Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3 1 lemez lemez

Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3 1 lemez - 96 72340 5 lemez - 480 72341 SZŰRŐVIZSGÁLATI TESZTKÉSZLET HEPATITIS C VÍRUS ANTI-HCV ANTITESTEINEK VÉRSZÉRUMBÓL / EMBERI VÉRPLAZMÁBÓL TÖRTÉNŐ KIMUTATÁSÁRA ENZIM-IMMUNOASSAY MÓDSZERREL 883635-2013/09

TARTALOM 1. A FELHASZNÁLÁS CÉLJA...... 3 2. A TESZT ÖSSZEFOGLALÓ BEMUTATÁSA.. 3 3. A VIZSGÁLAT ELVE...3 4. REAGENSEK...4 5. FIGYELMEZTETÉS ÉS BIZTONSÁGI ELŐÍRÁSOK.5 6. MINTÁK.7 7. VIZSGÁLATI PROTOKOLL 8 8. A TESZT KORLÁTAI.12 9. A TESZT TELJESÍTMÉNYÉNEK MUTATÓI.13 10. IRODALOMJEGYZÉK..14 2 [HU]

1. A FELHASZNÁLÁS CÉLJA A Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3 vizsgálat a hepatitis C vírus (HCV) fertőzés kimutatására szolgáló indirekt kvalitatív enzim immunoassay, melynek alapja a HCV elleni antitestek emberi vérszérumból vagy vérplazmából történő kimutatása. A jelen hepatitis C szűrővizsgálati tesztet diagnosztikai laboratóriumok és vérbankok is használhatják. 2. A TESZT ÖSSZEFOGLALÓ BEMUTATÁSA A hepatitis C-vírus (HCV) burokkal rendelkező, pozitív irányú RNS-vírus (9,5 kb.), amely a Flavivírusok családjába tartozik. Az 1989-ben izolált HCV-vírusnak hat fő genotípusa ismert. A HCV-ről bebizonyosodott, hogy ez a vírus a nem-a és nem-b típusú virális hepatitis-megbetegedések legfőbb okozója. A HCV-fertőzés akut és krónikus formában jelentkezik, és májzsugorhoz, valamint hepatocelluláris karcinomához vezethet. A hepatitis-c elsődleges tesztje során anti-hcv antitestek kimutatását célzó, harmadik generációs ELISA enzim immunoassay-t használunk. 3. A VIZSGÁLAT ELVE A Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3 teszteljárás alapjául szolgáló szilárd fázis a következő tisztított antigénekkel van bevonva: rekombináns fehérje a hepatitis C vírus nem-strukturális régiójából (NS3 és NS4), egy peptid a strukturális régióból (kapszid), a folyékony fázis (konjugátum) pedig peroxidázzal jelölt, humán IgG ellen egérben termeltetett antitesteket tartalmaz. A teszt kivitelezése a következő reakciólépésekből áll: 1) Előbb a mintahigítót (R6), majd a mintákat és a kontroll-szérumokat (R3 és R4) bemérjük a mikrolemez tesztlyukaiba. Amennyiben a HCV antitestek jelen vannak, azokat a szilárd fázisban rögzített antigének megkötik. 2) 37 C-on 1 órán keresztül tartó inkubálást és egy mosási lépést követően bemérésre kerül peroxidázzal jelölt, humán IgG ellen egérben termeltetett antitesteket tartalmazó konjugátum (R7). Humán IgG jelenléte esetén utóbbi előbb reakcióba lép a szilárd fázissal, a humán IgG elleni konjugátum pedig megköti a humán antitesteket. 3) 37 C-on 30 percig végzett inkubálást követően a nem kötött enzimes konjugátumot egy mosási lépésben eltávolítjuk és az antigén-antitest-peroxidáz komplexet a szubsztrát hozzáadásával azonosítjuk. 4) Laboratóriumi hőmérsékleten (18-30 C) végzett 30 perces inkubálást követően a reakciót leállítjuk és a spektrofotométert 450/620-700 nm-en leolvassuk. A minták esetén mért abszorbancia-értékek lehetővé teszik a HCV elleni antitestek jelenlétének vagy hiányának kimutatását a mintában. A kapott szín intenzitása arányos a szilárd fázison megkötött HCV-antitest mennyiségével. 3 [HU]

4. REAGENSEK 4.1. Leírás Címkejelzés R1 Microplate R2 Concentrated washing solution (20X) R3 Negative control R4 Positive control R6 Sample diluent R7 Conjugate R8 Substrate buffer Leírás Mikrolemez 12 db, egyenként 8 db, tisztított rekombináns hepatitis C antigénekkel (NS3, NS4) és HCV kapszid peptiddel bevont tesztlyukat tartalmazó csík. Egyedi azonosítószám = 94 Mosóoldat-koncentrátum (20X) Tris NaCl puffer ph 7.4 Tartósítószer: ProClin 300 (0,04%) Negatív kontroll BSA (marha szérumalbumin) tartalmú Tris HCI puffer; Tartósítószer: ProClin 300 (0,1%) Pozitív kontroll HCV termeltetett antitesteket tartalmazó humán szérum, HBs antigénre illetve anti-hiv1 és anti-hiv2 antitestekre negatív; BSA-t tartalmazó Tris HCl pufferben hígítva, fotokémiai úton inaktivált formában. Tartósítószer: ProClin 300 (0,1%) Mintahigító Citrát puffer; lila színnel jelölve Tartósítószer: Nátrium-azid (<0,1%), Cosmocil CQ (0,025%) Konjugátum Humán IgG/peroxidáz ellen egérben termeltetett antitest Zöld színnel jelölve. Tartósítószer: ProClin 300 (0,5 %) Szubsztrát Citromsav és nátrium-acetát oldata, ph 4,0; 0,015%) hidrogén-peroxidot és 4% dimetil-szulfoxidot (DMSO) tartalmaz. Kiszerelés/előítés 72340 72341 1 lemez 1 fiola 70 ml Feloldandó 1 fiola 1 ml 1 fiola 1.5 ml 1 fiola 15 ml 1 fiola 15 ml 1 fiola 60 ml Feloldandó 5 lemez 1 fiola 235 ml Feloldandó 1 fiola 1 ml 1 fiola 3 ml 2 fiola 2 x 30 ml 2 fiola 2 x 30 ml 2 fiola 2 x 60 ml Feloldandó 4 [HU]

R9 Chromogen: TMB (11X) R10 Stopping solution Kromogén: TMB oldat 3,3', 5,5' Tetrametil-benzidint (TMP) tartalmazó oldat Leállító oldat 1N kénsav-oldat. 1 fiola 5 ml Feloldandó 1 fiola 28 ml 2 fiola 2 x 5 ml Feloldandó 3 fiola 3 x 28 ml 4.2. Tárolási és kezelési körülmények A tesztletet +2-8 C között kell tárolni. Ezen a hőmérsékleten tárolva a letben található minden reagens felhasználható a csomagoláson feltüntetett szavatossági ideig a felnyitás után is (kivéve a speciális eseteket). Felnyitás után, amennyiben szennyeződés nem lép fel, az R2, R3, R4, R6, R7, R8, R9 és R10 reagensek 2-8 C tárolva a címkén látható szavatossági ideig felhasználhatók. Azonosító kód R1 R2 R8 + R9 Tárolási mód A visszazárható tasak felbontása után a tesztcsíkok az eredeti tasakban ragasztószalaggal gondosan visszazárva, +2-8 C-on tárolva 1 hónapig felhasználhatók. A kihígított mosóoldat (R2) +2-30 C 2 hétig tárolható. A koncentrált mosóoldat +2-30 C-on tárolható. Feloldás után a reagensek szobahőmérsékleten (18-30 C), sötétben tárolva 6 órán át felhasználhatók. 5. FIGYELMEZTETÉS ÉS BIZTONSÁGI ELŐÍRÁSOK Csak in vitro diagnosztikai célra, szakképzett egészségügyi dolgozó által alkalmazható. 5.1. Egészségügyi és munkavédelmi előírások: Ezt a tesztet kizárólag olyan laboratóriumi szakképzésben részesült személyzet használhatja, amely tisztában van a potenciális veszélyekkel. Viseljen megfelelő védőruházatot, amely laboratóriumi kesztyűből, szem/arcvédő maszkból áll, továbbá a reagenseket és a mintákat kezelje a helyes laboratóriumi gyakorlat szerint. A tesztlet humán vérkomponenseket tartalmaz. Az R4 (pozitív kontroll) ítéséhez használt humán eredetű anyagok ellenőrzésük során nem mutattak reaktivitást a hepatitis B vírus felszíni antigénjével (HBs Ag), és a humán immundeficiencia vírusok ellen termelt antitestekkel (HIV-1 és HIV-2 Ab), ugyanakkor pozitívak az anti-hcv antitestekre. Az R4 pozitív kontroll reagens melegítés által inaktivált állapotban van. Az ismert tesztmódszerek nem zárhatják ki teljes biztonsággal a fertőző ágensek jelenlétét. Ennélfogva minden emberi vérítményt, derivátumot, reagenst vagy betegmintát úgy kell kezelni, mintha képesek lennének fertőző betegségek átadására; tartsuk be a vér útján terjedő kórokozókra vonatkozó általános biztonsági előírásokat abban a formában, ahogyan azokat a helyi, regionális és országos szabályozás tartalmazza. 5 [HU]

Biológiai szennyeződések: a humán eredetű anyagokkal történő szennyeződéseket potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni. A nem savtartalmú kiömléseket, beleértve a kiömlés területét, az anyagokat és bármely érintett felületet vagy berendezést, az érintett mintákkal kapcsolatban felmerülő biológiai veszélyek ellen hatásos kémiai fertőtlenítő szerrel azonnal semlegesíteni kell (általában 10%-ra hígított háztartási hipóval 70-80% etanollal vagy izopropanollal, jodoforral [pl. 0,5% Wescodyne Plus stb.), majd szárazra kell törölni. A savat tartalmazó kiömléseket megfelelően fel kell itatni (fel kell törölni) vagy semlegesíteni kell, a területet vízzel le kell öblíteni, majd szárazra kell törölni, a kiömlés felitatására használt anyagokat adott esetben veszélyes biológiai hulladékként kell ártalmatlanítani. A szennyezett területet ezután valamelyik vegyi fertőtlenítőszerrel meg kell tisztítani. FIGYELMEZTETÉS: Ne helyezzünk nátrium-hipokloritot tartalmazó oldatot az autoklávba! Minden betegmintát és a teszt elvégzésénél használt minden anyagot úgy kell kezelni, mintha azok fertőző ágenst tartalmaznának. A laboratóriumi, kémiai vagy veszélyes biológiai hulladékokat a helyi, regionális és országos szabályozásnak megfelelően kell kezelni és eltávolítani. A jelen tesztkitben található egyes kémiai összetevőkre vonatkozó biztonsági és elővigyázatossági előírásokkal kapcsolatban lásd a címkéken jelzett piktogramo(ka)t, valamint a használati utasítás végén szereplő információkat. A biztonsági adatlap a www.bio-rad.com címen megtekinthető. 5.2 A protokollal kapcsolatos elővigyázatossági intézkedések 5.2.1.Előítés Az eredmények minősége függ az alábbi helyes laboratóriumi gyakorlat követésétől: Ne használjunk lejárt szavatosságú reagenseket. Ne keverjünk vagy társítsunk egy adott teszt-futtatáson belül különböző gyártási sorozatokból származó reagenseket. Használat előtt várjunk 30 percet arra, hogy a reagensek a szobahőmérsékleten stabilizálódjanak (18-30 C). A teszt megnevezése, valamint a teszt egyedi azonosítószáma minden egyes mikrotiter lemez keretén szerepel. Ez az egyedi azonosítószám minden tesztcsíkon is szerepel. Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3: Egyedi azonosítószám = 94 Használat előtt ellenőrizzük az egyedi azonosítószámot. Ha az azonosítószám hiányzik, vagy az alkalmazni kívánt teszt fenti számától eltér, a tesztcsíkot nem szabad felhasználni. MEGJEGYZÉS: Az alábbi reagensek esetében a kitben levőtől eltérő gyártási számú reagensek is használhatók, de egy vizsgálaton belül azonos gyártási számú terméket kell használni: mosófolyadék (R2, címke felirata: 20x, zöld színű), peroxidáz szubsztrát puffer (R8, címke felirata: TMB puffer, kék színű), kromogén (R9, címke felirata: TMB 11x, lila színű) és leállító oldat (R10, címke felirata: 1N, piros színű). Ezek a reagensek néhány más Bio-Rad gyártmányú termékhez is használhatók. Részletes felvilágosításért forduljanak műszaki szolgálatunkhoz. 6 [HU]

A reagensek feloldását óvatosan, szennyezés mentesen végezzük. Használjunk alaposan elmosott és ioncserélt vízzel jól átöblített üvegedényeket, illetve lehetőleg egyszer használatos eszközöket. Ne hagyjuk a tesztlemezt a mosási művelet vége és a reagensek bemérése között kiszáradni. Az enzimreakció nagyon érzékeny a fémionokra. Ezért vigyázzunk, hogy fémes eszközök a különböző konjugátum és szubsztrát oldatokkal ne érintkezhessenek. A színelőhívó oldatnak (szubsztrát puffer + kromogén) rózsaszínűnek kell lennie. A rózsaszín árnyalatnak a feloldást követő néhány percen belüli megváltozása azt jelzi, hogy a reagens nem használható és azt ki kell cserélni. A színelőhívó oldatot olyan eldobható egyszer használatos műanyag tálcán vagy üvegedényben kell elíteni, melyet először 1N sósavval előre elmostunk és desztillált vízzel alaposan kiöblítettünk, majd megszárítottunk. Ezt a reagenst fénytől elzárva kell tárolni. Soha ne használjuk ugyanazt a tartályt a konjugátum, illetve az előhívó oldat beméréséhez. 5.2.2.Eljárás közben A vizsgálati eljárás rendjén ne változtassunk. Ne végezzük el a tesztet a konjugátum enzimaktivitását potenciálisan megváltoztatni képes reaktív (savas, alkáli vagy aldehid) gőzök vagy por jelenlétében. Minden mintához használjunk új pipettahegyet. A tesztlyukak mosása kritikus lépés ezen eljárásban, ezért tartsuk be a mosási ciklusok ajánlott számát és bizonyosodjunk meg arról, hogy minden tesztlyukat teljesen feltöltöttünk. illetve később teljesen kiürítettünk. A helytelen mosás pontatlan eredményekhez vezethet. A teszt működési teljesítményének maximalizálása érdekében gondosan kövessük a fentebb ismertetett mosási eljárásokat. Egyes eszközök esetén azonban lehetséges, hogy szükségessé válik a mosási lépések optimalizálása (a mosási ciklusok számának és/vagy a ciklusonként felhasznált mosó puffer mennyiségének növelése) az elfogadható OD háttér elérése érdekében a negatív mintánál. Adaptációk és egyedi eljárások kérdésében keresse meg vállalatunkat. 6. MINTÁK A vérmintát a szokásos gyakorlatnak megfelelően vegyük le. A teszt EDTA, litium-heparinát, nátrium-citrát vagy ACD antikoagulánsokkal gyűjtött, hígítatlan szérum vagy plazma mintákon végezhető el. Az aggregátumokat tartalmazó mintákat vizsgálat előtt centrifugálással deríteni kell. A lebegő fibrin részecskék vagy aggregátumok tévesen pozitív eredményekhez vezethetnek. A mintákat +2 és 8 C között lehet tárolni, amennyiben a szűrést hét napon belül elvégezzük, ellenkező esetben a minták -20 C-on mélyfagyasztva tarthatók. A mintákat legfeljebb 3 alkalommal melegítsük fel és fagyasszuk A mintákat szobahőmérsékleten (18-30 C) kell felmelegíteni. Használat előtt ajánlott felfordítással összekeverni. Az eredményeket nem befolyásolja, ha a minták 120 g/lnél kevesebb albumint, vagy 200 mg/l-nél kevesebb bilirubint tartalmaznak, illetve ha 7 [HU]

a lipémiás minták 33 g/l-nél kevesebb triglicerid ekvivalenst vagy a hemolizált minták 2 g/l-nél kevesebb hemoglobint tartalmaznak. Mindamellett ne használjunk szennyezett, hiperlipémiás vagy hiperhemolizált szérumot. Ha a mintákat szállítani kell, a csomagolást az etiológiai ágensek szállítására vonatkozó hatályos szabályok alapján kell végezni, lehetőség szerint fagyasztva szállítással. A minták melegítése nem ajánlott. 7. VIZSGÁLATI PROTOKOLL 7.1.Szükséges, de nem mellékelt anyagok Desztillált víz. Nátrium-hipoklorit (háztartási hipó) és nátrium-bikarbonát. Szűrőpapír. Öntapadó fólia. Egyszerhasználatos védőkesztyű. Védőszemüveg. Eldobható kémcsövek. Automata vagy félautomata, állítható vagy előre beállított pipetták 50 μl, 80 μl, 100 μl, 200 μl és 1 ml térfogat bemérésére. 10 ml-es, 200 ml-es és 1000 ml-es kapacitással rendelkező osztott mérőhengerek. Vortex típusú keverő. Automata, félautomata vagy manuális mikrolemez-mosó rendszer. Termosztatikusan 37 ± 1 C-ra beállított vízfürdő vagy azzal egyenértékű száraz mikrolemez-inkubátor (*). Biológiailag veszélyes szennyezett maradványokat befogadó hulladékgyűjtő. Mikro-tesztlemez leolvasó 450, 490 nm és 620-tól 700 nm-ig szűrőkkel felszerelve (*). (*) Keressen fel minket a technikai osztályunk által támogatott felszerelésekkel kapcsolatos részletes felvilágosításokért. 7.2.A reagensek előítése 7.2.1. reagensek 1. reagens (R1): Tesztlemez Minden keret 12 tesztcsíkot tartalmaz, és visszazárható tasakba van csomagolva. Ollóval vagy szikével nyissuk fel a csomagolást 0,5-1 cm-rel a visszazárható csík fölött Nyissuk ki a tasakot és vegyük ki a keretet. A fel nem használt tesztcsíkokat tegyük vissza a tasakba. Gondosan zárjuk vissza a tasakot ragasztószalaggal, és helyezzük +2-8 C-os hőmérsékletű tárolóhelyre. 6. reagens (R6): Mintahigító Használat előtt felfordítással keverjük össze. 7. reagens (R7): Konjugátum Használat előtt felfordítással keverjük össze. 8 [HU]

7.2.2. Feloldandó reagensek 2. reagens (R2): Mosóoldat-koncentrátum (20x) 1:20 arányban hígítsuk desztillált vízzel, a felhasználásra oldat előállításához. Egy 12 tesztcsíkos lemezhez 800 ml-t ítsünk. 8. reagens (R8) + 9. reagens (R9): Enzim előhívó oldat. Hígítsuk az R9 jelű reagenst (kromogén) 1:11 arányban az R8 jelű (szubsztrát puffer) reagenssel (példa: 1 ml R9-es reagens 10 ml R8-as reagensben). 10 ml szükséges és elegendő 1-től 12-ig terjedő számú tesztcsíkra. Keverjük össze. 7.3. A vizsgálat menete Szigorúan kövessük a protokollt. Minden tesztben használjunk negatív és pozitív kontrollszérumokat a teszt minőségének és érvényességének megállapítása céljából. Alkalmazzuk a következő, helyes laboratóriumi gyakorlat elveket. 1. Alaposan dolgozzuk ki a minták beosztásának és azonosításának tervét. 2. Készítsük el a hígított mosóoldatot (hígított R2). (Lásd a 7.2 szakaszt) 3. Vegyük elő a tesztlemez-keretet és a szükséges mennyiségű tesztcsíkot (R1) a védőcsomagolásból. A fel nem használt tesztcsíkokat helyezzük vissza a csomagolásba. Zárjuk le a csomagolást, és helyezzük +2-8 C hőmérsékletű tárolóhelyre. 4. A következő sorrendben mérjük be a tesztlyukakba (ajánlott lemezkiosztás): 100 μl a mintahígítóból (R6) minden tesztlyukba, majd 50 μl negatív kontroll szérum (R3) az A1 jelű tesztlyukba, μl pozitív kontroll szérum (R4) a B1, C1, D1 jelű tesztlyukakba, 50 μl az első vizsgálandó mintából az E1 jelű tesztlyukba, 50 μl a második mintából a F1 jelű tesztlyukba stb. Keverjük össze a reakcióelegyet (minimum háromszori aspirációval vagy tesztlemez-rázóval 5 másodpercig). Ha a minták bemérése 10 percnél hosszabb időt vesz igénybe, ajánljuk, hogy a negatív és pozitív kontrollok hozzáadása a tesztelendő minták bemérése után történjen. Az alkalmazott üléktől függően a kontrollok helye és a bemérések sorrendje megváltoztatható. MEGJEGYZÉS: A minták bemérése után a mintát (vagy kontrollt) tartalmazó tesztlyuk színe liláról kékre változik. Ekkor lehetségessé válik a minták jelenlétének kimutatása 620 nm-en történő spektrofotometriás leolvasással (lásd a 7.7 szakaszt). 5. Amennyiben lehetséges, borítsuk be a lemezt új öntapadó filmmel. 6. Inkubáljuk a tesztlemezt 37 C ± 1 C-on, 60 percig (± 5 perc). 7. Távolítsuk el az öntapadó filmet. Távolítsuk el minden tesztlyuk tartalmát folyékonyhulladék-tartályba történő leszívással és mérjünk be minimum 370 µl mosóoldatot minden tesztlyukba. Aspiráljuk ismét, és ismételjük meg a mosási lépést minimum négyszer (összesen minimum öt mosási lépés történik). A maradék térfogatnak 10 μl-nél kevesebbnek kell lennie (ha szükséges, szárítsuk le a tesztcsíkokat szűrőpapíron fejjel lefelé történő fordítással). Ha automata mikrolemez-mosó berendezéssel rendelkezik, kövesse ugyanezt a működési ciklust. 8. Gyors ütemben mérjünk be 100 µl-t a konjugátum-oldatból (R7) minden tesztlyukba. 9 [HU]

A konjugátumot használat előtt gyengén fel kell rázni. Ha lehetséges, borítsuk be egy új öntapadó filmmel és inkubáljuk 37 C ± 1 C-on 30 percig (± 5 perc). MEGJEGYZÉS: A konjugátum színe zöld. A konjugátum jelenlétét a tesztlyukakban 620 nm-en történő spektrofotometriás leolvasással lehet igazolni (lásd a 7.7 szakaszt). 9. Távolítsuk el az öntapadó filmet, aspirációval ürítsünk ki minden tesztlyukat és mossuk legalább 5 alkalommal a fentebb ismertetett módon. 10. Készítsük el az enzimes előhívó oldatot (R8 + R9 reagens). 11. Gyors ütemben mérjünk be minden tesztlyukba 80 μl-t az előbbi lépésben frissen elített előhívó oldatból (R8 + R9). Hagyjuk az előhívási reakciót lezajlani sötétben, szobahőmérsékleten (18-30 C) 30 ± 5 percen át. Ne használjunk öntapadó filmet ezen inkubálás alatt. MEGJEGYZÉS: A rózsaszín színű előhívó oldat bemérését a vizsgálat ezen lépésében vizuálisan ellenőrizhetjük. (lásd a 7.7. szakaszt) 12. Az előhívó szubsztrátoldat-bemérés sorrendjének és sebességének megfelelő ütemezésben adjunk 100 μl leállító oldatot (R10) a tesztlyukakba. MEGJEGYZÉS: A színtelen leállító oldat bemérését a vizsgálat ezen lépésében vizuálisan ellenőrizhetjük. A leállító oldat hozzáadását követően a szubsztrát rózsaszín színezete eltűnik (a negatív minták esetén) vagy kékről sárgára változik (a pozitív minták esetén). 13. Óvatosan töröljük le a tesztlemez alját. Olvassuk le az optikai denzitást 450/620-700 nm-en lemezleolvasóval legalább 4 perccel a leállító oldat hozzáadását követően és a reakció leállítását követő 30 percen belül. 14. Az eredmények rögzítése előtt ellenőrizzük a megfelelést a leolvasás és a tesztlemez illetve a mintabemérési és azonosítási terv között. 7.4.A minőség ellenőrzése A teszt érvényességének megállapítására minden futtatáskor használjuk a pozitív (R4) és negatív (R3) kontrollokat. (Lásd a 7.5 pontot). 7.5.A teszt érvényességének kritériumai A jelen teszt a következő feltételek teljesülése esetén érvényes: 1. Az R3 jelű negatív kontroll esetén: A mért abszorbancia-értéknek kisebbnek kell lennie, mint a cut-off 60 %-a. O.D. < cut off x 0,6 2. Az R4 jelű pozitív antitest kontroll esetén: 0,800 < átlag O.D. R4 < 2,700 (Az átlagos mért abszorbancia-értéknek nagyobbnak kell lennie 0,800-nél, és kisebbnek kell lennie 2,700-nél.) Ha az R4 jelű antitest pozitív kontrollok valamelyik egyedi értéke az átlagos értéktől 30%-nál nagyobb mértékben különbözik, az értéket figyelmen kívül kell hagyni és a számítást a maradék két pozitív kontroll-érték használatával kell újból elvégezni. 7.6. Számítások és az eredmények kiértékelése A cut-off értéket az R4 pozitív kontrollal határozzuk meg. Számítsuk ki a mért átlag abszorbancia-értéket az R4 pozitív kontroll esetében. A cut-off érték (CO) kiszámítása: CO = OD R4 átlagértéke X 0,4 10 [HU]

Az anti-hcv antitestek jelenlétét vagy hiányát az egyes minták rögzített abszorbancia-értékének és a kiszámított cut-off értéknek az összehasonlításával kapjuk meg. Számítsuk ki a következő arányt minden minta esetében: Mintaarány = a minta optikai denzitása / cut-off érték A cut-off-értéknél kisebb optikai denzitással rendelkező mintákat negatívnak (arányérték < 1) tekintjük a Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3 tesztvizsgálattal. A cut-off-értéket megközelítő eredményeket (OD-10% < minta OD < cut-off, arányérték 0,9 és 1 között) azonban óvatosan kell értelmezni (amennyiben a ülék és a laboratóriumi eljárásrend ezt lehetővé teszi, javasolt az ilyen mintákat két párhuzamos tesztben újravizsgálni). A cut-off-értékkel egyenlő vagy azt meghaladó (arányérték > 1) optikai denzitással rendelkező mintákat kezdetben pozitívként kell tekinteni a Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3. tesztvizsgálattal. Két párhuzamos tesztben újra kell vizsgálni őket a végleges értelmezéshez. Ha az ismételt tesztet követően az arányérték a két párhuzamos teszt közül legalább az egyikben egyenlő vagy nagyobb, mint 1, az eredeti eredmény reprodukálható, a teszt pedig pozitívnak tekintendő a Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3. tesztvizsgálattal. Ha a két párhuzamosan megismételt vizsgálat közötti arányérték 1- nél kisebb, az eredeti eredmény nem megismételhető, a minta pedig negatívnak tekintendő. Ha a mintákat kétszer újra teszteltük és a Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3, tesztvizsgálattal negatívnak találtuk, de az egyik érték a cut-off érték közelébe esik (0,9 és 1 közötti arányértékkel), az eredményt óvatosan kell kezelni. Tanácsos a pácienst más módszerrel vagy más mintával újratesztelni. Amennyiben a tesztelt minták nagyon alacsony optikai denzitásúak (negatív OD), és ha a minták és a reagens jelenléte is kontrollált, az eredményt negatívnak lehet tekinteni. Ajánlott a pozitív mintákat az érvényben lévő nemzeti ajánlások és algoritmusok alapján megerősíteni. 7.7. A minta és a konjugátum bemérésének spektrofotometriás igazolása (opcionális) Az első lépés igazolása: Az (R6) mintahígító és a minta jelenléte. Az (R6) és a minta (vagy kontroll-szérum) jelenlétét a tesztlyukban 620 nm-en történő automatikus leolvasással lehet igazolni. Az (R6)-ot és a mintát (vagy kontroll-szérumot) egyszerre tartalmazó valamennyi tesztlyuk OD-értékének 0,800-nél nagyobbnak kell lennie. MEGJEGYZÉS: a minta hozzáadását követően az (R6) színe liláról kékre változik. 11 [HU]

A második lépés igazolása: a konjugátum (R7) jelenléte. Megjegyzés: a konjugátum (R7) zöld színű. A konjugátum (R7) jelenlétét a tesztlyukakban 620 nm-en történő automatikus leolvasással ellenőrizhetjük. Minden tesztlyuk OD értékének 0,300-nál nagyobbnak kell lennie (ennél a normánál alacsonyabb érték a konjugátum elégtelen bemérését jelzi). Az előhívó oldat pipettázásának igazolása A rózsaszín színű előhívó oldat jelenlétét a tesztlyukakban 490 nm-en történő automatikus leolvasással lehet igazolni. Az előhívó oldatot tartalmazó tesztlyuk esetén az optikai denzitásnak 0,100-nél magasabbnak kell lennie (az ennél alacsonyabb OD érték az előhívó oldat elégtelen bemérését jelzi). Az elített szubsztrát kromogén oldat hozzáadását követően látványos színváltozás, az üres tesztlyukakban színtelenből rózsaszínűre változás történik. 8. A TESZT KORLÁTAI A hepatitis C vírussal fertőzött betegek által mutatott immunológiai reakciók változatosságából adódóan (különösen szerokonverziók idején) a tesztek között a kimutatásban kisebb különbségek lehetnek a használt antigén-fehérjék fajtájától függően. Egy szűrőteszttel kapott negatív eredmény nem zárja ki a hepatitis C vírusnak valló kitettség vagy az általa történt fertőzöttség lehetőségét. A szakirodalom szerint az immunoszupressziós kezelésen áteső vagy HIV és HCV vírusokkal párhuzamosan fertőzött HCV hordozóknál az antitestek szintje különösen alacsony lehet, ami nem éri el a HCV-tesztek kimutatásának küszöbértékét. Minden ELISA eljárás közös hibája, hogy hamis pozitív reakciókat mutathatnak. Minden ismételten pozitívként mutatkozó minta esetén ezért javasolt a reakció specificitásának igazolása a Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3 tesztkitben megadott értelmezési kritériumok alapján, a megfelelő módszer alkalmazásával, pl. a HCV ellen termelt antitestek jelenlétének bizonyításával ELISA anti-hcv antitest szűrőteszt alkalmazásával vagy immunblottoláson alapuló anti-hcv antitestkimutatási teszt használatával. Ha szükséges, alkalmazzunk molekuláris biológiai tesztet a HCV vírusgenom kimutatására. A minták, konjugátumok és előhívó oldat bemérésének igazolására szolgáló kolorimetriás módszer nem teszi lehetővé a bemért térfogatok pontosságának igazolását. E módszer csupán a minta, a konjugátum és az előhívó oldat tesztlyukakban való jelenlétét mutatja. Ezzel a módszerrel a hibás válaszok aránya szorosan összefügg az alkalmazott rendszer pontosságával (a bemérés és leolvasás 10%-nál magasabb kumulatív variációs koefficiense lényeges mértékben csökkenti az igazolás minőségét). A Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3 teszt használata összeöntött vagy hígított minták esetében nem jóváhagyott. Az (R6) mintahígítóban kivételes alkalmakkor finom részecskék észlelése lehetséges, ezek jelenléte semmilyen esetben sem csökkenti a reagens minőségét. 12 [HU]

9. A TESZT TELJESÍTMÉNYÉNEK MUTATÓI 9.1. Precizitás mérése Reprodukálhatóságot és a kibővített ismételhetőséget különböző anti-hcv antitestkoncentrációjú mintákkal határoztuk meg. Az ismételhetőség meghatározására a mintákat 30 alkalommal teszteltük ugyanazon tesztszérián belül. A kibővített ismételhetőséget a mintáknak 20 napon keresztül, naponta két egymástól függetlenül lefuttatott párhuzamos tesztjével értékeltük. 9.1.1 Ismételhetőség Minták Szám Átlagok aránya Szórás Variációs koefficiens % Negatív 30 0,12 0,006 4,5 Anti-HCV 30 1,29 0,059 4,6 gyengén pozitív Anti-HCV 30 1,33 0,112 8,4 gyengén pozitív Anti-HCV erősen pozitív 30 3,60 0,191 5,3 A pozitív mintákon kapott variációs koefficiens < 10 %. 9.1.2. Kibővített ismételhetőség Minták Szám Átlagok aránya Vizsgálaton belül Vizsgálatok közötti / operátor SD CV SD % Napok között Összes reprodukálhatóság SD CV % CV % SD CV % Negatív 120 0,13 0,009 7,3 0,011 8,5 0,005 3,9 0,015 11,8 Anti- 120 1,40 0,053 3,8 0,119 8,5 0* N.A. 0,130 9,3 HCV gyengén pozitív Anti- HCV gyengén pozitív Anti- HCV erősen pozitív 120 1,48 0,082 5,6 0,120 8,1 0* N.A. 0,145 9,8 120 3,57 0,141 4,0 0,173 4,8 0* N.A. 0,223 6,2 * A becsült negatív variancia-érték = 0, A pozitív mintákon kapott variációs koefficiens < 15 %. 13 [HU]

9.2. A teszt klinikai működési teljesítménye A Monolisa Anti-HCV PLUS Version 3 teljesítményét véletlenszerűen kiválasztott véradó donoroktól, valamint kórházi betegektől, akut és krónikus hepatitis C vírus fertőzöttségben szenvedőktől, továbbá a hepatitis C vírussal nem összefüggő klinikai tüneteket mutató betegektől származó mintákon teszteltük. A vizsgálatokat két véradó-helyszínen, egy kórházi helyszínen és a Bio-Rad saját helyszínén végeztük. 9.2.1. Diagnosztikai specificitás A vizsgálatot 2 véradó-központban, véletlenszerűen kiválasztott véradóktól származó vérszérum és EDTA plazma mintákon végeztük. Kórházban ápolt betegeken szintén ült specificitás-vizsgálat. Valamennyi mintát EU-ban regisztrált anti-hcv tesztekkel vizsgáltuk. 1. táblázat: specificitás-teszt Populáció Helyszín Véradók Minta típusa Mennyiség Kezdetben reaktív minták (IR) Ismételt reaktív minták (RR) Specifikusság (%) #1 szérum* 2641* 2 2 2,636/2,638 szérum 537 1 1 536/537 #2 plazma 2002 4 1 2,001//2,002 #1 + #2 5180* 7 4 99,92 % 5,173/5,177 0 0 100 % 502/502 Kórházi betegek #3 szérum 502 Konfidenciaintervallum 95 %% 99,80-99,98 99,30-100,00 * a referencia-vizsgálat során meghatározatlannak talált 3 donort kivettük a számításokból. 9.2.2 Diagnosztikai érzékenység vizsgálata A teszt diagnosztikai érzékenységét 559, hepatitis C vírussal fertőzött betegtől származó mintán vizsgáltuk; 465 különböző genotipizált minta (1; 2; 3; 4; 5; 6) tesztvizsgálatára került sor. Az említett minták közül 25 mintát a vizsgálatot megelőző 24 órán belül vették le a páciensektől. 1. táblázat: tesztelt genotípusok Genotípusok Minták száma 1 (1, 1a, 1a//b, 1b) 2 (2, 2a/c, 2a, 2b, 2b/3) 3 (3, 3a, 3b, 3c) 4 (4, 4a, 4a/c, 4a/c/d, 4c, 4e, 4h, 4n, 4r) 5 (5, 5a) 6 (6, 6a, 6a/b, 6n) Összesen 230 51 107 63 8 6 465 A tesztelt minták egészén a diagnosztikai szenzitivitás 100%-nak (559/559) igazolódott, 95%-os megbízhatósági intervallummal [99.3-100,0]. Akut fertőzött betegektől származó minták esetén: 14 [HU]

38, kereskedelmi forgalomban elérhető szerokonverziós panelt teszteltünk a Monolisa HCV Anti-HCV PLUS Version 3 tesztjével (9 kapszid profil, 10 NS3 profil és 19 többösszetevőjű profil), összehasonlítva azt egy EU-ban regisztrált teszttel. Az említett 38 szerokonverzió közül egy panelen a Monolisa HCV Anti-HCV PLUS Version 3 és az összehasonlításként szolgáló teszt nem mutatott ki fertőzést. A Monolisa HCV Anti-HCV PLUS Version 3 által kimutatott 37 panel között 11 esetben korábban mutatta ki a fertőzöttséget, 25 esetben azonos volt a kimutatás ideje, míg egy esetben később mutatta ki, mint a másik teszt. 9.3. Analitikai specificitás, keresztreakciók vizsgálata A következő 283, potenciálisan interferáló mintát vizsgáltunk a Monolisa HCV Anti- HCV PLUS Version 3 teszttel: adott esetben fertőző megbetegedések kórokozói ellen antitesteket tartalmazó minták (cytomegalovírus, Epstein Barr vírus, VZV, kanyaróvírus, rózsahimlő-vírus, mumpsz-vírus, herpesz-vírus, influenza-vírus, hepatitis A vírus, hepatitis B vírus, HIV 1/2, HTLV 1/2, szifilisz, Toxoplasma gondii, dengue-láz, Chagas-kór); a kockázati csoportból származó minták (dialízisben részesülő betegek, nem hepatitis alapú cirrózisban szenvedők, terhes nők, többszöri szülésen átesett nők), vagy immunrendszeri megbetegedésben szenvedőktől származó minták (autoantitestek, reuma-faktorok, egér ellenes antitestek, myelomák). A Monolisa HCV Anti-HCV PLUS Version 3 teszttel egy minta sem bizonyult pozitívnak. Az említett célcsoport populációján mért specificitás 100% (283/283), hasonló a klinikai minták esetében mért specificitáshoz. 9.4. Kioltási effektus (Hook effektus) A kioltási effektus esetleges létezését 5, magas titerű minta tesztelésével tanulmányoztuk különböző hígításokban. A hígítatlan és hígított minták után kapott eredmények egyezése mutatja, hogy nem áll fenn kioltási effektus. 10 - IRODALOMJEGYZÉK ALBORINO F., BURIGHEL A., TILLER F.W., VAN HELDEN J., GABRIEL C., RAINERI A., CATAPANO R., STEKEL H. Multicenter evaluation of a fully automated third-generation anti-hcv antibody screening test with excellent sensitivity and specificity. Med. Microbiol. Immunol. 2011, 200: 77 83. BHARTIA A.R., LETENDREA S.L., WOLFSONA T. Clinical variables identify seronegative HCV co-infection in HIV-infected individuals. J. of Clin. Virol. 2011, 52: 328 332. CHEN-JI H., HWEI-LING P., CHIH-YU C. Improving Antigenicity of the Recombinant Hepatitis C Virus Core Protein via Random Mutagenesis. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 2011: 359042. CHING W.M., WYCHOWSKY C., BEACH M.J., WANG M., DAVIES C.L., CARL M., BRADLEY D.W., ALTER M.S., FEINSTONE S.M., WAI-KUO SMIM J. Interaction of immune sera with synthetic peptides corresponding to the structural protein region of hepatitis C virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, April 1992, 89: 3190-3194. CHOO Q.L., RICHMAN K.H., HAN J.H., BERGER K., LEE C., DONG C., GALLEGOS C., COIT D., MEDINA-SELBY A., BARR P.J., WEINER A.J., 15 [HU]

BRADLEY D.W., KUO G. and HOUGHTON M. Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991, 88: 2451-2455. EASL EASL Clinical Practice Guidelines: Management of hepatitis C virus infection. Journal of Hepatology. 2011, 55(2): 245-64. NASOFF M.S., ZEBEDEE S.L., INCHAUSPE G., PRINCE A.M. Identification of an immudominant epitope within the capsid protein of hepatitis C virus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, June 1991, 88: 5462-5466. RIDER P.J. and LIU F. Crosstalk between HIV and hepatitis C virus during co-infection. BMC Medicine. 2012, 10: 32. Strader DB, Wright T, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management and treatment of Hepatitis C. AASLD Practice Guideline. Hepatology. 2004, 39: 1147-1171. WIDELL A., BUSCH M. Exposed or not exposed - that is the question: evidence for resolving and abortive hepatitis C virus infections in blood donors. Transfusion. 2009, 49: 1277-1281. ZACHARY P., ULLMANN M., DJEDDI S., WENDLING M.-J., SCHVOERER E., STOLL-KELLER F., GUT J.-P. Evaluation of two commercial enzyme immunoassays for diagnosis of hepatitis C in the conditions of a virology laboratory. Pathologie Biologie, 2004, 52 (2004): 511 516. 16 [HU]

17 [HU]

18 [HU]

19 [HU]

20 [HU]

21 [HU]