A dezoxicitidin-kináz aktiválódásának lehetséges szerepe a DNS-hibajavítás és az apoptózis folyamatában

Átírás

1 Semmelweis Egyetem Pathobiokémia Doktori Program A dezoxicitidin-kináz aktiválódásának lehetséges szerepe a DNS-hibajavítás és az apoptózis folyamatában Doktori (Ph. D.) tézisek dr. Keszler Gergely Témavezetõ: Prof. Staub Mária Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet Budapest, 2004.

2

3 Bevezetés A DNS-replikációhoz, -rekombinációhoz és -hibajavításhoz szükséges dezoxiribonukleozid-trifoszfát-prekurzorok elõállításának domináns útvonala az S-fázishoz kötött de novo bioszintézis, azonban bizonyos sejttípusokban (limfociták és neuronok) nagy jelentõsége van a dezoxinukleozidok újrahasznosításán alapuló mentõ (salvage) reakcióknak is, amelyek a citoszolban és a mitokondriumokban egyaránt végbemehetnek. A de novo útvonal elsõsorban a DNS megkettõzõdéséhez szükséges óriási mennyiségû dezoxiribonukleotidot szolgáltatja, míg a nyugvó sejtekben fellépõ DNS-károsodás folyamatos javításának, illetve a mitokondriális DNS replikációjának és hibajavításának nukleotid-utánpótlásáról elsõsorban a mentõ rendszerek gondoskodnak. A mentõ reakciók a táplálékból származó (extracelluláris) purin- és pirimidin-nukleozidokat, illetve az endogén nukleinsavak lebomlása során keletkezõ nukleozidokat és szabad bázisokat képesek újrahasznosítani, ezáltal jelentõs mennyiségû energiát takarítanak meg a sejt számára. Az emlõs sejtekben négy dezoxiribonukleozid-kináz ( mentõ enzim ) fordul elõ, amelyek az ATP vagy UTP?-foszfátcsoportját a nukleozidok 5 -helyzetû hidroxilcsoportjával észteresítik. A timidinkináz-1 (TK1) és a dezoxicitidin-kináz a citoplazmában, míg a timidin-kináz-2 (TK2) és a dezoxiguanozin-kináz (dgk) a mitokondriumok mátrixában található. Mindegyik enzim sajátos és részben átfedõ dezoxiribonukleozid-specificitással rendelkezik. A dezoxicitidin-kináz (dck) széles szubsztrát-specificitásánál fogva nemcsak a dezoxicitidint, hanem a purin-dezoxiribonukleozidokat is foszforilálni képes, sõt a természetes nukleozidok 1

4 módosított származékait, a gyógyszerként forgalmazott citotoxikus nukleozid-analógokat is kitûnõen foszforilálja, ami azok hatásmechanizmusának sebesség-meghatározó lépését jelenti. A foszforilált analógok a sejtben felhalmozódnak, majd trifoszfáttá alakulva a DNS-szintézist gátolják, illetve apoptózist válthatnak ki. A dck által foszforilálható legfontosabb nukleozid-analógok közé tartozik a 2-klór-dezoxiadenozin (CdA), a hajas sejtes leukémia és számos limfóma hatékony gyógyszere, továbbá az akut leukémiák kezelésére használt arabinozil-citozin (arac) és az egyes szolid tumorok terápiájában sikerrel alkalmazott 2, 2 -difluor-dezoxicitidin (gemcitabin). A dezoxicitidin-kináz megfelelõ aktivitása ezen gyógyszerek klinikai hatékonysága szempontjából kulcsfontosságú tényezõ. A daganatos szövetek dezoxicitidin-kináz-aktivitásának elvesztése és/vagy az antagonista mûködésû 5 -nukleotidázok túlzott expressziója gyakran áll a nukleozid-analógokkal szemben kifejlõdõ rezisztencia hátterében, ami napjainkban az onkológia egyik legégetõbb problémáját jelenti. A dck-hiányos és nukleozidanalógokra rezisztens daganatok kemoterápiás érzékenysége drámai módon javítható a vad típusú dck cdns-ének transzfekciójával. Nemrégiben fejlesztették ki a dck egy genetikailag módosított változatát, amelynek katalitikus aktivitása sokszorosan meghaladja a vad típusú enzimét, és génterápiás felhasználásához is nagy reményeket fûznek. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a dck aktivitása sok más egyéb faktor mellett a kemoterápia hatékonyságát döntõ módon meghatározza. Ezért minden olyan körülmény, ami a dezoxicitidin-kináz aktivitását fokozza, a klinikai gyakorlat szempontjából komoly jelentõséggel bír, mivel a legtöbb tumor számottevõ dck-aktivitással rendelkezik, amely citosztatikumokkal és gamma-besugárzással jelentõsen fokozható, míg a génterápia alkalmazásának útjában még számos megoldatlan elméleti és gyakorlati akadály áll. 2

5 Célkitûzések Kutatómunkám kiindulópontját az a laboratóriumunkban tett megfigyelés képezte, hogy a CdA-val kezelt humán limfociták dckaktivitása jelentõs mértékben megnövekedett. Mivel az aktívabb enzim több CdA-t tud foszforilálni, a nukleozid-analóg citotoxicitása fokozódik, ami azon túl, hogy bepillantást nyújt a dck aktivitásának biokémiai szabályozásába, egyúttal komoly gyakorlati jelentõséggel is bír a nukleozid-analógokkal végzett daganatterápia hatékonysága szempontjából. Célkitûzésünk a dck aktiválódásának alábbi szempontok szerinti részletesebb tanulmányozása volt: 1. Vizsgálni kívántuk, hogy a dck aktiválódása szelektív jelenség-e, avagy a nukleozid- és nukleotid-metabolizmus más enzimeinek az aktivitása is megváltozik-e a CdA hatására. 2. Az enzimaktiválódás körülményeinek tisztázása, illetve a jelenség okának megközelítése fizikai és kémiai sejtkárosító hatások alkalmazásával. Választ kerestünk arra, hogy? A dck aktiválhatóságának tekintetében van-e különbség a különbözõ eredetû nyugvó és osztódó (normál, illetve transzformált) sejtek között?? Van-e különbség a természetes dezoxinukleozid-szubsztrátok, illetve a purin- és pirimidin-analógok enzimaktivitásra gyakorolt hatása között?? Nem-metabolizálható szubsztrát-analógokkal (nukleozid-5 - tioszulfátok) aktiválható-e az enzim?? Célzott DNS-károsító hatások fokozzák-e a dck aktivitását?? Szerepet játszhat-e a dck aktiválódása a limfociták apoptózisában? 3

6 3. Kísérletet tettünk a dck-aktiválódás molekuláris mechanizmusának megértésére, azaz tisztázni kívántuk a következõket:? Lehetséges-e, hogy az enzim aktiválódása allosztérikus mechanizmus révén történik?? Lehetséges-e, hogy az észlelt aktiválódásért az enzim foszforilációja a felelõs? Milyen hatással van az aktivitásra a kináz/foszfatáz egyensúly megzavarása protein-foszfatáz gátlószerek, illetve hiperozmotikus kezelés alkalmazásával?? Történik-e stabil konformáció-változás az aktiválódás során?? Szerepet játszik-e a p53-fehérje a DNS-károsodás nyomán fellépõ enzimaktiválódásban? Módszerek Sejtkezelések A dck aktiválódásának vizsgálatához primer sejtkultúrákat (humán tonzilla limfocita, normál és leukémiás perifériás limfocita, timocita), valamint limfoid és mieloid sejtvonalakat használtunk (HL60, CCRF-CEM, K562). A G- és S-fázisú sejtek szeparálása albumin sûrûséggrádiensen történt. A sejtszuszpenziókat 1 2 órán át nukleozid-analógokkal, illetve egyéb genotoxikus szerekkel kezeltük, majd a sejteket centrifugálással ülepítettük, mostuk és ismételt fagyasztás-felolvasztással nyerskivonatokat készítettünk belõlük, amelyeket a továbbiakban enzimaktivitás-mérésre, illetve a dck immunfestésére (western blot) használtunk. A felsorolt sejtkezelések kapcsán jelzett dezoxicitidinnel és timidinnel metabolikus jelölést is végeztünk, majd a sejtek alkoholos feltárása után megmértük az etanololdékony poolba, illetve a makromolekula- (DNS) frakcióba beépült radioaktivitást. A limfociták?-besugárzása és a DNS-lánctörések szemikvantitatív meghatározása (Comet assay, egyedi sejtek alkalikus 4

7 gélelektroforézise) az Országos Sugárbiológiai Intézetben, dr. Sáfrány Géza laboratóriumában történt. Enzimaktivitás-mérés A dck és a timidin-kinázok enzimaktivitását jelzett dezoxicitidin-, illetve timidin-szubsztrátok felhasználásával, az idõ függvényében lineáris szakaszon, telítési szubsztrát-koncentrációnál mértük. A dezoxicitidilát-dezamináz és 5 -nukleotidáz aktivitásokat 14 C-dCMP, illetve 14 C-dIMP szubsztrátokkal a fenti körülmények között mértük. Denaturáló és natív immunblot Az egyes sejtkivonatok dck-fehérjemennyiségét Laemmli módszerével, diszkontinuus SDS-gélelektroforézist követõ western blottal hasonlítottuk össze. A natív immunblottot SDS-t és denaturáló ágenst nem tartalmazó mintákból, natív elektroforézissel és semi-dry blottolással végeztük. A humán dck C-terminális doménje ellen termeltetett poliklonális antitestet dr. Taljanidisz János (Herakleion, Görögország) bocsátotta rendelkezésünkre. A rekombináns dckfehérje dr. Staffan Eriksson (Uppsala, Svédország) laboratóriumából származott. Dezoxinukleozid-trifoszfát-poolok mérése és apoptózis-markerek vizsgálata Az intracelluláris dezoxinukleozid-trifoszfát-poolokat a limfociták metanollal való feltárását követõ centrifugálással elkülönített felülúszóból, Sherman és Fyfe szintetikus oligonukleotidtemplátokra kidolgozott primer-extenzión alapuló módszerével határoztuk meg. Az apoptózis vizsgálata a sejtkivonatok kaszpáz-3- szerû aktivitásának mérésével, illetve a kromatin-fragmentáció gélelektroforetikus kimutatásával (DNS-létra) történt. 5

8 Eredmények és megbeszélésük 1. Megállapítottuk, hogy humán limfociták rövidtávú (1 2 órás) CdA-kezelése során a dezoxiribonukleozid-mentõ enzimek közül kizárólag a dck aktivitása emelkedik, miközben sem a dck-val funkcionális kapcsoltságban mûködõ dcmp-dezamináz, sem pedig az 5 -nukleotidázok aktivitása nem változik. 2. A dck aktiválódását kiváltó tényezõkkel kapcsolatban a következõket állapítottuk meg: Az osztódó és nyugvó sejtpopulációk vizsgálata során kiderült, hogy a G-fázisú sejtekben dúsított limfocita-preparátum dckaktivitása alacsonyabb, de jobban stimulálható, mint az S-fázisú sejtek enzimaktivitása, tehát a normál limfocitákban kiváltható dck-aktiválódás mértéke és a sejtek osztódási rátája között fordított arányosság áll fenn. A vizsgált leukémiás sejtvonalak CdA-ra való érzékenységének és az enzimaktiválódás mértékének tekintetében azonban jelentõs eltéréseket találtuk. A dezoxiadenozin-analógokkal (CdA) kiváltható enzimaktiválódás mértéke messze meghaladta a pirimidin-származékok (arac és dfdc) hatását, míg a (ribo)adenozin-analógok csak minimálisan aktiválták a dck-t. A természetes szubsztrátok közül kizárólag a dezoxiadenozin aktiválta az enzimet, a dezoxicitidin viszont a dck aktiválódását felfüggesztette. A dck által nem foszforilálható timidin-5 -tioszulfát drasztikusan csökkentette a timin-nukleotid-poolt s ezzel párhuzamosan aktiválta a dck-t. A nukleozid-analógok a DNS-t károsítják, ami feltehetõen a dck aktiválódásának elõidézõje. Ezt azzal is alátámasztottuk, 6

9 hogy a DNS-repair-aktivitást gátló aphidicolinnal, illetve a topoizomeráz-ii-inhibitor etopoziddal kezelt limfociták dckaktivitása is jelentõsen emelkedett, továbbá a DNS közvetlen károsítása a sejtek?-besugárzásával gyors és jelentõs enzimaktiválódást eredményezett. A besugárzás nyomán keletkezõ DNS-lánctörések javításának üteme és a dck aktiválódásának idõfüggvénye között szoros korrelációt találtunk. Mindebbõl az valószínûsíthetõ, hogy a dck aktivitásának emelkedését a DNS károsodása indítja el, és a stimulált enzim a hibajavításhoz szükséges dezoxiribonukleotidok fokozott szintézisét biztosíthatja. A limfociták CdA-, aphidicolin- és etopozid-kezelése során a dck aktiválódásával párhuzamosan a sejtek kaszpáz-3-aktivitása is emelkedett, továbbá az intracelluláris datp-pool szelektív növekedését észleltük. Ezek az eredmények felvetik annak lehetõségét, hogy a dck korai aktiválódása a károsodott sejtek apoptózisában is szerepet játszhat azáltal, hogy az apoptoszómához szükséges datp termelõdését a dezoxiadenozin fokozott foszforilációja révén biztosítja. 3. Az aktiválódás molekuláris mechanizmusával kapcsolatban a következõ megállapításokat tettük: A dck aktivitásának emelkedése nem járt együtt az enzim expressziójának növekedésével. Az enzim aktiválódását ugyanakkor meg lehetett akadályozni a sejtekhez adott BAPTA- AM-mel, egy hidrofób kalcium-kelátorral. A kalcium azonban nem közvetlen kofaktora a dck-nak, ugyanis a nyerskivonathoz adott EGTA az enzim aktivitását nem befolyásolta. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az aktiválódás nagy valószínûséggel az enzimfehérje kalciumfüggõ poszt-transzlációs módosításának a következménye. 7

10 Limfociták calyculin A-val, a protein-foszfatáz-1 és -2A gátlószerével történõ kezelése a dck-aktivitás emelkedéséhez vezetett, a?-besugárzással stimulált enzimaktivitást pedig a calyculin A tovább fokozta. A számos protein-kináz mûködését befolyásoló hiperozmotikus stressz a dck aktivitását jelentõsen csökkentette. A dck másodlagos módosításának folyamatában tehát minden valószínûség szerint egy fehérje-foszforilációs lépés is szerepet játszik. Natív immunfestés során összefüggést találtunk a dck-fehérje enzimaktivitása és immunreaktivitása között. Ez közvetett bizonyítéka annak, hogy az aktiválódás során az enzimfehérje jelentõs térszerkezet-változáson megy keresztül, amelynek jeleként a C-terminális epitop jobban hozzáférhetõvé válik az ellenanyag számára, s egy katalitikusan aktívabb térszerkezet alakul ki. A konformáció-változást részleges tripszinolízissel is kimutattuk. A CdA-val aktivált sejtek kivonatának protein-foszfatáz-kezelése a dck natív immunreaktivitásának jelentõs csökkenését eredményezte, ami arra utal, hogy a konformáció-változás hátterében az enzim reverzibilis foszforilációja állhat. A rekombináns dck natív állapotában egyáltalán nem reagált az antitesttel, ami azt jelzi, hogy térszerkezete jelentõsen különbözik a humán enzimétõl. A p53-fehérjének meghatározó szerepe van a DNS-károsodás szignáljának továbbításában. A normál limfocitákon alkalmazott p53-inhibitor, a pifithrin-? dck-aktiválódást gátló hatása, valamint a funkcionális p53-allélt nem tartalmazó Burkittlimfóma-eredetû sejtvonalak dezoxicitidin-kináz-aktivitásának gyenge stimulálhatósága összefüggést sejtet a p53 mûködése és a dck aktiválódása között. 8

11 Közlemények Az értekezés alapjául szolgáló közlemények: 1. Csapó Z, Keszler G, Sasvári-Székely M, Smid K, Noordhuis P, Peters GJ, Staub M. Similar changes were induced by Cladribine and by Gemcitabine, in the deoxypyrimidine salvage, during shortterm treatments. Adv. Exp. Med. Biol. 1998, 431, (Imp. F.: 0,360) 2. Spasokoukotskaja T, Sasvári-Székely M, Keszler G, Albertioni F, Eriksson S, Staub M. Treatment of normal and malignant cells with nucleoside analogues and etoposide enhances deoxycytidine kinase activity. Eur. J. Cancer 1999, 35, (Imp. F.: 2,537) 3. Keszler G, Szikla K, Kazimierczuk Z, Spasokoukotskaja T, Sasvári-Székely M, Staub M. Selective activation of deoxycytidine kinase by thymidine-5 -thiosulphate and release by deoxycytidine in human lymphocytes. Biochem. Pharmacol. 2003, 65, (Imp. F.: 2,993) 4. Csapó Z, Keszler G, Sáfrány G, Spasokoukotskaja T, Talianidis I, Staub M, Sasvári-Székely M. Activation of deoxycytidine kinase by gamma-irradiation and inactivation by hyperosmotic shock in human lymphocytes. Biochem. Pharmacol. 2003, 65, (Imp. F.: 2,993) 5. Keszler G, Spasokoukotskaja T, Csapó Z, Talianidis I, Eriksson S, Staub M, Sasvári-Székely M. Activation of deoxycytidine kinase in lymphocytes is calcium dependent and involves a conformational change detectable by native immunostaining. Biochem. Pharmacol. 2004, 67, (Imp. F.: 2,993) 9

12 6. Keszler G, Spasokoukotskaja T, Csapó Z, Virga S, Staub M, Sasvári-Székely M. Selective increase of datp pools upon activation of deoxycytidine kinase in lymphocytes: implications in apoptosis. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2004, 23, (Imp. F.: 0,813) 7. Keszler G, Spasokoukotskaja T, Sasvári-Székely M, Staub M. Implication of deoxycytidine kinase activation in deoxyadenosinemediated cytotoxicity. kézirat, közlésre elküldve Az értekezés témájához szorosan nem kapcsolódó közlemények: 1. Keszler G, Csapó Z, Spasokoukotskaja T, Sasvári-Székely M, Virga S, Demeter A, Eriksson S, Staub M. Hyperthermy increases the phosphorylation of deoxycytidine in the membrane phospholipid precursors and decreases its incorporation into DNA. Adv. Exp. Med. Biol. 2000, 486, (Imp. F.: 0,513) 2. Demeter A, Abonyi M, Look KY, Keszler G, Staub M, Weber G. Differences in thermostability of thymidine kinase isoenzymes in normal ovary and ovarian carcinoma. Anticancer Res. 2001, 21, (Imp. F.: 1,416) 3. Keszler G, Spasokoukotskaja T, Virga S, Sasvári-Székely M, Staub M. Stimulation of deoxycytidine kinase results in prolonged maintenance of the enzyme activity. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2004, 23, (Imp. F.: 0,813) 4. Rónai Z, Guttman A, Keszler G, Sasvári-Székely M. Capillary electrophoresis study on DNA-protein complex formation in the polymorphic 5 upstream region of the dopamine D4 receptor (DRD4) gene. Curr. Med. Chem. 2004, 11, (Imp. F.: 4,409) 10

13 Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom Intézetünk igazgatójának, Mandl József egyetemi tanárnak, a Pathobiokémia doktori program vezetõjének, hogy kutatómunkámat lehetõvé tette és támogatta. Hálás köszönetemet szeretném kifejezni témavezetõmnek, Staub Mária egyetemi tanárnak azért a támogatásért, tudományos iránymutatásért és megértésért, amelyre kutatómunkám során mindig támaszkodhattam. Köszönöm Sasvári Máriának, hogy ötleteivel, optimizmusával és építõ kritikájával segítette munkámat. Szpaszokukockaja Tatjana a kutatási témában való alapos jártasságával és kísérleti tapasztalataival számtalan nehézségen segített át, és a munkám során felmerülõ kérdések megvitatásából rengeteget tanultam. Hálás vagyok Csapó Zsoltnak értékes gyakorlati tanácsaiért, beszélgetéseinkért, és Virga Sándornénak a kísérletek kivitelezése során nyújtott segítségéért és tanácsaiért. Valamennyiüknek köszönöm, hogy mindvégig kellemes légkörben dolgozhattam. Szeretném megköszönni munkacsoportunk valamennyi, eddig nem említett tagjának Király Orsolyának, Nemoda Zsófiának, Szántai Eszternek, Rónai Zsoltnak, Barta Csabának, Boór Krisztinának, Szilágyi Ágnesnek és Kolmann Gabriellának, hogy segítségükre, véleményükre mindig számíthattam, továbbá az Intézetbõl mindazoknak, akik ötleteikkel, kritikáikkal és konkrét segítségükkel munkám sikeréhez hozzájárultak. Hálás köszönettel tartozom Taljanidisz Jánosnak azért, hogy a laboratóriumában töltött és tudományos szemléletemre döntõ befolyást gyakorló két év során számtalan új módszerrel, készséggel és ismerettel, továbbá munkatársai önzetlen barátságával gazdagodhattam. Köszönöm gimnáziumi kémiatanáromnak, Pénzes Ferencnek, hogy szakmai és emberi példájával, támogatásával elmélyítette bennem a kémia szeretetét. Végül és mindenekelõtt szeretném megköszönni Családomnak, hogy céljaim elérésében támogattak, és szeretetükre, megértésükre mindig támaszkodhattam. 11