet játszanak. A kromoszómális virulencia gének a baktériumnak a növényi sejtfalhoz való kötődését segítik elő, míg a szintén kromoszómálisan kódolt kataláz termeléssel a baktérium a növényi védekezés során keletkező hidrogén-peroxidot bontja le. A Ti-plazmidok

5 virulencia (vir) géneket tartalmaznak, amelyek az ugyanezen a plazmidon lévő onkogének és opin gének átviteléért felelősek (KADO, 1991). Transfer DNS-nek (T-DNS) nevezzük a Ti-plazmidnak azt a szakaszát, amely képes a növényi sejtbe átjutni, és ott a genomba beépülni. Ez a szakasz hozzávetőlegesen 21-23 kilóbázis nagyságú, és két rövid, 25 bázispár hosszúságú ismétlődő határszekvencia (left border: LB, right border: RB) veszi körül. A transzport folyamatban a baktérium kromoszómán (chva, chvb és chve) és a Ti-plazmidon (vira-virh) lévő virulencia géneknek van meghatározó szerepe (1. ábra). A chv gének folyamatosan, úgynevezett konstitutív módon nyilvánulnak meg és termékeik a baktérium növényi sejtfalhoz való tapadását okozzák (MATTHYSSE ET AL., 2000), míg a vir gének expressziója viszont szigorúan szabályozott, és aktiválódásuk indítja el a T-DNS átviteli mechanizmusát. A növényi sebzés során keletkező monoszacharidok és fenolvegyületek (pl.: acetosziringon), melyek a sebzéskor védekező céllal képződnek a növényben, az agrobaktérium sejtben beindítják a növényi sejt transzformációjához vezető folyamatokat. Mindkét vegyületcsoport serkenti a Ti-plazmidon található 8 vir gén (vira-h) expresszióját. Az így létrejött vir-indukció során termelődő VirD1 protein a T-DNS jobb oldali határszakaszánál bemetszi ( nick ) a Ti-plazmidot. Ezt követően az egyszálú T-DNS 5 - végéhez kovalensen kapcsolódni fog a VirD2 protein, kialakítva a T-DNS/VirD2 komplexet (T-szál), ami a VirB/D4 fehérjék által formált csatornán átjut a növényi sejtbe (1. ábra). A T-szálon kívül ezen a transzportrendszeren keresztül mennek át a növényi sejtbe a kórfolyamat szempontjából fontos, egyéb baktériális eredetű Vir-proteinek is, mint például a VirE2 és a VirF (GELVIN, 2003). A T-komplex sejtmagi lokalizációs szignált is tartalmaz, ami megkönnyíti a magpóruson való áthaladást. Az egyszálú T-DNS illegitim rekombinációval random beépül a növényi sejtmagi genomba, elsősorban a transzkripcionálisan aktív szakaszokba, így a rajta levő gének az eukarióta tulajdonságaik miatt átíródnak és expresszálódnak, valamint öröklődnek. A növényi sejt transzformációja kettő, a T-DNS onko- és opingénjei által meghatározott, élettani változást okoz. A tumorszövet kialakításában szerepet játszó gének növényi növekedési hormonok bioszintéziséért felelős fehérjéket kódolnak. Túltermelésük felborítja a normális növényi sejtosztódási folyamatokat, és tumoros növekedést indít el. Az egyik ilyen hormon az auxin (indol-3-ecetsav), melynek bioszintéziséért az iaam és az iaah gének által kódolt enzimek, a triptofán-monooxigenáz és az indolacetamid-hidroláz a

6 felelős. A másik hormon a citokinin, amelynek képződését az ipt gén által kódolt AMPizopentenil transzferáz enzim irányítja. 1. ábra: A fertőzés folyamata (VELICH, 2001). (1) A növényi sejtből sebzés hatására felszabaduló fenol- és cukorszármazékok aktiválják a ChvE és VirA proteineket, melyek a VirG proteinnel alkotott két-komponensű rendszer aktiválásával elindítják a (2) vir-indukciót. A VirD1/D2 és a T-DNS által alkotott T- komplex átkerül a növényi sejtbe a VirB/VirD4 fehérjék által formált csatornán (3) és a függetlenül átjutott fehérjék (VirE, VirF) segítségével integrálódik a növényi genomba (4). Eredménye a hormon és az opin szintézis lesz. A másik élettani változás, hogy a baktérium specifikus aminosav származékokat, ún. opinokat termeltet a fertőzött növénnyel, és ezáltal kedvező ökológiai környezet alakít ki (ESCOBAR AND DANDEKAR, 2003). Az opinok általában egy aminosav és egy szerves sav, vagy egy aminosav és egy cukor összekapcsolódásával keletkeznek. A különböző Agrobacterium törzsek csak az általuk felhasználható opinokat termeltetik a növénnyel, szén és nitrogénforrásként hasznosítják őket, és ezzel kizárólag saját fennmaradásukat segítik elő (DESSAUX ET AL., 1993). 2. 3. A szőlő Agrobacterium-os golyvásodása A szőlő golyvás betegségéért felelős A. vitist a fertőzött ültetvényekben már minden kontinensen kimutatták (SZEGEDI, 2007). A vesszőgolyva a magas művelésű ültetvényeken súlyos terméskiesést okozhat.

7 A tünetek a fás részeken (pl.: törzsön, kordonkaron, egy éves termőcsapokon) fordulnak elő. A fiatal zöld hajtásokon a tünetek nem jelennek meg, annak ellenére, hogy a hajtásválogatás kedvez a tumorok kialakulásának. A beteg növények gyengén fejlődnek, levélzetük sárgászöld vagy vöröses, a levelek esetenként kanalasodók. A talaj feletti részeken egyenetlen felületű, karfiolra emlékeztető tumorok láthatók. A törzsön vagy kordonkaron a tumorok általában hosszirányban fejlődnek ki, és gyakran teljesen körülölelik a megtámadott részt. A baktérium az osztódásra és differenciálódásra képes kambiális sejteket alakítja át tumorsejtekké, így a sejtburjánzás következtében az edénynyaláb rendszer elveszíti funkcióját, ami a tőke gyengüléséhez, súlyosabb esetben a tőke pusztulásához vezethet. A betegség két szakaszra osztható. Az elsőben megkezdődik a baktérium felszaporodása a növényben, majd az aktív növekedés ideje alatt okozott valamilyen sérülés hatására megindul a tumorképződés. Ilyen sérülések kialakulásához vezethet a téli fagyhatás vagy tavasszal, a nedvkeringés megindulásakor kialakuló megemelkedett turgornyomás a xylemben. A betegség második szakasza a nedvkeringés megindulása utáni időszakra tehető, amikor a szőlő különösen fagyérzékeny, s a hirtelen lehűlés komoly károkat okozhat. A fertőzés szisztematikusan elterjed a szőlőben, mivel a baktérium a phloemban és a xylemben egyaránt terjed, ezért a növény tünetmentes, egészséges részeiben is bárhol előfordulhat (SZEGEDI, 2007). 2. 4. Genetikai térképek Az első genetikai térképezési munkák a 20. század elején készültek el. A kromoszómán a gének lineáris sorrendben, lokuszokban helyezkednek el. A genetikai térképezésnek két fő célja van. Egyrészt annak a sorrendnek a meghatározása, ahogy a gének egymáshoz viszonyítva elhelyezkednek, valamint a gének közötti relatív távolság (géntávolság) megállapítása. A távolság egysége, annak a kifejezése, hogy a keresztezésben szereplő gének között milyen gyakran jön létre rekombináció. Egy egységnyi térképtávolság (centimorgan, cm) 1 %-os rekombinációs gyakoriságnak felel meg. Ezt a genetikai távolságot nem lehet pontosan átfordítani fizikai (bázispárban mért) távolságra, az egyes régiókban ritkábban, máshol gyakrabban bekövetkező rekombináció miatt, ráadásul függ a genom méretétől is. A genom térképek pontjai kezdetben látható fenotípusos markerek, mutációk voltak. Ezek a génekben bekövetkezett mutációk csak korlátozott számban álltak rendelkezésre, és egy genotípusban nem lehetett hibás gének nagy számát felhalmozni, mert a mutációk

8 erősen befolyásolták az egyed életképességét. Így a kisszámú térképponttal nem tudták az összes kromoszómát lefedni. Ráadásul a klasszikus térképezésben használható kisebb mutánspark kialakítása is sok időt és fáradságot vesz igénybe. A molekuláris genetika fejlődésével a fenotípusos markereket felváltották a molekuláris markerek, melyeket szinte korlátlan számban lehet találni és nem érintik egy egyed életképességét. Az egy kromoszómán elhelyezkedő markerek egy kapcsoltsági csoportot (linkage group, LG) alkotnak. A markerek lineáris sorrendje a közöttük levő távolság alapján határozható meg két-, három-, vagy multipontos becsléssel (RITTER ET AL., 1990). Szőlőnél a Grattapaglia és Sederoff (GRATTAPAGLIA AND SEDEROFF, 1994) által leírt kétszeres pseudotestcross térképezési stratégiával dolgoznak. Egy ilyen populáció esetében az egyik szülő heterozigóta, a másik recesszív homozigóta egy-egy tulajdonságra nézve (LODHI ET AL., 1995). A kapcsoltsági analízis során először a szülői térképeket kell elkészíteni, majd a kodomináns, vagy mindkét szülőben heterozigóta markerek segítségével létrehozható a konszenzus térkép. Mára az összes gazdaságilag jelentős növényfajnál elkészült egy vagy több genetikai térkép. Annak valószínűsége, hogy kapcsolt markert találunk egy génhez, fordítottan arányos a gén és a marker távolságával. Egy teljes genetikai térkép elkészítésénél arra kell törekedni, hogy a markerekkel minél egyenletesebben és sűrűbben lefedett térképet hozzunk létre, ami így alkalmas lesz bármely térképezendő tulajdonság (gén) helyzetének utólagos és pontos meghatározására. 2. 5. DNS markerek a genetikai térképezésben A térképezés genetikai markerek segítségével történik. A genetikai markerek különböző tulajdonságokat meghatározó változatok (allélok), amelyek megkülönböztethetők egymástól a klasszikus értelemben vett fenotípus (morfológia, fiziológia) vagy molekuláris szinten, a fehérjék vagy a DNS jellemzésével. Tanksley (TANKSLEY AND ORTON, 1983) molekuláris markereknek nevezte el azokat a markereket, amelyek fehérje és/vagy DNSszinten különböztetik meg az egyes alléleket egymástól. Ezen változatok jelenléte általában nem okoz az egyed szintjén észrevehető fenotípusos változást, a legtöbb DNS marker nem is géneken belüli különbségeket jelez, ezért az ilyen allélek közötti eltérést polimorfizmusnak nevezzük. A DNS-szintű markerek alkalmazását a Southern-blot technika, az ezen alapuló RFLP módszer, majd a polimeráz láncreakció (polimerase chain reaction, PCR) kidolgozása tette lehetővé.

9 2. 5. 1. RAPD markerek A véletlen amplifikált polimorf DNS (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA), DNS szekvenciák specifikus megsokszorozásán (PCR) alapuló módszer, amelyet a vizsgált DNS bizonyos szekvenciáival komplementer primerek használata tesz lehetővé (WILLIAMS ET AL., 1990). A primerek rendszerint 9-10 bázisból álló egyszálú oligonukleotidok, amelyek a genomi DNS két különböző helyén a komplementer szálakhoz kötődnek. Ha ezek a kötődési helyek megfelelően kis távolságban (100-2000 bp) vannak egymástól, akkor a PCR során meghatározott hosszúságú DNS fragmentum keletkezik. Egy primer általában több diszkrét lokusz megsokszorozását is eredményezi ugyanazon mintában. A reakció során keletkezett DNS szakaszok gélelektroforézis segítségével történő elválasztásával a vizsgált egyedek közötti polimorfizmus kimutatható. E módszer alkalmas különböző genomok hasonlóságának vagy különbözőségének, specifikus fenotípushoz kapcsoltható fragmentumok jelenlétének vagy hiányának kimutatására, populációk genetikai szerkezetének elemzésére, egyedek DNS-ujjlenyomatának elkészítésére (BARDAKCI, 2000). A RAPD mintázatok reprodukálhatósága körül sok vita van. A reprodukálhatóságot főleg a templát DNS minősége és mennyisége határozza meg, ezért a DNS bomlását kizáró izolálási módszert kell választani. A nagyon magas vagy nagyon alacsony templát DNS-koncentráció szintén megbízhatatlan mintázathoz vezet. Ha egy adott templát DNS-re az optimális koncentrációt megállapíthatjuk, akkor a további RAPD analíziseknél is ezt kell használni. Előnye, hogy nem igényel előzetes szekvencia ismeretet vagy munkát (pl. cdns-bank készítés) a markerek előállításához, és ugyanazon primerek széles körben használhatók több fajtához is. A RAPD markerek használata egyszerű és gyors, általában domináns öröklődésűek, a fajok széles skáláján alkalmazható, és nincs szükség arra, hogy a felszaporítani kívánt DNS szakaszokat génbankokból keressük ki. A módszer hátránya, hogy érzékeny a PCR reakció körülményeinek nagyon kis megváltozására, és előfordulhat, hogy az amplifikáció nem a templát DNS-ről, hanem a szennyeződésként véletlenül bevitt DNS-ről történik meg. 2. 5. 2. SCAR markerek A RAPD primerek megbízhatóságának javítása érdekében, Paran és Michelmore (PARAN AND MICHELMORE, 1992) javasolták az ismert szekvenciájú amplifikált régió (SCAR, Sequence Characterized Amplified Region) markerek kifejlesztését. A SCAR markerek a RAPD módszerrel kimutatott és polimorfizmust jelző DNS szakaszok további

10 jellemzéséből származnak. Miután a kérdéses RAPD fragmentumot klónozták és végeinek szekvenciáját meghatározták, a szekvencia ismeretében olyan specifikus primer páros tervezhető, amely segítségével egy adott polimorfizmus nagy biztonsággal vizsgálható. A SCAR primereket speciális DNS régiók sokszorozására használják. Használatuk kedvezőbb, mint a RAPD markereké, mert általában csak egy szakaszt jelölnek, és a PCR reakció körülményeinek változtatására kevésbé érzékenyek. A SCAR markereket géntérképezésre, marker alapú klónozásra, vagy markeren alapuló szelekcióra (MAS, Marker-Assisted Selection), valamint közel rokon fajták azonosítására használják. 2. 5. 3. A mikroszatellita vagy SSR markerek A mikroszatellita vagy SSR (Simple Sequence Repeat) szekvenciák tandem módon ismétlődő egyszerű szekvencia motívumok, melyeknek határoló régiói konzervatívok és egyediek, ezért alkalmasak primerek tervezésére. A 2-6 bázisból álló motívumok ismétlődésének számában van eltérés a különböző genotípusok között. Kialakulásuk valószínűleg mutációk és replikációs csúszások eredménye (MORGANTE ET AL., 2002). Sok kedvező tulajdonságuk - a gyakori előfordulás az eukarióta genomokban, magas fokú hosszpolimorfizmus, mendeli öröklődés, kodominancia, lokusz specifikusság, PCR alapú detektálás és egyértelmű allélelkülönítés - nagyon hatékony genetikai markerré teszi őket (MORGANTE AND OLIVIERI, 1993). Különösen értékes markerek a genom térképezéshez, de a populációgenetikában, a fajta- és klónazonosításban (PELLERONE ET AL., 2001; REGNER ET AL., 2006) is általánosan alkalmazzák őket. Hátrányuk, hogy egy PCR reakcióban csak egy lokuszról lehet információt nyerni, szemben a RAPD technikával, valamint az, hogy a markerek csak korlátozottan vihetők át egyik fajból a másikba, ezért minden fajnál külön azonosítani kell őket (AGRAWAL ET AL., 2006). 2. 5. 3. 1. SSR markerek szőlőben Szőlőben az első mikroszatellita markereket Thomas és Scott izolálta (THOMAS AND SCOTT, 1993) az 1990-es évek elején. Ez az első öt marker egy genomkönyvtárban azonosított VVS1-VVS5 sorozat volt. 1996-ban VVMD5, VVMD6, VVMD7, és VVMD8 markereket fejlesztették Browers és munkatársai (BOWERS ET AL., 1996), és 1999-ben ugyanez a kutatócsoport újabb 22 markert írt le (BOWERS ET AL., 1999). Ugyanebben az évben Sefc és munkatársai 18 SSR markert (VrZag sorozat) (SEFC ET AL., 1999), majd a

11 következő évben Scott és munkatársai újabb 124 SSR marker izolálását publikálták (SCOTT ET AL., 2000). Az 1999-ben alakult a Vitis Microsatellite Consorcium (VMC), hogy az SSR primerek iránti hatalmas igényt, nagyszámú új marker izolálásával kielégítse. 19 kutatócsoportja egyre több SSR szériát publikál (DIGASPERO ET AL., 2000; ADAM-BLONDON ET AL., 2004; DIGASPERO ET AL., 2005; MERDINOGLU ET AL., 2005). Már közel 600 SSR marker áll rendelkezésre a szőlő genotípus vizsgálatokhoz. (Az SSR marker honlap az alábbi címen érhető el: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists). 2. 6. Szőlő genetikai térképek és a genomszekvencia A V. vinifera és más Vitis fajokkal hibrid genomon számos genetikai térkép készült már. Az elsőt Lodhi és munkatársai készítették (LODHI ET AL., 1995), mely 422 RAPD, 16 RFLP és néhány izoenzim markert tartalmazott. 2000-ben készült el Dalbo és munkatársainak térképe (DALBO ET AL., 2000), melyen az ivart meghatározó gént helyezték el. A következő, Doligez és munkatársai (DOLIGEZ ET AL.,2002) által készített térkép főleg AFLP és kisebb részben SSR markerekből állt, és a magvatlanságot, valamint a bogyósúlyt befolyásoló QTL-eket (Quantitative Trait Lokus) térképezték rajta. A legtöbb genetikai térképet rezisztencia lokuszok felderítésére hozták létre. Doucleff (DOUCLEFF ET AL., 2004) 475, zömében AFLP markerekből álló térképe a Xifinema index és a Pierce betegség elleni rezisztencia elhelyezésére készült. További térképeket publikáltak a gombarezisztenciák tanulmányozására Grando és munkatársai (GRANDO ET AL., 2003), Fischer és munkatársai (FISCHER ET AL., 2004), Welter és munkatársai (WELTER ET AL., 2007). 2004-től már főleg SSR markerekből álló térképek láttak napvilágot. Ezen markerek előnye, hogy könnyen átvihetők egyik térképezési populációról a másikra, így összehasonlíthatóvá és egyesíthetővé válnak különböző populációkon készített térképek, míg az AFLP és RAPD markereknél az információátvitel nehézségbe ütközik (REGNER ET AL., 2002). A legteljesebb jelenlegi szőlő genetikai térkép a Doligez és munkatársai (DOLIGEZ ET AL., 2006) által szerkesztett 5 munkacsoport 5 genetikai térképének egyesítésével készült el. 439 primerpárral 512 lokuszt térképeztek rajta, szinte mind SSR marker. A kapcsoltsági csoportok teljes hosszúsága 1647 cm, a markerek átlagos távolsága 3,3 cm. 2007-ben DiGaspero publikált munkatársaival (DIGASPERO ET AL., 2007) egy 420 SSR-ből és 82 RGA markerből álló térképet.

12 A szőlő genom szekvenciáját 2007-ben publikálták, két párhuzamosan folyó munka eredményeként (JAILLON ET AL., 2007; VELASCO ET AL., 2007). Ez a negyedik virágos növény és az első gyümölcstermő növény, amelynek megismertük a teljes bázissorrendjét, ami hangsúlyozza a szőlő gazdasági jelentőségét. Jaillon és társai a szekvenálást egy 93 %- os homozigótaságig öntermékenyített Pinot Noir fajtából származó PN 40024 genotípuson, teljes genom shotgun módszerrel végezték. A szekvenált szakaszok 8,4-szeresen fedik le a genomot, 487 Mb teljes genomméretet adnak ki, amely 30.434 feltételezetten fehérjét kódoló gént tartalmaz. A teljes genom közel 41 % transzpozon eredetű szekvenciából, 37 % intron és 7 % exon szekvenciából áll (JAILLON ET AL., 2007). Velasco és társai szintén Pinot Noir fajtával dolgoztak, de egy heterozigóta vonalból indultak ki ( termesztett fajta ), amely jobban tükrözi a szőlőgenom változatosságát, viszont pont ezért a szekvencia összeállítása sok nehézségbe ütközik. A munka eredményeként elkészült 505 Mb hosszú szekvenciában 29.585 feltételezett gént annotáltak (VELASCO ET AL., 2007). Ebben az esetben a testvérkromatidák szekvenciája 11 %-ban különbözött egymástól, főleg azért, mert az egyik, vagy a másik homológ kromoszóma eltérő helyeken is tartalmaz mobilis elemeket vagy deléciókat. Az 1. kromoszómák egy nagyon hasonló részletét mutatja a 2. ábra. 2. ábra: A heterozigóta Pinot Noir fajta genomjának egy részlete. Az 1. kromoszómapár azonos szakaszain (a, b) zöld szín jelzi a kódoló szekvenciákat, piros a mobilis elemeket. Az egyik vagy másik kromoszómában hiányzó szekvenciát szaggatott vonal jelzi. I.: a részlet eleje, II.: a részlet összehasonlításának folytatása (VELASCO ET AL., 2007).

13 3. A munka előzményei 3.1. Az utódpopuláció előállítása Az elmúlt években tanszékünkön egy olyan V. vinifera hibridcsalád utódain végeztek kísérleteket, amely hordoz egy V. amurensis eredetű Agrobacterium rezisztenciát (Agr1 lokusz). Ennek létrehozása több lépésben történt (3. ábra). Közvetlen szülőként a rezisztens Kunbarát és a fertőzésnek nem ellenálló Sárfehér fajtát használták fel. A keresztezésből származó közel 300 magoncot 2008 tavasza óta nevelik a kecskeméti Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet telephelyén. 3. ábra: Az Agrobacterium rezisztencia térképezésére létrehozott család eredete. 3.2. Az utódpopuláció jellemzése A 300 magonc klónjainak felhasználásával, mesterséges fertőzéssel határozták meg a növények Agrobacterium törzsekkel szembeni fogékonyságát. A növények fiatal szárait mesterséges sérüléseken keresztül fertőzték az 1. táblázatban feltüntetett törzsekkel. A tumorképződést 6 hét után értékelték (4. ábra). A kiértékelést követően 153 rezisztens és 114 szenzitív utód képezte a térképezési populációt (lásd a Függeléket). 1. táblázat: A fertőzésekben használt Agrobacterium törzsek. Törzs Jellemző tulajdonság Eredet A. tumefaciens C58 nopalin Ti-plazmid HOOYKAAS ET AL., 1980 A. vitis Tm4 oktopin Ti-plazmid SZEGEDI ET AL., 1988 A. vitis AT1 noplain Ti-plazmid SZEGEDI ET AL., 1988 A. vitis S4 vitopin Ti-plazmid SZEGEDI ET AL., 1988

14 4. ábra: Tumorképződés egy szenzitív és egy rezisztens utód esetében. 3.3. Rezisztenciához kapcsolt markerek keresése Első lépésként RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) és SSR (Single Sequence Repeat), majd DAF (DNA Fingerprinting Amplification) kísérletek segítségével kerestek polimorfizmust a szülők között (5. ábra). Eddig 1560 RAPD primer és 1038 primerpár kombináció tesztelését végezték el, és 647 esetben tudtak különbséget kimutatni a szülőkből származó DNS mintákon. Az SSR markerek segítségével 18 polimorfizmust találtak 39 primerpárt kipróbálva. 1031 bp 500 bp 5. ábra: Eltérő RAPD markerek a két szülőben. A tesztelt primerek az OPM primersorozat tagjai. A piros nyilak a Kunbarátban megjelenő különbségeket mutatják, a sárgák a Sárfehérben lévőket. K: Kunbarát, S: Sárfehér, L: 100 bp DNS ladder plus kontroll (fragmentek hossza: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1031, 1200, 1500, 2000, 3000 bp). Ezt követően, 5 rezisztens és 5 szenzitív egyedet kiválasztva vizsgálták az azonosított polimorfizmusok kapcsoltságát a rezisztenciához. Az eddig tesztelt 647 RAPD primer közül 9 segítségével találtak olyan DNS fragmenteket, amelyek csak a rezisztens egyedekből származó mintákban jelentek meg. Ezek segítségével a teljes utódpopulációt megvizsgálták, és felállítottak egy feltételezett markersorrendet (6. ábra).

15 6. ábra: Az Agr1 rezisztencia lokuszhoz kapcsolt markerek sorrendje és néhány rekombináns utód genotípusa. (+): a DNS marker jelen van; (-): a marker nincs jelen. Piros szám: rezisztens, kék szám: szenzitív egyed. Mivel időközben a Pinot Noir genom szekvenciája is nagyjából elkészült, bioinformatikai eszközökkel próbálták meghatározni, hogy melyik kromoszómán található az azonosított kapcsoltsági csoport. Kiderült, hogy az izolált és megszekvenált, rezisztenciához kapcsolt RAPD fragmentek többsége nem ad ebben megfelelő támpontot. Vagy nem illeszthető egyik Pinot Noir kromoszóma szekvenciájához sem, vagy egyszerre több kromoszómán is előfordul hasonló szekvencia, mivel az retrotranszpozon szekvenciát képvisel. Egy mikroszatellita szekvencia és néhány részszekvencia alapján feltételezhető, hogy a rezisztenciagén kapcsoltsági csoportja a 15. kromoszóma része.

16 4. Célkitűzések Munkánk közvetlen célja a V. amurensis-ből származó domináns és feltehetően egy génes Agr1 (Agrobacterium rezisztencia) lokusz helyzetének meghatározása a V. vinifera genomban. Ennek érdekében a következő célokat tűztük ki magunk elé: 1. További, a rezisztenciához kapcsolt RAPD és SSR markerek jelenlétének meghatározása a 153 rezisztens és a 114 szenzitív utódban, a genetikai térkép pontosítása érdekében. 2. Célunk volt továbbá a Pinot Noir 15. kromoszómájának szekvenciája alapján tervezett primerek segítségével ismert helyzetű polimorfizmusokat azonosítani, és ezek kapcsoltságát vizsgálni az Agr1 lokuszhoz, a teljes utódpopuláció felhasználásával. Ezzel egyben el kívántuk dönteni azt is, hogy valóban a 15. kromoszómán helyezkedik-e el a rezisztenciagén, mint ahogy arra néhány előzetes eredmény utalt.

17 5. Alkalmazott anyagok és módszerek 5.1. Szőlő DNS izolálása A DNS izoláláshoz 1-3 g fiatal szőlőlevelet folyékony nitrogénben dörzsöltük szét és 20 ml CEP pufferbe [2 % CTAB (hexadecyl-trimethyl-ammonium-bromide), 100 mm Tris, 20 mm EDTA, 1,4 M NaCl, 0,5 % β-mercaptoethanolt] tettük, amihez 100 mg polyvinylpyrrolidont (PVP, Sigma P6755) adtunk (1g levél/100mg PVP). Mindezt jól összeráztuk és 1 órán keresztül 65 C vízfürdőbe inkubáltuk, mialatt többször összekevertük. Az egy óra elteltével 20 ml kloroformot (1:1 arányban) adtunk hozzá, óvatosan összeráztuk és 30 percig állni hagytuk, közben sűrűn forgattuk. Ezután 10 percig centrifugáltuk (4400 rmp, IEC Centra rotor No 7231). A felülúszót új csőbe mértük és 0,5 térfogatnyi nátrium-klorid oldatot (5 M, ph:7.0) valamint 0,6 térfogatnyi izopropanolt adtunk hozzá. Óvatosan összeráztuk. Következő lépésben 5 percig centrifugáltuk (4400 rmp), majd a felülúszót leöntöttük, alaposan lecsurgattuk és 1 ml TE (50:20) [50 mm Tris (ph:7.5), 20 mm EDTA] oldatban oldottuk fel, amihez 10 µl 10 mg/ml DNáz mentes (forralt) RNázt adtunk és 1-2 óráig szobahőmérsékleten oldódni hagytuk. Ezek után a mintákat három részre osztottuk szét, hogy eppendorf csövekben folytathassuk a munkát. 300 µl DNS oldathoz 300 µl TES puffert [TE-ben 10 mm Tris (ph:7.5), 1 mm EDTA, 1% SDS] adtunk és 10 perc jégen való inkubálás után 300 µl NH 4 Ac (7,5 M, 0 C) oldatot adtunk hozzá. Alapos összekeverés után 10 percig -20 C-ra tettük a csöveket, majd a keletkezett csapadékot ülepítettük (5 perc, 12000 rpm). A felülúszót 500 µl-ként új csövekbe óvatosan átpipettáztuk és 0,6 térfogat i-propanollal kicsaptuk a benne lévő DNS-t (20 perc -20 C). Ezután 5 percig centrifugáltuk (12000 rmp) a mintákat. A csapadékot 70 %-os etilalkohollal mostuk, majd szárítottuk a mintákat és 100 µl ioncserélt vízben oldottuk fel (ARNEDO-ANDRES ET AL., 2002). 5.2. Polimeráz láncreakció A rezisztenciagénhez kapcsolt markerek keresésének elvégzésére PCR alapú módszereket használtunk. A felhasznált PCR programokat és primereket a 2. és 3. táblázat tartalmazza. A PCR reakció körülményei: 10 mm TRIS (ph:8.8), 50 mm KCl, 0,08 % Nonidet P40, 1,5 mm MgCl2, 0,2 mm datp, 0,2 mm dctp, 0,2 mm dgtp, 0,2 mm dttp, 1,25 U Taq polimeráz (Dream Taq, FERMENTAS) 0,5 µm primer, 20 ng templát DNS.

18 2. táblázat: Alkalmazott PCR reakciók. Program Chr15 VIV 1. 2:00-95 C 2:00-95 C 2. 0:30-95 C 0:30-95 C 3. 0:30-58 C 0:30-56 C 4. 0:40-72 C 0:40-72 C 5. 32 x go to 2 32 x go to 2 6. 5:00-72 C 5:00 72 C 7. end end 3. táblázat: Alkalmazott primerek és jellemzőik. Primer Nukleotid szekvencia (5-3 ) vviv67f2 vviv67r2 OPQ-15 OPQ15scar-1 OPQ15scar-2 ATTCTCATTTGGGTTCTCAC TTCAGTAGTCACTCTCAAC GGGTAACGTG AGTAGAGATAATGATGGTGTAG GCACATGATACAAAATCTGT 5.3. Agaróz gélelektroforézis A DNS fragmentek elválasztására agaróz gélt használtunk, melyet TBE pufferrel készítettünk (89 mm Tris, 89 mm Bórsav, 2 mm EDTA) és 0,1 µg/ml végkoncentrációban etidium-bromidot adtunk hozzá. A DNS-mintákhoz 0,2 térfogat 5xSTOP (10 % ficoll-400, 0.25M EDTA ph: 8.0, 0.2 % brómfenolkék) oldatot adtunk az elválasztás előtt. A 200-500 bp nagyságú fragmenteket 2 %-os, a nagyobb fragmenteket 1 %-os gélen választottuk el. Kontrollként 100 bp DNS Ladder plust (fragmentek hossza: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1031, 1200, 1500, 2000, 3000 bp; az aláhúzottak erősebben látszanak a gélen) alkalmaztunk (FERMENTAS). A kiértékelést BioDoc-It M fotodokumentációs rendszer (BioImaging system, www.uvp.com) segítségével végeztük. 5.4. Fragment izolálás Polimeráz láncreakció után a keletkezett DNS fragmentet agaróz gélelektroforézis segítségével tisztítottuk. Az izolálni kívánt fragment előtt bemetszettük a gélt és a résbe Whatman DE 81 papírt helyeztünk. További 20 perc 60 V elektroforézis után a papírt Eppendorf csőbe tettük, és a DNS-t 2x 50 µl 1M NaCl oldattal távolítottuk el. A DNS

19 kicsapása 0,1 térfogat 3M Na-acetát oldattal (ph:7.0) és 2 térfogat abszolút etanollal történt. A DNS-csapadékot 20 perc, -20 o C inkubálás után centrifugáltuk, szárítottuk, és 20 µl steril desztillált vízben oldottuk fel. 5.5. DNS ligálás, transzformálás A klónozásoknál a pjet1 direkt szelekciós vektort alkalmaztuk (FERMENTAS). A ligálási elegyet vektor DNS, fragment DNS, ligáz puffer (5x puffer: 200 mm TrisHCL, 50 mm MgCl 2, 50 mm dithiotreitol, 2,5 mm ATP, ph:7.8) és steril desztillált víz felhasználásával készítettük. A reakcióhoz T4 DNS ligázt használtunk (FERMENTAS), és az elegyet legalább 2 óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A kompetens sejtek készítéséhez XL1-Blue törzset használtunk. 200 ml SOB tápoldatban (2 % Bacto trypton, 0,5 % Yeast extract, 10 mm NaCl, 2,5 mm KCl, ph:7.0) éjszakán át növesztett baktériumkultúrát 10 percre jégre tettük. 10 perces centrifugálást (4000 rpm) követően a leülepedett sejteket 80 ml hideg TB pufferben (10 mm PIPES, 15 mm CaCl 2, 250 mm KCl, ph:6.7) szuszpendáltuk fel. 10 perces jégen történő inkubáció, majd egy újabb centrifugálás után az összegyűjtött sejteket 20 ml jéghideg TB pufferben szuszpendáltuk fel. A szuszpenzióhoz 1,5 ml DMSO-t adtunk, a sejteket Eppendorf csövekbe szétosztva folyékony nitrogén segítségével fagyasztottuk és transzformációig -80 C-on tároltuk (INOUE ET AL., 1990). Egy transzformáláshoz 100 µl kompetens sejtet használtunk fel. A sejteket -80 C-ról jégre tettük és felolvadás után hozzáadtuk a ligált DNS oldatot. 30 percig jégen inkubáltuk, majd 3 perces 37 C-os hősokkot alkalmaztunk. A hősokkot követően 400 µl LB tápfolyadékot adtunk az oldathoz, majd 1 órán keresztül 37 C-on inkubáltuk. Ezután a sejteket szelektív LB táptalajra (SAMBROOK ET AL., 1989) kentük ki és egy éjszakán át 37 C-on inkubáltuk. 5.6. Plazmid DNS izolálás A plazmid DNS-t Ish-Horowicz és Burke módszer szerint alkalikus lízissel preparáltuk (ISH-HOROWICZ AND BURKE, 1981). E. coli esetén a sejteket a megfelelő antibiotikum jelenlétében 3-3 ml LB tápfolyadékban növesztettük egy éjszakán át. 1,5 ml felnövesztett baktériumkultúrát Eppendorf csőben 20 másodpercig centrifugáltunk, majd a felülúszó leöntése után a leülepedett sejteket 100 µl TEG oldatban (50 mm glükóz, 25 mm Tris, 10 mm EDTA, ph:8.0) szuszpendáltuk fel. A felszuszpendált sejteket 200 µl NS oldat (0,2 N NaOH, 1 % SDS) hozzáadásával óvatos keverés mellett feltártuk. A

20 mintákat 5 percig 0 C-on inkubáltuk, majd 160 µl jéghideg NaAc (3 M NaAc, ph:4.8) hozzáadása után erősen összeráztuk a pelyhes csapadék megjelenéséig. Ezt követően az előbbi inkubálást újra elvégeztük. A kivált SDS csapadékot 5 percig centrifugáltuk, majd a felülúszóból a plazmid DNS-t kb. 400 µl izopropanollal csaptuk ki. 5 perces -20 C-on történő inkubációt követően a mintákat ismét lecentrifugáltuk és 70 %-os etanollal mostuk, majd szárítottuk. A csapadékot 100 µl Tris-Ac oldatban (50 mm Tris, 100 mm NaAc, ph:8.0) feloldottuk és 200 µl 96 %-os etanollal ismét kicsaptuk. 5 perces 0 C-os inkubáció után a mintákat újból lecentrifugáltuk, mostuk és szárítottuk, majd a kapott DNS-t 50 µl RNáz (50-100 µg/ml) enzimet tartalmazó steril desztillált vízben oldottuk fel. 5.7. DNS szekvencia meghatározás és értékelés A munkánk során tisztított plazmid DNS minták és PCR fragmentumok nukleotid szekvenciáját a megfelelő oligonukleotidok segítségével a PTE ÁOK Genetikai Intézet DNS Szekvenáló Laboratóriumában határozták meg. A részszekvenciákat a Chromas Pro (www.technelysium.com.au/chromaspro.html) program segítségével ellenőriztük, javítottuk és a Lasergene (DNA Star Inc.) program segítségével illesztettük össze. A szekvenciák elemzésére az NCBI honlapján elérhető V. vinifera genomprojekthez kapcsolt különböző funkciókat alkalmaztuk (BLAST elemzés, szekvencia lekérés): www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/leuks.cgi 5.8. Primerek tervezése A V. vinifera 15. kromoszómájának szekvenciája és géntérképe az alábbi címen érhető el: www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nc_012021.2 A lekért szekvenciák mentén a primerek tervezését a Sequence Manupulation Suite (SMS) honlap PCR Primer Stats programja segítségével végeztük http://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_primer_stats.html. Ez a program elemzi a primerek GC arányát, olvadási hőmérsékletét (Tm), a lehetséges, a PCR reakciót zavaró esetleges komplementer szakaszok meglétét. A munkánk során tervezett és alkalmazott primereket a 4. táblázat tartalmazza. Minden primerpárt először a 2. táblázatban (5.2. fejezet) leírt Chr15 programmal próbáltunk ki.

21 4. Táblázat: A dolgozatban részletesebben bemutatott tervezett primerek és jellemzőik. Primer chr15-1m6igr1 chr15-1m6igr2 chr15-1m83 chr15-1m83rev chr15-1m833 chr15-1m833rev chr15-1m9 chr15-1m9rv chr15-1m6 chr15-1m6rev Nukleotid szekvencia (5'-3') CTACTAGGCCAAGGCTTAC ATGGAGGCAGAATATGTAGC TTATCCACAACAAAATAGCCT TGCATATTCTGTACCATCAC CTGGACAACCACCTTG TTGCTTAAGGGCTCAATAAC TTCAACGTTTCCCCACTC TATTTCTTGTGCGTGCAAC CTTATATTCATCAGTGGAGAAATC CAGTAGTTGTACGTTTCCAG

22 6. Eredmények és megvitatásuk Az előzetes RAPD analízis során sikerült különbséget kimutatni az OPQ-15 dekamer primerrel a két szülő között. A Kunbarát fajtában megjelenő DNS fragment megtalálható volt az előzetesen tesztelt rezisztens utódokban is, de hiányzott a szenzitívekből (7/A. ábra). A fragment szekvenciájának meghatározása után csoportunkban két primert terveztek az 614 bp hosszú fragment két végéhez közel (OPQ15scar-1, OPQ15scar-2). Feladatom az volt, hogy ellenőrizzem, vajon sikerült-e kifejleszteni ezzel egy rezisztenciához kapcsolt SCAR markert. Ha igen, akkor a teljes utódpopulációt meg kellett vizsgálni e marker jelenlétére. 6.1. OPQ-15 RAPD marker jellemzése A szülők mellett először 5 szenzitív és 5 rezisztens egyedet vizsgáltunk meg a polimorfizmus jelenlétére. A 7/B. ábrán látható, hogy a nyíllal jelezett különbséget adó fragmentum mindegyik rezisztens egyedben megjelenik, míg a szenzitív egyedek egyikében sem. Ez azt jelenti, hogy a tervezett primerek segítségével sikerült egyetlen, valószínűleg a rezisztenciához kapcsolt DNS-markert találni, azaz egy SCAR markert kifejleszteni. A teljes utódpopuláció tesztelését követően hasonló eredményeket kaptam. 153 rezisztens utód közül csak hétben nem volt kimutatható az OPQ-15scar marker, míg a 114 szenzitív utódnál szintén csak 7 esetben volt jelen (lásd a Függeléket). Tehát 267 utód között találtunk 14 rekombinánst, s ez alapján az Agr1 rezisztencia lokusz és az OPQ- 15scar marker távolsága nagyjából 5 cm. 7. ábra: Az OPQ-15 RAPD marker (A) és az OPQ-15 SCAR marker (B) működése R: Rezisztens utódok, Sz: Szenzitív utódok, K: Kunbarát, S: Sárfehér, L: 100 bp DNS ladder plus kontroll.

23 Az OPQ-15scar marker tehát egyértelműen kapcsolt a rezisztenciához, de sajnos nem tudtuk meghatározni, hogy melyik kromoszómán helyezkedik el, mivel több Pinot Noir kromoszómán is található hasonló szekvencia. A csoportunkban meghatározott más RAPD szekvenciák sem voltak köthetők egyetlen kromoszómához, ezért a továbbiakban arra próbáltunk bizonyítékot találni, hogy a rezisztenciagén melyik kromoszómán helyezkedik el. 6.2. A VVIV67 mikroszatellita marker is kapcsolt a rezisztenciához A RAPD markerek mellett számos SSR marker és a rezisztencia kapcsoltságát is vizsgálták csoportunkban. Néhány utód vizsgálata során úgy tűnt, hogy a Pinot Noir genomban a 15. kromoszómán lokalizált VVIV67 marker kapcsolt lehet a rezisztenciához, ezért a teljes utódpopulációt megvizsgáltuk a jelenlétére. A tesztelés megkezdése előtt új primerpárt terveztünk az irodalomban leírtak helyett (8. ábra), hogy a 360 bp körüli fragment méretét megnöveljük, és ezzel agaróz gélen biztonságosabban tudjuk vizsgálni a marker jelenlétét. >VVIV67 region 1433600-1434600 V. vinifera chromosome 15 ACCTTTATACACACAACCAAATCCACCTTCCCCAAGCTTTAGCATCCTACTGAAATCATGTGTGGCATGT CTAAGCTCGGAAAAAGAGAAGACTCGCAAGTTTTGAGCCTTCTCTTCATATAATTCTGGTATACTGCGCC GTGAAGTAGTTGAACACGAAGATTTAATGACCAGATCAGACCCCGAGTAGTATGATTTGCTTTGGTTTTT CAACTCCGGCGCTGATCTTTGTACCTTCAATCGGGTCTTATCTTTAAAGTAGTAGAAACACTTCATTCTT CAGAAttcagtagtcactctcaacGTTCAACTGTGAACTTTGTTGGAGTCCATCAAATTCATCTAGAAAA GAATAGCAACTACATTAATAAATTAACAGCAATCAGCATTTTGCACACAATCACAGAGAGAGATTGAGAT TATAAAAAATAAAAAATAATAAAAAAAGGGGAAATTTTGAAAAAGAAATGAAAGAAGTGGGGGAAGCAAG GGAAACCCAGATGAGAAAAAGTTTTAGCAAAATAGAAATGAGCAGAATCTTAGATTGGCAAAACACACAG AAATGGCTACACAAAAACAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGCAGAG ACAGAGACAGAGAGAGGAAAGAAGTGGGGGAGGCAAGGGAAACCCTATGAGAAGTTATAGAAACAGGAAT GAAGAGAATCTTATATTGACAAAACACAGAAAAATGGCAACACAACAAGGAAGGAGTCAAAATTAACCGC AAAATTTTGAGGAAGAAATTGAGTAAACAGAAAAGGGTGTAAAAAAATAgtgagaacccaaatgagaatC AGATTCAGAAATGTTAGAACAAAACCACAAATTGAACCAGAGCCACATGAGAATTCATTAGAAGCACCCA GTACAAAGCATTCTAATCAAAACAAAGATTGAGAATTGAACGTTCTAAGTAAGACCCACACGAGAAAAAC AAGAAAAGAACTATTATAAT 8. ábra: A VVIV67 mikroszatellita (SSR) régió szekvenciája. Az eredeti primerek helyzetét aláhúzás, az új primerek elhelyezkedését a kis betűs aláhúzott szekvenciák jelzik. Az új primerekkel (vviv67f2, vviv67r2) egy 500 bp körüli fragment jelent meg a Kunbarát fajtában és a rezisztens utódokban, amely a szenzitívekben csak ritkán volt

24 kimutatható (9. ábra). A teljes utódpopuláció tesztelése után ezt a markert 11 kivételével valamennyi rezisztens utódban megtaláltuk, míg a szenzitív utódok közül csak 16 egyedben volt jelen (lásd a Függeléket). Ezzel egy olyan szekvencia kapcsoltságát mutattuk ki az Agr1 lokuszhoz, amely, - legalább is a Pinot Noir fajtában - a 15. kromoszóma 1,434 Mb körüli pozíciójában található (lásd az előzetes genetikai térképet: 6.5. fejezet, 14. ábra). 600 bp 500 bp 9. ábra: A VVIV67 SSR marker előfordulása. R: Rezisztens, Sz: Szenzitív utódok, K: Kunbarát, S: Sárfehér, L: 100 bp DNS ladder plus kontroll. A VVIV67 mikroszatellita marker és néhány részszekvencia alapján azt feltételeztük, hogy az Agr1 rezisztencia lokusz a 15. kromoszómán helyezkedhet el. Ezen tények ismeretében új stratégiát dolgoztunk ki a rezisztenciagén helyzetének megerősítésére és új kapcsolt markerek keresésére. Már nem random polimorfizmusokat kerestünk, hanem a Pinot Noir 15. kromoszóma szekvenciája alapján tervezett primerekkel próbáltunk polimorfizmusokat találni a Kunbarát és a Sárfehér genom megfelelő részein. 6.3. Célzott polimorfizmus keresés a 15. kromoszóma mentén Elképzelésünk az volt, hogy az ismert Pinot Noir genomszekvencia alapján, elsősorban egyedi, 1-2 kb nagyságú intron szekvenciák felsokszorozásához tervezünk primereket, a végüknél található exon szekvenciákhoz (10. ábra). A megfelelő termékeket izolálva és klónozva a Kunbarát és Sárfehér fajtákból meghatározzuk azok pontos bázissorrendjét és a

25 talált polimorfizmusokat felhasználva fejlesztünk ki új SCAR markereket, majd ezek kapcsoltságát vizsgáljuk az Agr1 lokuszhoz. Annak ellenére, hogy sikerült ezen az úton különbségeket találnunk és egy SCAR markert kifejlesztenünk, megpróbálkoztunk egy gyorsabb és olcsóbb megközelítéssel. Így a későbbi kísérleteinkben már azt vizsgáltuk, hogy egy adott szekvenciára tervezett primerpár eredményez-e azonnal Kunbarát specifikus SCAR markert. 10. ábra: A V. vinifera Pinot Noir 15. kromoszóma egy részlete. Az ábra felső része a koordinátákat jelzi (1812 kb-1828 kb), alsó része pedig a szakaszon feltételezett kódoló szekvenciák exon-intron szerkezetét mutatja. Az előzetes eredmények alapján azt feltételeztük, hogy a 15. kromoszóma 1,5-2,5 Mbig terjedő szakaszán helyezkedhet el a rezisztenciagén, így ez a szekvencia szolgált alapul a primerek tervezéséhez. A tervezett primereket a 4. táblázat tartalmazza, míg néhány alkalmazott primerpár által kimutatható, a Kunbarát és Sárfehér fajtákból származó PCRfragmentet a 11. ábra mutatja. 11. ábra: Polimorfizmusok kimutatása a két szülő között a Pinot Noir 15. kromoszóma 1,5-2,5 Mb-ig terjedő szakaszának szekvenciája alapján tervezett primerekkel. K: Kunbarát, S: Sárfehér, L: 100 bp DNS ladder plus kontroll. A tesztelt primerpárok neve alul látható.

26 A különböző primerekkel eltérő eredményeket kaptunk: a) Az 1M6 primerpárral nem sikerült terméket amplifikálnunk. b) Az 1M6igr primerpárral más méretű fragmentet kaptunk a két szülői mintából. Ha a Kunbarát fajtában kimutatott kisebb fragment csak az egyik homológ kromoszómáról képződik, akkor markerként felhasználható az Agr1 rezisztencia lokusz térképezésre (Ennek bizonyítását mutatja a 6.4. és 6.5. fejezet). c) Az 1M83 primer esetében egyforma méretű fragmenteket kaptunk a Kunbarát és a Sárfehér genomból. Annak ellenére, hogy méretbeli különbséget nem tudtunk kimutatni, ez nem jelenti azt, hogy nincs eltérés a két szülő szekvenciái között. Így szekvencia meghatározás után esetleg ebben az esetben is található polimorfizmus. d) Az 1M833 primerpár szintén más méretű fragmentet eredményez a két szülői mintából, tehát itt is az a) pontban megfogalmazott megfontolások érvényesek. e) Az 1M9 primerpárral csak a Sárfehér fajta esetében kaptunk fragmentet, tehát ez a szekvencia nem található meg a rezisztens egyedekben. Ez a marker lehet specifikus a Sárfehér fajta egyik 15. kromoszómájára, de a Kunbarátban található rezisztencia térképezésére biztosan nem alkalmas. 6.4. Az 1M6igr PCR fragmentek szekvenciájának elemzése A 11. ábrán látható, hogy az 1M6igr primerekkel a Kunbarát fajtából egy kisebb (1,3 kb), a Sárfehér fajtából egy nagyobb (2,0 kb) PCR fragmentet sikerült felsokszorozni. Hogy megállapíthassuk, tényleg ugyanazt a lokuszt képviseli mindkét fragment, csak az egyik deléciót vagy inszerciót hordoz a másikhoz képest, a két fragmentet izoláltuk és pjet1 vektorba klónoztuk (lásd 5.5. fejezet). Az inszert jelenlétét és orientációját számos klónnál kolónia PCR segítségével határoztuk meg az 1M6igr1 és az 1M6igr2 primerek alkalmazásával. Az azonos irányú fragmenteket tartalmazó klónok közül mind Kunbarát (k24_4, k25_5), mind Sárfehér (s21_1, s22_2, s23_3) eredetű klónoknál meghatároztuk az első 4-500 bázis nukleotid sorrendjét. A kapott szekvenciákat egymással és a Pinot Noir genom szekvenciával is összehasonlítottuk a BLASTN program segítségével (5. táblázat).

27 5. táblázat: Az 1M6igr primerekkel izolált DNS-klónok szekvenciájának BLASTN elemzése REGISZTRÁCIÓS SZÁM LEÍRÁS * PONT- SZÁM SZEKV. E- érték AZONOS- SÁG V. vinifera Pinot Noir seq. (1M6igr) adatbázisból NW_002238113.1 Vitis vinifera chromosome 15 genomic contig 2900 1 0.0 1 NW_002238215.1 Vitis vinifera chromosome 6 genomic contig 1805 0,99 0.0 0,96 NW_002239676.1 Vitis vinifera genomic contig 1801 0,98 0.0 0,96 NW_002238222.1 Vitis vinifera chromosome 7 genomic contig 1794 0,98 0.0 0,96 NW_002238146.1 Vitis vinifera chromosome 19 genomic contig 1744 0,99 0.0 0,96 NW_002238090.1 Vitis vinifera chromosome 12 genomic contig 1731 0,98 0.0 0,95 NW_002238109.1 Vitis vinifera chromosome 14 genomic contig 1716 0,98 0.0 0,97 V. vinifera Kunbarát seq. (k24_4, k25_5) NW_002238113.1 Vitis vinifera chromosome 15 genomic contig 693 1 0.0 0,96 NW_002239676.1 Vitis vinifera genomic contig 691 0,99 0.0 0,96 NW_002238073.1 Vitis vinifera chromosome 11 genomic contig 682 1 0.0 0,95 NW_002238222.1 Vitis vinifera chromosome 7 genomic contig 676 1 0.0 0,95 NW_002238146.1 Vitis vinifera chromosome 19 genomic contig 671 1 0.0 0,95 NW_002238215.1 Vitis vinifera chromosome 6 genomic contig 671 1 0.0 0,95 V. vinifera Sárfehér seq. (s22_2, s23_3) NW_002238103.1 Vitis vinifera chromosome 14 genomic contig 804 0,99 0.0 0,99 NW_002240855.1 Vitis vinifera genomic contig 798 0,99 0.0 0,98 NW_002238099.1 Vitis vinifera chromosome 13 genomic contig 798 0,99 0.0 0,98 NW_002238077.1 Vitis vinifera chromosome 11 genomic contig 798 0,99 0.0 0,98 NW_002238249.1 Vitis vinifera chromosome 9 genomic contig 734 0,99 0.0 0,96 V. vinifera Sárfehér seq. (s21_1) NW_002238113.1 Vitis vinifera chromosome 15 genomic contig 752 0,98 0.0 0,98 NW_002238237.1 Vitis vinifera chromosome 8 genomic contig 747 0,98 0.0 0,98 NW_002238134.1 Vitis vinifera chromosome 17 genomic contig 741 0,98 0.0 0,98 NW_002238222.1 Vitis vinifera chromosome 7 genomic contig 730 0,98 0.0 0,97 NW_002238173.1 Vitis vinifera chromosome 2 genomic contig 730 0,98 0.0 0,97 NW_002240855.1 Vitis vinifera genomic contig 725 0,98 0.0 0,97 NW_002238119.1 Vitis vinifera chromosome 16 genomic contig 658 0,98 0.0 0,94 (*) A leírás oszlopban látható, hogy a homológ régiók több, különböző kromoszómán is előfordulnak. Az elemzésekből kiderült, hogy a Kunbarátból származó mindkét klón (k24_4, k25_5) a várt szekvenciát tartalmazza, mely megfelel a Pinot Noir genom 15. kromoszóma 1,6 Mb körül található szekvenciájának, de számos ehhez nagyon hasonló szekvencia található még a Pinot Noir genom több más pontján is (lásd a leírás oszlopban megadott

28 kromoszómaszámokat). Mikor ezek kódoló kapacitását a BLASTX prorgam segítségével megvizsgáltuk kiderült, hogy mind egy Gag-proteáz-integráz-RT-RNázH poliprotein egy részletét kódolják, azaz retrotranszpozon szekvenciákhoz hasonlóak. A Sárfehérből származó két szekvencia (s22_2, s23_3) azonos volt, de nem hasonlított a Kunbarátból származó szekvenciára. Számos hasonló szekvencia található a Pinot Noir genomban, melyek szintén retrotranszpozon eredetűek. Az s21_1 szekvencia mindkét előző szekvenciától eltért, de ez is egy, számos helyen előforduló retrotranszpozon részlethez volt hasonló. Mindezekből megállapítottuk, hogy a Kunbarát mintákból származó DNS fragment (1,3 kb) feltehetően a 15. kromoszóma megfelelő szakasza, de a Sárfehérből származó PCR fragmentek ennek a régiónak nem polimorf alléljei, hanem más kromoszóma-részletet képviselnek. Mindezek ellenére valószínű volt, hogy a tervezett 1M6igr primerek egy Agr1 lokuszhoz kapcsolt egyedi 1,3 kb nagyságú szekvenciát sokszoroznak fel. Hogy ezt bizonyítsuk, ismét az utódpopulációban kellett megvizsgálnunk ennek a markernek az előfordulását. 6.5. Az 1M6igr marker kapcsolt az Agr1 lokusszal Az 1M6igr primerekkel felsokszorozott 1,3 kb nagyságú régióval SCAR markerként dolgoztunk tovább, és vizsgáltuk a rezisztens kromoszómához való kapcsoltságát. A 12. ábra mutatja a primerek által kimutatható fragment utódokban való előfordulását. Az összes utód levizsgálása után 31 olyan esetet találtunk, amikor a rezisztencia jelenléte nem korrelált az 1M6igr fragment jelenlétével, azaz 267 utódból 31 volt rekombináns (lásd a Függeléket). Ez nagyjából 12 cm távolságnak felel meg. 12. ábra: 1M6igr primer tesztelése az utódokon. K: Kunbarát, S: Sárfehér, L: 100 bp DNS ladder plus kontroll, Sz: szenzitív utódok, R: rezisztens utódok.