Géntár klónok azonosítása a szőlő Rcg1 Agrobacterium rezisztencia lókusz közelében

Átírás

1 Géntár klónok azonosítása a szőlő Rcg1 Agrobacterium rezisztencia lókusz közelében DIPLOMAMUNKA Készítette: ERDŐ-BONYÁR SZABINA Biológus MSc hallgató Témavezetők: Dr. PUTNOKY PÉTER, Dr. KUCZMOG ANETT PTE TTK Biológia Intézet Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék PÉCS, 2018.

2 TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS Az agrobaktériumok, mint növényi kórokozók Az agrobaktérium fertőzés folyamata Szőlő agrobaktériumos megbetegedése Az Rcg1 Agrobacterium rezisztenciagén térképezése Géntárak, vektorok CopyRight v2.0 vektor A MUNKA ELŐZMÉNYEI CÉLKITŰZÉSEK ANYAGOK ÉS MÓDSZER A géntár elkészítése és tárolása A géntár klónok azonosítása specifikus primerekkel PCR Agaróz gélelektroforézis Plazmid DNS izolálás DNS szekvencia meghatározás DNS szekvencia elemzés EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK A géntár klónok eltevése és tárolása A géntár klónok azonosítása specifikus primerekkel A cos4820 géntár klón szekvenciájának elemzése A cos4831 géntár klón szekvenciájának elemzése ÖSSZEFOGLALÁS IRODALOMJEGYZÉK INTERNETES HIVATKOZÁSOK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS FÜGGELÉK Függelék: A WAX2-5 jelű gén (LOC ) exonjainak szekvenciái Függelék: A WAX4AMU2 gén és a cos4831 páros illesztése

3 1. BEVEZETÉS A környezet, amelyben élünk mikroorganizmusokban gazdag, melyekkel az élőlények sokrétű kölcsönhatásban állhatnak. A mikrobák egy része kórokozó hatású, fertőzést, betegséget okozhat, melyeket patogéneknek nevezünk, ide tartoznak a baktériumok, gombák, vírusok. Szinte az összes gazdaságilag fontos növényünk jelentős kórokozó körrel rendelkezik, melyek jelenléte súlyos gazdasági károkhoz vezethetnek, azonban a védekezés ellenük gyakran nehézkes. A kórokozók jelentős terméscsökkentő és minőségrontó hatásának felismerésével a betegség ellenállóság kialakítása egyre fokozottabb elvárás lett. Kezdetben a növénynemesítés során egyszerű keresztezésekkel próbálkoztak, azonban ez hosszadalmas és alacsony hatékonyságú folyamat, ráadásul sok esetben a kívánt tulajdonság mellett számos kedvezőtlen tulajdonság jelenlétével is számolni kellett. Később a tudomány fejlődésének köszönhetően egyre nagyobb teret nyertek a különböző biotechnológiai módszerek alkalmazása, melyek segítségével specifikusabban lehet a növények ellenállóságát fokozni. Nagy áttörést a különböző genetikai térképek elkészítése és a genomszekvenálás fejlődése hozott, mellyel számos élőlény genomja ismertté és ezáltal vizsgálható vált. A genomok ismerete utat nyitott annak kutatására, hogy mi állhat a rezisztenciák hátterében. Számos esetben megfigyelték, hogy a rezisztenciát különböző rezisztenciagének jelenléte okozza, melyek eltérő és gyakran eddig ismeretlen módon felelősek a rezisztenciáért. A rezisztencia gének genetikai térképezésén alapuló klónozása (map based cloning) egy új lehetőséget nyújthat az ellenálló növények körének szélesítésére azáltal, hogy az izolált rezisztencia gének bizonyos fajokba sikeresen bevihetők és kifejezhetők, és így e fajok ellenállósága is fokozható az adott betegségekkel szemben. Munkánk célja egy Agrobacterium rezisztenciáért felelős Vitis amurensis gén azonosítása és izolálása, mely később lehetővé tenné több ellenálló szőlőfajta és esetleg más gazdasági növény létrehozását. 3

4 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Az agrobaktériumok, mint növényi kórokozók Smith és Towsend bizonyította be először 1907-ben, hogy a golyvásodás hátterében bakteriális fertőzés áll. Végül 1942-ben kapta meg a patogén a ma is használatos nevét [Agrobacterium tumefaciens (Smith et Townsend)Conn] (Allen and Holding, 1974). A Rhizobiaceae családba tartozó agrobaktériumok talajlakó, Gram-negatív mikroorganizmusok, többségük szaprofitaként korhadó szerves anyagokon él, azonban találhatóak köztük olyan fajok, melyek a növények daganatos megbetegedését okozzák (Escobar and Dandekar, 2003). Kezdetben az általuk okozott megbetegedés alapján különítették el az Agrobacterium fajokat, mint a szőrősgyökerűséget (hairy root) okozó Agrobacterium rhizogenes, a málna szárán golyvásodást (cane gall) okozó Agrobacterium rubi, a gyökérgolyvát (crown gall) indukáló Agrobacterium tumefaciens és a szőlő koronagubacsos megbetegedését okozó Agrobacterium vitis. Az Agrobacterium radiobacter fajok nem patogén mikroorganizmusok (Allen and Holding, 1974). Később az Agrobacterium fajokat biokémiai és fiziológiai sajátságaik alapján három biotípusba sorolták, melyek közül a szőlőt a 3. biotípus károsítja (Süle, 1978). Az agrobaktériumok rendkívül széles gazdakörrel rendelkeznek, az általuk okozott tumoros megbetegedések a nyitvatermők és a kétszikűek akár 60%-át is érinthetik (Decleene and Deley, 1976). Egyedülállóan képesek a növényekkel géntranszfert megvalósítani, azaz genetikailag kolonizálva a növényt agrobaktérium géneket juttatnak át és fejeztetnek ki a növényben, amik kontrollálatlan sejtnövekedést és csak a kolonizáló baktériumok által metabolizálható speciális tápanyagok szintézisét okozzák (Schell et al., 1979). A tumorképzéshez szükséges genetikai információ a nagyméretű ( kb) tumor indukáló (Ti) plazmidon kódolt. A plazmidon két régió kulcsfontosságú a fertőzési folyamatban, a vir régió és a T-DNS. A virulencia gének felelősek a T-DNS-nek a baktériumból a növényi sejtekbe történő átjutásáért (Zaenen et al., 1974). 2.2 Az agrobaktérium fertőzés folyamata Valamilyen sebzés hatására a növényből különböző fenolos vegyületek (pl. acetosyringon) szabadulnak fel, melyet az Agrobacterium faj érzékelve hozzátapad a 4

5 növényhez, majd a vir génjei aktiválódása során előkészítik a T-DNS-t a transzferhez és a növényi genomba történő integrációhoz (Pu and Goodman, 1993). A Ti-plazmidon kódolódó VirA fehérje detektálja a növényi szignált, autofoszforiláció során aktiválódik és ezáltal képes lesz foszforilálni a VirG fehérjét, ami a többi virulencia gén aktiválódásához vezet (Burr et al., 1998). Az így termelődő VirD1 és VirD2 fehérjék közreműködésével a Tiplazmidról egyszálú kb hosszúságú DNS-fragment (T-DNS) keletkezik, mely két rövid, 25 bázispár hosszúságú ismétlődő szekvencia által behatárolt. A VirD2 fehérje a T- szál 5 -végéhez köt, majd a T-szál/Vir fehérje komplex a VirB és VirD4 fehérjék által alkotott IV-es típusú szekréciós apparátuson keresztül a növényi sejt citoplazmájába jut (Gelwin, 2003). A T-komplexen lévő nukleáris lokalizációs szignál segíti a sejtmagba jutást, ahol nem-homológ rekombinációval a növényi sejtmagi genomba integrálódik (Koncz et al., 1994). A genetikai transzformáció sematikus ábrázolása az 1. ábrán látható. 1. ábra: Az agrobaktérium általi genetikai transzformáció sematikus folyamata (Tzfira and Citovsky, 2006). A folyamat részletes leírása a szövegben található. 5

6 A T-DNS-en két fontos géncsoport különíthető el: az opin szintézisért felelős gének és az onkogének. A T-DNS növényi tumor indukálásért felelős onkogénjei megváltoztatják a fitohormonok szintézisét és a fertőzött sejtek érzékenységét, így eredményezve a tumor megjelenését. Az auxin szintézéséhez az iaam és iaah gének, a citokinin szinézishez az ipt gén szükséges (Binns and Costantino, 1998). A másik géncsoport olyan speciális anyagok termeltetésére kényszeríti a transzformált növényi sejteket, melyek csak a fertőző Agrobacterium faj számára hasznosítható, így teremtve számára saját ökológia niche-t. Ezek a speciális kisméretű molekulák az opinok, melyek aminosav és cukor vagy szerves sav összekapcsolódásával alakulnak ki. A Tiplazmidon helyezkednek el azok a gének, melyek az opinok felvételét és katabolizmusát segítik. Több, mint 20 fajta opin azonosítható, azonban egy törzs csak kevés félét képes termelni, a termelt opin alapján kategorizálhatóak is a törzsek: oktopin, nopalin és agropintípusúak (Dessaux et al., 1993; Escobar and Dandekar, 2003) Szőlő agrobaktériumos megbetegedése A szőlő agrobaktériumos golyvásodásáért elsősorban az Agrobacterium vitis, ritkábban az Agrobacterium tumefaciens felelős (Szegedi, 2007). Szőlőn a tünetek főleg a fás részeken figyelhetőek meg, de a gyökereken is előfordulhatnak (2. ábra), azonban a fiatal zöld hajtásokon sosem jelennek meg, mivel valószínűleg a fiatal hajtásokban még nincs jelen a patogén (Szegedi and Németh, 1996). A tumorok mindig a még osztódásra képes kambiális sejtekből alakul ki, melyek így nem tudják ellátni normál funkciójukat, azaz nem hoznak létre új háncs és fa elemeket, melyek következtében a növény tápanyagszállítása zavart szenved. Ezáltal a fertőzött tőkék a tumor kiterjedésétől függően legyengülnek vagy elpusztulnak. Emiatt a szőlőtermesztésben világszerte nagy károkat okoz a járványos megbetegedés (Szegedi, 2007). 6

7 2. ábra: A szőlő agrobaktérium által okozott golyvásodása (fotó: Szegedi Ernő). A szőlőben a betegség lefolyását két szakaszra tudjuk elkülöníteni. Az első (látens) szakasz tünetmentes, ekkor történik a baktériumok felszaporodása a növényben. Majd valamilyen sérülés, például fagyhatás hatására megindul a tumorképződés (Szegedi, 2007). Mivel jelenleg nincs megfelelő hatékonyságú védekezési mód a tumor képződés ellen, a legjobb megoldást az új, rezisztens fajták előállítása jelentené (Szegedi et al., 1984). Az 1960-as évek közepén tesztelték, hogy agrobaktériummal történő fertőzés során néhány Vitis fajon, például a V. labrusca és a V. amurensis nem képződtek tumorok (Tamm, 1954), és a rezisztencia számos hibridjükön is megfigyelhető volt. A Vitis vinifera alapvetően fogékony a betegségre, azonban a V. amurensis-ből keresztezéssel átvihető a rezisztencia lókusz, mely Mendeli, domináns öröklődést mutat, így a keletkező hibrid utód rezisztenssé válhat az agrobaktérium fertőzéssel szemben (Szegedi et al., 1984; Szegedi and Kozma, 1984) Az Rcg1 Agrobacterium rezisztenciagén térképezése A rezisztencia molekuláris hátterének megértéséhez nélkülözhetetlen a rezisztencia gén genetika térképezése és izolálása, melyhez az ilyen természetesen előforduló, ismeretlen funkciójú rezisztenciagének esetében a genetikai térképezésen alapuló génklónozás (map based cloning) nyújt lehetőséget. Ami során a keresett génnel szoros kapcsolatban lévő DNS 7

8 markerek keresése és azonosítása után a megfelelő klónok kiválogathatóak és szekvenciájuk meghatározható. A genetikai térkép elkészítéséhez a megfelelő térképező populáció előállítását követően különböző markerekre nézve meg kell határozni az egyedek genotípusát. Genetikai markereknek azokat a különböző tulajdonságokat meghatározó változatokat (allélok) nevezzük, melyek fenotípus vagy molekuláris szinten, a fehérjék vagy a DNS jellemzésével megkülönböztethetőek egymástól. A markerek a köztük lévő rekombinációs frekvencia meghatározásával különböző kapcsoltsági csoportokba rendezhetőek, melyek segítségével megszerkeszthető a genetikai térkép (Kole and Abbott, 2008). Az általunk tanulmányozni kívánt Agrobacterium rezisztencia, Rcg1 lókusz (resistance of crown gall) esetében az agrobaktérium fertőzéssel ellenálló V. vinifera Kunbarát és a fertőzésre fogékony V. vinifera Sárfehér fajták keresztezéséből származó BC2 hibridcsalád utódait illetve a szülőket vizsgálták különböző RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), SCAR (Sequenced Characterized Amplified Region) és SSR (Simple Sequence Repeat) markerekkel. Az adatok alapján megfigyelték, hogy a rezisztens Kunbarát fajta a V. amurensis teljes 15. kromoszómáját tartalmazza, amin az Rcg1 lókusz található. A markersorrend meghatározásával sikerült egy hozzávetőleges genetikai térképet szerkeszteni, illetve a markerek alapján vizsgálva a 15. kromoszóma szekvenciáját és összehasonlítva a Pinot Noir fajtáéval sikerült meghatározni, hogy az Rcg1 lókusz a 15. kromoszómán 7,87 Mb és 9,31 Mb között helyezkedik el (3. ábra) (Kuczmog et al., 2012). 3. ábra: Az Rcg1 régió genetikai térképe. A felső vonal a Pinot Noir 15. kromoszóma megfelelő részének a fizika térképét reprezentálja. Az alsó rész mutatja a Rcg1 régióban használt markerek sorrendjét és genetikai távolságaikat. A pontozott vonalak jelölik a DNS markerek helyét a 15. kromoszóma szekvenciáján. A térképtávolságok centimorganban (cm) értendők (Kuczmog et al., 2012). 8

9 A térképezési adatok arra utalnak, hogy az Rcg1 régióban szokatlanul nagy a rekombinációs frekvencia, mely a régió magas repetitív szekvencia tartalmának lehet következménye. A Pinot Noir genom szekvenciájának annotációja szerint ebben a régióban kilenc teljes vagy csonka WAX gén kópia található két csoportban. A WAX2-szerű (ECERIFERUM, CER2) gének hét kópiája található meg 9,040 Mb és 9,360 Mb között (4. ábra), illetve két további WAX2 homológ azonosítható 7,343 Mb és 7,549 Mb között. Egy átlagos WAX gén tíz exont tartalmaz és 7 kb kiterjedésű. 4. ábra: A Vitis vinifera 15. kromoszóma szekvenciája (12xWGS), melyen a nyilak jelzik a DCC1 és a WAX2 gének elhelyezkedését, a nyilak iránya mutatja a gének irányát. A kutatócsoportunk által előállított 15. kromoszómára homozigóta rezisztens szőlő esetében a rezisztencia génnel kapcsoltan feltehetőleg több és eltérő szekvenciájú WAX gén kópia található (Kutatócsoportunk még nem közölt eredményei). A WAX géncsoport egyik végén található DCC1 gén a Pinot Noirban egyedi szekvencia. A sokszoros ismétlődő szekvenciák miatt újabb, rezisztenciához kapcsolt genetikai markerek kifejlesztése nehézségekbe ütközött. A további cél a régió szekvenciájának a meghatározása lett. Ehhez el kellett készíteni egy szőlő géntárat a megfelelő genotípusú növényből, és azonosítani majd megszekvenálni a régióhoz tartozó klónokat. 9

10 2.5. Géntárak, vektorok A géntár egy organizmus teljes genetikai anyagát reprezentáló klónok gyűjteménye. Készítése során a DNS-t izolálják és darabolják, majd a gélelektroforézissel kiválogatott megfelelő méretű fragmenteket a választott vektorba klónozzák. A klónozó vektorok a klónozandó DNS hordozómolekulái, alkalmasak az idegen DNS tárolására és felsokszorosítására. A vektoroknak saját replikációs origóval kell rendelkezniük, ezáltal önálló replikációra képesek, tartalmazniuk kell egy szelekciós markert, és rendelkezniük kell klónozó hellyel, ez legtöbbször multiklónozó hely (MCS), amely a vektorban csak egyszer előforduló, egymás mellett elhelyezkedő különböző restrikciós endonukleáz hasítóhelyek, ezek segítik az inszert DNS beépülését. A ligálás után a vektorokat a megfelelő gazdaszervezetbe juttatva a klónok fenntarthatóak és vizsgálhatóak. A kísérleti organizmustól illetve a klónozandó DNS méretétől és típusától függően többféle könyvtár létrehozására van lehetőség (Sharma and Alex, 2017). A jelenlegi kísérletünkhöz a BAC, a YAC és a kozmid vektorok közül választottunk, melyek mind alkalmasak egy eukarióta géntár készítéséhez. A kozmid könyvtárak kifejlesztése nagy lépést jelentett a genetikai kutatások során, mivel kétszer akkora méretű inszert befogadására volt képes, mint az addig elérhető λ-fág vektorok. A kozmid vektorok ötvözik a plazmidok és a λ-fág vektorok előnyeit. A klónozandó DNS fágként csomagolódik be és jut be a sejtbe, de a sejtben plazmidként képes replikálódni. A λ-fág genomból csak a cos szekvencia jelenléte szükséges a plazmidon. A fágfejbe történő csomagolás limitált mérete miatt a bejuttatható inszert maximum 45 kb nagyságú. Tehát a kozmid vektorok előnye, hogy az in vitro pakolás hatékonysága jóval magasabb, mint a transzformációé. Hátránya, hogy a kisebb inszert méret miatt több klón előállítása szükséges, aminek tárolása és átvizsgálása nehéz és hosszadalmas (Preston, 2003; Sharma and Alex, 2017). A nagyméretű genomok még nagyobb inszertet befogadni képes vektorokat igényeltek, ezért fejlesztették ki a mesterséges kromoszóma vektorokat. A BAC (bakteriális mesterséges kromoszóma, bacterial artificial chromosomes) az E.coli F-plazmidján alapú vektor, mely nagyméretű, akár 350 kb méretű inszertek befogadására képes és alapvetően sejtenként egy kópiában van jelen. Az E.coli sejtekbe a géntár hatékonyan bejuttatható elektroporációval, melyekben több generáción keresztül stabilan képes fennmaradni. 10

11 A YAC (élesztő mesterséges kromoszóma, yeast artificial chromosomes) egy eukarióta eredetű vektor, amit plazmidként lehet szaporítani Escherichia coli sejtekben, az elkészített géntárat pedig Saccharomyces cerevisiae sejtekben tartják fent, ahol lineáris mesterséges kromoszómaként replikálódik. Az élesztőben való replikációhoz nélkülözhetetlen az élesztő kromoszómáról három szerkezeti elem: az ARS (autonomously replicating sequence), a centromer (CEN) és két telomer (TEL). Akár kb nagyságú inszertet is képes hordozni, azonban alacsonyabb stabilitással jellemezhető (Monaco and Larin, 1994; Sharma and Alex, 2017). A megfelelő könyvtár kiválasztásához meghatároztuk, hogy a Vitis vinifera genom reprezentálásához a különböző könyvtárak esetében mennyi klón létrehozása szükséges, ehhez a Clarke- Carbon összefüggést hívtuk segítségül, amivel kiszámolható, hogy hány klón szükséges a teljes genom reprezentálásához (Clarke and Carbon, 1976). A Vitis vinifera genomja 486,2 Mb nagyságú. Kozmid könyvtár készítése során átlagos 40 kb-os inszert mérettel számolva klón előállítása szükséges, hogy a teljes szőlő genom reprezentálva legyen 99,5%-os valószínűséggel. BAC könyvtár esetében átlag 150 kb-os inszerttel számolva csak klón, míg az átlag 500 kb-os inszert méretű YAC esetében csupán klón szükséges. Tehát BAC illetve YAC könyvtár esetében lényegesen kevesebb klón előállítása szükséges, ami megkönnyíti a klónok tárolását és későbbi átvizsgálását, azonban ezek követélményeinek megfelelő nagyméretű DNS előállítása technikailag nagyon nehéz. Jelen esetben is ebbe a problémába ütközve végül a kozmid könyvtár készítése mellett döntött a kutatócsoport klón eltevése és tárolása lehetőségeinket meghaladó munka lett volna, ezért célszerűbbnek tűnt csoportokban eltenni a géntár klónjait. Különböző tesztek eredménye alapján végül a 96 zsebes mikrotiter lemez minden egyes zsebébe klónt helyeztek, így 670 darab mikrotiter lemez helyett akár 34 darab mikrotiter lemez is elégséges a teljes reprezentációhoz. A kozmid géntár készítésénél a lehetséges vektorok közül a CopyRight v2.0 vektorra esett a választás, számos előnyös tulajdonsága miatt CopyRight v2.0 vektor A kozmid könyvtár készítéséhez a CopyRight v2.0 psmart FOS vektort (Lucigen Corporation, Middleton, USA) használtuk, mely az E.coli F-plazmidján alapuló kozmid 11

12 vektor. A vektor mérete 7,5 kb és kb nagyságú inszertet képes hordozni az in vitro bepakolás után. Az egykópiás replikációs origó mellett tartalmaz egy indukálható közepeskópia (medium copy) replikációs origót is, ami lehetővé teszi az alapvetően egy kópiában jelenlévő plazmid in vivo felsokszorozódását. Az egykópiás állapot az ori2 (oris) replikációs origó, a repe gén és a parabc megoszlási lókusz által szabályozott. Indukálva a TrfA replikátor fehérje génjét aktiválódik a közepeskópia replikációs origó (oriv), ami a plazmid sejtenkénti akár 50 kópiára történő amplifikálódását eredményezi (5. ábra). A vektor klóramfenikol rezisztencia gént tartalmaz, ezt kihasználva válogattuk ki az inszertet tartalmazó klónokat. Emellett a feldolgozatlan vektor más direkt szelekciós markereket is tartalmaz, a lacz/sacb géneket, melyek szintén segítik az üres, vágatlan vektort tartalmazó sejtek kiválogatását. A Bacillus subtilis levansucrase enzimét kódoló sacb letális az E. coli sejtek számára 5% szacharóz jelenlétében, mivel a levansucrase enzim a szacharózt az E. coli számára toxikus levánná alakítja, így csak a sikeres inszerción átesett és ennek következtében elromlott sacb gént tartalmazó sejtek maradnak életben. Szacharóz hiányában a lacz gén jelenléte miatt kék-fehér szelekcióval is kiválogathatóak a klónok (Sharma and Alex, 2017, 1. weboldal). 5. ábra: psmart FOS vektor szerkezete. sacb - levansucrase gén, lacz β-galaktozidáz α-peptidje, Cm r klóramfenikol rezisztencia gén, ori2 egy kópiás replikációs origó, oriv indukálható replikációs origó, par A,B,C- aktív megosztási rendszer (partitioning) gének, cosn - lambda csomagolási szignál; T - transzkripció terminátor (1. weboldal). 12

13 3. A MUNKA ELŐZMÉNYEI A géntár készítéshez célszerűnek látszott egy, az Rcg1 rezisztencia lókuszra és környezetére homozigóta szőlővonal előállítása, ami megkönnyíti a rezisztencia gén közelében lévő klónok azonosítását. Az elmúlt években több heterozigóta vonal önbeporzásával is olyan utód populációkat állítottak elő, melyek tartalmazták a kívánt homozigóta egyedeket. Ezt különböző DNS markerek segítségével igazolták. A géntár készítéséhez az Rcg1 régióra homozigóta növényből tisztítottak DNS-t, sejtmag izolálás után (nem publikált eredmények). A kutatás következő lépcsője egy géntár elkészítése volt, amihez a szőlő DNS random összetörése után PFGE futtatás segítségével válogatták ki a megfelelő méretű (35-45 kb) fragmenteket, melyeket a CopyRight v2.0 vektorba ligálták be. A fágok összeszerelődését követően ezzel a fágszuszpenzióval fertőzték a Replikátor FOS törzseket, melyek genotípusa: F mcra Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) enda1 reca1 φ80dlaczδm15 ΔlacX74 arad139 Δ(ara,leu)7697 galu galk rpsl (Str R ) nupg (attl arac-pbad-trfa250 bla attr) λ. A klónokat klóramfenikol tartalmú LB táptalajon növesztették fel. Én a géntár klónok eltevésénél és a megfelelő géntár klónok azonosításánál csatlakoztam a kutatáshoz. 13

14 4. CÉLKITŰZÉSEK Kutatócsoportunk távlati célja az Agrobacterium fertőzéssel szembeni rezisztenciát kialakító Rcg1 rezisztenciagén azonosítása és a rezisztencia molekuláris biológiai hátterének megismerése. Ennek érdekében a jelen munkában a következő célokat tűztük ki magunk elé: 1. Egy megfelelően reprezentatív szőlő géntár létrehozása 2. Az Rcg1 lókusz környezetében azonosított WAX és DCC1 géneket tartalmazó géntár klónok izolálása és szekvenciájuk meghatározása, a régió teljes szekvenciájának meghatározása érdekében. 14

15 5. ANYAGOK ÉS MÓDSZER 5.1. A géntár elkészítése és tárolása A géntárat reprezentáló klóramfenikol rezisztens telepeket tartalmazó normál, kilenc centiméter átmérőjű Petri-csészékről minden egyes kisméretű, hat centiméter átmérőjű Petricsészére db telepet szaporítottunk tovább (átcsíkozással). Másnap a kisméretű Petricsészéken felnőtt telepek LB 15% glicerin tároló folyadékban történő felszuszpendálást követően csoportonként μl folyadékot helyeztünk párhuzamosan két 96 zsebes, 500 μl zsebtérfogatú MegaBlock mikrotiter lemez egy-egy zsebébe. Ezen felül az egy sorba tartozó minden csoportból μl mintát összegyűjtöttünk egy Eppendorf csőbe. Így a lemez zsebenként klónt, míg az egyes sorokban lévő 12 zsebet összesítő Eppendorf cső 12*20, azaz 240 klónt tartalmazott. A 240 klónt tartalmazó mintákat használtuk fel a géntár klónok azonosításának első lépéseként (5.2. fejezet). Egy mikrotiter lemezre 96*20, azaz 1920 klónt helyeztünk és összesen 40 mikrotiter lemezt töltöttünk meg, így összesen klónt tartalmaz az elkészített géntár. A párhuzamosan elkészített két-két mikrotiter lemez közül az egyik -80 C-ra került a hosszú távú tároláshoz, míg a másikat -20 C-on tárolva a mindennapi klónkeresésre használtuk fel A géntár klónok azonosítása specifikus primerekkel A klónok keresésére PCR reakciókat használtunk, melyekhez WAX és DCC specifikus primereket alkalmaztunk (1. táblázat). A mikrotiter lemezek egy-egy sorának összes klónját (240 klón) tartalmazó mintákat használtuk fel a géntár klónok azonosításának első lépéseként, amivel meghatározhattuk, hogy mely mikrotiter lemez melyik sorában található egy-egy keresett klón (6. ábra). Ezáltal csupán nyolc PCR reakcióval megállapítható, hogy melyik sor tartalmaz pozitív klónt. A klónkeresés második lépéséhez 12 PCR teszt szükséges a soron belüli pozitív zseb azonosításához. Végül a géntár klónok azonosításának harmadik lépésénél a pozitív zseb tartalmát egyedi telepekre hígítását (-5x,- 6x) követően 200 klónt szaporítottunk fel egyedileg LB klóramfenikol tartalmú táptalajon, majd kolónia PCR segítségével teszteltük a pozitív klón jelenlétét, először tíz-tíz klónonként, majd pozitív csoport találása után a tíz klón egyedi PCR tesztjével. 15

16 5.3. PCR A klónok keresésére, átvizsgálására polimeráz-láncreakciókat (PCR) használtunk, melyekhez a 1. táblázatban feltüntetett WAX és DCC1 specifikus primereket alkalmaztunk. A reakció körülményei 24 μl-ben: 0.2 mm datp, 0.2 mm dctp, 0.2 mm dgtp, 0.2 mm dttp, 1.5 mm MgCl2 (1-4 mm), nm primer, 20 ng templát DNS, 1 U Taq polimeráz, 1xPCR puffer (10 mm TRIS-pH: 8,8; 50 mm KCl; 0,08% Nonidet P40). Az alkalmazott PCR programot az 2. táblázat tartalmazza. A reakció során pozitív kontrollként szőlő DNS-t, illetve a klónok keresése során az előző munkafolyamatban talált pozitív mintát használtuk 1. táblázat: Alkalmazott primerek Primer Nukleotid szekvencia (5-3 ) WAX001 WAX001R DCC1 DCC1-1R WAX005R B5602 B8102 B8103 GATGCTCCACAAG GGAAGGGAAATATGGAGAAG TTTGTTATTTTAATTGGTTTGCG TTGCTTGAATTTTGGAGTTC GCATAATTTTTTGAAAGAGCCAA GAAATCCTAAGCTCAAAATCAAG CAAGTGGCTCTTCTCCATA GGTGTGATGTAGAGTGAAAC (T m= 58 C+/-1 C) 2. táblázat: Alkalmazott PCR reakció Program 1. 5:00 95 C 2. 0:30 95 C 3. 0:30 58 C 4. 0:40 72 C 5. 35x go to 2 6. end 16

17 5.4. Agaróz gélelektroforézis A PCR reakciók után a DNS fragmentek elválasztására 2%-os agaróz gélt használtunk, melyet TBE pufferrel készítettünk (89 mm Tris, 89 mm Bórsav, 2 mm EDTA) és 0,1 μg/ml végkoncentrációban etídium-bromidot adtunk hozzá. Az elválasztás előtt a DNS mintákhoz 0,2 térfogatnyi 5xSTOP (10 % ficoll-400, 0.25M EDTA ph: 8.0, 0.2 % brómfenolkék) oldatot adtunk. A futtatásokhoz 100 bp GeneRuler DNS Ladder Plus-t (fragmentek hossza: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1031, 1200, 1500, 2000, 3000 bp; az aláhúzottak erősebben látszanak a gélen) alkalmaztunk (FERMENTAS). A kiértékelést BioDoc-It M fotodokumentációs rendszer (BioImaging system, segítségével végeztük Plazmid DNS izolálás Az Ish-Horowicz és Burke módszert használva alkalikus lízissel preparáltuk a plazmid DNS-t (Ish-Horowicz and Burke, 1981). Az E. coli sejteket egy éjszakán át 3-3 ml LB tápfolyadékban, a megfelelő antibiotikum jelenlétében növesztették, majd a plazmid instabilitásának csökkentése érdekében és kihasználva az arabinózzal indulkálható kópiaszám növelést, még 4 órán át lettek növesztve a sejtek arabinóz jelenlétében. Ezután 1,5 ml baktériumkultúrát 20 másodperces centrifugálását követően, a felülúszót leöntve a leülepedett sejteket 100 μl TEG oldatban (50 mm glükóz, 25 mm Tris, 10 mm EDTA, ph:8.0) szuszpendálták fel. A sejtek feltárása 200 μl NS oldat (0,2 N NaOH, 1 % SDS) hozzáadásával és óvatos keveréssel történt. A minták 5 perces 0 C-os inkubálását követően 160 μl hideg NaAc (3 M NaAc, ph:4.8) hozzáadása után pelyhes csapadék megjelenéséig rázzuk. 5 perces 0 C-os inkubálás után 5 perc centrifugálás következett, majd a felülúszóból kb. 400 μl izopronallol történt a plazmid DNS kicsapása. A minták 5 perces 0 C-on történő inkubálása után újra 5 perc centrifugálás következett, majd ezt 70 %-os etanollal történő mosás és szárítás követte. A csapadékot 100 μl TRIS-Ac oldatban (50 mm Tris, 100 mm NaAc, ph:8.0) oldották fel és 200 μl 96%-os etanollal csapták ki ismét. Az 5 perces inkubálás, centrifugálás, mosás és szárítás ismétlése után a kapott DNS-t μl RNáz ( μg/ml) tartalmú steril desztillált vízben oldották fel. A DNS minták szekvenálásához a DNS további tisztítására volt szükség. A mintákhoz 0,1 térfogat 10% SDS és 1 térfogat 7,5 M NH4Ac hozzáadását követően 20 percig -20 C-on történt az inkubáció, majd 5 perces centrifugálás után a felülúszókat új csőbe 17

18 pipettázták át. Ezekhez 0,6 térfogat izopropanolt adva 20 percig -20 C-on lettek inkubálva, majd 70%-os etanolos mosás és szárítás következett. A keletkezett csapadék 40 μl steril desztillált vízben lett felvéve DNS szekvencia meghatározás A munkánk során tisztított DNS minták nukleotid szekvenciáit új-generációs szekvenálással (NGS) határozták meg. A szekvenálást a Szentágothai János Kutatóközpontban a Mikrobiális Biotechnológiai Kutatócsoport tagjai végezték az Ion Torrent PGM készülék segítségével DNS szekvencia elemzés A DNS szekvenciák elemzése különböző bioinformatikai programok használatával végeztük. Először a vektor szekvenciájának megkeresése és eltávolítása történt. Az inszert a vektorba a PmlI klónozó helynél épült be, ezáltal a vektor szekvencia két végét cac-gtg határolta, ezek előtt, illetve után található az inszert. A vektor szekvenciájával történő egyszerű keresés nem mindenesetben hoz sikert, ennek több oka is lehet. Lehetséges, hogy a szekvencia fordítva van, ilyenkor megvizsgáljuk a reverz komplementerét, vagy néhány bázis eltér a szekvenciában, ilyenkor érdemes jellegzetes motívumokra keresni, mint például a cac-gtg közelében lévő gcggccgc motívum (NotI hasítóhely). Különböző génkereső programok segítségével meghatározható, hogy az adott szekvenciában milyen kódoló szakaszok prediktálhatóak, ezek mekkora kiterjedésűek és irányúak, illetve kiíratható az általuk kódolt fehérjék szekvenciája is. A szekvenciák vizsgálatához az FGENESH (2. weboldal), egy eukarióta génkereső program Vitis vinifera fajokra érzékenyített verzióját használtuk. Az FGENESH által prediktált fehérjék azonosítására a BLASTP (3. weboldal) fehérjeszekvenciák elemzésére alkalmas programot használtuk, mely megmutatja, hogy a fehérje adatbázisban fellelhetőek-e a prediktált fehérjékkel teljesen vagy részben homológ fehérjék. Az eredmény során számszerűen és ábrán is jelzi a homológia mértékét. Első körben érdemes a Vitis vinifera genom oldalán (4. weboldal) elérhető BLASTP alkalmazást használni a szőlő specifikus fehérjék keresésére, majd a BLASTP teljes adatbázisát 18

19 használni a nemszőlő, például különböző transzpozonok jelenlétének vizsgálatára. A rokonfehérjék alapján következtethetünk a prediktált fehérje tulajdonságaira, funkciójára. Esetünkben a keresés elsősorban a DCC1 és a WAX génekre irányult. Érdemes lehet a szekvenciák BLASTX (2. weboldal) futtatását is elvégezni, mely mind a hat lehetséges leolvasási keretben vizsgálja a szekvenciákat a lehetséges összes kódoló rész és az általuk kódolt fehérjék megtalálása végett. Az FGENESH program nem feltétlenül képes a szekvenciában jelenlevő összes exont megfelelően detektálni, ezért érdemes a BLASTN (2. weboldal) nukleotidszekvencia elemző program segítségével összehasonlítani a szekvenciákat a WAX gének mind a 10 exon szekvenciájával (Pinot Noir 15. kromoszómáján található WAX2-5 jelű gén exon szekvenciái, lásd Függelék). Az exon szekvenciákkal történő vizsgálat segítségével a csonka, elmutált gének is kimutathatóak. A szekvenciák beillesztése után az Align two or more sequences funkció segítségével elvégezzük az irányított BLASTN elemzést. Az eredmény számszerűsítve kiírja az azonosság mértékét és ábrán is jelzi a bázisok egyezését. A megtalált hasonló exon szekvenciák segítségével könnyen beazonosítható a szekvenciákban az exonok helye, melyeket nagybetűvel jelölünk ki a szekvenciákban. Ezután, szintén a fenti BLAST alkalmazás segítségével, ellenőrizzük, hogy melyik klón szekvenciája mutat hasonlóságot a korábbi kísérletek során a különböző specifikus primerek és markerek segítségével meghatározott WAX szekvenciákkal. Két szekvencia pontos illesztését a PAIRWISE (5. weboldal) páros illesztőprogram segítségével végeztük. 19

20 6. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 6.1. A géntár klónok eltevése és tárolása Az eddig elkészített klónt tartalmazó géntár átvizsgálása során a DCC1 primerekkel eddig összesen hat zseb bizonyult pozitívnak, melyekből négy klónt sikerült azonosítani és megszekvenálni. A WAX specifikus primerekkel eddig 14 pozitív zsebet sikerült azonosítani. Ezekből eddig hat klónt sikerült izolálni és megszekvenálni. További öt klón azonosítása során nem jártunk sikerrel, a pozitív PCR ellenére több, mint 400 telep levizsgálása után sem tudtuk azonosítani az egyedi klónt. Úgy tűnik, hogy a klónok egy része valami ok folytán instabil. Ez a klón azonosítás több fázisában is előfordult. Volt, hogy a pozitív sor és zseb azonosítása ellenére a pozitív klónt egyedi telepek formájában lehetetlen volt azonosítani, illetve hogy a pozitív reakciót adó egyedi klón tisztítás közben elveszett és már nem adta a PCR reakciót. Ennek több oka is lehet. Lehetséges, hogy vannak olyan klónok, melyek így nem fenntarthatóak E. coli-ban, vagy, hogy a kis Petri-csészére történő továbbszaporítás során valamelyik csík kevert telepből állt, így csak töredékében tartalmazta az adott pozitív klónt, ami túl alacsony mennyiségű jelenléte miatt később már nem volt azonosítható. A géntár klónok készítésének sematikus ábrázolása az 6. ábrán látható. 20

21 6. ábra: Az ábrán a géntár elkészítésének és a klónok keresésének sematikus folyamata látható. (A) A kozmid géntár eltevése és a pozitív sor azonosítása. (B) A soron belül a pozitív zseb azonosítása. (C) A pozitív klón azonosítása. A római számok a klónkeresési lépéseket jelölik. A folyamat részletes leírása az 5.1. fejezetben található A géntár klónok azonosítása specifikus primerekkel A géntár klónok azonosítása többlépcsős folyamat során DCC1 és WAX génekre specifikus primerekkel történt (6. ábra, 1. táblázat). A pozitív klón azonosításához először a mikrotiter lemez egy sorát, majd a zsebet, végül magát a telepet azonosítottuk. Az eltevés során a mikrotiter lemez soronkénti összes zsebéből származó 240 klón került egy-egy Eppendorf csőbe, így kiderült melyik mikrotiter lemez melyik sorában található pozitív klón. A pozitív sor beazonosítása után a zsebenként történő PCR teszttel azonosítottuk melyik a 21

22 pozitív zseb. Ennek tartalmát egyedi telepekként történő felnövesztését követően, először kolónia PCR-ral meghatároztuk, hogy melyik tízes csoportban található a keresett klón, majd újabb kísérletben az egyedi klónt is azonosítottuk. Szemléltetésképpen az 7. ábrán látható az egyik mikrotiter lemezen megtalált pozitív soron belüli pozitív zseb azonosítása. Az 8. ábrán pedig a pozitív zseb tartalmának tíz telepre történő leszűkítését figyelhetjük meg, mely során kiderült, hogy a pozitív klón az első tíz egyedileg továbbszaporított telep között van. 7. ábra: A gélfotón a pozitív zseb azonosítása látható. Az ötös számú mikrotiter lemez C sorának tesztelésekor az ötös zseb adott pozitív reakciót, azaz az ötös zsebben található a keresett klón. A hetedik oszlopban található a DNS Ladder, a 14. oszlopban pedig a pozitív kontroll, ami a sorazonosításból származó pozitív minta (Nagy Dávid). 8. ábra: A gélfotón az ötös számú mikrotiter lemez A sorának hatodik zsebéből továbbszaporított egyedi telepek tízes csoportjainak tesztelése látható. Az első tízes csoport adta a reakciót, azaz abban található a keresett klón. Az ábrán látható (a) és (b) a pozitív kontrollt jelenti, az (a) a pozitív zsebből származó minta, míg a (b) szőlő DNS. Az utolsó helyen (L) látható a DNS Ladder (Nagy Dávid). 22

23 Az általam elemzett két kozmid klón szekvencia, a cos4820 és cos4831, melyek a B5602/WAX005R primerpárral lettek kiszedve. Szekvenálásukat Urbán Péter végezte a Szentágothai János Kutatóközpont Genomikai Laborjában A cos4820 géntár klón szekvenciájának elemzése A cos4820 klón szekvenciája egy bázispár hosszú összefüggő részből áll, melynek elején és végén azonosítható a vektor szekvenciája. Ennek eltávolítását követően az FGENESH program Vitis vinifera génekre érzékenyített verziója a bázispár hosszú szekvenciában négy gén, illetve 14 exon jelenlétét jelezte. A négy gén által kódolt feltételezett fehérjék BLASTP elemzését elvégezve megállapítható, hogy az első, második és a negyedik gén egy-egy ismeretlen tulajdonságú Vitis vinifera fehérjével mutat némi hasonlóságot az adatbázisban, míg a második gén esetében található részleges homológia egy RNase H retrotranszpozon szekvenciával is. A harmadik gén által kódolt fehérje nagy hasonlóságot mutatott egy WAX fehérjével, tehát a kilenc exonból álló gén egy csonka WAX génnek tűnt. Ennek ellenőrzésére irányított BLASTN elemzést végeztünk a cos4820 szekvencia és a WAX gén exonok között, mely során kiderült, hogy mind a tíz WAX exon néhány bázis eltéréssel megtalálható volt a szekvenciában, tehát egy teljes WAX gén azonosítható. A 9. ábrán látható a cos4820 kozmid klón szekvenciáján predikált gének sematikus ábrázolása. A szekvenciát az illesztőprogram segítségével összehasonlítva az előzőleg azonosított WAX szekvenciákkal kiderült, hogy megtalálható a cos4820 kozmid klón szekvenciájában a WAX2-3b jelű gén 5 - nem kódoló régiója és nyolc exon szekvenciája (exon 1-8)( bázispár), sőt utána megtalálható még a 9. és 10. exon is, tehát a teljes WAX2-3b gén azonosítható a géntár klón szekvencián. 23

24 9. ábra: A cos4820 klónon prediktált gének elhelyezkedése A cos4831 géntár klón szekvenciájának elemzése A cos4831 kozmid klón szekvenciája nem volt egybefüggő, négy kontigból állt. A vektor szekvencia az első kontig közepén volt azonosítható, azonban a vektor szekvencia eltávolítását követően az első kontig két része nem illeszthető össze, mert nem ismert a kontigok pontos sorrendje. Mind az öt különálló rész (1.a,1.b,2.,3.,4. kontigok) esetében külön végeztük el a génkeresést az FGENESH programmal. A génkereső program az első kontig egyik részében sem talált prediktálható kódoló szakaszt, azonban a BLASTX elemzés az 1.a részben talált egy valószínűleg csonka, nem működő citokróm b6/f komplex VI. alegységét kódoló domént, az 1.b kontigban pedig egy Ty1/Copia family retrotranszpozáz domént. Az FGENESH a második, bázispár hosszú kontig esetében egy három exonból álló gént azonosított, és az általa kódolt fehérje a BLASTP adatbázisban egy ismeretlen Vitis vinifera fehérjével és MULE transzpozáz elemekkel mutatott hasonlóságot. A harmadik, bázispár hosszú kontigban a program egy csonka gén, négy exonjának jelenlétét jelezte. A kódolt fehérje egy WAX fehérjével mutatott bizonyos homológiát. A negyedik, bázispár hosszú kontigban szintén egy csonka gén, hat exonjának jelenlétét jelezte. A kódolt fehérje szintén WAX fehérje részlettel mutatott hasonlóságot. A WAX exonok helyének azonosítására a klón szekvenciája és a tíz WAX exon között irányított BLASTN elemzést végeztünk, ami bizonyította, hogy a harmadik kontigban az első négy, míg a negyedik kontigban az exon volt megtalálható, tehát ebben a klónban is egy 24

25 teljes WAX gén volt megfigyelhető. Az exonok megfelelő irányba állása miatt érdemes a harmadik és negyedik kontig szekvenciájának reverz komplementerét venni (10. ábra). Ezután ellenőrizve, hogy az előzőleg meghatározott WAX szekvenciákkal található-e homológia, kiderült, hogy a bázispártól a bázispárig tartó szekvencia részlet (4. kontig) tökéletes egyezést mutat a már korábban meghatározott WAX4AMU2 szekvenciával (az illesztést lásd a Függelék-ben). Így a WAX4AMU2 szekvencia eddig beazonosított 5-9. teljes exon és csonka 10. exon szekvenciája mellett fény derült az első négy exon szekvenciájára is, tehát a teljes WAX4AMU2 gén kódoló rész szekvenciája ismertté vált. 10. ábra: A cos4831 klónon prediktált gének elhelyezkedése (A kontigok sorrendje a többi átfedő klón segítségével lett megállapítva). Az újonnan megismert illetve kiegészített szekvenciák felhasználhatók arra, hogy új PCR alapú markereket lehessen az egyedi szekvenciájukra tervezni, melyekkel a géntár átfedő klónjainak eddig még nem ismert szekvenciái is azonosíthatók. Érdemes lehet a szekvenciákban lévő transzpozon szekvenciákat is megvizsgálni, mert beépülhetnek olyan helyre transzpozonok, melyek Pinot Noir illetve más fajtákban nincsenek ott jelen. Így ezeket az egyedi szekvenciákat is fel lehet használni új DNSmarkerek tervezésére. 25

26 7. ÖSSZEFOGLALÁS Gazdasági növényeinket számos súlyos betegség veszélyeztetheti, ilyen az Agrobacterium törzsek által okozott tumoros megbetegedés is, mely a szőlő és gyümölcstermesztésben világszerte jelentős károkat okoz. A fertőzés szisztematikus jellege miatt a leghatékonyabb védekezést az ellenálló fajták létrehozása jelentené. Megfigyelték, hogy a V. amurensis fajok, illetve a tőlük származó domináns, egygénes Agrobacterium (Rcg1) rezisztenciát hordozó V. vinifera hibrid utódok is ellenállóak a patogén törzsekkel szemben. A munkánk távlati célja ennek az Rcg1 lókusznak az azonosítása és a rezisztencia molekuláris hátterének feltárása. A rezisztencia gén azonosítására a genetikai térképezésen alapuló klónozás nyújt lehetőséget. Az elmúlt években különböző DNS markerek használatával sikeresen meghatározták, hogy az Rcg1 lókusz a 15. kromoszómának nagyjából a közepén helyezkedik el. Az ismert Pinot Noir genomszekvencia alapján megállapítható, hogy ez a régió gazdag ismétlődő szekvenciákban. Ezek WAX2-szerű (ECERIFERUM), Arabidopsis-ban CER2 gének, melyek számos kópiában fordulnak elő és a kutikula viasz minőségét befolyásolják. Az Rcg1 lókuszt tartalmazó régió szekvenciájának megismeréséhez első lépésként elkészítettünk egy kozmid géntárat egy rezisztens növényből származó DNS-ből kiindulva. Különböző WAX specifikus primerekkel történt a régió első klónjainak azonosítása. Ezek közül két klón szekvenciáját elemeztem. Mindkét általam elemzett kozmid klón, a cos4820 és cos4831, szekvenciájában megtalálható egy teljes WAX gén mind a tíz exonjával. Sőt ezeket összehasonlítva a korábban markerek és primerek segítségével meghatározott WAX szekvenciákkal, tökéletes egyezést mutatnak a meglévő WAX2-3b és WAX4AMU2 részleges szekvenciákkal, ráadásul felfedték ezen szekvenciák eddig ismeretlen részeit is, így a teljes WAX2-3b és WAX4AMU2 szekvencia ismertté vált. Az átfedő klónok segítségével meghatároztuk a cos4820 és cos4831 klónon prediktált gének elhelyezkedését. A további, átfedő géntár klónok azonosításával és e szekvenciák elemzésével remélhetően összeállítható a rezisztenciagént tartalmazó régió szekvenciája, és azonosítható az Rcg1 lókusz is. 26

27 8. IRODALOMJEGYZÉK Allen, O. N. and Holding, A. J. (1974): Genus II. Agrobacterium. In: Bergey s Manual of Determinative Bacteriology, 8th Edition : , eds.: Buchanan, R. E. and Gibbons, N. E., Williams and Wilkins Co, Baltimore. Binns, A.N. and Costantino, P. (1998): The Agrobacterium oncogenes. In: The Rhizobiaceae: , eds.: Spaink, H.P. et al., Academic Publishers, Kluwer. Burr, T. J., Bazzi, C., Süle, S., Otten, L. (1998): Crown gall of grape: Biology of Agrobacterium vitis and the development of disease control strategies. Plant Disease 82: Clarke, L., Carbon, J. (1976): A Colony Bank Containing Synthetic Col El Hybrid Plasmids Representative of the Entire E. coli Genome. Cell 9: Decleene, M. and Deley, J. (1976): The host range of crown gall. Bot. Rev. 442: Dessaux, Y., Petit, A., Tempé, J. (1993): Chemistry and biochemistry of opines, chemical mediators of parasitism. Phytochemistry 34: Escobar, M. A., Dandekar, A. M. (2003): Agrobacterium tumefaciens as an agent of disease. Trends Plant Sci 8: Gelvin, S. B. (2003): Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the gene-jockeying tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67: Ish-Horovicz, D., and J. F. Burke (1981): Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl. Acids Res. 9: Kole, C., Abbott, A.G. (2008): Principles and practices of plant genomincs. Volume 1: Genom mapping: 393. Science Publishers. Enfield, NH, USA. 27

28 Koncz, Cs., Németh, K., Rédei, Gy., Schell, J. (1994): Homology recogniotion during T- DNA integration into the plant genome. In: Homologous recombination and gene silencing in plants: , ed.: J. Paszkowszki, Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherland. Kuczmog, A., Galambos, A., Horváth, Sz., Mátai, A., Kozma, P., Szegedi, E., Putnoky, P. (2012): Mapping of crown gall resistance locus Rcg1 in grapevine. Theor Appl Genet 125: Monaco, A. P., Larin, Z. (1994): YACs, BACs, PACs and MACs: artificial chromosomes as research tools. Trends Biotechnol, 12: Preston, A. (2003): Choosing a cloning vector. Methods in Molecular Biology 235: Pu, X.-A., Goodman, R. N. (1993): Attachment of Agrobacteria to Grape Cells. App Environ Microb 59: Schell, J. et al. (1979): Interactions and DNA transfer between Agrobacterium tumefaciens, the Ti plasmid, and the plant host. Proc. R. Soc. London Ser B 204: Sharma, G., Alex, L. (2017): Vectors: Its importance in biotechnology and different types of vectors. Recent Advances in Biotechnology 2: Süle S. (1978): Biotypes of Agrobacterium tumefaciens in Hungary. J Appl Bacteriol 44: Szegedi, E. (2007): Az Agrobaktériumos golyvásodás biológiája és az ellene való védekezés. Kertgazdaság 39: Szegedi, E., Korbuly, J., Koleda, I. (1984): Crown gall resistance in East-Asian Vitis species and in their V. vinifera hybrids. Vitis 23: Szegedi, E., Kozma, P. (1984): Studies on the inheritance of resistance to crown gall disease of grapevine. Vitis 23:

29 Szegedi, E., Németh, J. (1996): Szőlő hajtások Agrobacterium vitis tartalmának vizsgálata. Növényvédelem 32: Tamm, B. (1954): Experimentelle Untersuchungen über die Verbreitung des bakteriellen Pflanzenkrebses und das Auftreten von Sekundärtumoren. Arch Mikrobiol 20: Tzfira, T., Citovsky, V. (2006): Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Curr Opin Biotechnol 17: Zaenen J, Van Larebeke N, Tenchy H, Schell J. (1974): Supercoiled circular DNA in crown gall inducing Agrobacterium strains. J. Mol. Biol. 86:

30 9. INTERNETES HIVATKOZÁSOK 1. weboldal: A CopyRight vektor leírása: Cloning%20Kits.pdf 2. weboldal: FGENESH eukarióta gén prediktáló program: 3. weboldal: BLAST, homológia keresés nukleotid és fehérje szekvencia adatbázisokban: 4. weboldal: Vitis vinifera genom oldala 5. weboldal: EMBOSS Needle, szekvenciák páros illesztése: eotide 30

31 10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Szeretném megköszönni a lehetőséget, hogy a Pécsi Tudományegyetem Természettudományi Karának Biológiai Intézetében, a Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszéken készíthettem el a diplomamunkámat. Hálás köszönettel tartozom témavezetőimnek, Dr. Putnoky Péternek és Dr. Kuczmog Anettnek munkám irányításáért, hasznos tanácsaikért, rengeteg segítségükért gyakorlati és elméleti téren is. Köszönöm a tanszék összes munkatársának, hogy segítségükkel hozzájárultak a munkám elkészüléséhez. Végül köszönöm családomnak és barátaimnak a bíztatásért és támogatásért. 31

32 11. FÜGGELÉK Függelék: A WAX2-5 jelű gén (LOC ) exonjainak szekvenciái A gén a Pinot Noir genomban a 15 kromoszóma bp és bp közötti szakaszán helyezkedik el. >1ex ATGGCTTCTAAACCTGGAATACTCACTGATTGGCCATGGACGCCTCTTGGCAACTTCAAG >2ex TACGTGGTCTTGGCACCATGGGCGATTCATGCCATACACTCGTTCCTAGTGAAAGATGAAAAGGAGAGAGACGTTGCTCAC TTTCTAATATTCCCATTTCTGTTATCGAGGATGCTCCACAACCAGCTTTGGATTTCACTTTCTCGCCATCGAACAGCCAAA GGCAACAACAGGATTGTTGACAAGGGCATTGAATTTGAGCAAGTTGACAGAGAAAGAAACTG >3ex GGATGACCAGATTATTTTCAACGGGATCATATTCTACATAGCCTATTTCATACTTCCAGGGGCTTCTCACATGCCCTTATG GAGAGCAGATGGTGTGGTTATTACAATTCTGCTTCATACGGGCCCTGTGGAGTTTCTGTATTACTGGCTTCACAGGGCTCT ACACCATCATTATCTCTACTCACGTTACCATTCTCATCACCATTCCTCTATCGTCACTGAGCCCATCACCT >4ex CTGTCATTCATCCATTTGCGGAGCATATAGGATATTTTCTGCTGTTTTCAATACCATTGCTGACCATGATCTTCACCAGAA CAAGCTCTGTTGTAGCTTTTTTTGGCTATATCTCTTATATTGATTTCATGAACAACATGGGGCATTGCAACTTCGAGCTCG TGCCCAAGTGGCTCTTCTCCATATTTCCCTTCCTCAAGTATCTTATGTATACCCCCTC >5ex GTTTCACTCTTTGCATCACACCCAATTTCGAACCAATTACTCACTCTTCATGCCATTCTACGACTTCATGTATGGTACTAT GGACAAATCTTCAGATGTGTTATATGAAAAATCACTTACAAGGCCTGAAGAATCGCCTGATGTAGTGCATCTCACCCATCT CACAACGCCAAACTCCATTTATCATATAAGGCTAGGTTTTGCCTCTGTGGCCTCCAAGCCATACATCTCCAAATGGTACTT GAGACTAATGTGGCCTCTAACATCTTCGTATATGATGTTGATTTGGATTTGTTCTCGTACATTTGTTCTTGAAAGGAACCA TTTCAACAAACTCAAGTCACAAACATGGGTCATACCAAAATATAGGGTTCAA >6ex TACTTCTTGAAATGGCAAAATGAACCCATCAATAGCTTGATTGAAGAAGCCATACTACATGCAGAGGAAAGAGGTGTTAAA GTGTTGAGTTTAGGTCTTCTCAACCAG >7ex GGTGAAGAGCTTAATCTATATGGTAAGCTTTATATCCATTTAAATCCTAAGCTCAAAATCAAGGTGGTGGATGGGAGCAGC TTAGCAGTAGCTGTTGTTTTGAACAGCATTCCAAAAGGAACCACTCAAGTACTCTTCAGAGGCAAGCTCTCTAAGGTTGCT TATTTCACAGCCATTGCTTTGTGCCAAAAGGGCATCCAG >8ex GTGACTACTTTCTGTGAGGAAGAGCACAAGAAGATCAAAATGAAGCTGAACACCAAATTGGGAGATAAATTGGCTCTTTCA AAAAATTATGCCCATAAG >9ex ATATGGTTGGTTGGAGATGGCTTGACCGAAGAAGAACAGTTGAAGGCACCAAAAGGAACTCTATTTATTCCCTTTTCTCAG TTCCCACCAAAGAGAATGCGCAAAGATTGCTTCTACCACACCACACCAGCAATGATGTCTCCCACTTCTTTTGAGAACATG GATTCTTGTGAG >10ex AATTGGTTGCCAAGAAGAGCAATGAGTGCATGGCGTGTGGCTGGAATATTGCATGCATTAGAAGGATGGAATGTGCACGAG TGCGGTCACACCATATTCGATATTGAGAAGATTTGGGAAGCCAGTTTTCAACATGGATTTCGTTCTTTAATGATTCCCTCT TAA 32

33 11.2. Függelék: A WAX4AMU2 gén és a cos4831 páros illesztése. A cos kontig szekvenciája az 1265 bp-3815 bp között tökéletes egyezést mutat a WAX4AMU2 szekvenciájával. wax4amu R 1201 CTGCATCACACCCAATTTCGGACCAATTACTCACTCTTCATGCCATTCTA 1250 wax4amu GTACTATGGACAAATCTTCAGATGTATTATATGAAA R 1251 CGACTACATGTATGGTACTATGGACAAATCTTCAGATGTATTATATGAAA 1300 wax4amu2 37 AATCACTTACAAGGCCTGAAGAATCGCCTGATGTAGTGTATCTCACCCAT R 1301 AATCACTTACAAGGCCTGAAGAATCGCCTGATGTAGTGTATCTCACCCAT 1350 wax4amu2 87 CTCACAACACCAGACTCCATTTATCATATAAGGCTAGGTTTTGCCTCTAT R 1351 CTCACAACACCAGACTCCATTTATCATATAAGGCTAGGTTTTGCCTCTAT 1400 wax4amu2 137 GGCCTCTAAGCCATACATCTCCAAATGGTACTTGAGACTAATGTGGCCTC R 1401 GGCCTCTAAGCCATACATCTCCAAATGGTACTTGAGACTAATGTGGCCTC 1450 wax4amu2 187 TAACATCTTTGTATATGATGTTGATTTGGATTTGTTCTCGTACATTTGTT R 1451 TAACATCTTTGTATATGATGTTGATTTGGATTTGTTCTCGTACATTTGTT 1500 wax4amu2 237 CTTGAAAGGAACCATTTCAACAAACTCAAGTTACAAACATGGGTCATTCC R 1501 CTTGAAAGGAACCATTTCAACAAACTCAAGTTACAAACATGGGTCATTCC 1550 wax4amu2 287 AAAATATAGGATTCAAgtaagaatcatattttgttgttattttgttttct R 1551 AAAATATAGGATTCAAgtaagaatcatattttgttgttattttgttttct 1600 wax4amu2 337 taatttattaatgtattttatcattgtttcttttttttttaagactgatt R 1601 taatttattaatgtattttatcattgtttcttttttttttaagactgatt 1650 wax4amu2 387 tatttctagttagttattactcattgaatcaattgttgagtggtgtagta R 1651 tatttctagttagttattactcattgaatcaattgttgagtggtgtagta 1700 wax4amu2 437 CTTCTTGAAATGGCAAAATGAACCCATCAATAGCTTGATTGAAGAAGCCA R 1701 CTTCTTGAAATGGCAAAATGAACCCATCAATAGCTTGATTGAAGAAGCCA 1750 wax4amu2 487 TACTAGATGCAGAGCAAAGAGGCGTTAAAGTGTTGAGTTTAGGTCTTCTT R 1751 TACTAGATGCAGAGCAAAGAGGCGTTAAAGTGTTGAGTTTAGGTCTTCTT 1800 wax4amu2 537 AACCAAgtaagttatttctcctttaccattttggttccatttttttttct R 1801 AACCAagtaagttatttctcctttaccattttggttccatttttttttct 1850 wax4amu2 587 tcttctttagtttcccccactccctttggtccctttcatgcatagatgta R 1851 tcttctttagtttcccccactccctttggtccctttcatgcatagatgta