a DNS-hibajavítás és az apoptózis folyamatában

Átírás

1 A dezoxicitidin-kináz aktiválódásának lehetséges szerepe a DNS-hibajavítás és az apoptózis folyamatában KESZLER GERGELY Doktori (Ph. D.) értekezés Pathobiokémia Doktori Program Témavezető: Dr. Staub Mária egyetemi tanár Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet Budapest, 2004.

2 TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS IRODALMI HÁTTÉR A DEZOXIRIBONUKLEOTID-ANYAGCSERE ÁTTEKINTÉSE A dezoxiribonukleotidok de novo bioszintézise A mentő útvonalak A dezoxiliponukleotidok szintézise A HUMÁN DEZOXIRIBONUKLEOZID-KINÁZOK JELLEMZÉSE A dezoxicitidin-kináz A dezoxicitidin-kináz génje A dezoxicitidin-kináz-fehérje A dck enzimológiai tulajdonságai A dezoxicitidin-kináz expressziója A dck által aktivált nukleozid-analógok és terápiás jelentőségük A timidin-kináz A mitokondriális dezoxinukleozid-kinázok NUKLEOTIDÁZOK: A DEZOXINUKLEOZID-KINÁZOK FUNKCIONÁLIS ANTAGONISTÁI CÉLKITŰZÉSEK MÓDSZEREK ANYAGOK SEJTKULTÚRÁK, KEZELÉSEK, METABOLIKUS JELÖLÉS Sejtkultúrák Sejtszám és élősejtszám meghatározása Sejtkultúrák kezelése. 40 2

3 Limfociták γ-besugárzása Radioaktívan jelölt dezoxinukleozidok metabolizmusának mérése NYERSKIVONATOK ENZIMAKTIVITÁSÁNAK MÉRÉSE Nyerskivonat készítése A fehérje-koncentráció meghatározása dck- és TK-enzimaktivitás mérése Dezoxicitidilát-dezamináz-aktivitásmérés nukleotidáz-aktivitás meghatározása LIMITÁLT PROTEOLÍZIS POLIAKRILAMID-GÉLELEKTROFORÉZIS ÉS WESTERN BLOT SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis Denaturáló és natív immunblot NYERSKIVONATOK KEZELÉSE λ-protein-foszfatázzal COMET-ELJÁRÁS dntp-poolok MÉRÉSE APOPTÓZIST VIZSGÁLÓ ELJÁRÁSOK Kaszpáz-3-aktivitásmérés Kromatin-fragmentáció kimutatása (DNS-létra) RT-PCR EREDMÉNYEK A DEZOXICITIDIN-KINÁZ AKTIVÁLÓDÁSA CITOTOXIKUS NUKLEOZIDOK HATÁSÁRA CdA hatása normál limfocita-szubpopulációk dck-aktivitására I, II Normál és transzformált sejtpopulációk összehasonlítása a dck aktiválódásának szempontjából I Egyéb purin-analógok hatása a dck aktivitására I Dezoxipurin- és dezoxipirimidin-, illetve ribopurin-analógok összehasonlító vizsgálata I A dfdc (gemcitabin) hatása tonzilla-limfociták nukleotidanyagcseréjére III

4 A dezoxicitidin-kináz in vivo aktiválása gemcitabinnal A dck természetes szubsztrátjainak hatása az enzim aktivitására I, II A dck aktivitásának emelése nem-metabolizálódó nukleozid-monofoszfát-analógokkal és a dezoxicitidin felfüggesztő hatása IV CÉLZOTT DNS-KÁROSÍTÁSSAL KIVÁLTOTT dck-aktiválódás VIZSGÁLATA Etopozid és aphidicolin hatása a dezoxicitidin-kináz aktivitására I γ-besugárzás okozta változások a nukleotid-anyagcserében V A dck aktiválódása a DNS-károsodás korai következménye II A dck-aktiválódás ÉS AZ ENZIMEXPRESSZIÓ ÖSSZEFÜGGÉSEI II, V A REVERZIBILIS PROTEIN-FOSZFORILÁCIÓ ÉS A dck- AKTIVÁLÓDÁS KAPCSOLATA A dck aktiválása calyculin A-val V Hiperozmotikus stressz hatása az enzimaktivitásra V Tirozin-kináz-inhibitorok dck-aktiváló hatása II A dck-aktiválódás LEHETSÉGES SZEREPE AZ APOPTÓZIS FOLYAMATÁBAN Apoptózis-markerek vizsgálata A datp-pool szelektív növekedése a dck aktiválódása nyomán VI A p53 és a dck-aktiválódás kapcsolata VI A dck AKTIVÁLÓDÁSA KALCIUMFÜGGŐ FOLYAMAT A szabad citoplazmatikus Ca 2+ -szint csökkentése a dck aktivitását gátolja VII A kalcium permisszív szerepet játszik a dezoxicitidin-kináz aktiválódásában VII A kalcium a dck-aktivitásnak nem kofaktora VII A dck AKTIVÁLÓDÁSÁT FOKOZOTT ELLENANYAG-KÖTÉS KÍSÉRI Az enzimaktivitás és a konformációs állapot összefüggései VII A konformációs változás követése limitált proteolízissel II.91 4

5 A konformáció-változás valószínűleg reverzibilis foszforiláció következménye MEGBESZÉLÉS A DEZOXICITIDIN-KINÁZ AKTIVÁLÓDÁSA CITOTOXIKUS NUKLEOZIDOK HATÁSÁRA I, II, III, IV A DNS-KÁROSODÁS ÉS AZ ENZIMAKTIVÁLÓDÁS ÖSSZEFÜGGÉSEI I, II, III, V A dck AKTIVÁLÓDÁSÁNAK FELTÉTELEZETT MECHANIZMUSA A reverzibilis foszforiláció szerepe a dck aktivitásának szabályozásában V A dck aktiválódása kalciumfüggő folyamat VII A dezoxicitidin-kináz aktiválódását konformáció-változás kíséri II, VII A dck AKTIVÁLÓDÁSÁNAK LEHETSÉGES SZEREPE AZ APOPTÓZIS FOLYAMATÁBAN VI KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOMJEGYZÉK A DOLGOZAT TÉMAKÖRÉBEN MEGJELENT KÖZLEMÉNYEK

6 ÖSSZEFOGLALÁS A dezoxicitidin-kináz (dck) a dezoxinukleozid-mentő reakciók egyik központi jelentőségű enzime, amely széles szubsztrát-specificitásánál fogva számos klinikailag fontos nukleozid-analóg foszforilálására is képes, így az enzim aktivitása a kemoterápia hatékonyságának egyik meghatározó tényezője. Irodalmi adatok szerint a dck-t egy látszólag nem szabályozott és sejtciklustól független, állandó aktivitás jellemzi. Ennek ismeretében meglepetésként hatott munkacsoportunk azon megfigyelése, hogy normál limfociták rövid távú 2-klór-2 - dezoxiadenozin-kezelésével a sejtek dck-aktivitása a többszörösére fokozható. E klinikai szempontból is ígéretes jelenség további vizsgálata során megállapítottuk, hogy az enzim aktivitása normál és leukémiás perifériás limfocitákban is jól stimulálható, a malignus sejtvonalak viszont lényegesen különböznek a dck aktiválhatósága szempontjából. A dck aktiválódását a további purin- és pirimidin-típusú szubsztrátanalógokon kívül különféle DNS-károsító ágensekkel, így a DNS-polimerázgátló aphidicolinnal és a topoizomeráz-ii-inhibitor etopoziddal, illetve a sejtek γ- besugárzásával is ki lehetett váltani, ami arra utal, hogy a jelenséget a DNS károsodása okozza. Az aktivitás-növekedés sejtélettani jelentőségét a Comet-eljárással nyomon követett DNS-hibajavítás fokozott nukleotidigényének kielégítése képezheti. A dck aktiválódása során a datp-pool szelektív növekedését tapasztaltuk, ami az enzimaktiváció és a limfociták apoptózisának kapcsolatát is felvetette. Az aktiválódás mechanizmusával kapcsolatban kimutattuk, hogy az aktivitás fokozódása nem jár együtt a dck-fehérje mennyiségének megváltozásával. A proteinfoszfatáz gátló calyculin A aktiváló, illetve a hidrofób kalcium-kelátor BAPTA-AM gátló hatása azt bizonyítja, hogy az aktiválódás folyamata kalciumfüggő, és a reverzibilis fehérje-foszforiláció is szerepet játszik benne. Natív immunfestés segítségével összefüggést találtunk a dck enzimaktivitása és immunreaktivitása között, ami arra utal, hogy az aktiválódás során a dck egy olyan konformáció-változáson megy keresztül, ami egy katalitikusan aktívabb térszerkezet kialakulását eredményezi. 6

7 SUMMARY Deoxycytidine kinase (dck) plays a central role in the deoxynucleoside salvage processes. Moreover, based on its surprisingly broad substrate specificity, this enzyme is responsible for the bioactivation of several nucleoside analogues of therapeutical importance, influencing the sensitivity of malignant tissues towards chemotherapy. The prevailing view suggested that the activity of dck is not cell cycle-regulated and seemingly constant. In sharp contrast to this assumption, dck activity was found to be elevated several fold upon short-term treatments of normal primary lymphocytes with 2-chloro-2 -deoxyadenosine, which might be a potentially important phenomenon with respect to the clinical practice, too. Further investigations showed that the activity of dck could be augmented equally well both in normal and in leukaemic peripheral lymphocytes, but huge differences were revealed in the extent of stimulation in the malignant cell lines tested. Potentiation of enzyme activity was also elicited by a number of purine and pyrimidine substrate analogues as well as by DNA-damaging agents including the DNA polymerase inhibitor aphidicolin, the topoisomerase II inhibitor etoposide and γ-irradiation. These findings indicated that the main trigger of activation could be the damaged DNA itself, and the biological relevance might be to supply the dntps for the enhanced DNA repair, monitored by the Comet assay. Activation of dck was paralleled by specifically elevated levels of intracellular datp, raising the possibility that dck activation might be linked to apoptosis induction. With regard to the mechanism of enzyme activation, no changes were found in the protein levels of dck upon stimulation. The protein phosphatase inhibitor calyculin A enhanced the activity of dck, while opposite results were obtained with BAPTA- AM, a cell-permeant calcium chelator, demonstrating that the activation process is calcium dependent and comprises a protein phosphorylation step. A positive correlation was found between the enzymatic activity and the native immunoreactivity of dck, strongly arguing that dck undergoes a conformational change during activation that results in the formation of a catalytically more active steric structure. 7

8 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE Enzimek ADA adenozin-dezamináz (EC ) dck dezoxicitidin-kináz (EC ) dgk dezoxiguanozin-kináz (EC ) 5 -NT 5 -nukleotidáz PARP poli(adp-ribóz)-polimeráz (EC ) PKC protein-kináz C RR ribonukleozid-5 -difoszfát-reduktáz (EC ) TK1 citoplazmatikus dezoxitimidin-kináz (timidin-kináz-1; EC ) TK2 mitokondriális dezoxitimidin-kináz (timidin-kináz-2) Sejtek, sejtvonalak AML BL-41 CCRF-CEM CLL DG-75 HEK-293 HL60 K562 PBMC WiDr akut mieloid leukémia humán Burkitt-limfóma eredetű sejtvonal humán T-limfoblasztoid sejtvonal krónikus limfoid leukémia humán B-limfoblasztoid sejtvonal humán embrionális vese eredetű sejtvonal humán promielocita sejtvonal humán krónikus mieloid leukémia-sejtvonal perifériás vér mononukleáris sejt humán colontumorból izolált sejtvonal Nukleozidok, nukleotidok AaraC AMP-CP AzadC AraC AraG CAFdA CdA CrA da dc dg dt du dfdc FaraA dntp FdUMP 5-FU 5-aza-1-β-D-arabinofuranozil-citozin adenozin-5 -(α,β-metilén)-difoszfát 5-aza-2 -dezoxicitidin 1-β-D-arabinofuranozil-citozin (citarabin) 9-β-D-arabinofuranozil-guanin 2-klór-2 -arabino-fluoro-2 -dezoxiadenozin (clofarabin) 2-klór-2 -dezoxiadenozin (cladribin, leustatin, pepstatin) 2-klór-riboadenozin 2 -dezoxiadenozin 2 -dezoxicitidin 2 -dezoxiguanozin 2 -dezoxitimidin 2 -dezoxiuridin 2,2 -difluoro-2 -dezoxicitidin (gemcitabin, gemzar) 2-fluoro-1-β-D-arabinozil-adenin (fludarabin) dezoxinukleozid-trifoszfát 5-fluoro-uridin-5 -monofoszfát 5-fluoro-uracil 8

9 LN liponukleotidok rpu ribopurin Urd ribouridin 3 H-dC 2 -dezoxi-[5-3 H]-citidin 3 H-dT 2 -dezoxi-[5-metil- 3 H]-timidin 3 H-CdA 2-klór-2 -dezoxi-[8-3 H]-adenozin 3 H-dATP 2 -dezoxi-[2, 8-3 H]-adenozin-5 -trifoszfát 3 H-dTTP [metil- 3 H]-timidin-5 -trifoszfát 3 H-FdUMP 2 -dezoxi-5-fluor-[6-3 H]-uridin-5 -monofoszfát 14 C-IMP [8-14 C]-inozin-5 -monofoszfát 14 C-dCMP 2 -dezoxi-[2-14 C]-citidin-5 -monofoszfát Egyebek 3-ABA 3-aminobenzamid APC aphidicolin BAPTA-AM 1,2-bisz(2-aminofenoxi)etán-N,N,N,N -tetraecetsav tetrakisz(acetoximetil észter) BSA borjú szérumalbumin DCF 2 -dezoxicoformycin DEAE dietil-amino-etil DEVD-pNA N-acetil-Asp-Glu-Val-Asp-para-nitroanilid DMEM Dulbecco s modified Eagle s minimal essential medium DTT 1,4-ditio-L-treitol ECL enhanced chemiluminescence reaction EDTA etilén-diamin-tetraacetát EGF(R) epithelial growth factor (receptor) EGTA etilénglikol-bisz(2-aminoetiléter)-n,n,n,n -tetraacetát HEPES N-(2-hidroxietil)piperazin-N -(2-etánszulfonsav) MAPK mitogen-activated protein kinase MEK mitogen-activated protein kinase kinase; MAPK kinase MMLV Moloney Murine Leukemia Virus NP-40 Nonidet P-40 PBS phosphate buffered saline PFT-α pifithrin-α PI3K foszfatidil-inozitol-3-kináz PMSF fenil-metil-szulfonil-fluorid PVDF polivinilidén-difluorid RPMI Roswell Park Memorial Institute RT-PCR reverz transzkripció - polimeráz láncreakció SAH S-adenozil-homocisztein SAM S-adenozil-metionin SDS sodium dodecyl sulphate (nátrium-lauril-szulfát) TBST Tris base, saline, Tween-20 Tris trisz-[hidroximetil]-amino-metán TS tioszulfát VP16 etopozid; 4 -dezmetilepipodofillotoxin-9-[4,6-o-etilidén-β-d-glukopiranozid] 9

10 1. BEVEZETÉS Az onkológia egyik alaptételének tekinthető megállapítás szerint a daganatos betegségek gyógyításának három alappillérét a sebészi beavatkozás, a besugárzás és a kemoterápia képezi. Hosszú évtizedek tapasztalatai alapján dolgozták ki és napjainkban is folyamatosan javítják azokat a terápiás protokollokat, amelyekkel egy-egy daganattípus gyógyításában a legjobb eredmény érhető el. Ugyanakkor egyre szélesebb körben terjed az a szemlélet, hogy minden tumort egyedileg kell kezelni és minden beteget személyre szabott gyógymódban kell részesíteni, hiszen még a szövettanilag azonos típusú daganatok is egészen másképp reagálhatnak ugyanarra a kezelésre. Remény van arra, hogy már a nem túl távoli jövőben rutinszerűvé válik a tumoros szövetminták molekuláris genetikai vizsgálata (microarray), amelynek segítségével megállapítható a malignus transzformációhoz vezető molekuláris történés(ek) természete, ami egyénre szabott, célzott és hatékony beavatkozásokat tesz majd lehetővé. A rákos megbetegedések gyógyszeres kezelése során a tumorsejtek osztódási ütemét a legkülönfélébb támadáspontokon igyekeznek gátolni. A citosztatikumok három fő csoportjába a nukleotidok és nukleinsavak bioszintézisét gátló antimetabolitok (purin- és pirimidin-analógok, valamint a fólsav-antagonisták), a DNS-t károsító alkilálószerek, platinakomplexek és antibiotikumok, illetve a mitotikus orsót bénító vinca-alkaloidok és taxánok sorolhatók. Az elsők között alkalmazott kemoterápiás szerek egyike az arabinozil-citozin volt, amely látványos áttörést hozott az akut fehérvérűség gyógyításában, és mind a mai napig a mieloid leukémiák kezelésének alapját képezi. Napjaink kemoterápiás törekvéseinek középpontjában a citotoxikus szerek tumorszelektivitásának fokozása, más szóval a nemkívánt mellékhatások visszaszorítása, valamint az egyre gyakrabban jelentkező rezisztencia leküzdése áll. Ez utóbbi jelenség legalább akkora klinikai problémát jelent, mint a baktériumok antibiotikum-rezisztenciájának rohamos fokozódása. A nukleozid-analógok köztük az arabinozil-citozin ellen kialakuló rezisztencia kutatása irányította rá a figyelmet a dezoxicitidin-kináz enzimre, amelynek csökkent vagy hiányzó aktivitása gyakran áll a rezisztencia molekuláris hátterében, így az enzim vizsgálata fontos gyakorlati értelmet nyert. 10

11 A dezoxicitidin-kináz (dck) a sejtekbe jutó nukleozid-analógokat foszforilálja, amely lépés elengedhetetlenül fontos azok biológiai hatásának kifejtéséhez, ugyanis a foszforilált analógok a sejtben felhalmozódnak, majd gátolják a dezoxiribonukleotidok és a DNS szintézisét, illetve programozott sejthalált válthatnak ki. A dezoxicitidin-kináz élettani szerepe a DNS katabolizmusa során keletkező, illetve a sejt környezetéből felvett nukleozidok újrahasznosítása; ennek megfelelően a dck a nukleozid-mentő (salvage) enzimrendszerek tagja. Az enzim elnevezése annyiban pontatlan, hogy széles szubsztrát-specificitásánál fogva nemcsak a dezoxicitidint, hanem a purindezoxiribonukleozidokat is foszforilálni képes, sőt a természetes nukleozidok mesterségesen módosított származékait, a gyógyszerként forgalmazott nukleozidanalógokat is nagy hatásfokkal aktiválja. Ebből eredően a dck megfelelő aktivitása ezen gyógyszerek hatékonysága szempontjából kulcsfontosságú tényező. Munkacsoportunk már hosszabb ideje foglalkozik a nukleozid-mentő folyamatokban közreműködő enzimek vizsgálatával, s ennek kapcsán az egyes kemoterápiás szerek hatásmechanizmusával. A kísérletek során egy roppant érdekes jelenségre derült fény: a nukleozid-analógokkal kezelt normál limfociták dezoxicitidinfoszforiláló képessége megnőtt, s ez a változás egyértelműen a dezoxicitidin-kinázaktivitás jelentős emelkedésének volt tulajdonítható. Kutatómunkám célja a miért, mi által és milyen célból klasszikus kérdéskör alapján az enzimaktiválódás biokémiai hátterének feltárása volt. Eredményeink arra utalnak, hogy az enzim aktiválódása egy többféle sejttípuson is megfigyelhető, a DNS károsodása nyomán fellépő kalciumfüggő jelenség, amelynek során az enzim minden valószínűség szerint foszforilálódik és egy katalitikusan aktívabb térszerkezetet vesz fel. Ennek nyomán nemcsak természetes szubsztrátjait, hanem azok analógjait is hatékonyabban foszforilálja, ami magyarázatul szolgálhat azon klinikai megfigyelésekre, hogy a daganatos betegségek kezelése során a nukleozid-analógok és más genotoxikus szerek együttes adásával lényegesen jobb terápiás hatás érhető el. 11

12 2. IRODALMI HÁTTÉR 2.1. A dezoxiribonukleotid-anyagcsere áttekintése A DNS szintéziséhez szükséges dezoxiribonukleozid-trifoszfát-prekurzorok előállításának domináns útvonala a citoszolban zajló de novo bioszintézis, azonban bizonyos sejttípusokban (limfociták és neuronok) nagy jelentősége van a dezoxinukleozidok újrahasznosításán alapuló mentő (salvage) reakcióknak is, amelyek a citoszolban és a mitokondriumokban egyaránt végbemehetnek. A de novo útvonal elsősorban a DNS megkettőződéséhez szükséges óriási mennyiségű dezoxiribonukleotidot szolgáltatja, míg a nyugvó sejtekben fellépő DNS-károsodás folyamatos javításának, illetve a mitokondriális DNS replikációjának és hibajavításának nukleotid-utánpótlásáról elsősorban a mentő rendszerek gondoskodnak A dezoxiribonukleotidok de novo bioszintézise A de novo reakcióút során először ribonukleozid-difoszfátok keletkeznek aminosavakból, C 1 -töredékekből, szén-dioxidból és ribóz-5-foszfátból bonyolult és magas energiaigényű mechanizmusok révén. A dezoxiribonukleotidok keletkezésének kulcslépése a ribóz 2 -helyzetű hidroxilcsoportjának a ribonukleotid-reduktáz által katalizált redukciója, amely egyúttal a teljes útvonal sebesség-meghatározó lépése és legfontosabb szabályozási pontja is. A ribonukleotid-reduktáz holoenzim az R1 és R2 jelű alegységekből tevődik össze. Az R1-polipeptid féléletideje 20 óra és a sejtciklus minden fázisában jelen van. A ribonukleotid-reduktáz mégis jellegzetesen az S-fázisban aktív enzim, mivel a rövid (3 órás) féléletidejű R2-alegység kizárólag ebben a fázisban szintetizálódik [1]. Aktivitását és specificitását ugyanakkor allosztérikus hatások is befolyásolják, aminek a dezoxiribonukleozid-trifoszfátok kiegyensúlyozott szintézisében van jelentős szerepe [2]. A dntp-koncentrációk egymáshoz viszonyított arányának eltolódása ugyanis a DNS-polimerázok hibás működéséhez vezet, azaz megnő a mutációk száma [3]. Az elmondottakból az következik, hogy a dezoxiribonukleotidok de novo szintézise kizárólag osztódó sejtekben mehet végbe, és ez a nézet évtizedeken át 12

13 szilárdan tartotta magát ben viszont felfedezték a ribonukleotid-reduktáz R2-es alegységének p53r2-vel jelölt változatát, amely UV- és γ-sugárzásnak kitett sejtekben a p53 transzaktiváló hatása nyomán szintetizálódik és az R1 fehérjéhez kötődve akár nyugvó sejtekben is létrehozza a funkcionális holoenzimet [4]. Röviddel később kiderült, hogy ennek az új ribonukleotid-reduktáz-variánsnak a károsodott DNS kijavításához szükséges dezoxiribonukleotidok gyors előállításában van szerepe [5] A mentő útvonalak A mentő reakciók a táplálékból származó (extracelluláris) purin- és pirimidinnukleozidokat, illetve az endogén nukleinsavak lebomlása során keletkező nukleozidokat és szabad bázisokat képesek újrahasznosítani, ezáltal jelentős mennyiségű energiát takarítanak meg a sejt számára. A purin-nukleotidok katabolizmusából származó szabad bázisok (adenin, guanin és hipoxantin) és ezek nukleozidjai egyaránt hasznosíthatók, míg a pirimidinek általában nukleozid formában kerülnek újrafelhasználásra a megfelelő nukleozid-, illetve dezoxinukleozid-kinázok közreműködésével. A mentő útvonalak szerepe osztódó sejtekben valószínűleg redundáns, mert számos olyan sejtvonalat azonosítottak, amelyekből egy vagy több mentő enzim hiányzott. Ugyanakkor azt is kimutatták, hogy S-fázisú timuszsejtekben a de novo útvonal a purin-, míg a mentő reakciók a pirimidin-prekurzorok utánpótlásáért felelősek [6]. A nyugvó sejtek mentő reakcióútjai feltehetően a DNS-hibajavítás és a mitokondriumok dntp-ellátása szempontjából nélkülözhetetlenek, továbbá a citosztatikus és antivirális nukleozid-analógok aktiválása miatt kiemelkedő klinikai jelentőségre tettek szert. A nukleozid-mentő enzimek élettani funkciói azonban még nincsenek pontosan tisztázva. A purinbázisok a jól ismert foszforibozil-transzferázok segítségével alakulhatnak vissza nukleotidokká. Ezen enzimek hiánya súlyos anyagcsere-betegségekhez vezet, ilyen például a hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz hiányában kialakuló, jellegzetes idegrendszeri érintettséggel járó Lesh-Nyhan-szindróma, ami a neuronok purinmentő reakcióinak fontosságára utal. Olyan enzimek is ismertek, amelyek az így keletkező nukleotidok ribozil-csoportját dezoxiribózra cserélik, így megkerülhető a nyugvó sejtekből hiányzó ribonukleotid-reduktáz által katalizált redukciós lépés. A 13

14 dezoxiribonukleotidok mentő reakciói azonban leginkább a dezoxiribonukleozidokból indulnak ki, és a dezoxiribonukleozid-kinázok közreműködését igénylik. DNS DNC DNS DNS-degradáció datp dgtp dctp NDPK RR NDP dadp dgdp dcdp dudp dutp dttp NDPK dtdp datp dgtp dctp dttp NDPK dadp dgdp dcdp dtdp de novo ribonukleotid szintézis AK GMPK UMP/CMPK TMPK TS damp dgmp dcmp dump dtmp DA dck dtk1 AK3??? damp dgmp dcmp dtmp dgk TK2 da dg dc du dt m e n t ő r e a k c i ó k da dg dc dt? mitokondrium citoplazma extracelluláris tér da CNT2 dg ENT CNT1 da dg dc dt dc dt 1. ábra. A dezoxiribonukleotidok de novo szintézise és mentő reakciói Rövidítések: CNT, koncentratív nukleozid-transzporter; ENT, ekvilibratív nukleozid-transzporter; DNC, mitokondriális dezoxiribonukleotid-karrier; RR, ribonukleotid-reduktáz; DA, dezoxicitidilátdezamináz; TS, timidilát-szintáz; AK, adenilát-kináz; GMPK, guanilát-kináz; UMP/CMPK, UMP/CMP-kináz; TMPK, timidilát-kináz; NDPK, nukleozid-difoszfát-kináz. A mitokondrium belső membránjára vetített kérdőjel a feltételezett mitokondriális dezoxinukleozid-transzportert jelöli. A DNS lebomlása során keletkező szabad dezoxiribonukleozidok közvetlenül elérhetők a mentő enzimek számára (1. ábra). A legtöbb sejt azonban speciális nukleozid-transzporterekkel is rendelkezik, amelyeken keresztül az extracelluláris tér dezoxiribonukleozidjai a citoplazmába juthatnak (transzmembrán diffúziójuk hidrofil jellegük miatt nem lehetséges, bár ismertek olyan nukleozid-analógok, mint a 3 - azidotimidin és a 2,3 -didezoxi-adenozin, amelyek képesek átdiffundálni a sejtmembránon). Két nagy nukleozid-transzportercsalád ismert. Az ekvilibratív nukleozid-transzporterek (ENT) a purin- és pirimidin-nukleozidok facilitált diffúzióját biztosítják a koncentráció-grádiensnek megfelelően, akár mindkét irányban is. A 14

15 koncentratív nukleozid-transzporterek (CNT) a nukleozidok sejtbe történő felvételét nátrium-kotranszport révén biztosítják, tehát a koncentráció-grádiens ellenében is működhetnek, ugyanakkor szűkebb specificitásuk van. Az 1-es típusú CNT elsősorban pirimidin-nukleozidokat, míg a 2-es típusú döntően purin-nukleozidokat képes szállítani (1. ábra) [7]. A nukleozid-mentő folyamatok legfontosabb lépése a nukleozidok foszforilációja, hiszen a foszforilált nukleozidok erősen negatív töltésüknél fogva megrekednek a sejt belsejében. Az 5 -nukleotidázok azonban újra lehasíthatják a foszfátcsoportot, s ez a felszabaduló nukleozid kiáramlásához vezethet. A sejtből kijutó nukleozidok más sejtek nukleozid-membránreceptoraihoz kötődve a sejtek közötti jelátvitelt szolgálhatják, illetve visszakerülhetnek a kibocsátó sejt belsejébe. Az így létrejött szubsztrátciklus az intracelluláris nukleotid-koncentráció szabályozásának érdekes lehetőségét biztosítja [8]. Az emlős sejtekben négy különböző dezoxiribonukleozid-kináz fordul elő, amelyek az ATP vagy UTP γ-foszfátcsoportját a nukleozidok 5 -helyzetű hidroxilcsoportjával észteresítik. A timidin-kináz-1 (TK1) és a dezoxicitidin-kináz a citoplazmában, míg a timidin-kináz-2 (TK2) és a dezoxiguanozin-kináz (dgk) a mitokondriumok mátrixában található. Mindegyik enzim sajátos és részben átfedő dezoxiribonukleozid-specificitással rendelkezik [9] (1. ábra). Homológjaik a baktériumokban [10] és az eddig vizsgált eukarióta fajok szinte mindegyikében megtalálhatók, az élesztősejtek kivételével. Érdekesség, hogy Drosophila-fajokban egyetlen, az ún. multiszubsztrát dezoxiribonukleozid-kináz ( Drosophila-kináz ) fordul elő, amely az összes természetes dezoxiribonukleotidot foszforilálhatja [11]. A dezoxiribonukleozid-monofoszfátok további foszforilációját a sejtekben nagy mennyiségben megtalálható és magas aktivitású nukleozid-monofoszfát és -difoszfátkinázok katalizálják; előbbiek a nukleobázisokra specifikusak, viszont a ribo- és dezoxiribonukleotidokat egyaránt hatékonyan foszforilálják. A jelenleg ismert nukleozid-monofoszfát-kinázok közé a timidilát-kináz, az UMP-CMP-kináz, az adenilát-kináz ötféle izoenzime és a három guanilát-kináz-izoenzim tartozik. A nukleozid-difoszfát-kinázok viszont egyáltalán nem specifikusak (1. ábra). A három egymást követő foszforilációs lépés közül a dezoxiribonukleozid-kinázok aktivitása a sebességmeghatározó [12]. 15

16 A dezoxiliponukleotidok szintézise Ismert, hogy a membránalkotó foszfolipidek prekurzorainak aktiválása CTP felhasználásával történik. A CTP dctp-vel való helyettesíthetőségét már röviddel a foszfolipid-prekurzorok aktiválásért felelős citidilil-transzferáz felfedezését követően kimutatták [13]. Azonban sokáig úgy tűnt, hogy ennek nincs in vivo jelentősége, mígnem az időközben kifejlesztett HPLC-technikák segítségével lehetővé vált a dcdpkolin és a dcdp-etanolamin kimutatása sejtkivonatokból [14, 15]. Laboratóriumunkban kimutatták, hogy tonzilla-limfocitákban nagyon jól lehet jelezni a dcdp-kolint a sejtkultúrához adott radioaktív dezoxicitidinnel, és ezt a jelölődést a médiumhoz adott ribocitidin nagy feleslege sem csökkenti [16, 17, 18]. Ez arra utal, hogy az exogén eredetű, tehát a dezoxicitidin-kináz által foszforilált dezoxicitidinből képződő dctp-t a citidilil-transzferáz valóban felhasználja a membrán-liponukleotidok szintézise során. A CDP-kolin és a dcdp-kolin exogén ribo- illetve dezoxicitidinnel való jelzettsége azt mutatta, hogy a sejt a kétféle nukleozidot egyaránt fel tudja használni a foszfatidil-kolin szintézise folyamán. Ennek alapján a dezoxiliponukleotidoknak in vivo is lehet szerepe. További vizsgálatok kimutatták, hogy a liponukleotidok szintézisére szolgáló dctppool elkülönül a de novo szintézisből származó dctp-pooltól [14, 19]. A fent említett dcdp-kolin mellett kimutatható volt a dcdp-etanolamin és a dcdp-diacil-glicerol jelölődése is [15, 20]. Az 2. ábrán a liponukleotidok (LN) és a dezoxiliponukleotidok (dln) lehetséges képződési útjainak sémája látható. Feltehetően az UTP-ből de novo képződő CTP-pool szolgáltatja elsődlegesen a CTP-t a citidilil-transzferáz számára. A mentő úton az exogén ribocitidint az uridin-citidin-kináz foszforilálja CMP-vé, amelynek CDP-vé alakulása valószínűleg az UMP-CMP-kináz révén történik, majd a nukleoziddifoszfát-kináz a CDP-t CTP-vé alakítja. Ily módon a mentő reakciók révén keletkezett CTP és a de novo CTP-pool keveredése valószínű. Ez megmagyarázhatja azt a furcsa eredményt, hogy az izotóppal jelzett ribocitidin inkorporációja a CDP-kolin-frakcióba igen alacsony, ugyanis az intracelluláris CTP-pool a radioaktív jelzést nagymértékben felhígítja. Ugyanakkor a liponukleotidok exogén dezoxicitidinnel igen jól jelölhetők. Ennek valószínű oka a dctp-pool funkcionális megosztottsága, ami lehetővé teszi az exogén dezoxicitidin közvetlen bejutását a liponukleotid-frakcióba [15]. 16

17 LN DNS dln dln UTP CTP dctp de novo pool dctp salvage pool UDP CDP dndp RR dcdp UMP-CMP-kináz UMP CMP dcmp dump dtmp uridin-citidin-kináz - dck U rc dc 2. ábra. A liponukleotidok (LN) és dezoxiliponukleotidok (dln) szintézise, illetve a dctp-pool megosztottsága RR, ribonukleotid-reduktáz; rc, ribocitidin; dc, dezoxicitidin. Az arabinozil-citozin (arac) egy fontos antileukémiás gyógyszer [21], és 2-es pozíciójú hidroxilcsoportjának térállása ezt az analógot elsősorban a dezoxiribocitidinhez teszi hasonlatossá. Laboratóriumunk vizsgálatai szerint a limfociták radioaktív arac-vel történő jelölése esetén az arac mindössze 3 5%-a kerül a CDP-kolin/dCDP-kolin-frakcióba [16]. Radioaktív dc-t adva viszont 15%-os volt a liponukleotidok jelzettsége, s ez az arány akkor is megmaradt, ha a radioaktív dc-t nagy mennyiségű arac-vel együtt adták a sejtekhez. Ennek oka feltehetően az, hogy a dc és az arac eltérő úton metabolizálódik. Valószínű, hogy az arac a de novo dctp-poolba kerül be, amely csak elenyésző mértékben fordítódik a liponukleotidok szintézisére. Az arac-t a dck foszforilálja, az aracmp további foszforilációja az UMP-CMP-kináz révén történik, azonban a továbbiakban az aractp mégis elkülönül a mentett dezoxicitidin-trifoszfát-pooltól. A keletkező aractp DNS-be történő beépülése mérhető, bár a DNS-polimerázt az aractp kifejezetten gátolja [21]. Az arac tehát inkább a de novo képződött dctp útját követi. Ezek a kísérletek szintén alátámasztották a dctp-pool funkcionális megosztottságát. 17

18 2.2. A humán dezoxiribonukleozid-kinázok jellemzése Bár a dezoxicitidin-kináz a citoplazmában található, érdekes módon mégis a mitokondriális dezoxinukleozid-mentő kinázokkal mutat hasonlóságot. A dck, a dgk és a TK2 természetes szubsztrátjai tekintetében némi átfedés figyelhető meg; az enzimek expressziója konstitutív, továbbá aminosavsorrendjükben kb. 40%-os azonosság és ennél jóval magasabb fokú homológia figyelhető meg [9]. A TK1 ezzel szemben mind szerkezetében, mind S-fázis-specifikus expressziója tekintetében eltérő. A dck, a dgk és a TK2 hasonlóságának filogenetikai magyarázatát az adja, hogy feltehetően valamennyien a herpeszvírusok timidin-kinázainak származékai. Ezzel szemben a TK1 az E. coli és a poxvírusok timidin-kinázaihoz hasonló [12]. Az említett dezoxiribonukleozid-kinázok legfontosabb tulajdonságait az 1. táblázat összegzi. Tulajdonképpen közéjük kellene sorolni az adenozin-kinázt is, amely a dezoxiadenozint is foszforilálhatja, de magas K M -értéke miatt fiziológiás körülmények között erre nem kerül sor [12]. A táblázatból kitűnik, hogy a dgk és a TK2 a mitokondriális kompartmenten belül valamennyi dntp szintézisét képes biztosítani. A mitokondriális nukleozid-transzportert mindezidáig nem sikerült azonosítani (1. ábra), habár létezésének egyértelmű bizonyítéka, hogy a sejtekhez kívülről adott arag in vivo kitűnően foszforilálódik, és ez az analóg egyedül a mitokondriális dgk-nak szubsztrátja [22]. Az viszont bizonyított tény, hogy a mitokondriumok dezoxiribonukleotidokat is felvehetnek egy, a belső membránban található transzlokáz révén [23] (1. ábra). 1. táblázat. A dezoxiribonukleozid-kinázok összehasonlítása dck TK1 dgk TK2 Lokalizáció citoplazma citoplazma mitokondrium mitokondrium Expresszió konstitutív S-fázisban konstitutív konstitutív Természetes szubsztrátok dc, da, dg dt, du dg, da dt, du, dc 18

19 A dezoxicitidin-kináz A dezoxicitidin-kináz génje A dck-t kódoló gén a 4-es kromoszóma q13.3 q21.1 lokuszán található [24]. A gén hét exonból áll, és 260 aminosavat kódol. A második intron meglepően hosszú (>19 kb), és valószínűleg az enzim szövetspecifikus expressziójában játszik szerepet. A dck klónozása több téves eredményt követően 1991-ben járt sikerrel [25]. A klónozott enzimet egy dck-hiányos egér-sejtvonalban expresszálták, és a rekombináns fehérje tulajdonságai megegyeztek az emberi szövetekből tisztított dck paramétereivel. Az aminosav-szekvencia alapján azonosítani lehetett az enzim nukleotidkötő doménjét, és kiderült, hogy a dck szerkezete bizonyos fokú homológiát mutat a herpeszvírusok timidin-kinázaival, sőt meglepő módon az src tirozin-kináz-család tagjaival is [25, 26]. A dck promoterén két GC-boxot és két E-boxot azonosítottak, amelyek döntő módon befolyásolják a promoter aktivitását [27]. Kromatin-immunprecipitációval bizonyították, hogy a GC-boxokhoz in vivo az Sp1/Sp3 (specificity protein), az E-boxokhoz pedig az USF1/USF2 (upstream sequence factor) transzkripciós faktorok dimerjei kötődnek. A HepG2-sejteken végzett tranziens transzfekciók azt mutatták, hogy az USFdimer a gén transzkripcióját stimulálta, míg az Sp1 gátolta. Ez az ellentétes hatás részben az USF- és Sp1-faktorok közvetlen fehérje-fehérje kölcsönhatásán alapul, ugyanis az USF DNS-kötő doménjéhez kötődő Sp1 valószínűleg csökkenti az USF DNSkötő képességét [27]. Az eddigieken kívül még az E2F (eukarióta transzkripciós faktor- 2) palindrom kötőhelyének fele is kimutatható a promoteren, ahova az E2F in vitro bekötődhet és a transzkripciót is aktiválhatja [28]. A hiányos E2F-kötőhely ugyanakkor megmagyarázhatja azt a tényt, hogy a dck in vivo nem S-fázis-függő enzim, ellentétben a TK1-gyel, amelynek promoterén megtalálható a teljes E2F-kötőhely [29], és az E2Fretinoblasztóma fehérjekomplexnek a G1/S-fázishatáron történő felbomlása az E2F bekötődését és a TK1 transzkripciójának ugrásszerű emelkedését eredményezi [30]. Az utóbbi években egymástól függetlenül több munkacsoport is beszámolt arról, hogy alternatív splicing révén inaktív dck mutánsok keletkezhetnek, amelyeket a kettes, a hármas, a négyes vagy az ötös exon által kódolt peptidszakasz teljes hiánya jellemez. Ezeket a hibás enzimfehérjéket különböző nukleozid-analógokra rezisztens 19

20 sejtvonalakból [31-33], valamint akut mieloid leukémiában szenvedő, de arac-re nem reagáló betegek mieloblasztjaiból is izolálták [34]. Ezek az eredmények megerősítették a dck szerepét a kemorezisztencia kialakulásában, ugyanakkor kiderült, hogy a katalitikusan inaktív (vagy nem is expresszálódó) dck-mutánsok a vad típusú enzimre nincsenek domináns-negatív hatással [32, 35]. Felmerült, hogy egyes rezisztens sejtvonalakban a dck promotere hipermetilált lehet, de ezt kísérletileg nem sikerült igazolni [36] A dezoxicitidin-kináz-fehérje A dck homodimer formában aktív, s két azonos, 30 kda tömegű monomerből áll [25, 37, 38]. Kétdimenziós elektroforézissel mégis két különböző izoelektromos pontú dck-polipeptidet azonosítottak (pi: 5,5 és 5,7) [37, 39], aminek pontos magyarázata még nem ismert, de elképzelhető, hogy az alegységek töltéskülönbségét a fehérjelánc egy töltéshordozó másodlagos módosítása okozza. A dck-fehérje stabilitását magas fehérjekoncentráció (pl. albumin), 20% glicerin, valamilyen redukáló ágens (pl μm DTT) és komplex detergensek jelenléte nagyban fokozza [37, 38]. Az enzim stabilitása a szubsztrátok és a foszfátdonorok megkötése révén tovább növekszik [40]. A rekombináns dck térszerkezete a közelmúltban vált ismertté [41] (3. ábra). A homodimer globuláris fehérje betekeredett állapotban leginkább a Drosophila dezoxiribonukleozid-kinázra és a humán dgk-ra hasonlít [41]. A monomerek hidrofób magját öt párhuzamos lefutású β-lemez képezi, amelyeket tíz α-hélix vesz körül. A monomerek α4-es és α7-es hélixei alkotják a dimerizációs felületet; a dimer szerkezetét elsősorban a hidrofób oldalláncok kölcsönhatásai stabilizálják. A dck működése szempontjából három szekvencia-motívumnak van kitüntetett szerepe. Az egyik az ún. P-hurok, amelynek GX 4 GKS/T általános aminosavsorrendje (a dck-ban 28 GNIAAGKS 35 ) valamennyi dezoxinukleozid-kinázban megőrzött, és a foszfátdonor α- és β-helyzetű foszfátcsoportjainak megkötéséért felelős. A másik kritikus szerkezeti elem a Glu 127, az Arg 128 és a Ser 129 alkotta ERS motívum, ahol a glutaminsav-oldallánc szerepe a magnéziumion rögzítése (a magnéziumionnal további koordinációs kötéseket létesít a P-hurok 35-ös szerinje, a β-foszfát egyik oxigénatomja 20

21 és három vízmolekula). A 128-as arginin a katalitikus funkció kulcsa, ugyanis a nitrogénatomokban gazdag guanidinocsoportjával afféle molekuláris csörlőként működve a nukleozid-szubsztrát nukleofil P- LID 5 -hidroxil-csoportját 3,6 hurok Ǻ távolságra közelíti a foszfátdonor γ-foszfátjához, így teremtve meg a foszfáttranszfer legfontosabb feltételét. Végül a 3. ábra. A dck-dimer térszerkezete Az alsó ábra harmadik kulcsfontosságú ( felülnézet ) a felső oldalnézeti kép 90 fokos elforgatásával keletkezett. A kristályszerkezetbe zárt domén az ún. fedőhurok dezoxicitidin és ADP sárga színnel van jelölve. ( 188 RIYLRGRN 195 ), amely az enzimhez kötődött ATP-re legyezőszerűen ráborul és három konzervatívan megőrzött arginin-oldalláncával az ATP-kötést stabilizálja, illetve a 194-es arginin oldallánca közvetlen kölcsönhatásba kerül a γ-helyzetű foszfáttal, így az átmeneti katalitikus komplex fontos stabilizátorának tekinthető. A dck kristályosítása és röntgendiffrakciós analízise két szubsztrátanalóggal, az aracvel és a difluor-dezoxicitidinnel képzett komplex formájában is sikerrel járt. Ezek a vizsgálatok a dck széles szubsztrát-specificitásának és a nukleozid-analógok gyakran még a természetes szubsztrátokénál is hatékonyabb foszforilációjának molekuláris szintű magyarázatát adták [41]. A 4. ábrán a humán dck, dgk és TK2, valamint a Drosophila dezoxiribonukleozid-kináz aminosav-szekvenciái láthatók a nagyfokú homológiát érzékeltető ábrázolással. A 15 aminosavból álló insert domén érdekes módon csak a dck-ban (s részben a dgk-ban) található meg. A peptidszakasz deléciója az enzim szubsztrát-specificitását jelentősen megváltoztatta [41]. 21

22 4. ábra. A humán dck, dgk és TK2, valamint a Drosophila nukleozid-kináz szekvenciáinak összehasonlítása Az azonos aminosavakat piros, a hasonló karakterűeket sárga, a közös szerkezeti motívumokat pedig kék szín emeli ki. Az α1 10 és β1 5 szerkezeti elemek a dck-ra vonatkoznak. Átvéve: Sabini et al., Nat. Struct. Biol. 2003, 10, A humán dck-fehérje ellen nyúlban termeltetett poliklonális ellenanyag az egérből, a majomból és a patkányból származó dck-enzimet is kitűnően felismeri, ami az emlős dezoxicitidin-kinázok nagyfokú homológiájára utal [42], és ez a különböző emlősfajok dck-cdns-ének klónozása, majd az aminosavsorrend megállapítása révén is megerősítést nyert [43]. Az egér- és a humán dck szekvenciájának kisfokú eltérése ugyanakkor jellegzetes enzimkinetikai különbségekben nyilvánul meg [43, 44, 45]. Johansson és munkatársai a zöld fluoreszcens fehérjéhez (GFP) kapcsolt dezoxicitidin-kinázt különböző sejtvonalakban expresszálva azt tapasztalták, hogy a 22

23 fúziós fehérje a magban található, és a dck elsődleges szerkezetében megtalálható feltételezett nukleáris lokalizációs szignál elrontásával a dck-gfp sejtmagba történő felvétele megszűnt [46]. Ebből azt a következtetést vonták le, hogy a széles körben elfogadott nézettel szemben a dck nem a citoplazmában, hanem a sejtmagban található. Eredményeiket azonban már a rákövetkező évben megcáfolták Hatzis és munkatársai, akik az általuk előállított specifikus dck-antitest segítségével, in situ immunfluoreszcenciával és a sejtek frakcionálásával bizonyították be, hogy az endogén dck a citoplazmában található, ám túltermeltetése esetén valóban beléphet a sejtmagba [47]. Természetesen nem zárható ki, hogy bizonyos körülmények között az endogén dck is a sejtmagba kerül, aminek esetleg az enzim szabályozásának szempontjából lehet jelentősége A dck enzimológiai tulajdonságai A dck természetes szubsztrátjai közé a dezoxicitidin mellett a dezoxiadenozin és a dezoxiguanozin tartoznak [48], de az enzim emellett a terápiás jelentőségű nukleozid-analógok széles skáláját is foszforilálja [12], sőt a többi dezoxinukleozidkinázzal ellentétben a nukleozid-szubsztrátok L-dezoxiribózt tartalmazó enantiomerjeit és α-térállású anomerjeit is kitűnően hasznosítja [49]. Történeti érdekesség, hogy átfedő szubsztrát-specificitása miatt ezt az enzimet tévedésből dezoxiadenozin-kináz néven is törzskönyvezték (EC ) [12]. A purin-szubsztrátok alacsonyabb affinitással kötődnek az enzimhez (da: K M = 42 μm, dg: K M = 150 μm), mint a dezoxicitidin (K M = 0,8 μm); ezek az arányok azonban a környezet ionerősségének változtatásával eltolhatók [50]. A különböző munkacsoportok által leírt v max -értékek ugyanakkor jelentősen különböznek, ami részben módszertani eltérésekkel, részben az enzim nagyfokú instabilitásával magyarázható. Datta és munkatársai a dc-re, da-ra és dg-ra 8500, és nmol/perc/mg tisztított fehérje v max -értéket mértek [48], szemben a Bohman és Eriksson által meghatározott 145, 620 és 800 nmol/perc/mg tisztított fehérje adatokkal [37]. Ezek az eredmények azonban megegyeznek abban, hogy a purin-nukleozidok foszforilációja a dezoxicitidinéhez viszonyítva jóval gyorsabban történik. A dck stabilitásának érdekes vonása, hogy a 37 ºC-on inkubált enzim dezoxiadenozin-foszforiláló kapacitása már két 23

24 óra elteltével a felére esik, míg dezoxicitidint foszforiláló képessége még hat óra múlva is változatlan [40]. A szubsztrátok egymással szemben kompetitív gátlószerként viselkednek. A dezoxicitidin erősen gátolja a másik két szubsztrát kötődését, míg a purin-nukleozidok kevésbé gátolják a dezoxicitidin foszforilációját, ami a Michaelis-konstansok ismeretében jól magyarázható [37]. A dck azonban nem csupán a foszforilálandó nukleozid, hanem a foszfátdonor szempontjából is széles specificitású, hiszen az UTP-t az ATP-nél is eredményesebben hasznosítja, s elképzelhető, hogy in vivo körülmények között is elsősorban UTP-vel működik [51]. Kimutatták, hogy ATP jelenlétében a nukleozid és a foszfátdonor bekötődése bármilyen sorrendben történhet, UTP jelenlétében viszont először a foszfátdonor kötődik az enzimhez, ami megkönnyíti a nukleozid-szubsztrát dokkolását [52]. Az ATP és az UTP megkötése az enzim konformáció-változásával jár, ami az eredményesebb foszfáttranszfert segíti elő [53]. A dck térszerkezetének tisztázása a katalitikus funkció és a széles szubsztrátspecificitás jobb megértéséhez is hozzájárult [41]. Az 5. ábrán a dck-hoz kötődött dezoxicitidin-szubsztrátot rögzítő másodlagos kölcsönhatások láthatók. A dck specificitásának egyik legfontosabb meghatározója a 133-as aszpartát, amely a dck által nem foszforilálható timidinnel és dezoxiuridinnel a pirimidin-gyűrű 4-es helyzetű aminocsoportjának hiánya miatt nem tud kölcsönhatást 5. ábra. A dck-hoz kötött nukleozid-szubsztrátot rögzítő kölcsönhatások A megfelelő analógokkal létesített további hidrogénkötéseket a d1 és d2 nyilak jelölik. A kék körök vízmolekulákat jelképeznek. A feltüntetett távolságok angströmben értendők; 1 Å = 0,1 nm. AraC, arabinozilcitozin; Gem., gemcitabin; Cyt., ribocitidin. 24

25 létesíteni. Hasonló diszkriminátor-szerepet játszik a 104-es arginin, amely jelentős térigényénél fogva nem hagy elég helyet a timidin 5-ös helyzetű, nagy térigényű metilcsoportjának. Ezeket a megállapításokat fényesen igazolja az a kísérlet, amelyben a dck 104 Arg Met és 133 Asp Ala kettős mutánsa a timidint is kitűnően foszforilálta [41]. A ribonukleozidok bekötődését a 86-os helyzetű tirozin-oldallánc akadályozza meg, amelynek fenolos hidroxilcsoportja túlzott közelségbe kerülne a ribóz 2 - hidroxilcsoportjával. A 86-os tirozin ugyanakkor a 197-es glutaminsavval közösen vesz részt a dezoxiribonukleozid 3 -helyzetű hidroxilcsoportjának rögzítésében. A krisztallográfiás szerkezeti modell bizonyos pirimidin-típusú nukleozidanalógok eredményes foszforilációjára is magyarázatot nyújt. Az arabinozil-citozin 2 - helyzetű, a dezoxiribóz-gyűrű síkja felett elhelyezkedő hidroxilcsoportja az ERS motívum 128-as arginin-oldalláncával létesít hidrogénkötést (5. ábra; a d1 távolság 3,0 Ǻ). A gemcitabin (2,2 -difluoro-2 -dezoxicitidin) egyik fluoratomja szintén ezzel az argininnel léphet kölcsönhatásba, míg a sík alatti másik fluor-szubsztituens a 86-os tirozin hidroxilcsoportjával létesíthet hidrogénkötést (5. ábra; d2 = 2,7 Ǻ). Ezek a kölcsönhatások azt eredményezik, hogy a két nukleozid-analóg a dezoxicitidinnel összemérhető affinitással kötődik az enzimhez. A purin-nukleozidok és analógjaik kötődésének térszerkezeti modellje azonban még nincs kidolgozva. Régóta ismert, hogy a dctp a dck feedback gátlószere, a K I értéke 1 μm [38, 48, 54]. A dctp feltételezett allosztérikus kötőhelye valószínűleg nem egyezik meg az ATP-kötőhellyel, mivel kompetíció nem mutatható ki közöttük, ellenben a dctp gátló hatását dttp-vel fel lehetett függeszteni [54]. A tisztított enzim radioaktív dctp-vel történő jelölése során kiderült, hogy a feedback inhibitor kötőhelye részben átfedő mind a foszfátdonor, mind a nukleozid-szubsztrát kötőhelyével. Ennek megfelelően a dctp egy biszubsztrát analógnak is tekinthető, amely a dck-hoz való kötődése révén mind az ATP/UTP, mind pedig a nukleozid-szubsztrát bekötődését megakadályozza [55] A dezoxicitidin-kináz expressziója A dck enzim jelenléte és aktivitása az agy és a máj kivételével szinte valamennyi szövetből kimutatható [56, 57]. Kimagaslóan magas expresszió és enzimaktivitás mérhető a limfoid sejtekben, különösen a T-limfoblasztokban; a T- 25

26 limfociták érése során viszont a dck expressziója fokozatosan csökken, így az enzim mennyisége az érett T- és B-sejtekben már nagyon hasonló [57]. A dck mrns-ének alacsony, konstitutív jelenlétét valamennyi vizsgált szövetben, így agy- és májszövetben is kimutatták, a limfocitákban viszont ezt tíz-hússzorosan meghaladó szinteket találtak [44]. A májban és az agyban viszont valamilyen poszt-transzkripciós gátló mechanizmus érvényesül, ami az enzimfehérje szintézisét megakadályozza [58]. Számos, egymásnak ellentmondó adat látott napvilágot a dck expressziójának sejtciklus-függő szabályozásáról; az újabb eredmények viszont egyértelműen azt mutatják, hogy a dck protein- [57] és mrns-szintje [59] a limfocita-sejtciklus valamennyi fázisában azonos. A dck aktivitásának szelektív meghatározása [56, 60], illetve az enzim expressziójának immunológiai [57], valamint a kvantitatív, reverz transzkripcióhoz kapcsolt polimeráz-láncreakción (real-time RT-PCR) [61, 62] alapuló módszerekkel történő pontos mérésének kidolgozása nyomán kiderült, hogy a rosszindulatú tumorok dck-aktivitása és expressziója számos esetben meghaladja a normál szövetre jellemző értékeket [63], sőt egyes lágyrész-szarkómákból a limfoid sejtekre jellemző magas expresszió és enzimaktivitás mérhető [57]. A vizsgált humán tumorok dck-tartalma és enzimaktivitása átlagosan háromszorosa ötszöröse volt a megfelelő normál szövetekben mért értékeknek, ám még így is csak az ötödét érte el a normál limfocitákat jellemző aktivitásnak. A tumorok emelkedett dck-aktivitásának oka, illetve a dck esetleges szerepe a malignus transzformáció folyamatában még távolról sem tisztázott kérdés, ellenben a kemoterápia szempontjából fontos és hasznosítható tényező, mivel a legfontosabb nukleozid-analóg típusú daganatellenes gyógyszerek aktiválásának sebesség-meghatározó lépését a dck katalizálja. A különböző típusú leukémiában szenvedő betegek véréből izolált transzformált limfocitákban a dck expressziója és aktivitása számottevő különbségeket mutat, és összefüggést találtak az enzimaktivitás, valamint a betegség kemoterápiára való érzékenysége között [64, 65], amit a későbbiekben további munkacsoportok vizsgálatai is megerősítettek [35, 66, 67]. Természetesen a tumor magas dck-aktivitása nem feltétlenül jelenti azt, hogy a daganat a nukleozid-analóg kemoterápiára jól fog reagálni [68], ám az irodalom mégis jó prediktív értéket tulajdonít ennek a paraméternek [21, 69, 70]. További bizonyítékot jelentenek azok a megfigyelések, hogy a dck mrns-ének antiszenz oligonukleotidokkal, illetve ribozimokkal történő inaktiválása a nukleozid-analógokkal 26

27 szembeni rezisztencia kifejlődéséhez vezet [71, 72], viszont a dck génjének nukleozidanalóg kezelésre rezisztens tumorsejtekbe történő bevitele jóval érzékenyebbé teszi a sejteket az alkalmazott terápiával szemben [66, 73, 74]. A továbbiakban rövid áttekintést szeretnék adni a dezoxicitidin-kináz által foszforilált legfontosabb nukleozid-analógokról A dck által aktivált nukleozid-analógok és terápiás jelentőségük Az arabinozil-citozint (arac) a hatvanas évek óta eredményesen használják az akut mieloid és limfoid leukémiák, valamint a krónikus mieloid leukémiák blasztos fellángolásainak kezelésére. A sejtbe jutott arac-t a dck nagy hatékonysággal monofoszfáttá alakítja, majd az UMP-CMP-kináz és a nukleozid-difoszfát-kináz aractp-vé foszforilálja. Az aractp közvetlen gátló hatást fejt ki a DNS-polimerázokra, valamint a szintetizálódó DNS-be épülve láncterminációt okoz [75]. A dck-hiányos sejtekben arac-rezisztencia lép fel [70, 71], ami a sejtek hosszú ideig tartó alacsony dózisú arac-kezelésével is kiváltható [76]. A klinikai rezisztencia áttörésében sikerrel kecsegtető szellemes megoldás lehet az egyelőre in vitro körülmények között kipróbált S-acil-tioetil-araCMP nevű vegyület, az arac származéka. Ez a szer kellően apoláris ahhoz, hogy a membránon átdiffundálva a sejtbe jusson, ahol az S-acil-tioetil-csoport lehasadásával felszabadul az aracmp; így tehát a dck katalizálta foszforilációs lépés megkerülhető [76]. Preklinikai vizsgálatok folynak az arac hosszú szénláncú zsírsavakkal konjugált származékaival is, amelyekkel kiküszöbölhető a károsodott membrántranszport miatt fellépő rezisztencia, továbbá az arac hatástartama is meghosszabbítható [77]. A dfdc (2,2 -difluoro-2 -dezoxicitidin, gemcitabin, gemzar), a dezoxicitidin két geminális helyzetű fluoratommal szubsztituált származéka volt az első, szolid tumorok ellen is hatékony dc-analóg. Az eredetileg antivirális szernek szánt analógot 1986 óta eredményesen használják petefészek-, tüdő-, emlő- és hasnyálmirigydaganatok kezelésére. Hatásmechanizmusa rendkívül összetett. A dck által foszforilált dfdc-t a dezoxicitidilát-dezamináz dfdump-vé dezaminálja, s ez a metabolit a timidilát-szintázt erősen gátolja [78]. A gemcitabin difoszfátja a ribonukleotid-reduktáz 27

28 inhibitora [79, 80]. A dfdc-trifoszfát gátolja a DNS- és RNS-polimerázokat, ugyanakkor az arac-hez hasonlóan beépülhet a DNS-be, ami ún. maszkírozott láncterminációt eredményez. Ez azt jelenti, hogy a DNS-szintézis leállása csak egy további nukleotid inkorporációja után következik be [78]. A szer DNS-inkorporációját elősegíti a ribonukleotid-reduktáz gátlása, ugyanis ha kevesebb természetes dctp áll rendelkezésre, akkor nagyobb a valószínűsége annak, hogy a polimeráz a gemcitabintrifoszfátot építi be helyette. A dfdc az RNS-be is beépülhet, de ennek jelentősége még vitatott [81]. A 2-klór-2 -dezoxiadenozint (CdA, cladribin) 1972-ben szintetizálták először, és már ebben az évben kiderült antileukémiás hatása [82]. A CdA a dezoxiadenozin halogénezett származéka (6. ábra), amely rezisztenssé teszi az adenozin-dezamináz (ADA) katalizálta dezaminációval szemben, viszont a dck-nak kitűnő szubsztrátja marad, sőt a dezoxiguanozin-kináz is jól foszforilálja [57, 83]. Jól ismert, hogy az adenozin-dezamináz hiányában a datp koncentrációja toxikus szinteket ér el a sejtben [84]; ebből az valószínűsíthető, hogy a CdA toxicitásáért az aktív metabolit, a CdA CAFdA FaraA CdATP felhalmozódása lehet a felelős, amit a 6. ábra. A cladribin (CdA), a clofarabin (CAFdA) későbbiekben kísérletesen is igazoltak [85]. A CdA egyedülálló tulajdonsága, hogy osztódó és nyugvó sejtekre és a fludarabin (FaraA) szerkezete egyaránt toxikus. Osztódó sejtekben legfontosabb hatása a DNS-szintézis leállítása, amit a ribonukleotid-reduktáz és a DNS-polimerázok gátlása révén ér el [85]. A CdAkezelés során a sejt metilációs reakciói sem működhetnek tökéletesen, mivel a CdATP a transzmetilációs ciklus egyik enzimét, az S-adenozil-homocisztein-hidrolázt erősen gátolja, aminek következtében az SAM/SAH arány jelentősen lecsökken [86]. Nyugvó sejtekben a CdATP a hibajavító DNS-polimerázok gátlása révén DNS-lánctöréseket okoz, ennek következtében a poli(adp-ribóz)-polimeráz enzim aktiválódik, s a kiterjedt 28

29 ADP-riboziláció a NAD koenzim mennyiségének kritikus csökkenéséhez vezet, ami az ATP-szintézis gátlásán keresztül a sejt pusztulását eredményezi [87]. E klasszikusnak tekinthető mechanizmussal párhuzamosan a CdA a sejtek apoptotikus programját is beindítja [88, 89]. Később kimutatták, hogy a sejtmentes kivonatokhoz adott CdATP és citokróm-c hatására aktiválódik a kaszpáz-rendszer [90], illetve a citokróm-c citoplazmába történő kiáramlásához a nukleozid-analógok mitokondriumra gyakorolt közvetlen hatása is hozzájárul [91]. A legújabb eredmények szerint ez utóbbi mechanizmus annyira fontos tényező, hogy a mitokondriumok CdA-kezelés indukálta citokróm-c-kibocsátásának károsodása esetén az érintett sejtek rezisztensek lesznek a CdA-ra [92]. Azt is kimutatták, hogy a programozott sejthalál indukciója a gemcitabin [93, 94] és az arac [94] hatásmechanizmusának is lényeges részét képezi. A CdA ma a hajas sejtes leukémia elsőként választandó gyógyszere; a betegek több mint 95 %-a kedvezően reagál erre a kezelésre. Ez a betegség a B-sejtes krónikus limfoid leukémia egyik változata, amely a transzformált limfociták jellegzetesen nyúlványos megjelenéséről kapta a nevét [95]. A CdA emellett az akut és krónikus mieloid leukémia, a krónikus limfoid leukémia és a rosszul differenciált non-hodgkin-limfómák kezelésében is hatékonynak bizonyult, sőt az autoimmun betegségek terápiájában is helyet kapott, mivel immunszuppresszív hatása felülmúlja a ciklosporinét [96]. A CdA hatékonysága ösztönzőleg hatott további halogénezett dezoxiadenozinszármazékok szintézisére (6. ábra). Az arabinozil-fluor-adenint (FaraA, fludarabin) már a klinikai gyakorlatban is használják a CLL kezelésére [97]. A CAFdA (clofarabin, 2- klór-2 -fluor-arabinozil-adenin) kifejlesztésével a CdA savra való érzékenységéből és az FaraA gyenge vízoldékonyságából eredő farmakokinetikai hátrányokat egyaránt sikerült kiküszöbölni [98]. Ez a vegyület pillanatnyilag a klinikai vizsgálatok II-es fázisában van [99]. A dck a felsorolt tumorellenes szereken kívül számos olyan nukleozid-analógot is képes foszforilálni, amelyek a humán immundeficiencia- és a hepatitis B-vírusok replikációját gátolják, mint pl. a 2,3 -didezoxicitidin és az arabinozil-adenin [12]. 29

30 A timidin-kináz-1 A citoplazmatikus timidin-kináz-1 (TK1) génje a 17-es kromoszóma hosszú karján található. A humán TK1 gént 1983-ban klónozták [100]. Az enzim monomerjének molekulatömege 24 kda, és tetramer formában aktív. Foszfátdonorként az ATP-n kívül valamennyi nukleozid- és dezoxinukleozid-trifoszfátot hasznosíthatja a CTP és a dttp kivételével. Érdekes jelenség, hogy az enzim tetramerizációját az ATP indukálja, míg ATP nélkül a nagyon alacsony katalitikus aktivitású dimer forma alakul ki [101]. A TK1 szubsztrát-specificitása a többi nukleozid-kinázéhoz viszonyítva jóval szűkebb. Fő szubsztrátja a dezoxitimidin (K M = 0,5 3 μm), emellett kisebb hatékonysággal a dezoxiuridint is foszforilálja, a dezoxicitidint és a purin-nukleozidokat viszont nem képes hasznosítani. A TK1 által foszforilált antimetabolitok közül legismertebb az 5-fluor-dezoxiuridin és az azidotimidin, amit az AIDS terápiájában használnak. A TK1 kizárólag olyan nukleozidokat képes foszforilálni, amelyek a pirimidin-gyűrű 5-ös pozíciójában valamilyen nagy térkitöltésű szubsztituenst tartalmaznak [102]. A TK1 működésének szabályozása transzkripciós, transzlációs és poszttranszlációs szinten történő összetett folyamat. A TK1 aktivitása normálisan osztódó és malignus sejtekben egyaránt magas [57]. Az enzim S-fázis-specifikus expressziója az E2F és NF-Y (nuclear factor Y) transzkripciós faktorok promoteren található kötőhelyével jól magyarázható [29, 30, 103]. Az osztódásukban gátolt sejtek timidinkináza viszont gyorsan degradálódik; ez a folyamat a 30 aminosavból álló C-terminális domén épségét feltételezi, de az enzim szubsztrátjainak jelenléte a fehérje lebomlását meggátolja [104]. A C-terminális domén deléciója HeLa-sejtekben a mutáns TK1 konstitutív expressziójához vezetett [105]. Chang és munkatársai kimutatták, hogy mitózis során a TK1 foszforilálódik, ami aktivitásának csökkenését eredményezi [106], valamint a fehérje specifikus lebomlásához vezet [107]. Ugyanez a munkacsoport azt is leírta, hogy a TK1 a p21 sejtciklus-szabályzó fehérjével komplexet alkot, de a kölcsönhatás funkcionális jelentősége egyelőre nem ismert [108]. Érdekes kérdés, hogy a szervezetnek miért van szüksége a citoplazmatikus timidin-kinázra, hiszen az csupán az S-fázisban működik, éppen akkor, amikor a sokkal nagyobb dezoxitimidilát-szintetizáló kapacitással rendelkező ribonukleotid-reduktáz is 30

31 aktív. A magyarázat valószínűleg a timidinmentés kisebb energiaigényében rejlik. A TK1-génkiütött egér mindenesetre életképes, ám jellegzetes fenotípusos eltéréseket mutat. Az állatok egyéves koruk körül elpusztulnak glomerulosclerosis talaján kialakuló krónikus veseelégtelenségben. Az immunrendszer károsodására a lép megváltozott szövettani szerkezete, a lép-limfociták erősen csökkent kolónia-formáló képessége, valamint az artériák gyulladásos megbetegedései utalnak. A szérum timidinszintje jelentősen emelkedett [109] A mitokondriális dezoxinukleozid-kinázok A mitokondriális DNS szintéziséhez, illetve hibajavításához folyamatos dntpellátásra van szükség. A mitokondrium belső membránja viszont az erősen poláris nukleotidok számára átjárhatatlan, így a mátrix nukleotid-utánpótlását egyrészt a nemrégiben azonosított nukleotid-transzporter [23], másrészt a mitokondriális mentő enzimek biztosítják (a de novo nukleotid-bioszintézis enzimeit eddig csak a citoplazmában sikerült kimutatni). A nyugvó sejtek citoplazmájában ráadásul annyira lecsökken a dntp-szintézis sebessége, hogy a mitokondrium nukleotidigényét teljes egészében a timidin-kináz-2-nek és a dezoxiguanozin-kináznak kell fedeznie. Bár korábban a dck mitokondriális lokalizációja is felmerült, később bebizonyosodott, hogy a dck-nak nincsen mitokondriális izoenzime [110]. A humán TK2 génje a 16-os kromoszómán található, és 1997-ben klónozták [111]. Az enzim az N-terminálison található targetszekvencia segítségével kerül a mitokondriumba [112], ugyanakkor kis mennyiségben a citoplazmából is kimutatható, de az még nem eldöntött, hogy citoplazmatikus retenció, avagy mitokondriális szivárgás, netán egy mindmáig ismeretlen citoplazmatikus izoenzim miatt [113]. A TK2 expressziója konstitutív, és a különböző szövetekben mérhető aktivitása a mitokondriumok számával arányos [57, 112]. A TK2-fehérje molekulatömege 29 kda, és szubsztrátjai bekötődése nyomán a katalitikusan aktív dimer formába megy át [114]. Az enzim természetes szubsztrátjai közé a három pirimidin-dezoxiribonukleozid tartozik, míg a purin-nukleozidokat nem hasznosítja, de számos dezoxicitidin- és dezoxiuridin-analógot is foszforilálhat [102]. 31

32 A humán dezoxiguanozin-kináz (dgk) két 29 kda-os alegységből álló homodimer. A dgk-t eddig minden vizsgált szervből ki tudták mutatni; expressziója a TK2-höz hasonlóan nem sejtciklus-függő, és jó összefüggést mutat az adott szövet mitokondrium-ellátottságával [12]. Egyes agytumorok és citomegalovírussal fertőzött sejtek viszont kiemelkedően magas dgk-aktivitást mutatnak [83]. Az enzim cdns-e 277 aminosavat kódol, amelyből az első 17 a mitokondriális import-szekvencia. A sejtek biokémiai frakcionálása, illetve in situ immunfluoreszcens vizsgálata egybehangzóan azt jelzi, hogy a dgk a mitokondriális mátrixban található [115, 116], ámbár apoptózis során a dgk kijuthat a citoplazmába [116]. A dgk egy alapvetően purin-specifikus dezoxiribonukleozid-kináz (K M -je a dezoxiguanozinra nézve 2,5 7,6 μm, a dezoxiadenozinra pedig 60 μm), amely a pirimidin-nukleozidokat nem foszforilálja [83]. A dgk által hasznosítható nukleozidanalógok közé tartozik a 2-klór-2 -dezoxiadenozin (CdA), a 2,2 -difluordezoxiguanozin, valamint az arabinozil-guanozin is (arag), amelyet a dezoxiguanozinhoz hasonló affinitással foszforilál (K M = 8 μm) [117]. Bár az arag-t gyenge hatékonysággal a dck is képes foszforilálni, az in vivo hatás feltétele a dgk által történő foszforiláció, amint azt Zhu és munkatársai a közelmúltban demonstrálták [118]. Radioaktívan jelzett arac-vel, illetve arag-vel inkubált sejtek autoradiográfiája során kiderült, hogy az aractp a nukleáris DNS-be, míg az aragtp kizárólag a mitokondriális DNS-be épült be. A kísérletet egy dck-hiányos sejtvonallal megismételve azt kapták, hogy az arac inkorporációja eltűnt, majd a dck-cdns transzfekciója után újra megjelent a magban, de a mitokondriumok arag-vel való jelöltsége a dck hiányában és jelenlétében sem változott. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a nukleozid-analógok elsősorban azon kompartment DNS-ébe épülnek be, amelyben első foszforilációs lépésük megtörténik. Ezt a megfigyelést a szerzők a dck különböző sejtkompartmentekbe történő mesterséges irányításával is megerősítették, egyúttal kimutatták, hogy a mitokondriális DNS-be inkorporálódott analógok beindítják a programozott sejthalál folyamatát [119]. Az arag tehát különös klinikai jelentőségre tehet szert a csökkent vagy hiányzó dck-aktivitást mutató daganatok kemoterápiájában, mert a tumorsejteket a mitokondriumok dgk-függő károsítása révén apoptózisra bírhatja. Természetesen az arag-rezisztencia kialakulásának veszélye is fennáll [120]. 32

33 A mitokondriális dezoxinukleozid-kinázok további gyógyászati jelentőségét az adja, hogy inaktiválódásuk az ún. mitokondriális DNS-depléciós szindrómák (MDS) kialakulását eredményezheti, amely betegségekre a mitokondriális DNS-molekulák számának (kópiaszám) csökkenése és a mitokondriumok következményes diszfunkciója jellemző. A súlyos májelégtelenséggel, hipoglikémiával, laktát-acidózissal és idegrendszeri szövődményekkel jelentkező hepatocerebrális MDS hátterében a dgk kódoló régiójának pontmutációját azonosították, ami a dgk fehérje teljes hiányával jár [121]. A főként izomdisztrófiával kísért muszkuláris típusú MDS-t a TK2 gén olyan mutációi okozzák, amelyek egyetlen aminosav kicserélődéséhez vezetnek ( 90 His Asn, vagy 181 Ile Asn). Ezek a mutáns enzimek viszont a vad típusú TK2 aktivitásának csak %-át képesek biztosítani, ami a mitokondriumok homeosztázisának fenntartásához a jelek szerint nem elegendő [122]. Ezek a megfigyelések a mitokondriális nukleozid-mentő reakciók élettani jelentőségére is rámutatnak nukleotidázok: a nukleozid-kinázok funkcionális antagonistái Az 5 -nukleotidázok a dezoxinukleozid-kinázokkal ellentétes működést fejtenek ki azáltal, hogy a nukleozid-monofoszfátok 5 -helyzetű foszfátcsoportját lehasítják. Az 5 -nukleotidázok elhelyezkedésük szempontjából három fő csoportba sorolhatók [123]: ismeretesek a szérumban, a sejtmembrán külső felszínén (ektoenzimek), illetve a citoplazmában található 5 -nukleotidázok. A szérumban található 5 -nukleotidázok aktivitása májkárosodás és bizonyos daganatos megbetegedések esetén megemelkedik, így diagnosztikus jelentőségük van [124]. Az ekto-5 -nukleotidáz a membránba ágyazott enzim, amely extracelluláris nukleotidokat metabolizál; CD73 felszíni antigénnek is nevezik. Elsődleges szubsztrátja az AMP, de valamennyi purin- és pirimidin-nukleotid bontására képes. Az utóbbi időben ismerték fel a lokális hormonokként, illetve neurotranszmitterekként funkcionáló extracelluláris nukleotidok és nukleozidok biológiai szerepét a szív-érrendszer és az idegrendszer működésének szabályozásában. Az ekto-5 -nukleotidáz fontos szerepet tölt be ezen nukleotidok és nukleozidok egymáshoz viszonyított arányának beállításában [125]. 33

34 Az intracelluláris nukleotidok hidrolízisét a citoplazmatikus 5 -nukleotidázok végzik. Az ekto-5 -nukleotidázhoz nagyon hasonló enzim az ún. citoplazmatikus alacsony K M -ű nukleotidáz, amely elsősorban AMP-t bont. A hasonlóság a két enzim molekulatömegében (70 kda), aminosav-szekvenciájuk nagyfokú homológiájában, működésük ph-optimumában és aktivitásuk ATP-vel való gátolhatóságában nyilvánul meg. A másik sejten belüli nukleotidáz a citoplazmatikus magas K M -ű 5 -nukleotidáz, amelynek elsődleges szubsztrátjai az IMP és a GMP, és aktivitásuk ATP-vel stimulálható. Rajtuk kívül további citoplazmatikus 5 -nukleotidázokat is leírtak, amelyeknek biológiai szerepe még nem teljesen tisztázott [12]. A citoplazma 5 -nukleotidázai a dck által foszforilált nukleozid-analógokat is hatékonyan defoszforilálhatják. A két 5 -nukleotidáz emelkedett expressziója és/vagy fokozott aktivitása gyakran áll a nukleozid-analógokkal szemben in vivo és in vitro kialakuló rezisztencia hátterében, amint azt az alábbi vizsgálatok eredményei is bizonyítják (2. táblázat). Analóg Betegség/sejtvonal 5 -nukleotidáz Hivatkozás CdA hajas sejtes leukémia magas K M [64] arac akut mieloid leukémia magas K M [70, 126] arac akut mieloid leukémia citoplazmatikus [127] arac/cda erythroleukémia citoplazmatikus [128] CdA HL-60 magas K M [129] CdA, FaraA, arac, dfdc K562 citoplazmatikus [130] CdA, dfdc Jurkat, HEK-293 alacsony K M [131] 2. táblázat. A magas 5 -nukleotidáz -aktivitás és a nukleozid-analógokkal szembeni rezisztencia közötti összefüggések hematológiai betegségekben és sejtvonalakon A citoplazmatikus jelző a citoplazma össz-5 -nukleotidáz-aktivitásának emelkedett voltára utal. 34

35 3. CÉLKITŰZÉSEK Kutatómunkám kiindulópontját az a laboratóriumunkban tett megfigyelés képezte, hogy a CdA-val kezelt humán limfociták dck-aktivitása jelentős mértékben megnövekedett. Mivel az aktívabb enzim több CdA-t tud foszforilálni, a nukleozidanalóg citotoxicitása fokozódik, ami azon túl, hogy bepillantást nyújt a dck aktivitásának biokémiai szabályozásába, egyúttal komoly gyakorlati jelentőséggel is bír a nukleozid-analógokkal végzett daganatterápia hatékonysága szempontjából. Célkitűzésünk a dck aktiválódásának az alábbi szempontok szerinti részletesebb tanulmányozása volt: 1. Vizsgálni kívántuk, hogy a dck aktiválódása szelektív jelenség-e, avagy a nukleozid- és nukleotid-metabolizmus más enzimeinek az aktivitása is megváltozik a CdA hatására. 2. Az enzimaktiválódás körülményeinek feltérképezése, illetve a jelenség okának és jelentőségének tisztázása fizikai és kémiai sejtkárosító hatások alkalmazásával. Választ kerestünk arra, hogy A dck aktiválhatóságának tekintetében van-e különbség a különböző eredetű nyugvó és osztódó (normál, illetve transzformált) sejtek között? Van-e különbség a természetes dezoxinukleozid-szubsztrátok, illetve a purin- és pirimidin-analógok enzimaktivitásra gyakorolt hatása között? Nem-metabolizálható szubsztrát-analógokkal (nukleozid-5 -tioszulfátok) aktiválható-e az enzim? Célzott DNS-károsító hatások fokozzák-e a dck aktivitását? Szerepet játszhat-e a dck aktiválódása a limfociták apoptózisában? 35

36 3. Kísérletet tettünk a dck-aktiválódás molekuláris mechanizmusának megértésére, azaz tisztázni kívántuk a következőket: Változik-e a dck-fehérje mennyisége a folyamat során? Lehetséges-e, hogy az észlelt aktiválódásért az enzim foszforilációja a felelős? Milyen hatással van az aktivitásra a kináz/foszfatáz-egyensúly megzavarása protein-foszfatáz-gátlószerek, illetve hiperozmotikus kezelés alkalmazásával? Történik-e stabil konformáció-változás az aktiválódás során? Szerepet játszik-e a p53-fehérje a DNS-károsodás nyomán fellépő enzimaktiválódásban? 36

37 4. MÓDSZEREK 4.1. Anyagok 3 H-dC (specifikus aktivitás: 555 GBq/mmol, koncentráció: 37 MBq/ml) és 3 H- dt (925 GBq/mmol, 37 MBq/ml) izotópokat, Hybond ECL nitrocellulóz-membránt (RPN2020D), Hybond-P PVDF-membránt (RPN1416F), ECL western blot detektáló reagenst (RPN2108), tormaperoxidázzal konjugált anti-nyúl IgG-t, valamint Ficoll- Hypaque TM szintetikus szukróz-polimert az Amersham Biosciences-től vásároltunk. A radioaktívan nem jelölt természetes nukleozidokat és nukleotidokat, az RPMI tápoldatot, továbbá a PMSF, DTT, NP-40, glicerin, Ponceau S, DNáz, ribonukleáz A, proteináz K, etídium-bromid, BAPTA-AM, thapsigargin, Coomassie Brilliant Blue R-250, EGTA, aphidicolin, okadainsav, szorbitol, tripánkék, FaraA, arac, azadc, 3- ABA, genistein, β-glicerofoszfát, AMP-CP, 5-FU, FdUMP, PD 98059, SB , tripszin és szójabab eredetű tripszin-inhibitor anyagokat a Sigma cégtől szereztük be. A fehérjekoncentráció meghatározásához használt reagensek (Bio-Rad D C Protein Assay Kit No ) és a széles sávú protein marker a Bio-Rad Laboratories termékei. A Kieselgel 60 F DC vékonyréteg-kromatográfiás szilikagél-lemezt a Merck, a BSA-t és a poolok méréséhez használt dezoxinukleozidtrifoszfátokat a Bohringer-Mannheim, a rekombináns λ protein foszfatázt (20000 U/ml) és kiegészítő reagenseit (10x reakciópuffer és MnCl 2 ) a New England Biolabs, a dezoxicoformycint a Warner-Lambert Co. (USA), az alacsony lágyuláspontú agarózt, fötális borjúszérumot, penicillint, streptomicint és L-glutamátot pedig a Gibco Laboratories szállította. A calyculin A, a tirfosztin A47 és PD vegyszereket a Calbiochemtől, az E. coli DNS-polimeráz I Klenow fragmentet (5000 U/ml) a Pharmacia cégtől (Uppsala, Svédország), az oligonukleotid primert és templátokat a Sigma-Genosys-től (Pampisford, UK), az üvegszálas GF/C filtereket a Whatman cégtől (Maidstone, UK) vásároltuk. A 14 C-IMP-t (2,07 GBq/mmol, 3,7 MBq/ml) és 14 C-dCMP-t (15 GBq/mmol, 4 MBq/ml) az UVUUR Co. szállította (Prága, Csehország). A 3 H-CdA (152 GBq/mmol, 37 MBq/ml), 3 H-dATP (1092 GBq/mmol, 37 MBq/ml) és 3 H-dTTP (2257 GBq/mmol, 37 MBq/ml) izotópok pedig a Moravek Biochemicals Inc. termékei. Eagle s MEM 37

38 tápoldatot, valamint steril PBS oldatot az Országos Epidemiológiai Központ Tápfolyadék Laboratóriumától (Budapest) vásároltunk. A DMEM tápfolyadékot a Flow Laboratories-től (Irvine, Skócia) szereztük be. Az etopozidot a Bristol-Myers Squibb Scandinavia, a CAFdA-t pedig dr. H. Cottam (University of California, San Diego, USA) bocsátotta rendelkezésünkre. A CdA-t, CrA-t és a nukleozid-5 -tioszulfátokat dr. Z. Kazimierczuk (Varsó, Lengyelország) szintetizálta [132, 133]. Az összes többi, itt fel nem sorolt reagens a Reanal (Budapest) analitikai tisztaságú gyártmánya volt Sejtkultúrák, kezelések és metabolikus jelölés Sejtkultúrák A humán T-limfoblasztoid CCRF-CEM, a humán B-limfoblasztoid DG-75, a humán Burkitt-limfóma eredetű Ramos- és BL-41, valamint a krónikus mieloid leukémia K562 és promielocitás leukémia HL60-sejtek tenyésztése 10% fötális borjúsavóval kiegészített és 100 U/ml penicillint, 100 μg/ml streptomicint és 2 mm L- glutamátot tartalmazó RPMI-1640 médiumban történt 37 ºC-on, vízgőzzel telített 5% CO 2 95% O 2 atmoszférában. A sejtek kezelése céljából az exponenciális fázisban osztódó kultúrákat (4 8 x 10 5 sejt/ml) lecentrifugáltuk (1100 g, 5 perc, 4 ºC), szérummentes tápoldatban kétszer mostuk, majd dializált szérumot tartalmazó RPMI tápoldatban vettük fel 2 10 x 10 6 sejt/ml sűrűségben. Az egészséges donorok, illetve gemcitabinnal kezelt pancreastumoros betegek vérlimfocitáit (perifériás mononukleáris sejtek (PBMC)), valamint krónikus limfoid vagy akut mieloid leukémiában szenvedő betegektől levett, heparinozott vérmintákból származó CLL-PBMC- és AML-PBMC- sejteket Ficoll-Hypaque grádienscentrifugálással izoláltuk. A teljes vért megegyező térfogatú PBS-sel hígítottuk, majd két rész vért óvatosan egy rész Ficoll-oldat (ρ = 1,077 g/ml) felületére rétegeztünk és 20 ºC-on 800 g-vel 20 percig centrifugáltuk. A mononukleáris sejtek alkotta fehér gyűrűt óvatosan kiszívtuk a centrifugacsőből, majd a sejteket PBS-ben kétszer mostuk és RPMI-tápoldatban 10 7 sejt/ml koncentrációban felszuszpendáltuk. 38

39 Humán tonzilla-limfocitákat 3 6 év közötti gyermekek tonsillectomia során eltávolított szájpadmanduláiból preparáltunk [134]. A mandulákat a Heim Pál és a Bethesda Gyermekkórház bocsátotta rendelkezésünkre, és a sejtizolálás a műtétet követő másfél órán belül elkezdődött. Az apróra vagdosott és Eagle s MEM oldattal összekevert tonzillákból a nyiroksejteket enyhe rázással távolítottuk el. A szövetdarabok két réteg gézen történő eltávolítása után a sejtszuszpenziót kétszer mostuk jéghideg Eagle s oldatban történő centrifugálással (K23 centrifuga, 1100g, 10 perc). Végül a sejteket 10 7 /ml koncentrációban Eagle s MEM-oldatban felszuszpendáltuk. A tonzilla-limfociták nyugvó és osztódó sejtpopulációinak elválasztását albuminsűrűséggrádiens centrifugálás segítségével végeztük. 1 ml sejtszuszpenziót (10 8 sejt/ml) 1 ml, 25%-os, Eagle s MEM tápfolyadékban oldott BSA-grádiens felületére rétegeztünk és 30 percen át 1000 g-vel centrifugáltunk. A limfoblasztok (S-fázisú sejtek) az interfázisban gyűlnek össze, a nagyobb sűrűségű kis limfociták (G-fázisú sejtek) pedig leülepednek a centrifugacső aljára. Az így szeparált sejtpopulációkat PBS-sel mostuk, majd koncentrációjukat Eagle s MEM-ben 10 7 /ml-re állítottuk be. Humán timocitákat szívműtéteken átesett fél egy éves gyermekek timuszából az előző bekezdésben leírt módszer szerint izoláltunk; a műtét során eltávolított szerveket az Országos Kardiológiai Intézet bocsátotta rendelkezésünkre. Az egér timuszból és lépből történő limfocita-preparálás is a tonzillánál ismertetett módszer szerint történt Sejtszám és élősejtszám meghatározása A primer limfocita-kultúrákban a sejtszámot Türck-oldattal történő szupravitális festéssel határoztuk meg. A Türck-oldattal megfelelő mértékben hígított sejtekkel Bürker-kamrában két független számolást végeztünk. Az élősejtszámot tripánkék kizárási teszttel határoztuk meg (0,4% tripánkék 0,85%-os nátrium-klorid-oldatban). Az élősejtszám a kísérletekben 90% felett volt. A sejttenyészetek koncentrációját és a sejtek térfogatát Coulter Multisizer automata készülékkel (Coulter Electronics, Luton, UK) mértük. 39

40 Sejtkultúrák kezelése A szövetből vagy vérből izolált, illetve sejttenyészetekből nyert, 0,5 1 ml térfogatú sejtkultúrákat Eppendorf csövekben, 37 ºC-os vízfürdőben, az egyes kísérletek leírásánál megadott szerekkel és időtartamokig inkubáltuk. A kezeléseket a sejtszuszpenziók jégen történő gyors lehűtésével állítottuk le, majd centrifugálással ülepítettük a sejteket (Eppendorf centrifuga, 1100 g, 2 perc). A sejtcsapadékot hideg PBS-oldatban kétszer mostuk, majd extrakciós pufferben vettük fel Limfociták γ-besugárzása A primer tonzilla-limfocita-kultúrák γ-besugárzását 60 Co sugárforrással, Siemens Gammatron-3 készülékkel végeztük szobahőmérsékleten, Eppendorf csövekben. A légdózis-teljesítmény 0,4882 Gy/perc volt 52,5 cm távolságból besugarazva. Az elnyelt dózis 0,5 4 Gy között változott, amelyet a besugárzási idő megfelelő megválasztásával (1,0 8,2 perc) állítottunk be. A besugárzást követően a sejteket meghatározott ideig 37 ºC-on inkubáltuk, majd jégen lehűtöttük és sejtkivonatokat készítettünk belőlük. A sejtek γ-besugárzását az Országos Sugárbiológiai és Sugáregészségügyi Intézetben, dr. Sáfrány Géza munkacsoportjával együttműködésben végeztük Radioaktívan jelölt dezoxinukleozidok metabolizmusának mérése A különböző hatóanyagokkal való kezelést, illetve γ-besugárzást követően a sejtszuszpenziókat (5 x 10 6 sejt 500 μl-es térfogatban) 30 percen át jelöltünk 3 H-dC-nel vagy 3 H-dT-nel (1,0 μci/ml, a specifikus aktivitás cpm/pmol között mozgott). A centrifugált sejtcsapadékot kétszer mostuk jéghideg PBS-sel, majd 100 μl 75%-os etanol hozzáadása után a mintákat egy éjszakán át 20 ºC-on tartva csaptuk ki a sejtfehérjéket. Az etanollal kicsapott szuszpenzió lecentrifugálását követően (1850 g, 2 perc) minden minta felülúszójából μl-t mértünk két sorozat DEAE-szűrőpapírra [135]. Az első sorozat papírra cseppentett felülúszót szárítószekrényben beszárítottuk. Ez tartalmazza a sejtbe jutott összes, alkohol-oldékony radioaktivitást, amelyet 40

41 kísérleteinkben felvételnek neveztünk. A másik sorozat filtereit enyhe kevergetés mellett 10 percig jéghideg, 1,5 mm-os ammónium-formiát oldattal, majd percig szobahőmérsékletű 1,5 mm-os ammónium-formiáttal, desztillált vízzel és 96%-os etanollal mostuk, majd ezeket a papírokat is beszárítottuk. Mivel a mosás után kizárólag a foszforilált dezoxinukleozidok maradnak a DEAE-papírhoz kötődve (a szintén jelölt dezoxiliponukleotidok, illetve a nem foszforilált jelzett dezoxinukleozidok lemosódnak), az így elkülönített frakciót foszforilációnak nevezzük. A dezoxiliponukleotid- és dezoxinukleozid-frakciók jelöltsége a felvétel és foszforiláció különbségének felel meg [15]. Mivel a sejtbe jutott radioaktív nukleozidok mindössze 1 2%-a marad foszforilálatlan, mennyiségük elhanyagolható, tehát a felvétel és foszforiláció különbségéből számottevő pontossággal tudunk következtetni a dezoxiliponukleotid-frakció jelöltségére. A megszárított DEAE-filtereket szcintillációs üvegküvettákba helyeztük, majd a hozzájuk kötődött radioaktivitást 200 μl 0,5 M perklórsavval eluáltuk és 3 ml szcintillációs koktélt mértünk rá (összetétele: 33 v/v% Triton-X-100, 12,14 mm 2,5- difenil-oxazol (PPO), 92 μm 1,4-di-[2-(5-fenil)oxazoil]benzol (POPOP) toluolban oldva). Alapos összerázás után a minták aktivitását Packard-Bell szcintillációs számlálóval mértük. Az alkohollal feltárt sejtek centrifugálással elkülönített csapadékát 0,5 M perklórsavban felszuszpendáltuk, majd centrifugáltuk és kétszer mostuk. A savban nem oldódó csapadékot 500 μl perklórsavban 90 ºC-on 60 percig kezeltük. A szuszpenzió lehűtését és centrifugálását követően az elhidrolizált nukleinsavakból származó nukleotidok a felülúszóban találhatók. Az ebben a frakcióban mérhető, DNS-be és RNS-be épült radioaktivitást inkorporációnak nevezzük (a kívülről adott, jelzett dezoxinukleozidok csak a DNS-frakcióba inkorporálódnak [17]). A savas felülúszóból 200 μl-t közvetlenül küvettába mértünk, és a radioaktivitás meghatározása a fentiekkel egyező módon történt. A felvett, a foszforilált, illetve a DNS-be inkorporált radioaktív nukleozidok pmol/10 6 sejt/30 perc egységben kifejezett mennyiségét az ismert mennyiségű és specifikus aktivitású standardok azonos körülmények között mért aktivitásából számítottuk. 41

42 4.3. Nyerskivonatok enzimaktivitásának mérése Nyerskivonat készítése Az 5 x 10 6 sejtből származó csapadékot 100 μl extrakciós pufferben vettük fel, amelynek összetétele: 50 mm Tris-HCl ph 7,6, 0,5% NP-40 nem-ionos detergens, 20 v/v% glicerin, 2 mm DTT és 0,5 mm PMSF. A sejtek feltárását folyékony nitrogénben történő fagyasztás és jégen történő felolvasztás háromszori ismétlésével és erős rázatással segítettük elő. Az így kapott szuszpenzióból centrifugálással távolítottuk el a mag- és membrántöredékeket (14000 g, 30 perc, 4 ºC) A fehérje-koncentráció meghatározása A centrifugálással elkülönített felülúszó fehérjemérését az extrakciós puffer magas detergenstartalmának figyelembevételével a Bio-Rad cég Lowry módszerén alapuló mérőoldataival végeztük. Kalibrációra extrakciós pufferrel hígított albuminsorozatot használtunk. A western blotra kerülő minták fehérjetartalmát extrakciós pufferrel történő hígítással egységesen 5 mg/ml-re állítottuk be dck- és TK-enzimaktivitás mérése A dezoxicitidin-kináz enzimaktivitásának meghatározását 50 μl végtérfogatú kináz-reakcióelegyben végeztük, amelynek összetétele a következő: 50 mm Tris-HCl ph 7,6, 5 mm ATP, 5 mm MgCl 2, 10 μm 3 H-dC (specifikus aktivitás: cpm/pmol), 2 mm DTT és 10 mm NaF. A reakciót 5 μl sejtkivonat hozzáadásával indítottuk, és 37 ºC-on 30 percig inkubáltuk. Mérési körülményeink között az enzimreakció sebessége lineáris volt mind az inkubációs idő, mind az enzimkoncentráció függvényében. A reakció leállítása 40 μl-nyi reakcióelegy DEAEfilterpapírra történő cseppentésével történt. A papírok mosását, eluálását és a radioaktivitás mérését a alpontban leírtaknak megfelelően végeztük. A dck aktivitását 50 μm 3 H-CdA-szubsztráttal is megmértük a fentiekkel teljesen megegyező körülmények között. 42

43 A timidin-kináz aktivitásának meghatározása mindenben a fent rögzített paraméterek szerint történt azzal a kivétellel, hogy a reakcióelegy 10 μm 3 H-dTradioizotópot tartalmazott a 3 H-dC komponens helyett Dezoxicitidilát-dezamináz-aktivitásmérés A dcmp-dezamináz-enzimet 14 C-dCMP (15 GBq/mmol, 0,1 μci/reakció) szubsztráttal mértük a 10 mm Tris-HCl ph 8,0, 1 mm MgCl 2, 0,5 mm dcmp, 20 μm dctp és 20 μm β-merkaptoetanol összetételű reakcióelegy 50 μl-ében, a reakciót 5 μl nyerskivonat hozzáadásával indítva. A mérést 37 ºC-on történő 30 perces inkubálást követően kétperces forralással állítottuk le, majd dcmp dump-standard hozzáadása után (végkoncentrációk: 5 5 mm) a reakcióelegy 5 μl-ét Kieselgel 60 F 254 vékonyrétegen, n-butanol : ecetsav : H 2 O 2:1:1 térfogatarányú elegyével elválasztottuk. A szubsztrát dcmp-nek és a termék dump-nek megfelelő foltokat UV-lámpa alatt vágtuk ki a szilikagélből, aktivitásukat pedig a fent részletezett folyadék-szcintillációs eljárással határoztuk meg nukleotidáz-aktivitás meghatározása Az 5 -nukleotidázok aktivitását 14 C-dIMP (56 mci/mmol, 0,005 μci/reakció) szubsztrát felhasználásával az alábbi reakciópuffer 20 μl-ében mértük: 50 mm imidazol- HCl ph 7,0, 10 mm MgCl 2, 50 mm NaCl, 5 mm β-glicerofoszfát (nem-specifikus foszfatázgátló, az alkalikus foszfatáz aktivitását is gátolja), 1 mm AMP-CP (ekto-5 - nukleotidáz gátlószere), 1 mm IMP, 0,5 mg/ml BSA és 2 μl sejtkivonat. Egy párhuzamos mérési sorozatban a fentiek mellé még 5 mm ATP-t is adtunk az ATP-vel stimulálható 5 -nukleotidáz-aktivitás meghatározására. A reakció 60 percig 37 ºC-on zajlott, és a minták kétperces forralásával állítottuk le. Kromatográfiás standardként mm-os végkoncentrációban inozin IMP keveréket adtunk a csövekhez, majd 5 μl-nyi reakcióelegyet futtattunk az előző alpontban leírt körülményeknek megfelelően. Az inozinnak és az IMP-nek megfelelő foltok radioaktivitását is a fentieknek megfelelően, folyadék-szcintillációs eljárással mértük meg. 43

44 4.4. Limitált proteolízis Kontroll és CdA-val kezelt sejtekből a alpontnak megfelelően nyerskivonatokat készítettünk. A kivonatok részleges tripszines emésztését szobahőmérsékleten végeztük 0, 1, 3, 9, 15 és 45 percen keresztül az alábbi összetételű reakcióelegy 12 μl-nyi végtérfogataiban: 25 mm Tris-HCl ph 8,0; 100 mm NaCl; 2 mm DTT; 2 μg tripszin és 50 μg sejtfehérje. A reakciókat 2 μl szójabab eredetű tripszin-inhibitorral állítottuk le (4 mg/ml, a fenti Tris-NaCl-DTT pufferben oldva). A mintákat 15%-os SDSpoliakrilamid-gélen választottuk el, majd anti-dck western blotot végeztünk Poliakrilamid-gélelektroforézis és western blot SDS-poliakrilamid-gélelektroforézis Az 5 mg/ml fehérje-koncentrációra beállított sejtkivonatok 5 μl-ét azonos térfogatú 2x Laemmli (SDS-) mintapufferrel (100 mm Tris-HCl ph 8,0, 200 mm DTT, 4% SDS, 20% (v/v) glicerin, 0,2% brómfenolkék) kevertük össze, majd a mintákat 5 percnyi forralás után a 0,1% SDS-t tartalmazó, 12%-os diszkontinuus poliakrilamidgélre vittük. A sejtkivonatok mellett rekombináns dck-ból, illetve humán lép limfómából affinitás-kromatográfiával tisztított natív dck-ból is futtattunk különböző mennyiségeket (5 30 ng, illetve 20 μg). (Az N-terminálisán hexahisztidinnel címkézett rekombináns dck-t S. Eriksson munkacsoportja (Uppsala, Svédország) termelte E. coliban a pqe bakteriális expressziós vektorral [50]. A humán tisztított dck-t szintén S. Eriksson bocsátotta rendelkezésünkre [37]). A futtatás szobahőmérsékleten történt a Bio-Rad Mini Protean II elektroforézis készülékkel, konstans 120 V feszültséggel, 25 mm Tris bázist, 192 mm glicint és 0,1% SDS-t tartalmazó futtatópufferben (ph 8,3). A natív körülmények között kivitelezett fehérje-elválasztás a következőkben különbözött a fentebb leírtaktól: a mintapuffer nem tartalmazott SDS-t és DTT-t; a mintákat nem hődenaturáltuk a futtatás előtt; a gél és a futtatópuffer sem tartalmazott SDS-t; a futtatás 4 ºC-on történt. A gélekből a fehérjéket membránra transzferáltuk, illetve egyes natív géleket Coomassie-val festettünk. Az 50 v/v% metanol és 10 v/v% ecetsav elegyében oldott 44

45 0,2% Coomassie Brilliant Blue R 250 festékben 30 percig szobahőmérsékleten rázattuk a gélt, majd a festék feleslegét 50 v/v% metanol 10 v/v% ecetsav elegyével mostuk ki Denaturáló és natív immunblot Az SDS-poliakrilamid-gélen elválasztott fehérjéket Hybond ECL nitrocellulózmembránra vagy PVDF-membránra blottoltuk Bio-Rad Mini Trans-Blot készülék segítségével. A transzferpuffer összetétele: 25 mm Tris-bázis, 192 mm glicin, 0,1% SDS és 20 v/v% metanol. Az elektroblottot 350 ma konstans áramerősség mellett 60 percen át szobahőmérsékleten végeztük. Ezt követően a membránokat Ponceau S- oldattal megfestettük (0,1% Ponceau S 5%-os ecetsavban), hogy meggyőződjünk az egyes sávokban futtatott fehérjék azonos mennyiségéről és futási mintázatáról. A membránt annak teljes elszíntelenedéséig TBST-oldattal (10 mm Tris-HCl ph 8,0; 150 mm NaCl; 0,1% Tween-20 detergens) mostuk, majd 5% sovány tejport tartalmazó TBST-vel egy éjszakán keresztül blokkoltuk. Ezt követően a membránt 4 x 15 percig TBST-vel mostuk, majd egy órán át szobahőmérsékleten, enyhe rázás mellett 1% sovány tejport tartalmazó TBST-vel 1:5000 arányban hígított elsődleges ellenanyaggal inkubáltuk. A humán dck C-terminális doménje (epitop: 246 YESLVEKVKEFLSTL 260 ) ellen nyúlban termeltetett antitestet [47] Taljanidisz János munkacsoportja (Herakleion, Görögország) készítette és bocsátotta rendelkezésünkre. Az inkubálást 4 x 15 perces mosás követte. Másodlagos antitestként tormaperoxidázzal konjugált anti-nyúl IgG-t alkalmaztunk TBST-vel történt 1:10000-szeres hígításban. A membránokat egy órán keresztül rázattuk a másodlagos antitest oldatában, majd négyszer 15 percig mostuk TBST-vel. Az immunkomplexeket kémiai lumineszcencián alapuló reakcióval tettük láthatóvá és Kodak röntgenfilmre exponáltuk a jel erősségétől függően 0,1 20 percig. A natív gélről félszáraz (semi-dry) módszerrel, 4 ºC-on, 2 mah/cm 2 áramsűrűséggel blottoltuk át a fehérjéket PVDF-membránra. A készülék lemezeire helyezett szűrőpapírokat 25 mm Tris-bázist és 192 mm glicint tartalmazó, 8,3-as ph-jú transzferpufferrel itattuk át. A membránt a későbbiekben a fent leírtakkal megegyező módon inkubáltuk és hívtuk elő. 45

46 A dot-immunblot céljára 75 mm-os, 8,8-as ph-jú Tris-HCl oldatában 5 percig áztatott nitrocellulóz-membránt használtunk. A minták felcseppentése és beszárítása után teljes egészében a fent részletezett lépéseket követtük Nyerskivonatok kezelése λ-protein-foszfatázzal A alpont alapján készített sejtkivonatokból 5 μl-t (25 μg teljes fehérjetartalom) kezeltünk rekombináns λ-protein-foszfatázzal. A 20 μl végtérfogatú reakcióelegy az alábbi komponenseket tartalmazta: 400 U λ-protein-foszfatáz, 50 mm Tris-HCl ph 7,5; 0,1 mm Na 2 EDTA; 5 mm DTT; 0,01% Brij-35 detergens és 2 mm MnCl 2. Az emésztést 30 ºC-on 30 percig végeztük, majd a reakcióelegy 20 μl-éhez 5 μl natív 2x Laemmli-puffert adva a fehérjéket a 4.5. pontban bemutatott módszer alapján natív poliakrilamid-gélelektroforézissel szétválasztottuk és natív anti-dck western blottal azonosítottuk Comet-eljárás A γ-sugárzás okozta DNS-lánctörések és kijavításuk szemikvantitatív kimutatására ill. követésére az egyedi sejtek alkalikus gélelektroforézisének módszerét (Comet assay) alkalmaztuk. A mérésnél Singh és munkatársai módszertani leírására támaszkodtunk [136]. 5 x 10 4 besugarazott sejtet PBS-ben oldott, 0,5%-os, alacsony lágyuláspontú agaróz 85 μl-ében egyenletesen felszuszpendáltunk, majd a sejtszuszpenziót óvatosan, cseppenként adagolva egy tárgylemez felszínén egyenletes rétegben szétterítettük. A tárgylemez felületét előzőleg 1%-os normál lágyuláspontú agarózzal vontuk be. A gélréteg megszilárdulását követően a tárgylemezeket egy órára 4 ºC hőmérsékletű, frissen készített, enyhén lúgos kémhatású lízispufferbe merítettük (10 mm Tris-HCl ph 10,0; 2,5 M NaCl; 100 mm EDTA; 1% Triton X-100; 10 v/v% dimetil-szulfoxid), majd egy óra elteltével az erősen lúgos elektroforézis-pufferrel (1 mm EDTA, 300 mm NaOH) leöblítettük. Ezek után a lemezeket horizontális elektroforézis-kádba fektettük és annyi 4 ºC-os futtatópuffert töltöttünk rájuk, hogy a lemezeket kb. 0,25 cm rétegben ellepje. A DNS denaturálása céljából a futtatópufferbe merített lemezeket egy elsötétített helyiségben 20 percig állni hagytuk, majd a DNS- 46

47 fragmentumokat 20 percen át 1 V/cm térerősség mellett 300 ma áramerősséggel szétválasztottuk. Ezt egy renaturáló lépés követte: a kádból kiemelt lemezeket 5 percig 400 mm-os, ph 7,5-ös Tris-HCl oldatban semlegesítettük, majd az agarózrétegre cseppentett 60 μl etídium-bromiddal (20 μg/ml) megfestettük és fedőlemezzel borítottuk. A preparátumokat Zeiss fluoreszcens mikroszkóppal, 400-szoros nagyítás mellett értékeltük. A gél közepéről 25 sejtet választottunk ki, s az üstökösre emlékeztető futási mintázatokon a fej illetve a csóva területét a Comet Single Cell Gel Electrophoresis Analysis Software Package (Kinetic Imaging Ltd., London, UK) program segítségével határoztuk meg. A DNS-károsodás mértékét a fej/csóva területarányok számtani középértékével jellemeztük dntp-poolok mérése Az intracelluláris dezoxiribonukleozid-trifoszfát-poolokat Sherman és Fyfe [137] szintetikus oligonukleotid-templátokra kidolgozott módszerének általunk módosított változata alapján határoztuk meg. 5 x 10 6 limfocita PBS-sel mosott sejtcsapadékához 200 μl 65%-os metanolt mértünk s nagyon alapos felszuszpendálást követően a sejteket legalább egy éjszakán át 20 ºC-on tartva lizáltuk. A 15 percig g-vel történt centrifugálással elkülönített felülúszót vákuumcentrifugában beszárítottuk és a poolok méréséig 80 ºC-on tároltuk, majd a mérés előtt közvetlenül 200 mm Hepes- NaOH ph 7,4 és 20 mm magnézium-klorid tartalmú puffer 200 μl-ében oldottuk fel. A Klenow-polimeráz templátjául az alábbi oligonukleotid-szekvenciák szolgáltak: a dttp méréséhez 5 -(TTA) 6 GGCGGTGGAGGCGG-3 ; dctp-re 5 - (TTTG) 5 GGCGGTGGAGGCGG-3 ; dgtp-re 5 -(TTTC) 5 GGCGGTGGAGGCGG-3 és a datp meghatározására 5 -(AAAT) 5 GGCGGTGGAGGCGG-3. A felsorolt templátok 3 -végével komplementer közös primer szekvenciája: 5 - CCGCCTCCACCGCC-3. A polimeráz-reakció templát-primereit a közös primernek a négy különböző templáthoz történő hibridizálásával állítottuk elő úgy, hogy a primer és az adott templát ekvimoláris mennyiségeit 500 ml 70 ºC-os vízfürdőbe helyeztük és hagytuk fokozatosan szobahőmérsékletre hűlni. A meghatározás elve azon alapul, hogy a Klenow-fragment a szintetikus oligonukleotid-templát alapján kizárólag az adott templátnak megfelelő dntp-t építi be 47

48 a reakcióelegyhez adott sejtkivonatból. Például a (TTTG) 5 templáthoz az endogén dctp-t építi be a szintetizálódó komplementer láncba, míg a T helyekre a nagy moláris feleslegben kívülről adott radioizotóp jelen esetben 3 H-dATP kerül. Az inkorporált radioaktivitás mennyisége így szigorúan arányos az endogén dntp mennyiségével, amely a polimeráz-reakció limitáló faktora is egyben. Amint az a templátok szekvenciáiból látható, a datp-pool méréséhez 3 H-dTTP-izotópra, a másik három pool meghatározásához pedig 3 H-dATP-re van szükség. A polimeráz-reakcióhoz a Klenow-enzimet 3 U/μl koncentrációra hígítottuk az alábbi pufferrel: 42 mm Tris-HCl ph 7,45; 87 mm (NH 4 ) 2 SO 4 ; 8,5 mm β- merkaptoetanol; 847 μg/ml BSA és 50 v/v% glicerin. A radioizotópokat a megfelelő nem jelölt datp-vel, illetve dttp-vel ötszörösére hígítottuk. A poolokat az alábbi összetételű reakcióelegy 50 μl-ében mértük: 2,5 μm radioizotóp ( 3 H-dATP a dgtp-, dctp- és dttp-méréshez; specifikus aktivitása 5,9 Ci/mmol, illetve 3 H-dTTP a datppool meghatározásához; specifikus aktivitása: 12,2 Ci/mmol), 0,25 μm megfelelő templát-primer (a dgtp-templát kivételével, amelynek koncentrációját a magas háttér miatt 0,10 μm-ra csökkentettük), 0,3 U/μl Klenow-enzim és 25 μl Hepes-Mg-pufferben oldott meghatározandó nukleotid. A reakcióelegyeket 2 órán át 37 ºC-on inkubáltuk, majd a teljes reakciótérfogatot csirke-vörösvérsejt-dns-sel bevont GF/C üvegszálas filterpapírra cseppentettük. Ezt követően a szűrőpapírokat 5%-os triklórecetsavban oldott 0,1 mólos Na 4 P 2 O 7 -ban 10 percig, majd 5%-os triklórecetsavban kétszer 10 percig, végül 96%-os etanolban újabb 2 x 10 percig mostuk 0 ºC-on, majd megszárítottuk (nátrium-pirofoszfát jelenlétében a nem inkorporálódott mononukleotidok nem kötődnek). A filterekre kötődött radioaktivitást a alpontban részletezett módon, toluol/triton alapú szcintillációs méréssel határoztuk meg. Mérési standard gyanánt a hússzorosan kihígított radioizotópból cseppentettük a szűrőpapírra és mosás nélkül határoztuk meg az aktivitását. A sejtekből extrahált dntp-ok mennyiségét az ismert koncentrációjú dntp-ok hígítási sorozatából felvett kalibrációs görbe felhasználásával számítottuk, és a standard cpm/pmol hányados ismeretében pmol/10 6 sejt egységekben fejeztük ki. 48

49 4.9. Apoptózist vizsgáló eljárások Kaszpáz-3-aktivitásmérés A alpontban leírtak szerint aphidicolinnal, ill. CdA-val kezelt sejteket 2 mm EDTA-t, 1 mm DTT-t és 1% Triton-X-100-at tartalmazó PBS-ben vettük fel (200 μl lízis puffer/5 x 10 6 sejt), és fél órát inkubáltuk jégen, közben többször erőteljesen összeráztuk (vortex). A centrifugálással (13500 g, 15 perc, 4 ºC) elkülönített felülúszó 90 μl-éhez 5 μl 1 mg/ml koncentrációjú Ac-DEVD-pNA szubsztrátot adtunk és a fehérjekivonat kaszpáz-3-szerű aktivitását a lehasított para-nitroanilin extinkciójának 405 nm-en való követésével detektáltuk szobahőmérsékleten, a reakció lineáris időtartományában (0 15 perc) Kromatin-fragmentáció kimutatása (DNS-létra) A nukleoszomális DNS-fragmentáció kimutatására a Hirt által kidolgozott módszert követtük, amely a kis molekulasúlyú extrakromoszomális és citoplazmatikus DNS-darabok szelektív kivonásán alapul [138]. 5 x 10 6 sejtet 350 μl lízispufferben vettünk fel (összetétele: 0,6% SDS és 0,1% EDTA ph 8,0), 10 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk, majd 21 μl 5 mólos NaCl-ot adtunk hozzá és kíméletes összerázás után legalább 12 órán át 4 ºC-on állni hagytuk. Az így képződött csapadékot centrifugálással távolítottuk el (13500 g, 20 perc, 4 ºC). A felülúszót 1 mg/ml hőkezelt RNáz A-val 45 ºC-on 90 percig inkubáltuk, majd 200 μg/ml proteináz K-val kiegészítve ugyanazon hőmérsékleten további 120 percig kezeltük. A fenol/kloroform/izoamil-alkohollal (25:24:1) kivont és etanolos kicsapással tisztított DNS-t 60 μl vízben oldottuk, amelyből 20 μl-t 0,25%-nyi brómfenolkékkel színezett 40%-os szacharózoldat 4 μl-ével összekeverve 2%-os agarózgélre vittünk és kis molekulasúlyú DNS-markerrel együtt futtattunk Tris/acetát/EDTA-pufferben. A gélt 500 ng/ml koncentrációjú etídium-bromid-oldattal festettük. 49

50 4.10. RT-PCR Frissen preparált tonzilla-limfocitákból és SK-N-F1 humán neuroblasztómasejtekből a TRIzol módszerrel (Invitrogen) vontuk ki az RNS-t, majd 0,1 μg RNStemplátról MMLV reverz transzkriptázzal (Promega), random hexamer-primerek segítségével, a gyártó útmutatása alapján DNS-t szintetizáltunk. Az EGF-receptor cdns-ének specifikus amplifikálására a következő primerpárt használtuk [139]: 5 - GAGAGGAGAACTGCCAGAA-3 és 5 -GTAGCATTTATGGAGAGTG-3. A PCRreakciót az alábbi összetételű reakcióelegy 25 μl-ében végeztük: 10 mm Tris-HCl ph 9,0; 50 mm KCl; 1,5 mm MgCl 2 ; 0,2 mm dntp; pmol primer; 1,25 U HotStarTaq polimeráz (Qiagen) és 0,1 μg RNS-ből készített DNS-templát. A következő PCR-programot alkalmaztuk: 3 perces denaturálás 94 C-on; 30 thermociklus: 1 perces denaturálás 94 C-on 30 mp-es anneálás 57 C-on 1,5 perces extenzió 72 C-on; végül extenzió 72 C-on, 7 percig [139]. A PCR-termékeket 2%-os agarózgélen megfuttattuk és 500 ng/ml koncentrációjú etídium-bromid-oldattal festettük. 50

51 5. EREDMÉNYEK 5.1. A dezoxicitidin-kináz aktiválódása citotoxikus nukleozidok hatására Munkacsoportunk néhány évvel ezelőtt azt az érdekes megfigyelést tette, hogy humán tonzilla-limfociták primer kultúráinak CdA-val történő néhány órás kezelése a sejtek DNS-szintézisének gátlásával párhuzamosan a dck aktivitásának többszörös növekedéséhez vezet [140]. Az alábbiakban bemutatásra kerülő kísérletekben arra kerestünk választ, hogy ez a jelenség különböző eredetű normál és malignus sejtekben, sejtvonalakban, illetve más nukleozid-analógokkal történő kezelés hatására is bekövetkezik-e. I, II CdA hatása normál limfocita-szubpopulációk dck-aktivitására A humán szájpadmandulából nyerhető limfociták döntő többségükben nyugvó B-sejtek, azonban a germinális centrumokból származó nyiroksejtek mintegy %-a különböző antigén-stimulusok hatására aktivált állapotban van, belép a sejtciklusba és fokozott DNS-szintézis jellemzi [134]. Felmerült a kérdés, hogy a kevert limfocitapopulációban észlelt dck-stimuláció elsősorban a nyugvó, avagy az osztódó sejtekben történik-e. Ennek eldöntése céljából a frissen preparált sejteket albuminsűrűséggrádiensen történő centrifugálással túlnyomórészt G1-, illetve S-fázisú sejteket tartalmazó populációkra választottuk szét, kihasználva a nyugvó kis limfociták és az osztódó limfoblasztok közötti sűrűségkülönbséget. Az így elkülönített sejtek primer szuszpenzióit 1 μm CdA-val kezeltük percen át, majd megmértük a nyerskivonatok dezoxicitidin-kináz- és timidin-kináz-aktivitását optimális körülmények között, telítési szubsztrátkoncentrációnál [56]. Az enzimaktivitásokat a tríciummal jelzett szubsztrátok nukleozid-foszfáttá történő átalakulásának sebességével jellemeztük és pmol termék /10 6 sejt /perc egységekben fejeztük ki. A sejtek életképességét a kétórás CdA-kezelés lényegében nem befolyásolta; tripánkék-festéssel az élő sejtek aránya a kontroll és a kezelt sejtekben egyaránt 90% felett volt. Amint azt az 7/A. és 7/C. ábra mutatja, az S-fázisú kezeletlen sejtek dckaktivitása mintegy háromszorosa, TK-aktivitása pedig csaknem tízszerese volt a G- 51

52 fázisú, nem kezelt sejtekben mérhető enzimaktivitásnak. A G-fázisú sejtek 1 μm CdAval történt kétórás kezelésének hatására 2,5-szeresére fokozódott a nyerskivonat jelzett természetes szubsztráttal ( 3 H-dC) mért dck-aktivitása (7/A. ábra). Az S-fázisú frakció esetében a dck maximális aktiválása már 60 perc elteltével bekövetkezett, de a 60%-os emelkedés jóval alatta maradt a G-fázisú sejtekben észlelt értéknek. Ugyanakkor a folyamat dinamikája is jelentősen eltért a nyugvó sejtekben tapasztaltaktól, hiszen míg ott közel lineárisan emelkedett az enzim aktiválódásának időgörbéje, osztódó sejtekben a hatvanperces maximumot fokozatosan csökkenő értékek követték. dnmp, pmol/10 6 sejt/perc A B C S G S G S G perc 7. ábra. 2-klór-2 -dezoxiadenozin- (CdA) kezelés hatása humán tonzilla-limfociták dck- és TK-aktivitására I A sejteket albumin-grádiensen S-fázisú ( ) és G-fázisú ( ) frakciókra osztottuk, a jelzett ideig 1 μm CdA jelenlétében inkubáltuk, majd mostuk és végül nyerskivonatot készítettünk belőlük. A dck aktivitását 3 H-dC (A) és 3 H-CdA (B) szubsztrátokkal mértük, a timidin-kináz-aktivitást pedig 3 H-dT-nel határoztuk meg (C). Amellett, hogy a dck aktivitását jelentősen fokozza, a 2-klór-2 -dezoxiadenozin egyben az enzim kitűnő szubsztrátja is [102]. A kezeletlen sejtpopulációk nyerskivonatában 3 H-CdA-val mért dck-aktivitás lényegesen meghaladta a 3 H-dCszubsztráttal kapott értékeket (7/B. ábra). Ez összhangban van azzal a megfigyeléssel, hogy a dck a purin-származékokat magasabb V max -értékkel foszforilálja [56]. Viszont a CdA-val történő kezelések során a 3 H-CdA-foszforilációs kapacitás növekedése jóval alatta maradt a 3 H-dC-szubsztráttal mért értéknek: G-fázisú sejtekben csak 60%-os emelkedést mutatott, míg az S-fázisú frakcióban egyáltalán nem fokozódott. 52

53 Fontosnak tartottuk annak tisztázását, hogy a CdA-kezelés során észlelt dckaktivitás-fokozódás specifikus jelenség-e, vagy a többi nukleozid-mentő enzim aktivitásában is történnek bizonyos változások. A CdA-val különböző ideig kezelt sejtek kivonataiban 3 H-dT-szubsztráttal mért timidin-foszforilációs kapacitás egyik sejtpopuláció esetében sem mutatott változásokat (7/C. ábra). Elképzelhető azonban, hogy a timidin foszforilációjáért felelős TK1-és TK2-enzimek aktivitása ellenkező irányban változik, ami a 3 H-dT foszforilációjának mérése során rejtve maradt. Ezt az eshetőséget kizárandó, a TK-aktivitást 1 mm dc jelenlétében is megmértük. Irodalmi adatok szerint a TK2 a dc-t a dt-hez hasonló hatékonysággal foszforilálja [102], nagy feleslegben adott dezoxicitidinnel tehát a TK2 3 H-dT-foszforilációja erősen visszaszorítható [56]. Esetünkben a 3 H-dT-foszforilációs kapacitás dc hozzáadására csupán 4 5%-kal csökkent mind a kontroll, mind pedig a kezelt sejtekben (az eredmények nincsenek ábrán bemutatva). Ez arra utal, hogy a tonzilla-limfociták timidin-foszforilációs kapacitásának döntő hányadát a TK1 adja, illetve a CdA-kezelés során a két timidinkináz aktivitása nem változik. A limfociták dc-foszforilációs kapacitásának emelkedését a dck aktiválódásának tulajdonítottuk. A TK2 imént említett szubsztrát-specificitása ismeretében azonban nem lehet figyelmen kívül hagyni annak lehetőségét, hogy CdA-kezelés hatására a TK2 dcfoszforilációs kapacitása is emelkedik, habár kimutattuk, hogy az enzim dtfoszforilációs képessége nem változott. Ennek tisztázására a sejtkivonatok dcfoszforilációs kapacitását 1 mm dt jelenlétében is megmértük. Ilyen körülmények között a 3 H-dC-szubsztrátot csak a dck foszforilálja, mivel a TK2 elsősorban a nagy feleslegben adott timidint hasznosítja, a dck viszont a dt foszforilációjára nem képes. Az eredmények azt mutatták, hogy dt jelenlétében a 3 H-dC foszforilációja 2 3%-kal csökkent, és ez az érték CdA-kezelés során sem változott, tehát a dc-foszforilációs kapacitás megnövekedését egyértelműen a dck aktivitásának fokozódása magyarázza. A TK2 aktiválódásának lehetőségét a később tárgyalásra kerülő összes kísérletben az itt leírtaknak megfelelően kizártuk, így ez a továbbiakban nem kerül említésre. Mivel a CdA foszforilációjára a dck mellett a mitokondriális dezoxiguanozin-kináz is képes [83], azt is bizonyítanunk kellett, hogy a G-fázisú sejtek mérsékelten emelkedett 3 H-CdA-foszforilációs kapacitásának hátterében nem a dgk aktiválódása áll (7/B. ábra). A kérdés eldöntésére az aktivitásmérést akkora feleslegben adott (1 mm) dezoxi- 53

54 citidin jelenlétében is elvégeztük, ami a limfociták dezoxicitidin-kinázát gyakorlatilag telíti, így a megmaradó 3 H-CdAfoszforiláció a dgk számlájára írható. 40 Amint az a 8. ábrán látható, a dgk a 3 H-CdA-össz-foszforiláció kb. 10%- áért volt felelős, és enzimaktivitása a 30 dck + dgk dck széles koncentráció-tartományban alkalmazott kétórás CdA-kezelés 20 hatására sem változott. Mivel a dezoxicitidint 10 metabolizáló enzimek esetleges kapcsolt szabályzásáról is képet akartunk kapni, nyomon követtük a 0,01 0, dgk μm CdA dck-enzimaktivitás-mérés tárgyát képező reakciótermék, a H-dCMP 8. ábra. dck- és dgk-enzimaktivitások sorsát. Ahogy azt az irodalmi változása CdA-kezelés hatására Tonzilla áttekintésben részletesen tárgyaltuk, a H-dCMP amellett, hogy trifoszfáttá alakul, az 5 -nukleotidázok révén limfocitákat két órán át különböző koncentrációjú CdA-val kezeltünk, majd a sejtkivonat 3 H-CdA-foszforilációs kapacitását dc nélkül ( dck + dgk ), illetve 1 mm dc jelenlétében ( dgk ) is meghatároztuk. A két defoszforilálódhat, illetve a dcmpdezamináz dump-vé dezaminálhatja, érték különbsége a dck aktivitását adja ( dck ). majd a dump-t a timidilát-szintáz metilálja és timin-nukleotidokká alakítja át (9. ábra) [15]. Az utóbbi két eshetőség kísérleti rendszerünkben az össz- 3 H-dCMP-radioaktivitás csökkenéséhez vezet, hiszen a defoszforilált 3 H-dC a DEAE-cellulóz-papírra nem kötődik, a timidilát szintézise során TS pedig az 5-ös helyzetű tríciumatom 3 HdUMP dttp víz formájában távozik. Másrészt CdAMP, pmol/10 6 sejt /perc dcmp-da 3 HdCMP 5 -NT dck 3 HdC dctp RR 9. ábra. A dezoxicitidin-salvage és a dezoxipirimidinek átalakulásának vázlata II A dck aktivitását potenciálisan módosító enzimeket árnyékolt háttér jelöli. 5 -NT, 5 -nukleotidáz; dcmp- DA, dcmp-dezamináz; TS, timidilátszintáz; RR, ribonukleotid-reduktáz. 54

55 annak ismeretében, hogy a kívülről adott 3 H-dC 75%-a timidilát-szintézisre fordítódik [15], az is elképzelhető, hogy a szoros funkcionális kapcsoltságban működő dck dcmp-dezamináz timidilát-szintáz enzimrendszer szabályozása is össze van hangolva oly módon, hogy a dck aktiválódásával együtt a másik két enzim aktivitása is megemelkedik. A felmerült kérdések tisztázása érdekében kontroll és CdA-val kezelt tonzilla-limfociták kivonatában dcmp-dezamináz- és 5 -nukleotidáz-aktivitásokat mértünk 14 C-dCMP és 14 C-dIMP szubsztrátok felhasználásával. A mérési eredményeket a 3. táblázat foglalja össze. Az adatokból kiderül, hogy a felsorolt enzimek aktivitása 1 μm CdA hatására csak kis mértékben változott, míg a dck aktivitásában 2,5-szeres növekedés következett be. (Hasonló eredményeket kaptunk a dck egy másik aktivátorával, a későbbiekben tárgyalásra kerülő aphidicolinnal (APC) is). Ugyanakkor az is nyilvánvaló, hogy a dcmp-dezamináz és az 5 -nukleotidázok aktivitása még a stimulált dck aktivitását is jóval meghaladta, tehát a dc dt átalakulás sebességmeghatározó enzime a dezoxicitidin-kináz, amelynek aktiválódása a két másik enzim alapaktivitása mellett is a timin-nukleotidok intenzívebb képződéséhez vezethet. dck enzimaktivitás (pmol reakciótermék/10 6 sejt /perc) 5 -nukleotidáz 5 -nukleotidáz dcmp- dezamináz (ATP-független) (ATP-vel stimulált) kontroll 8,0 ± 0,1 232 ± 8 30,9 ± 1,2 137 ± 9 CdA 19,7 ± 0,7 282 ± 12 26,8 ± 0,1 127 ± 5 APC 18,0 ± 0,1 241 ± 15 23,9 ± 0,9 119± 9 3. táblázat. CdA- és aphidicolin-kezelés hatása tonzilla-limfociták dck, dcmpdezamináz és 5 -nukleotidáz aktivitásaira II A sejteket 3 μm CdA-val, illetve 2 μg/ml aphidicolinnal (APC) kezeltük 2 órán át. A felsorolt enzimek aktivitását a nyerskivonatból 3 H-dC, 14 C-dCMP és 14 C-IMP szubsztrátokkal mértük. Az ATP-vel stimulált 5 -nukleotidázaktivitást a reakcióelegyhez adott 5 mm ATP jelenlétében határoztuk meg. Az elmondottak összefoglalásaként leszögezhetjük, hogy a limfociták emelkedett dc-foszforilációs kapacitása egyértelműen a dck-aktivitás növekedésének tulajdonítható, tehát a továbbiakban a nyerskivonatok 3 H-dC-foszforilációs kapacitását a dck-aktivitás jellemzőjeként fogom kezelni. 55

56 enzimaktivitás a kontroll %-ában A 7. ábrán bemutatott eredmények azt sugallják, hogy a nyugvó sejtek dezoxicitidin-kináza nagyobb mértékben stimulálható. További összehasonlító vizsgálatokra egészséges csecsemő timuszból (túlnyomórészt T-limfoblasztok) és egészséges felnőtt perifériás vérből (nyugvó sejtek, 70%-a T-limfocita), illetve fiatal egér timuszból és egérlépből (kevert sejtpopuláció) izolált limfo citák primer kultúráit használtuk. A 10. ábra 100 oszlopai a kétórás CdAkezelést követően mért dck-aktivitásokat a to S G th vér th lép megfelelő kontroll akti- humán egér vitás %-ában tüntetik 10. ábra. CdA hatása különböző eredetű limfociták dckaktivitására II A kísérlethez használt fel. A legnagyobb - mononukleáris sejteket egér timuszból ( th ) és egér lépből ( lép ) (világos oszlopok), mértékű, közel 300%-os valamint emberi timuszból ( th ), perifériás vérből ( vér ) és aktivitás-emelkedést perifériás vérlimfociták- sejtekben dúsított frakciókra választottuk szét (sötét oszlopok). A tonzillából ( to ) preparáltuk. Az utóbbi kevert sejtpopulációt albumin grádiensen S-fázisú ( S ) illetve G-fázisú ( G ) ban és tonzilla-limfociták G-fázisú frakciójá- aktivitásokat a megfelelő kétórás kontroll aktivitások felsorolt sejtek primer kultúráit 3 μm CdA jelenlétében 2 órán át 37 ºC-on inkubáltuk. A sejtmentes kivonatokban mért dck ban tapasztaltuk, míg a százalékában ábrázoltuk. timuszsejtek a tonzilla S-fázisú populációjához hasonlóan szerényebb mértékű, mintegy másfélszeres dck-aktivitás-fokozódással reagáltak a CdA-stimulusra. Az egérlép-limfociták válasza szinte teljesen megegyezett a kevert tonzillasejtpopulációban észlelt közepes léptékű aktiválódással. A felsorolt adatok megerősítik azt a feltételezést, hogy a normál limfocitákban kiváltható dck-aktiválódás mértéke és a sejtek osztódási rátája között fordított arányosság állhat fenn. Továbbá az is nyilvánvaló, hogy a dck aktiválódása nem sejt- és fajspecifikus (patkány lép- és timusz-eredetű limfociták CdA-kezelésével az egérből származó sejteken észlelt enzimaktiválódáshoz nagyon hasonló eredményeket kaptunk), hanem sokkal inkább egy sejtciklus-függő jelenség. 56

57 Normál és transzformált sejtpopulációk összehasonlítása a dck aktiválódásának szempontjából I Több munkacsoport is összefüggést talált a transzformált sejtekben mérhető dck-aktivitás és a sejtek kemoterápiás érzékenysége között [31-35; 66-70]. Ennek fényében különös gyakorlati jelentőséget nyerhet a dezoxicitidin-kináz nukleozidanalógokkal kiváltható stimulációja, hiszen ezáltal a kemoterápia hatásfoka jelentősen javítható, a szervezetbe juttatott dózis csökkentésével pedig a nemkívánatos mellékhatások kockázata is mérsékelhető. In vitro végzett kísérleteinkben három különböző leukémiás sejtvonallal, a humán T-limfoblasztoid CCRF-CEM-, a promielocita eredetű HL60- és a krónikus mieloid leukémiából származó K562-sejtvonal exponenciálisan osztódó sejtjeivel, valamint egészséges és krónikus limfoid leukémiában szenvedő donorok perifériás mononukleáris sejtjeivel (PBMC, illetve CLL-PBMC) dolgoztunk. A sejtszuszpenziókat különböző CdA-koncentrációk mellett két órán át inkubáltuk, majd meghatároztuk a nyerskivonatok enzimaktivitását. Mindhárom sejtvonal 10 6 sejtre vonatkoztatott dckalapaktivitása jóval magasabb volt a vérlimfocitákat (különösen a normál sejteket) jellemző értéknél (11. ábra). A normál és a leukémiás vérlimfociták dck-aktivitása dcmp, pmol/ 10 6 sejt /perc (PBMC, CLL-PBMC) A 40 CCRF-CEM CLL-PBMC 20 PBMC (CCRF-CEM) B HL60 K 562 0,01 0, μm CdA 0,01 0, μm CdA 11. ábra. CdA hatása vérlimfociták és különböző leukémiás sejtvonalak dckaktivitására I A sejteket szérummentes RPMI-tápfolyadékban két órán át kezeltük a CdA feltüntetett koncentrációival, majd a sejtkivonatokból 3 H-dC-szubsztráttal dck-aktivitást mértünk. (A): normál (PBMC, ) és leukémiás (CLL-PBMC, ) vérlimfociták (bal ordináta), illetve CCRF-CEM-sejtek ( Δ ) (jobb ordináta) enzimaktivitása; (B): a HL60 ( ) és K562 ( ) mieloid sejtvonalakban mért aktivitások. 57

58 dózisfüggő módon a kezeletlen érték 3 4-szeresére emelkedett. A maximális aktiválás már az analóg 1 μm-os koncentrációjánál bekövetkezett (11/A. ábra). A CCRF-CEMsejtekben viszont más tendencia érvényesült: CdA hatására a sejtek kiugróan magas dck-alapaktivitása fokozatosan csökkent, 10 μm-nál már csak a kiindulási érték 2/3-át mértük. A HL60-sejtek viszont kifejezett enzimaktivitás-emelkedéssel reagáltak, 0,3 μm-nál közel négyszeres fokozódást észleltünk. A K562-sejtek enzimaktivitása csak minimálisan növekedett a kezelés hatására (11/B. ábra). Az eredményekből az valószínűsíthető, hogy a normál sejtek dezoxicitidin-kinázának aktiválódásához vezető mechanizmusok a leukémiás sejtvonalakban többé-kevésbé károsodtak és működésük megváltozott. A dck aktiválhatósága tekintetében a vizsgált sejttípusok reagáló és nem reagáló csoportokba sorolhatók. A CdA-val aktiválható HL60-sejtekkel, valamint CLL-limfocitákkal felvettük a dck-aktiválódás időgörbéjét is (12. ábra). Amíg a limfoid leukémiás sejtek 15 HL 60 dck-aktivitásának maximális stimulálásához 1 3 μmos CdA-kezelés esetén 90 0,3 μm CdA 3 μm CdA 0,03 μm CdA 120 percre volt szükség, 10 addig a HL60-sejtek CLL-PBMC esetében ezt már az alacsony 1 μm CdA dózisú (0,3 μm) CdAkezelés 5 is 30 perc alatt kiváltotta. 3 μm CdA-val végzett, 90 percet meghaladó időtartamú kezelés már az enzimaktivitás enyhe perc csökkenését eredményezte. 12. ábra. A CdA dck-aktiváló hatásának idő- és A CLL-PBMC- és HL60- koncentráció-függése HL60 - sejteken és leukémiás vér limfocitákon sejtek dck-aktivitása tehát CLL-PBMC -sejteket (, 1 μm CdA) és HL60 -sejteket ( Δ, 0,03 μm CdA;, 0,3 μm CdA; CdA-val nagyon jól, 3 μm CdA) a megadott paraméterek szerint kezeltünk stimulálható. és kivonataikból dck-aktivitást mértünk. dcmp, pmol /10 6 sejt /perc 58

59 Egyéb purin-analógok hatása a dck aktivitására I A 13. ábrán bemutatott eredmények arra utalnak, hogy HL60-sejtekben a dck a CdA-n kívül egyéb purin-analógokkal is aktiválható. A fludarabin (FaraA) a CdA-hoz hasonlóan a limfoid leukémiák hatékony gyógyszere [97, 141], a clofarabin (CAFdA) pedig egy új, ígéretes kemoterápiás szer, amelyben mind a CdA-ra, mint a FaraA-ra jellemző funkciós csoportok megtalálhatók [98, 99, 141]. Az enzimaktivitás maximális fokozásához CdA-ból 0,5 μm (11. ábra), CAFdA-ból 0,5 1 μm, FaraA-ból pedig 10 μm koncentrációra volt szükség (13. ábra). Az analógok itt felsorolt mennyiségei arányban állnak a dezoxicitidinkinázhoz való viszonylagos 25 CAFdA affinitásukkal [141], ami arra FaraA 20 utal, hogy enzimaktivitást növelő hatásuk előfeltétele a 15 dck révén történő 5 -foszforilációjuk. Ez a megfigyelés 10 azzal a ténnyel is összhangban van, hogy a dck maximális aktivációja csak bizonyos idő elteltével következik be, ami a különböző sejtek és analógok esetében más és más érték. dcm, pmol/10 6 sejt /perc 0,01 0, μμ 13. ábra. dck-aktivitások arabinozil-nukleozidanalógokkal kezelt HL60 -sejtek extraktumaiban I A sejteket két órán át kezeltük a CAFdA ( ) és az FaraA ( ) feltüntetett koncentrációival. A dck aktivitását 3 H-dC-nel mértük Dezoxipurin- és dezoxipirimidin-, illetve ribopurin-analógok összehasonlító vizsgálata I A következőkben néhány pirimidin-analóg (arac, 5-aza-araC (AaraC) és 5-azadC (AdC)) dck-aktiváló képességét vizsgáltuk tonzilla-limfocitákon (14/A. ábra). A dezoxicitidin-kináz mindhárom vegyületet hatékonyan foszforilálja [66, 102]. Az akut mieloid leukémia jól bevált gyógyszere, az arac, 10 μm-os koncentrációban közel kétszeresére emelte a kináz aktivitását, míg az AaraC megegyező koncentrációja csak másfélszeresére. Az AML alternatív gyógyszereként számontartott 5-aza-dC az enzim- 59

60 dcmp, pmol/10 6 sejt /perc A B K CAFdA 3 μm arac 1 μm arac 10 μm AdC 1μM AdC 10 μm AaraC 1 μm AaraC 10 μm K CdA 3 μm CrA 3 μm CrA CrA 10 μm 100 μm 14. ábra. Különböző nukleozid-analógok humán tonzilla-limfociták dck-aktivitására gyakorolt hatásának összehasonlítása I A frissen izolált sejteket két órán át az oszlopdiagramon feltüntetett szerek megfelelő koncentrációi mellett, illetve azok nélkül ( K ) inkubáltuk. (A): a CAFdA és különböző citidin-analógok, (B): a CdA és a CrA hatékonyságának összehasonlítása. A feltüntetett adatok három független mérés eredményei. aktivitást nem növelte, sőt nagyobb koncentrációban kismértékű gátlást tapasztaltunk. A 14/A. és 14/B. ábrákon a HL60-sejtek hatékony aktivátorának bizonyult CAFdA és CdA hatását is feltüntettem. A dezoxiadenozin-analógok által kiváltott dck-aktiválódás messze meghaladta a pirimidin-származékokkal kapott mértéket. Ez a tény arra utal, hogy a dezoxicitidin-kináz szubsztrátjai közül a dezoxiadenozin-származékok kitüntetett szerepet játszhatnak az enzim aktiválódásának folyamatában. Az előbbiekben említett analógokkal ellentétben a 2-klór-riboadenozint (CrA) nem a dck, hanem az adenozin-kináz foszforilálja [142], és a ribonukleotid-poolba kerül. A 14/B. ábrán megfigyelhető, hogy a 3 μm koncentrációban adott CrA a dck működését nem befolyásolta, ugyanakkor a dezoxiszármazék CdA markáns aktivitásfokozódást eredményezett. Ez a szembetűnő különbség a dezoxinukleozid-származékok enzimaktiválásban betöltött szerepét hangsúlyozza. Ugyanakkor a CrA nagyságrendekkel magasabb koncentrációi kismértékben stimulálni tudták a dck-t, ami 60

61 azzal magyarázható, hogy a CrA-nukleotidok kis hányada CdATP-vé képes alakulni a ribonukleotid-reduktáz- és nukleozid-difoszfát-kináz-enzimek közreműködésével A dfdc (gemcitabin) hatása tonzilla-limfociták nukleotid-anyagcseréjére III A CdA dck-ra gyakorolt aktiváló hatásának pontos mechanizmusát nem ismerjük, azonban feltételezhető, hogy a jelenség kiváltásában szerepet játszik a CdA erőteljes DNS-szintézist gátló [85, 140, 143], ribonukleotid-reduktázt gátló [85] és dcmp-dezaminázt gátló tulajdonsága [143]. A purin- és pirimidin-analógok dckaktiváló hatásában talált különbségekre magyarázatot keresve összehasonlítottuk az enzim két szubsztrátjának, a CdA-nak és a 2, 2 -difluoro-dezoxicitidinnek (dfdc) a DNS-szintézisre, valamint a dck aktivitására gyakorolt hatását (15. ábra). dnmp; pmol /10 6 sejt /perc 1 0,5 A dck TK1 a kontroll inkorporáció%-ában B 3 H-dC 3 H-dT 0,1 0, µm 0,1 0, µm 15. ábra. dfdc-kezelés hatása a dck és a TK1 aktivitására, valamint a 3 H-dT és 3 H-dC DNS-inkorporációjára tonzilla-limfocitákban III (A): Különböző koncentrációjú, kétórás dfdc-kezelések után a limfociták nyerskivonataiban mért dck- és TK1-enzimaktivitások. (B): A sejteket egy órán keresztül 3 H-dC-nel ( Χ ), illetve 3 H-dT-nel ( ) jelöltük a dfdc növekvő koncentrációinak jelenlétében. A sejtek alkoholos feltárása után megmértük a DNS-frakcióba beépült radioizotópok mennyiségét, amelyet a kezeletlen kontroll DNSinkorporációjának százalékában fejeztünk ki. A dezoxicitidin- és timidin-mentő folyamatok, valamint a DNS-szintézis jellemzésére a radioaktív nyomjelzés módszerét alkalmaztuk. Tonzilla-limfocitákat dfdc jelenlétében 3 H-dC-nel és 3 H-dT-nel jelöltünk, majd a sejtek alkoholos feltárását 61

62 követően megmértük a nukleotid-poolok radioaktivitását, illetve a nukleinsav-frakció jelöltségét. Ezzel párhuzamosan meghatároztuk a gemcitabin dck-t aktiváló hatásának koncentrációfüggését. A 15/A. ábráról leolvasható, hogy a dfdc kevésbé mintegy 60%-kal emelte a dck aktivitását, mint korábban bemutatott kísérleteinkben a CdA, azaz az arac-hez és az AaraC-hez hasonlóan viselkedett. Ugyanakkor a maximális stimulálás már 1 μm-nál bekövetkezett, a tízszeres koncentrációnak nem volt további aktiváló hatása. A citoplazmában található másik nukleozid-mentő enzim, a TK1 aktivitása viszont ebben az esetben sem változott. A dfdc a DNS-be történő 3 H-dT-inkorporációt erőteljesen (K i ~ 0,16 μm), a 3 H- dc beépülését kevésbé hatékonyan (K i ~ 0,4 μm) gátolta (15/B. ábra). A dttp-pool jelöltsége ugyanakkor hatszorosára, míg a dctp-pool jelöltsége csupán 1,5 1,7- szeresére emelkedett (ezek az adatok nincsenek ábrával illusztrálva). Ezek az eredmények lényegében megegyeznek a CdA-val végzett hasonló kísérletekből nyert adatokkal [143]. Kísérleteink során tehát nem találtunk olyan számottevő eltérést a dck által foszforilált purin- és pirimidin-analógok celluláris hatásmechanizmusa között, ami a dck aktiválásakor tapasztalt jelentős különbséget megnyugtatóan magyarázhatná A dezoxicitidin-kináz in vivo aktiválása gemcitabinnal A gemcitabin volt az első gyógyszer, amelyet előrehaladott hasnyálmirigyrák kezelésére engedélyeztek, mert a túlélési időt szignifikánsan meghosszabbítja. A budapesti Szent László Kórház Onkológiai Osztályával együttműködve megvizsgáltuk, hogy a lokálisan előrehaladott és távoli metasztázisokat adó pancreastumorban szenvedő és gemcitabinnal kezelt betegek perifériás vérlimfocitáinak (PBMC) dezoxicitidin-kináz-aktivitása fokozódik-e a kemoterápia során. A betegek 15 alkalommal, hetente egyszer, parenterálisan kapták a gemcitabint (1000 mg/m 2 30 perc alatt), amit 4 óra elteltével 600 mg/m 2 dózisú 5-fluorouracil-infúzió egészített ki. A gemcitabin beadását követően 2, illetve 20 óra elteltével vett vérmintákból limfocitákat preparáltunk, majd azok dck- és TK1-aktivitásait mértük. 62

63 Enzimaktivitás a kontroll %-ában A 16. ábrán 11 különböző betegből mért aktivitás-értékek átlagai láthatók. Figyelemreméltó, hogy a dck-aktivitás fokozódása gyakorlatilag megegyezik a tonzilla-limfociták kétórás in vitro gemcitabin-kezelése nyomán tapasztalt kb. 60%-os növekedéssel (15. ábra), tehát az effektus szérumot tartalmazó környezetben is kiváltható. A dck aktivitásának szelektív emelkedése még 20 óra elteltével is megfigyelhető volt, ám csökkent mértékben (16. ábra). Érdekes módon az utolsó kezelési ciklus során (15. hét) hasonló enzimaktiválódást már nem tapasztaltunk, ami rezisztencia kialakulására utalhat. 100 % 0 h 2 h 20 h dck dtk ábra. A dezoxicitidin-kináz aktiválódása gemcitabinnal kezelt betegek vérlimfocitáiban A gemcitabin-infúzió beadását követően 2 és 20 órával levett vérmintákból dck- és TK1-aktivitásokat mértünk. Az ábra 11 különböző betegből meghatározott aktivitások átlagát és az értékek szórását mutatja. Alapaktivitások (100%): dck: 20,54 pmol dcmp/perc/mg fehérje; TK1: 5,20 pmol dtmp/perc/mg fehérje. 63

64 I, II A dck természetes szubsztrátjainak hatása az enzim aktivitására Felmerült a kérdés, hogy a nukleozid-analóg szubsztrátokon túl a dck által foszforilált természetes nukleozidok befolyásolhatják-e az enzim aktivitását. Tonzilla-limfociták dezoxicitidin-kezelése érdekes módon az enzimaktivitás csökkenéséhez vezetett; a dcmp, pmol/10 6 sejt /perc dc 5 0,01 0, μμ ábra. Dezoxicitidin hatása a dck aktivitására I Tonzilla-limfocitákat - a feltüntetett mennyiségű dc-nel kezeltünk, majd megmértük a sejtkivonatok dck-aktivitását. sejtekhez adott 10 μm dc már 50%-kal csökkentette a dck aktivitását (17. ábra). Az irodalomból jól ismert a dezoxiadenozin toxikus hatása. Az adenozindezamináz (ADA) hiánya következtében fellépő súlyos immunhiányért a felhalmozódó dezoxiadenozint és datp-t teszik felelőssé [144]. A CdA a dezoxiadenozin ADArezisztens származéka, amely limfocitákban az ADA-hiányhoz erősen hasonló sejtkárosodást okoz [87]. Kézenfekvő volt megvizsgálni, hogy a limfocitákhoz adott da önmagában aktiválhatja-e a dck-t, vagy ehhez az ADA-t bénító 2 -dezoxicoformycin (dcf) [145] jelenléte is szükséges, azaz a CdA hatása felbontható-e az ADA-gátlás és a dezoxiadenozin-felhalmozódás komponensekre. Tonzilla-limfocitákat μm dezoxiadenozinnal és dcf-nel kezeltünk külön-külön, illetve kombinációban, amikor is a sejteket konstans mennyiségű (10 μm) dcf és növekvő koncentrációjú dezoxiadenozin hatásának tettük ki. Amint a 18/A. ábrán látható, egyik szer sem fokozta az enzimaktivitást, amennyiben önállóan adtuk, a kettős kezelés azonban dózisfüggő enzimaktiválódást eredményezett, amely 10 μm dezoxiadenozin-koncentrációnál érte el maximumát. Fontos megjegyezni, hogy a 10 μm da 10 μm dcf kombináció hatása összemérhető volt a 3 μm CdA-val kiváltható enzimaktiválódással (utóbbi oszlopdiagramként ábrázolva). A maximális dck-aktiválódás tehát látszólag kevesebb CdA-val is elérhető volt, azonban a jelzett koncentrációk (3 és 10 μm) nagyságrendileg megegyeztek, és figyelembe kell venni, hogy sejtbe történő felvételük paraméterei 64

65 különbözhetnek [21], ami a hatásos metabolit sejten belüli koncentrációját nagyban befolyásolhatta. Az eredmények tükrében A dck leszögezhetjük, hogy a CdA 11 da + dcf illetve a da a dezoxicitidinkináz dcf CdA egyformán hatásos akti- vátorai abban az esetben, ha a dezoxiadenozin inaktiválódását 9 7 da az ADA farmakológiai 5 gátlásával megakadályozzuk. 3 A referenciaként használt TK1 aktivitását a felsorolt kezelések 0 B 0,3 TK μm egyike sem befolyásolta (18/B. ábra). 5 4 CdA dcmp, pmol /10 6 sejt /perc dtmp, pmol /10 6 sejt /perc ábra. A dck aktiválódása dezoxiadenozin és dezoxicoformycin kombinált kezelés hatá- 2 sára II Tonzilla - limfociták párhuzamos kultúráit 2 órán át 0 0, μ M 1 dezoxiadenozinnal (da, szaggatott vonal) ill. dezoxicoformycinnel (dcf, pontozott vonal), valamint a két szer kombinációjával (da + dcf, folyamatos vonal, a dcf koncentrációja 10 μm volt) kezeltük, majd meghatároztuk a nyerskivonatok dck- (A) és TK1- (B) aktivitásait. A sötétített oszlopok a 3 μm CdA-val kezelt sejtek enzimaktivitásait tükrözik. A feltüntetett adatok három három párhuzamos meghatározás átlagait jelentik A dck aktivitásának emelése nem-metabolizálódó nukleozid-monofoszfátanalógokkal és a dezoxicitidin felfüggesztő hatása IV Az eddigiekben vizsgált nukleozidok mindegyike a dck szubsztrátja volt. A továbbiakban arra kerestük a választ, hogy az enzim által nem foszforilálható nukleotidanalógok képesek-e stimulálni a dck-t. Ennek eszközéül különböző nukleozid-5 - tioszulfát-analógokat választottunk [133], amelyek szabad 5 -hidroxil foszfátakceptorcsoporttal nem rendelkeznek. Ezek a vegyületek a megfelelő nukleozid-5 - monofoszfátok analógjainak tekinthetők [146, 147]. 65

66 Tonzilla-limfociták primer sejtkultúráit 2 órán át a 19. ábrán feltüntetett hatféle nukleozid-5 -tioszulfátanalóg (dezoxiadenozin-, dezoxicitidin-, ribopurin-, ribouridin-, 3 -azidotimidinés dezoxitimidin-5 -TS) 0,1 dck aktivitás (a kontroll %-ában) da-5 -TS rpu-5 -TS dc-5 -TS Urd-5 -TS azidot- 5 -TS dt-5 -TS és 1 mm-os koncentrációival ábra. Különböző nukleozid-5 -tioszulfátok hatása kezeltük és a nyerskivonatokból a szokásos módon dck- sejtkultúrákat két órán át inkubáltunk a feltüntetett tonzilla - limfociták dck-aktivitására IV Primer analógokkal (világos oszlopok: 100 μm; sötét oszlopok: 1 aktivitást mértünk. A hat mm), majd meghatároztuk a sejtkivonatok dckaktivitásait. A közölt adatok a kontroll aktivitás (5,2 pmol/ analóg közül egyedül a 10 6 sejt/ perc) százalékában értendők. timidinszármazék befolyásolta számottevően a dck aktivitását (40%-os növekedés 0,1 mm-nál és 100% 1 mm koncentrációban). A TK-izoenzimek aktivitásai egyik esetben sem változtak (19. ábra). A dt-5 -TS mm-os koncentrációi nagyságrendekkel meghaladták az előbbiekben tárgyalt nukleozid-analógokból szükséges mennyiségeket, ami ugyancsak arra utal, hogy a dt-5 -TS az eddigiektől eltérő (vagy közvetett) mechanizmussal aktiválja az enzimet. Figyelemreméltó továbbá a hatás specificitása, hiszen a dck által foszforilált da- és dc-szubsztrátok tioszulfát-analógjai egyáltalán nem aktiválták az enzimet (19. ábra). A sejtkivonathoz közvetlenül adott dt-5 -TS-tal az enzim aktiválódását nem lehetett előidézni (az adatok nincsenek ábrán bemutatva), és a TK-aktivitás sem változott. Ezt a kísérletet CdA-val és arac-vel megismételve hasonló eredményt kaptunk, ami arra utal, hogy a sejtek integritása és a membrán épsége a dck aktiválódásának sine qua non előfeltétele. Ha viszont az inkubációs elegybe az analógon kívül még 100 μm dezoxicitidint is juttattunk, akkor az aktiválás teljesen elmaradt. A dezoxicitidin markáns felfüggesztő hatása CdA-val és arac-vel inkubált tonzilla-limfocitákon ugyanígy érvényesült. Ugyancsak tonzillasejteken ellenőriztük, hogy a dt-5 -TS-hoz szerkezetileg leginkább hasonlító természetes nukleozid, a dezoxitimidin képes-e felfüggeszteni a tioszulfátanalóg hatását. A 20. ábra adataiból kiderül, hogy a dezoxitimidinnek nem volt 100 µm 1 mm 66

67 felfüggesztő hatása, míg a dezoxicitidin a dt-5 -TS jelenlétében éppúgy felére redukálta a dezoxicitidin-kináz aktivitását, mint önmagában alkalmazva (20. ábra). dcmp, pmol /10 6 sejt /perc dck TK dt-5 -TS 100 µm dt-5 -TS 1 mm dt 100 µm dc 100 µm ábra. Dezoxicitidin és dezoxitimidin hatása a dt-5 -TS-tal kezelt sejtek dckaktivitására IV Tonzilla-limfociták primer kultúráit a tioszulfát-analóg és a természetes pirimidin-nukleotidok feltüntetett kombinációival 120 percig inkubáltuk, majd meghatároztuk a sejtkivonatok dck- és TK-aktivitásait. Ugyanakkor a dt-5 -TS-kezelés a természetes nukleozidok jelenlététől függetlenül a sejtek TK1-aktivitásának enyhe csökkenését okozta. A dc felfüggesztő hatását elemezve kimutattuk, hogy a dezoxicitidin-kináz dt-5 -TStal kiváltott aktiválódásának kivédésére már 10 μm dezoxicitidin is elegendő volt, míg 1 μm koncentrációban részleges felfüggesztést tapasztaltunk (nincsen ábrán bemutatva). Hogy a dt-5 -TS dck-aktivitást emelő hatásmechanizmusának megértéséhez közelebb jussunk, a nem aktiváló uridin-tioszulfáttal való összehasonlításban megvizsgáltuk a két analóg nukleozid-mentő reakcióutakra gyakorolt hatásait. Limfocita kultúrákat perces tioszulfát-analóg-kezelésnek vetettünk alá, majd 20 perces 3 H-dCvagy 3 H-dT-pulzusjelölést alkalmaztunk (21. és 22. ábra). A felvétel frakció ( A ) a jelzett nukleozid-, nukleotid- és liponukleotid-pool összességét reprezentálja, míg a foszforiláció ( B ) a nukleozid-mono-, di- és trifoszfátok mennyiségét jelzi. Amint a 21. ábráról leolvasható, a dt-5 -TS a 3 H-dC-nel jelölt felvétel poolt és a nukleotidok mennyiségét %-kal növelte, míg a radioizotóp DNS-inkorporációját inkubációs időtől függően 50-70%-kal visszaszorította. A mentő reakcióutak ilyetén 67

68 való eltolódása a CdA- és dfdc-kezelések kapcsán is megfigyelhető volt. A jelzett timidin metabolizmusában viszont merőben más változásokat észleltünk (22. ábra). 2 1,5 A 0,10 0,06 A p m o l 3 H - d C / 10 6 s e j t 1 0,5 1 0,5 2 1,5 1 B C p m o l 3 H d T / 10 6 s e j t 0,02 0,08 0, B C 0, perc perc 21. ábra. dt-5 -TS és Urd-5 -TS hatásai tonzilla-limfociták 3 H-dC-metabolizmusára IV A sejteket 1 mm timidin-tioszulfát ( ) ill. 1 mm uridin-tioszulfát ( Δ ) jelenlétében, vagy azok nélkül ( ) 60, 120 illetve 180 percig inkubáltuk, majd 1,0 μci/ml 3 H-dC-nel ábra. dt-5 -TS és Urd-5 -TS hatásai tonzilla-limfociták 3 H-dT- IV metabolizmusára IV A kísérlet kivitelezése és az ábrázolás módja a ábráéval megegyező, azonban 3 H-dC helyett 1 μci/ml 3 H-dT-izotópot használtunk. A (C) ordináta beosztása eltérő. perces pulzusjelölést végeztünk. A sejtek alkoholos feltárását követően meghatároztuk az etanololdékony (A) és a DEAE-cellulózhoz kötött (B), valamint az etanolban nem oldódó (C) sejtfrakció radioaktivitását. A timidin-5 -tioszulfát valamennyi timidin-pool jelzését drasztikusan csökkentette. Különösen szembeötlő a különbség, ha a 3 H-dC és a 3 H-dT felvételét és foszforilációját hasonlítjuk össze, de a timin-nukleotidok DNS-inkorporációjának gátlása is jóval kifejezettebb volt, mint a citozin-dezoxinukleotidoké (a kontrollhoz képest kevesebb, mint 10% épült csak be a DNS-be). Ezek a változások legkönnyebben azzal az elmélettel magyarázhatók, hogy a dt- 5 -TS a sejtmembrán timidin-transzporterén keresztül történő timidinfelvételt kompetitíven gátolja, emiatt leesik a pool jelöltsége és a prekurzorok elégtelen 68

69 mennyisége miatt a DNS-szintézis üteme is csökken. A timin-nukleotidok hiánya előmozdítja a dcmp-dezamináz timidilát-szintáz útvonalon keresztül történő timidilátszintézist [134], amelynek dcmp-igényét végső soron az emelkedett dckaktivitás biztosítja. Golos és munkatársai kimutatták, hogy a timidilát-szintáz működését a dt-5 -TS nem gátolja [147], a pirimidin-nukleotidok átalakulása tehát elméletileg az analóg jelenlétében is zavartalanul folyhat. A timidintranszport kompetitív gátlása ellen szól viszont az a tény, hogy feleslegben adott dezoxitimidinnel a dck aktiválódását nem tudtuk kivédeni Célzott DNS-károsítással kiváltott dck-aktiválódás vizsgálata A CdA és dfdc egyik legszembetűnőbb hatása a DNS-szintézis gátlása volt (15. ábra ill. [140]). Ugyanakkor a nukleozid-analógok hatásmechanizmusa összetett és még nem minden részletében tisztázott; a ribonukleotid-reduktáz gátlása révén befolyásolják a dezoxiribonukleotid-poolokat, és a nukleotid-metabolizmus különböző enzimeit is gátolják [79, 143, 148]. A nyugvó sejteket jelentős DNS-hibajavító szintetikus aktivitás jellemzi, amelynek gátlása a genom károsodásához és előbb-utóbb programozott sejthalálhoz vezet, amint azt több nukleozid-analóggal kapcsolatosan kimutatták [88-94]. A továbbiakban azt kívántuk alátámasztani, hogy a DNS károsodásának oki szerepe van a dck-aktivitás megemelkedésében, ezért más, nem nukleozid-típusú ágensekkel etopoziddal, aphidicolinnal és a sejtek γ-besugárzásával próbáltuk előidézni a már jól ismert effektust. Ezekkel a kezelésekkel célzottabban lehetett a DNS-károsodást kiváltani, mint a komplexebb hatásmechanizmussal rendelkező nukleozid-analógokkal Etopozid és aphidicolin hatása a dezoxicitidin-kináz aktivitására I Az etopozid (VP16) egy daganatellenes gyógyszer, amely a topoizomeráz-ii DNS-sel képzett komplexéhez kötődve kétszálú és egyszálú DNS-lánctöréseket okoz, valamint reverzibilisen gátolja a DNS-ligáz aktivitását [149]. Az aphidicolin (APC) egy gomba eredetű toxin, a DNS-hibajavításban fontos szerepet betöltő DNS-polimeráz δ és ε inhibitora [150]. Az etopozidnak és az aphidicolinnak a dezoxicitidin-kináz aktivitására gyakorolt hatását a 23. ábra szemlélteti. Kétórás kezelést követően mindkét 69

70 szer a CdA-hoz hasonló mértékben, kb. 2,5-szeresére növelte az enzim aktivitását mind normál, mind pedig akut mieloid leukémiás vérlimfocitákban. A timidinkináz-izoenzimek aktivitását a CdA-hoz hasonlóan az etopozid és aphidicolin sem befolyásolta (az eredmények nincsenek ábrán bemutatva). dcmp, pmol/10 6 sejt /perc A normál AML K CdA VP16 APC K CdA VP16 B APC ábra. CdA, etopozid és aphidicolin hatása a dezoxicitidin-kináz aktivitására I Egészséges donor (A), illetve akut mieloid leukémiában szenvedő beteg perifériás vér-limfocitáit (B) két órán át 1 μm CdA-val ( CdA ), 100 μm etopoziddal ( VP-16 ), illetve 2 μg/ml aphidicolinnal ( APC ), valamint ezek nélkül ( K ) inkubáltuk, majd megmértük a sejtkivonatok dck-aktivitását γ-besugárzás okozta változások a nukleotid-anyagcserében V A γ-sugárzás részben közvetlenül, részben oxigéntartalmú reaktív szabadgyökök keltése révén DNS-kettőslánctöréseket okoz, amelyek rövid időn belül kijavítódnak [151]. Eközben valószínűleg változások következnek be a dezoxiribonukleozid-mentő reakcióutakban is, amit tonzilla limfociták 0 2 Gy dózisú besugárzását követően 3 H- dc- és 3 H-dT-pulzusjelöléssel vizsgáltunk. A 24/A. ábra a jelölt nukleotidok DNS-be történő beépülését a besugárzási dózis függvényében ábrázolja. A dezoxicitidin inkorporációja 1 Gy dózisnál tetőzött, míg a timidiné a vizsgált tartományban folyamatosan emelkedett. A sejtek DNS-szintézisének fokozódása a hibajavító reakciók aktiválódására utal. Ezzel párhuzamosan emelkedett a 24/B. ábrán feltüntetett felvétel, amely a sejtbe jutott és intracellulárisan foszforilált nukleozidok összmennyiségére utal, így megbízható jelzője a sejtek dck- és TK-aktivitásának. Meg kell jegyezni azonban, hogy a dck által in vivo foszforilált 3 H-dC kb. 75%-a timin-nukleotidokká alakul át [15], ami a radioaktív jelzés elvesztésével jár, tehát a sejtek dck-aktivitása sokkal magasabb, mint a különböző frakciókban mérhető dezoxicitidin-jelzés összege. Az össz-felvétel és a DNS-inkorporáció görbéinek összevetéséből kiderül, hogy a mentett 3 H-dT-nukleoti- 70

71 dok túlnyomó többsége (mintegy 95%-a) a DNS-be került, míg a jelzett dc-nél ez az arány kb. 30%. A timin- és citozin-dezoxinukleotid-poolok nagysága az elnyelt dózissal nem volt összefüggésben, viszont a citozin-dezoxinukleotid-pool jelzettsége a timidinét jóval meghaladta (24/B. ábra). A dezoxicitidin-liponukleotidok jelzettsége ugyanakkor a dnmp, pmol /10 6 sejt /30 perc 1,5 1,0 0,5 A 3 H-dT 3 H-dC dnmp, pmol /10 6 sejt /30 perc 1,5 1,0 0,5 B 3 H-dT 3 H-dC felvétel 3 H-dC nukl. 3 H-dC LN 3 H-dT nukl. 0,5 1 1,5 2 Gy 0 0,5 1 1,5 2 Gy 24. ábra. A dezoxiribonukleozid-mentő reakcióutak változásai γ-besugárzás hatására V Humán tonzilla-limfociták párhuzamos kultúráit különböző dózisokkal (0 2 Gy) besugaraztuk, majd 1 μci/ml 3 H-dC-nel vagy 3 H-dT-nel 30 percig jelöltük, és megmértük az etanollal feltárt sejtek különböző frakcióiba beépült radioaktivitást. (A): az alkoholban oldhatatlan nukleinsav-frakció jelöltsége; (B): a nukleotidok ( nukl. ) és a liponukleotidok ( LN ) jelölődése, valamint a sejtbe felvett összes radioaktivitás ( felvétel ) az elnyelt dózis függvényében. Az adatok a 10 6 sejt jelzett frakcióiba 30 perc alatt beépült [ 3 H]-nukleozidok mennyiségét jelzik. dózis függvényében 1 Gy-ig mérsékelt emelkedést mutatott, és a görbe lefutása erősen emlékeztetett a 3 H-dC DNS-inkorporációjára. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy besugárzás hatására mind a dezoxicitidin-, mind a dezoxitimidin-mentő útvonalak aktiválódnak, ami a dezoxitimidin esetében szinte kizárólag, a dezoxicitidin kapcsán pedig jelentős részben a hibajavító DNS-szintézis nukleotid-igényét elégíti ki. A liponukleotidok fokozott jelzettsége valószínűleg az oxidatív membránkárosodás javításához szükséges membránlipid-prekurzorok fokozott szintézisére utal. A besugárzott és a kontroll sejtek nyerskivonataiban mért enzimaktivitásokat a 25. ábra illusztrálja. γ-besugárzás hatására a dck aktivitása dózisfüggő módon emelkedett. 2 Gy elnyelt dózis mellett, 50 perces utóinkubálást követően közel négyszeres aktivitás-fokozódást tapasztaltunk (25/A. ábra). Ugyanakkor a sejtek besugárzása nyomán nem azonnal emelkedett meg az enzim aktivitása, hanem egy perces utóinkubálás volt szükséges a maximális aktiválódás eléréséhez (25/B. ábra). 71

72 A kontroll sejtekben csak minimálisan változott a dck aktivitása (25/B. ábra, dck kontroll ). A jelzett timidin felvételének és foszforilációjának kifejezett növekedése ellenére sem találtunk különbséget a kontroll és a besugárzott sejtek TK1-aktivitása között (25/B. ábra). A TK2 enzimaktivitása sem fokozódott a besugárzás hatására. dnmp, pmol /10 6 sejt /perc A dck B dck γ dck kontroll TK1 γ 0 0,5 1 1,5 2 Gy perc TK1 kontroll 25. ábra. γ-sugárzás hatása tonzilla-limfociták dck- és TK1-aktivitására V A különböző dózisokkal besugarazott, illetve kontroll sejteket különböző ideig 37 ºC-on tartottuk, majd nyerskivonataikból dck- és TK1-aktivitásokat mértünk. (A): dck-aktivitás növekvő dózisú besugárzást és 50 perces utóinkubálást követően. (B): az utóinkubációs idő függvényében mért dezoxinukleozid-kináz-aktivitások a kontroll ( dck kontroll és TK1 kontroll ), valamint az 1 Gy dózissal besugarazott sejtek ( dck γ és TK1 γ ) nyerskivonataiban. A DNS-lánctörések és kijavításuk dinamikájának követésére az ún. Comet- (üstökös) teszt nyújt lehetőséget. A besugárzott limfocitákat teljes-sejtelektroforézisnek vetettük alá, így a gyorsabban vándorló töredezett DNS elválasztható és elnyújtott csóva alakjában láthatóvá válik. A csóva területe a DNS-károsodás mértékével arányos [136]; a 26. ábra bal oldalán egy ép, a jobb oldalon egy erősen károsodott sejt ábra. Normál és besugarazott mikrofotója látható. A 4. táblázat a különböző limfocita mikrofotója (Comet időtartamokig utóinkubált kontroll és besugárzott eljárás) sejtek átlagos csóva/fej hányadosait tünteti fel. Ez az érték a kontroll sejtek esetében nem haladta meg a 4-et, míg 2 Gy besugárzást követően 26 fölé emelkedett, jelezvén, hogy az alkalmazott dózis a DNS jelentős fragmentációjához vezetett. A kettőslánc-törések ugyanakkor teljes mértékben kijavítódtak a 60 perces utóinkubálás során (a csóva/fej hányados a 26,26 értékről fokozatosan 3,75-re csökkent). A törések 72

73 kezelés idő 0 perc 15 perc 30 perc 60 perc kontroll 3,98 nincs adat nincs adat 3,83 γ-besugárzás 26,26 21,59 11,87 3,75 4. táblázat. A DNS lánctörések javításának dinamikája γ-besugárzás nyomán V A kontroll és az 1 Gy dózissal besugarazott tonzilla-limfocita-populációkat a jelzett időtartamú utóinkubálásokat követően a Comet-eljárással vizsgáltuk. A közölt értékek 25 sejt átlagos csóva/fej területarányát mutatják. javításának üteme a 15. perc után gyorsult fel, majd közel állandó sebességgel haladt. Ez a kinetika feltűnően hasonlít a dck aktivációs görbéjére (25/B. ábra). A DNShibajavítás és a dck-aktiválódás szoros időbeli kapcsoltsága arra utal, hogy ok-okozati kapcsolat állhat fenn a két jelenség között, vagyis a dck-aktiválódás szignálja a károsodott DNS-ből eredeztethető A dck aktiválódása a DNS-károsodás korai következménye II A poli(adp-ribóz)-polimeráz (PARP) egy nagy mennyiségben előforduló sejtmagfehérje, amely a DNS-károsodás érzékeny szenzora [152], és számos hibajavító fehérjét ADP-ribozilál. A PARP aktiválódása fontos szerepet tölt be a nukleozidanalógok hatásmechanizmusának késői fázisában, a nekrotikus sejthalál kiváltásában [87, 153]. Mindezek figyelembevételével ésszerűnek tűnt megvizsgálni, hogy a PARP aktivációja a dck enzimaktivitásában észlelt emelkedésnek előfeltétele-e. A kérdés eldöntéséhez tonzilla limfocitákat 60 és 120 percen át 5 mm 3-aminobenzamiddal, a PARP szelektív gátlószerével kezeltünk [87, 153]. A 3-aminobenzamid azonban sem a kontroll, sem pedig a CdA-val indukált dck-aktivitást nem befolyásolta számottevően (az adatok nincsenek ábrán bemutatva). Hasonló eredményre vezettek az aphidicolin és 3-aminobenzamid kombinációjával végzett kísérleteink is. Ezek az adatok arra engednek következtetni, hogy a PARP nem eleme a dck aktiválódásához vezető jelpályának. 73

74 5.3. A dck-aktiválódás és az enzimexpresszió összefüggései II, V Munkacsoportunk korábbi eredményei rámutattak, 31 kda hogy a dck aktivitásában a 5b 5c 6 bekövetkezett markáns emelkedést nem kísérte az hatása a dck-fehérje szintjére II 12%-os denaturáló ábra. Dezoxiadenozin- és dezoxicoformycin-kezelés poliakrilamid-gélen 25 μg-nyi mennyiséget futtattunk az enzimfehérje mennyiségének alábbi szerekkel 2 órán át kezelt sejtek nyerskivonataiból: növekedése [140, 154]. 2, nem kezelt kontroll; 3, 100 μm da; 4, 100 μm dcf; 5a, 1 μm da + 10 μm dcf; 5b, 10 μm da + 10 μm dcf; 5c, Ugyanezt tapasztaltuk a 100 μm da + 10 μm dcf; 6, 3 μm CdA. A blot dckspecifikus ellenanyaggal készült. 1-es sáv: 20 ng dezoxiadenozin és a dcf rekombináns dck. kombinációjával vagy CdAval kezelt sejtek kivonataiból készített denaturáló western blotton is (27. ábra). Pozitív kontrollként rekombináns dck-t is futtattunk a gélen [50]. A 28. ábra a 25/A. és 25/B. ábrákon feltüntetett enzimaktivitás-mérésre került minták immunblottját mutatja. Ebben az esetben a rekombináns kontroll lassabban futott a mintákban látható dck-nál, ami az N-terminális hexahisztidin-címkéből és a vektor polilinkerének megfelelő többlet-aminosavakból eredő molekulatömegnövekedés következménye (az előző gélben nincs meg ez a különbség, mert az ott használt rekombináns enzimről trombinnal lehasították a címkét). Az ábra alsó részén az egymásnak megfelelő kontroll és besugárzott mintákat a könnyebb összehasonlítás kedvéért párokba rendezve futtattuk. Habár a sávok intenzitásában kisebb eltérések felfedezhetők, ezek nem voltak reprodukálható változások, hanem valószínűleg a blottoló eljárás közben keletkezett műtermékek. Leszögezhető tehát, hogy az enzim aktivitásában mért közel négyszeres különbség ellenére a dck expressziója γ- besugárzás hatására sem változott. Ebből arra következtettünk, hogy az enzimaktiválódás hátterében nagy valószínűséggel a dck-fehérje poszt-transzlációs (másodlagos) módosítása állhat. 74

75 A 20ng 10ng 5ng kda B K 1 Gy K 1 Gy K 1 Gy K 1 Gy K 1 Gy K 1 Gy 10ng 30 kda 0 perc 10 perc 20 perc 30 perc 60 perc 120 perc 28. ábra. γ-besugárzott tonzilla-limfociták dck-expressziója V Anti-dCK western blot. A: 1: kontroll (0 Gy, utóinkubálás nélkül; 2: kontroll (0 Gy, 50 perces utóinkubálással); 3: 0,25 Gy; 4: 0,5 Gy; 5: 0,75 Gy; 6: 1,0 Gy; 7: 2,0 Gy; (3 7: 50 perces utóinkubálással); 8: 2 órás kezelés 3 μm CdA-val. B: Kontroll, illetve 1 Gy dózissal besugarazott sejtek dck-fehérjemennyisége az utóinkubálási idő függvényében. A ng-ban megadott értékek az adott sávban futtatott rekombináns dck-fehérje mennyiségei A reverzibilis protein-foszforiláció és a dck-aktiválódás kapcsolata Munkacsoportunk több korábbi megfigyelése a dck aktiválása a foszfatázgátló NaF-dal [155], illetve az enzim inaktiválása in vitro λ-protein-foszfatázkezeléssel [154] arra utalt, hogy a dck aktivitásának emelkedése közvetve vagy közvetlenül reverzibilis fehérje-foszforiláció következménye lehet. Ezt a feltevést alábbi kísérleteink is megerősítették A dck aktiválása protein-foszfatáz-inhibitorokkal V Tonzilla-limfocita-sejtkultúrák rövidtávú kezelése a protein-foszfatáz-1 és -2A inhibitor calyculin A-val a dck-aktivitás koncentrációfüggő emelkedését eredményezte; a maximális aktivitás-fokozódást 80 nm-nál észleltük, ami a kontroll érték kétszeresét érte el (29. ábra). A timidin-kináz-izoenzimek aktivitásában ugyanakkor nem történt változás. A kísérletet egy másik ismert protein-foszfatáz-gátlószerrel, az inkább PP2Ara specifikusabb okadainsavval elvégezve sokkal szerényebb mértékű stimulációt tapasztaltunk (a maximális aktiválás 10% volt 15 nm okadainsav-koncentráció mellett). 75

76 Az eredmények azt sejtetik, hogy a dck foszforilált állapotban aktív, foszfát-csoportját pedig a foszfoszerin/foszfotreonin oldalláncokra specifikus protein-foszfatáz-1 távolíthatja el, ami az enzimaktivitás csökkenését eredményezi. A 30. ábra 1 4. oszlopai a kombinációban alkalmazott γ- besugárzás és calyculin A-kezelés dckaktivitásra gyakorolt additív hatását szemléltetik Hiperozmotikus stressz hatása az enzimaktivitásra V dnmp, pmol /10 6 sejt /perc dck TK nm ábra. Calyculin A-kezelés hatása tonzilla - limfociták dck- és TK1- V aktivitására A sejteket a calyculin A feltüntetett koncentrációi mellett 60 percen át inkubáltuk, majd megmértük a nyerskivonatok enzimaktivitásait. A hiperozmotikus környezet hatására jelentős eltolódás következik be a sejt foszforilációs állapotában, példának okáért inaktiválódik a protein-kináz Bα [156] és a riboszómális S6-kináz [157], ellenben a MAPkináz-család tagjai közül a p38- és az Erk1/2- kinázok aktiválódnak [158]. A hiperozmolaritás dck-aktivitásra gyakorolt hatását limfociták 400 mm-os szorbitollal dnmp, pmol /10 6 sejt /perc γ-besugárzás calyculin A 20 nm 100 nm dck TK hiperozmotikus stressz nm 100 nm ábra. γ-besugárzás, calyculin A és hiperozmotikus stressz hatásai a dck és TK aktivitására V A tonzilla limfocitákat 10 percig előinkubáltuk a calyculin A feltüntetett koncentrációinak jelenlétében, illetve anélkül (-), majd bizonyos kultúrákat 1 Gy dózissal besugaraztunk (+) és a sejteket 40 percig 400 mm szorbitol jelenlétében (5 8 oszlopok), illetve anélkül (1 4 oszlopok) utóinkubáltuk. A dck- és TK-enzimaktivitásokat a sejtek nyerskivonataiból határoztuk meg. 76

77 történő kezelésével vizsgáltuk. A 30. ábra 1. és 5. oszlopának összevetéséből látható, hogy a szorbitollal kezelt sejtekben mért enzimaktivitás csak a kontroll érték felét érte el. γ-besugárzás hatására ugyan mind a szorbitollal kezelt (5 vs. 6. oszlop), mind a nem kezelt (1. vs. 2. oszlop) sejtekben 2-3-szoros aktivitás-fokozódást tapasztaltunk, de az aktiválódás abszolút értéke az előbbi esetben jóval kisebb volt. A calyculin A ugyanakkor már alacsony koncentrációban is csaknem teljes egészében kivédte az ozmotikus stressz gátló hatását, sőt magasabb koncentrációban kétszeresére fokozta az enzimaktivitást (7. és 8. oszlop). A kettős kezelések eredményei azt sugallják, hogy a γ- sugárzás és a calyculin A aktiváló, illetve a hiperozmotikus stressz inaktiváló hatása egymástól függetlenül, additív módon befolyásolja a dck aktivitását Tirozin-kináz-inhibitorok dck-t aktiváló hatása II Van den Neste és munkatársai az ultraibolya fény dck-stimuláló hatását részben a növekedési faktor-receptorok aktiválódásának tulajdonítják [159]. Erre alapozva kísérletet tettünk arra, hogy a dck aktivitását a receptor-tirozin-kinázok gátlószereivel befolyásoljuk. Tonzilla-limfocitákat kezeltünk tirfosztin A47-tel, az epidermális növekedési faktor tirozin-kinázának inhibitorával, illetve a nem specifikus tirozin-kinázinhibitor genisteinnel. Várakozásainkkal ellentétben azt tapasztaltuk, hogy a dck aktivitását mindkét vegyület koncentráció-függő módon emelte (31. ábra). A két aktivációs görbe lefutása annak ellenére nagyon hasonló, hogy a genistein nemcsak tirozin-kináz-inhibitor, hanem az etopozidhoz hasonlóan topoizomeráz- II-gátló tulajdonságokkal is rendelkezik [160]. A szelektív EGFR-inhibitor PD a dck aktivitását ugyan a tirfosztin A47-nél kisebb mértékben, de szignifikánsan emelte (32. ábra) dck TK1 Enzimaktivitás a kontroll %-ában μm 31. ábra. Tirozin-kináz-inhibitorok hatása a dck aktivitására II Tonzilla-limfociták primer kultúráit két órán át kezeltük a tirfosztin A47 (üres szimbólumok) és a genistein (kitöltött szimbólumok) feltüntetett koncentrációival, majd megmértük a sejtkivonatok dck- (négyzetek) és TK1- (körök) aktivitásait. 77

78 Ebből arra következtettünk, hogy az EGFR jelpályájának megszakítása a dck aktiválódását eredményezi. A növekedési faktorok receptorai három fő foszforilációs jelpályát aktiválhatnak, így a Ras-aktiválta MAP-kináz-kaszkádot, a foszfatidil-inozitol-3-kináz (PI3K)/ protein-kináz B (Akt) útvonalat, illetve a Rac-függő kinázokat, többek között a p38 MAP-kinázt [161]. A dck aktiválódásához vezető jelpályát a 300 felsorolt szignáltranszdukciós rendszerek egy-egy gátlószerével igyekeztünk azonosítani. Primer limfocita-kultúrákban a MEK-inhibitor PD és a p gátlószere, az SB a PD höz hasonló mértékű dck enzimaktivitás-fokozódást eredményezett 100 (32. ábra), miközben a TK1 aktivitása nem változott (nincsen ábrán bemutatva). Ezzel szemben a PI3K wortmanninnal történő blokkolása a dck aktivitását nem befolyásolta (az adatok nincsenek ábrán bemutatva) ábra. Protein-kináz-gátlószerek hatása a dck aktivitására II Primer tonzilla-limfociták párhuzamos kultúráit két órán át a következő szerekkel kezeltük: 1., kontroll; 2., 2 μm CdA; 3., 2 μg/ml aphidicolin; 4., 100 μm tirfosztin A47; 5., 10 μm PD ; 6., 50 μm PD 98059; 7., 50 μm SB A sejtek nyerskivonatából dck-aktivitást mértünk, az értékeket a kontroll aktivitás (4,9 ± 0,2 pmol dcmp/10 6 sejt/perc) százalékában fejeztük ki. dck aktivitás a kontroll %-ában Irodalmi adatok szerint a p38-kinázt a hiperozmotikus stressz is aktiválja [158, 162]. Mivel a szorbitollal kezelt limfociták dck-aktivitása jelentősen csökkent (30. ábra), lehetségesnek tűnt, hogy ezt a hatást a p38 jelpályája közvetíti. A p38-inhibitor SB nal azonban nem sikerült kivédeni az ozmotikus stressz okozta aktivitáscsökkenést (az adatok nincsenek ábrán bemutatva). 78

79 Fent ismertetett eredményeinket az EGFR tonzilla-limfocitákban való expressziójának bizonyításával is alátámasztottuk. A limfocitákból izolált RNS-ből RT- PCR-analízist végeztünk; a 454 bázispáros reakciótermék megjelenése az EGFreceptorra specifikus [139]. Pozitív kontrollként az EGF-receptort expresszáló SK-N-F1 neuroblasztóma-sejtek RNS-kivonatait [163], negatív kontrollként pedig reverz transzkriptázzal nem kezelt RNSkivonatokat használtunk (33. ábra) ábra. Az EGF-receptor mrnsének kimutatása tonzillalimfocitákból II Frissen izolált limfocitákból, illetve konfluens SK-N- F1-sejtekből RNS-t preparáltunk, majd a humán EGF-receptorra specifikus primerpár segítségével RT-PCR analízist végeztünk [140]. 139 Az amplifikált termékeket 2%-os agaróz gélen megfuttattuk és etídium-bromiddal festettük. Negatív kontrollként reverz transzkriptáz enzimmel át nem írt RNSmintákat alkalmaztunk. 500 bp 400 bp reverz transzkriptáz + + limfocita SK-N-F1 79

80 5.5. A dck-aktiválódás lehetséges szerepe az apoptózis folyamatában A nukleozid-analógokkal és más DNS-károsító kezelésekkel kiváltott dckaktiválódást a DNS-hibajavítás fokozott nukleotidigénye magyarázhatja, hiszen nyugvó sejtekben a dezoxicitidin-kináz valamennyi természetes dezoxiribonukleotid szintézisében közreműködik [134]. Ugyanakkor az is figyelemreméltó, hogy a felsorolt DNS-károsító anyagok és behatások végső soron beindítják a programozott sejthalál folyamatát, ami terápiás hatásuk alapját is képezi [88-94]. Az apoptózist a DNSkárosodás nyomán aktiválódó p53-függő jelpálya indítja el [164], illetve legalábbis a nukleozid-analógokkal kapcsolatban a mitokondriumokra gyakorolt közvetlen toxikus hatás, amelyet tranziens citoplazmatikus Ca 2+ -hullámok kísérnek [91, 92]. Az apoptoszóma felépülését a mitokondriumból kiáramló citokróm-c indítja el. Ehhez a folyamathoz datp is szükséges, amelynek in situ képződésében egyes elméletek szerint a citoplazmába kiáramló dgk is szerepet játszik [116]. Kimutatták, hogy a datp szubsztituált analógjai, mint pl. a CdATP és FaraATP, kitűnően helyettesíthetik a természetes nukleotidot az apoptoszóma képződése során [165]. Kísérleteinkben arra kerestük a választ, hogy a dck korai aktiválódása része lehet-e, illetve előmozdíthatja-e a limfociták apoptózisát a dezoxiadenozin fokozott foszforilációja révén Apoptózis-markerek vizsgálata Megvizsgáltuk, hogy kimutatható-e a citotoxikus szerekkel kezelt limfociták apoptózisa a sejtek néhány órás kezelése után, azaz a dck-aktiválódás és az apoptózis folyamatának beindulása időben egybeesik-e. CdA-val, illetve aphidicolinnal 2 órán át OD (x 10-2 ) aphidicolin CdA kontroll 5 10 perc ábra. Citotoxikus szerekkel kezelt limfociták kaszpáz-3 -aktivitása A 2 órán át 2 μm CdA-val vagy 2 μg/ml aphidicolinnal kezelt, illetve nem kezelt sejtek nyerskivonataihoz 55,6 μg/ml DEVD-pNA szubsztrátot adtunk, és folyamatosan regisztráltuk az optikai denzitás változását 405 nm-en. 80

81 kezelt tonzilla limfociták nyerskivonataiban DEVD-pNA-szubsztráttal kaszpáz-3-szerű aktivitást mértünk. A kezeletlen sejtekhez képest a CdA-val kezelt mintákban kétszeres, az aphidicolinnal kezeltekben közel háromszoros kaszpázaktivitás-fokozódást regisztráltunk (34. ábra), ami alátámasztja azt, hogy normál limfociták primer kultúráiban a programozott sejthalál mechanizmusai már órákon belül beindulnak. A klasszikus DNS-fragmentációs 2 h 4 h 6 h 16 h teszttel viszont még hosszabb távú (16 órás) kezelés során sem sikerült kimutatnunk az alacsony molekulatömegű DNS-fragmentumok megjelenését (35. ábra). Ez a megfigyelés ugyanakkor összhangban van 1033 bp 500 bp Lassota és munkatársai eredményeivel, akik flow-citometriával sem tudtak DNSfragmentációt 200 bp kimutatni CdA-val kezelt normál limfocitákon [89]. 35. ábra. DNS-fragmentációs teszt genotoxikus szerekkel kezelt limfocitákon Kontroll ( 1 ), illetve 2 μm CdA-val ( 2 ) vagy 2 μg/ml aphidicolinnal ( 3 ) 2, 4, 6 és 16 órán át kezelt tonzilla-limfocitákból Hirt módszere szerint [138] extrakromoszómális DNS-t preparáltunk, amelyet 2%-os agarózgélen futtattunk és etídium-bromiddal festettünk A datp-pool szelektív növekedése a dck aktiválódása nyomán VI Az 5. táblázatban feltüntetett kezeléseknek alávetett limfociták dntp-pooljait a Sherman és Fyfe által kidolgozott szintetikus oligonukleotid-templát módszer módosított változatával határoztuk meg [137]. A dttp-pool az alkalmazott kezelések során egyöntetűen csökkent, míg a dgtp-pool csak az aphidicolin- és a CdA-kezelés nyomán fogyatkozott meg számottevően (5. táblázat). A dctp-pool a dck aktivitását emelő szerek (etopozid, aphidicolin és CdA) hatására lényeges csökkenést mutatott, míg a dck aktivitását gátló kezelések során (hiperozmotikus stressz szorbitollal és nátriumkloriddal) alig változott. A dck aktiválódásával párhuzamosan a három felsorolt dezoxinukleotid mennyiségében bekövetkezett csökkenéssel szemben a datp-pool szignifikáns emelkedést mutatott (50%-os növekedés az etopoziddal, 77%-os az aphidicolinnal és 62%-os a CdA-val kezelt sejtek esetében). Mivel a datp-pool 81

82 szelektív növekedése a sejtek γ-besugárzásával is előidézhető volt (T. Szpaszokukockaja, személyes közlés), a genotoxikus behatások, a dck aktiválódása és a datp koncentrációjának specifikus emelkedése között ok-okozati összefüggés állhat fenn. Az is elképzelhető, hogy az aktivált dck a természetes szubsztrátjai közül a dezoxiadenozint fokozott affinitással foszforilálja. kontroll szorbitol NaCl etopozid APC CdA dck - 8,0 ± 0,1 *** 3,4 ± 0,2 *** 2,1 ± 0,2 *** 20,0 ± 0,1 *** 18 ± 0,1 *** 19,7 ± 0,7 *** aktivitás 100% 42% 26% 250% 225% 246% dntp - poolok dctp 4,6 ± 0,4 5,7 ± 0,5 * 4,3 ± 0,3 2,6 ± 0,4 *** 3,3 ± 0,7 ** 3,0 ± 0,7 ** 100 % 124 % 94 % 57 % 71 % 65 % dttp 3,2 ± 0,1 2,2 ± 0,9 ** 2,7 ± 0,7 1,1 ± 0,1 *** 2,3 ± 0,6 * 2,0 ± 0,3 *** 100 % 68 % 84 % 33 % 73 % 61 % dgtp 3,5 ± 0,8 3,2 ± 0,7 3,0 ± 0,1 3,0 ± 0,1 2,4 ± 0,3 ** 2,5 ± 0,3 ** 100 % 90 % 85 % 86 % 70 % 73 % datp 1,8 ± 0,5 1,9 ± 0,7 1,9 ± 0,8 2,7 ± 0,6 ** 3,2 ± 0,5 ** 2,9 ± 0,6 ** 100 % 106 % 106 % 150 % 177 % 162 % 5. táblázat. Az intracelluláris dntp-poolok változásai a dck aktiválódása és inaktiválódása nyomán VI Tonzilla-limfociták primer kultúráit a feltüntetett szerek jelenlétében két órán keresztül inkubáltuk (szorbitol: 400 mm; NaCl: 200 mm; etopozid: 100 μm; APC (aphidicolin): 2 μg/ml; CdA: 2 μm), majd a sejtkivonatokból dck-aktivitást mértünk, ami a táblázatban pmol dcmp/ 10 6 sejt/ perc egységekben, illetve a kontroll érték százalékában van kifejezve. A dezoxiribonukleotid-poolok mértékegysége pmol/10 6 sejt, illetve a kontroll sejtekben mért érték százaléka. A középértékeket és standard deviációkat három független meghatározás eredményeiből számítottuk. A szignifikancia-szintek jelölése a következő: *: p < 0,10; **: p < 0,05; ***: p < 0, A p53 és a dck-aktiválódás kapcsolata VI A p53-fehérje kulcsfontosságú szerepet játszik a sejtciklus szabályozásában és a genom épségének megőrzésében [164]. A nukleozid-analógokkal, UV- vagy γ- besugárzással előidézett DNS-károsodás hatására a p53 hiperfoszforilálódik és stabilizálódik, hogy a sejtciklus gátlása révén elősegítse a DNS hibáinak kijavítását, illetőleg a Bax-géneket transzaktiválva beindítsa a sejt apoptózis-programját [166]. Kísérleti rendszerünkben a pifithrin-α-t (PFT-α), a p53 közelmúltban azonosított inhibitorát [167] alkalmaztuk annak eldöntésére, hogy a DNS-károsodás nyomán fellépő dck-aktiválódást a p53 közvetíti-e. A 36. ábráról leolvasható, hogy a PFT-α dózisfüggő 82

83 módon gátolta a CdA-val kiváltott dck-aktiválást. A gátlás már a PFT-α alacsony koncentrációi mellett is megfigyelhető volt (5 μm PFT-α a dck aktivitását 198%-ról 157%-ra csökkentette). Ugyanakkor az alapaktivitás átmeneti emelkedését figyelhettük meg az 5 25 μm-os tartományban, amit a PFT-α magasabb koncentrációinál a dckaktivitás kifejezett csökkenése követett (100 μm-nál a kontroll aktivitás csupán 44%-a volt észlelhető). 200 A továbbiakban három Burkitt-limfóma-eredetű sejtvonalon, a vad típusú p53-fehérjét expresszáló DG-75-, illetve a sugárrezisztens és CdA p53-hiányos BL-41- és Ramos- kontroll sejteken vizsgáltuk meg a dck μm aktiválhatóságát. A konfluens ábra. A p53 - inhibitor pifithrin-α hatása a sejtkultúrákból nyert sejteket két dck VI aktivitására Tonzilla limfociták órán át CdA- és etopozid- (VP16) párhuzamos kultúráit a PFT-α növekvő koncentrációival, 2 μm CdA jelenlétében ( CdA ) kezelésnek vetettük alá, majd a vagy anélkül ( kontroll ) 2 órán át inkubáltuk. A feltárást követően mért dck-aktivitások a nyerskivonatokból enzimaktivitást kezeletlen kontroll aktivitás (4,77 ± 0,40 pmol mértünk. Amint a 37. ábrán látható, a dcmp/ 10 6 sejt/ perc) százalékában értendők. DG-75 p53 +/+ sejteken tapasztalt nagymértékű dck-aktiválódással szemben (2,5- szeres CdA-val és háromszoros etopoziddal) a két p53 -/- sejtvonalon csak minimális (50% alatti) enzimaktiválódás lépett fel. Ezek az adatok arra 50 A DG-75 p53 +/+ B BL-41 p53 -/- C Ramos p53 -/- utalnak, hogy a p53 lényeges szerepet tölt be a dck aktiválódásának 25 folyamatában. Ér- dekes módon a sejtek p53-státusza a dck alapaktivitására K CdA VP16 K CdA VP16 K CdAVP16 nincs hatással, hiszen a legmagasabb ábra. A p53-státusz és a dck-aktiváció összefüggései Burkitt-limfóma eredetű sejtvonalakon VI A VI alapaktivitásokat feltüntetett sejtkultúrákat két órán át 2 μm CdA-val, illetve épp a p53-hiányos BL-41- és Ramos-sejtvonalakon mértük 100 μm etopoziddal ( VP16 ) kezeltük, majd a sejtek nyerskivonataiból 3 H-dC szubsztráttal dck-aktivitást mértünk. (37. ábra). dcmp, pmol /10 6 sejt /perc dck aktivitás a kontroll %-ában 83

84 5.6. A dck aktiválódása kalciumfüggő folyamat Irodalmi adatok szerint a sejtekhez adott citotoxikus nukleozid-analógok perceken belül tranziens citoplazmatikus Ca 2+ -szint-emelkedéseket hoznak létre, ami összefüggésben van a mitokondrium-membrán áteresztőképességének fokozódásával [91, 92]. Mivel ezzel párhuzamosan a dezoxicitidin-kináz aktiválódása is megfigyelhető, felmerült a kérdés, vajon e két jelenség kapcsolatba hozható-e, azaz a kalciumszignál szerepet játszik-e az enzim aktiválódásában A szabad citoplazmatikus Ca 2+ - szint csökkentése a dck aktivitását A gátolja VII 200 CdA kontroll Tonzilla-limfociták szabad 100 intracelluláris Ca 2+ -koncentrációját a médiumhoz adott BAPTA-AM-mel, egy sejtpermeábilis szelektív Ca μm kelátorral [92] fokozatosan csökkentettük, majd a nyerskivonatokból a szokásos módon dck- és TK1-aktivitásokat mértünk. A BAPTA-AM acetoximetilcsoportját 50 B nem-specifikus intracelluláris μm észterázok hasítják le. Az így ábra. Az intracelluláris szabad kalciumkoncentráció keletkezett aktív forma nagy csökkentésével a dck affinitással, 1:1 mólarányban köti és inaktiválja a szabad kalciumionokat [92, 168]. aktivitása gátolható VII Humán tonzilla -limfo- citák párhuzamos kultúráit a BAPTA-AM különböző koncentrációival (1 100 μm) két órán át kezeltük 2 μm CdA jelenlétében (folyamatos vonal), illetve anélkül (szaggatott vonal), majd a Ahogy az a 38/A. ábrán látható, sejtkivonatokból dck- ( A ) és TK1- ( B ) aktivitásokat mértünk. Az enzimaktivitások a a BAPTA-AM a kontroll és a CdA-val kezeletlen kontroll aktivitások százalékában stimulált dck-aktivitást egyaránt vannak feltüntetve, amelyek a következők: dck-ra: 7,85 ± 0,08 pmol dcmp/ 10 6 sejt/ perc; koncentrációfüggő módon csökkentette. TK1-re: 3,59 ± 0,04 pmol dtmp/ 10 6 sejt/ perc. A CdA-indukálta enzimaktiválódás már a kalcium-kelátor alacsony koncentrációja a kontroll %-ában a kontroll %-ában 84

85 mellett is számottevően csökkent (1 μm hatására 231%-ról 192%-ra), 50 μm BAPTA- AM pedig teljes mértékben felfüggesztette a CdA stimuláló hatását, ezért további kísérleteink során ebben a koncentrációban alkalmaztuk. Érdekes módon a BAPTA-AM alacsony dózisban a dck alapaktivitását kissé emelte (140% 10 μm-nál), míg magasabb koncentrációban ( μm) markáns gátló hatást fejtett ki. (Ez a tendencia a pifithrin-α hatásában is megfigyelhető volt (36. ábra)). A BAPTA-AM esetleges citotoxikus hatását a tripánkék-festékkizárásos teszttel zártuk ki. A dck-t inaktiváló hatás specificitását a TK1 enzimaktivitásának meghatározásával ellenőriztük; a 38/B. ábra adataiból nyilvánvaló, hogy a TK1 aktivitása a kalcium-kelátor jelenlétében sem mutatott lényeges változást. Következő kísérletünkben az extracelluláris Ca 2+ -koncentráció csökkentésének hatását vizsgáltuk a dck aktivitása szempontjából. Primer tonzilla-limfocitakultúrákhoz az erősen hidrofil és ezért nem sejtpermeábilis EGTA kalcium-kelátort adtuk. Várakozásunknak megfelelően az Eagle s MEM tápfolyadék 1,8 mm-os kalcium-koncentrációjának sem részleges (1 mm EGTA), sem pedig teljes (5 mm EGTA) megkötése sem befolyásolta a dck enzimaktivitását. A dck aktivitása tehát az intracelluláris szabad kalciumkoncentráció függvénye. 300 Eredményeink felvetették azt a kérdést, hogy a 200 BAPTA-AM csupán az enzim aktivációjának folyamatát, tehát 100 CdA CdA + az aktív forma kialakulását + BAPTA-AM akadályozza meg, vagy pedig a perc már aktiválódott enzimet is gátolja. Ennek feltérképezése érdekében időben szétválasztottuk ábra. A BAPTA-AM gátló hatása a CdA-val kiváltott dck-aktiválódásra VII Tonzilla - limfocitákat a feltüntetett időtartamú CdA (2 μm) kezeléseknek vetettünk alá, majd dck-aktivitást a CdA aktiváló és a mértünk (folyamatos vonal). Párhuzamos kultúrákat 120 percen át inkubáltunk 2 μm CdA jelenlétében, BAPTA-AM gátló hatását. majd a feltüntetett időpontokban (a 30., 60. és 90. percben) 50 μm BAPTA-AM-t adtunk, de a dck Tonzilla-limfocitákat 2 μm aktivitását csak a 120 perc leteltével mértük meg CdA-val különböző időtartamokig kezeltünk (0 120 perc); a (szaggatott vonalak). Kontroll dck-aktivitás: 3,74 ± 0,07 pmol dcmp/ 10 6 sejt/ perc. dck aktivitás a kontroll %-ában 85

86 dck aktiválódásának időfüggvényét a 39. ábra folyamatos görbéje ábrázolja. Három másik sejtkultúrát 120 percen át CdA-val inkubáltunk, és az egyes sejtszuszpenziókhoz külön-külön a kezelés 30., 60. illetve 90. percében 50 μm BAPTA-AM-t adtunk. A sejtek dck-aktivitását a kétórás inkubálás leteltével mértük és a nem kezelt kontroll aktivitás százalékában fejeztük ki (39. ábra, szaggatott vonal). Eredményeink szerint a BAPTA-AM a CdA folyamatos jelenléte ellenére szignifikánsan csökkentette a hozzáadása pillanatában mérhető enzimaktivitást (példának okáért 255%-ról 125%-ra, ha a 60. percben adtuk; lásd a megfelelő szaggatott görbét). Ez azt mutatja, hogy a BAPTA-AM hozzáadásával nemcsak azt sikerült megakadályozni, hogy a CdA teljes mértékben aktiválja az enzimet a kétórás inkubálás során, hanem a hozzáadás pillanatáig elért aktiváció mértéke is jelentősen csökkent. Az a megfigyelés, hogy a 90. percben adott BAPTA-AM kevésbé volt hatékony, mivel csak 30 perc maradt hatása kifejtésére, részben annak is tulajdonítható, hogy a BAPTA-AM intracelluláris észterázok által történő hasítása valamennyi időt szintén igényel [92] A kalcium permisszív szerepet játszik a dezoxicitidin-kináz aktiválódásában VII A szabad kalciumszint dck-aktivitásra gyakorolt gátló hatásának jellemzése után azt vizsgáltuk meg, hogy a citoszol kalciumszintjének emelkedése önmagában képes-e aktiválni az enzimet. Az intracelluláris kalciumraktárak kiürítésére a szarkoendoplazmás retikulum Ca 2+ -ATPáz (SERCA) hatékony gátlószerét, a thapsigargint használtuk [169], azonban sem a dck alap-, sem CdA-val stimulált aktivitása sem növekedett a szer hatására (40. ábra). A thapsigargin 2 mm-os koncentrációja mellett megfigyelt aktivitás-csökkenés valószínűleg a thapsigargin transzmembrán kalciumcsatornákra gyakorolt gátló hatásával és a következményes intracelluláris kalciumszintcsökkenéssel magyarázható [170]. A fentiekkel összhangban, a sejtmembrán-na + /K + -ATPáz-inhibitor strofantinnal és a kalcium-ionofór ionomycinnel végzett sejtkezelések sem eredményezték a dck aktivitásának fokozódását. Ezen megfigyelések a kalciumnak a dck aktiválódásában betöltött permisszív szerepére utalnak: a fiziológiás intracelluláris kalcium-koncentráció 86

87 elengedhetetlen a dck megfelelő működéséhez, a- zonban a kalciumszint emelkedése önmagában nem képes az enzim aktivitásának fokozására. enzimaktivitás a kontroll %-ában ábra. Thapsigargin hatása tonzilla - limfociták dckaktivitására Primer sejtkultúrákat a thapsigargin (világos CdA (2 μm) oszlopok), illetve a thapsigargin és CdA (sötét oszlopok) thapsigargin (μm) 0,01 0,02 0,05 0,1 0,5 2 0,05 0,5 2 feltüntetett koncentrációi mellett 2 órán át inkubáltunk, majd a nyerskivonatból dckaktivitást mértünk. A kezeletlen kontroll aktivitás (100%): 3,32 ± 0,07 pmol dcmp/ 10 6 sejt/ perc A kalcium a dck-aktivitásnak nem kofaktora VII Fontosnak tartottuk annak tisztázását, hogy a kalcium a dck kofaktoraként viselkedik-e. Habár sem a sejtek feltárásához használt extrakciós puffer, sem pedig az enzimaktivitás-mérés puffere sem tartalmazott kalciumot, elméletileg fennáll az a lehetőség, hogy a dck a sejten belül kalciumot köt, vagy egy kalciumkötő fehérjével olyan komplexet képez, amely a sejtek feltárása során megőrzi épségét, és az in vitro kinázreakcióban az enzim aktivitását biztosítja. Hogy az esetlegesen az enzimhez kötött kalciumot elvonjuk, a dck reakciópufferébe 50 μm BAPTA-AM-et tettünk annak ismeretében, hogy a BAPTA kalciumkötő affinitása nagyságrendekkel meghaladja az ismert kalciumkötő fehérjékét. A BAPTA-AM jelenlétében azonban változatlan dckés TK1-enzimaktivitásokat mértünk mind a kontroll, mind a CdA-val kezelt sejtkivonatokból, ami azt is bizonyítja, hogy a BAPTA-AM sejtkezeléskor tapasztalt, enzimaktiválódást kivédő hatása nem a dck közvetlen gátlásának az eredménye. Azon eshetőség kizárására, hogy a sejt észterázai esetleg nem működőképesek a kinázreakció körülményei között és a BAPTA-AM prekurzor formában marad, a fenti kísérletet a reakcióelegyhez adott EGTA-val is megismételtük és ugyanazt az eredményt kaptuk (41. ábra). Ezek alapján leszögezhető, hogy a dck katalitikus aktivitásához a kalciumra közvetlenül nincsen szükség, azaz a Ca 2+ a dck-nak nem kofaktora. 87

88 ábra. A dck enzimaktivitásához a kalcium közvetlenül nem szükséges VII 2 μm CdA-val kezelt, illetve nem kezelt tonzilla -limfocitákból nyerskivonatokat készítettünk. Az extraktumok dck- és TK1-aktivitásait a megfelelő kinázreakcióelegybe tett 500 μm EGTA jelenlétében (sötét oszlopok), illetve EGTA nélkül (világos oszlopok) is meghatároztuk. Kontroll aktivitások (100%): : dck-ra: 3,09 ± 0,04 pmol dcmp/ 10 6 sejt/ perc; TK1-re: 0,79 ± 0,05 pmol dtmp/ 10 6 sejt/ perc. aktivitás a kontroll %-ában CdA EGTA dck TK A dck aktiválódását fokozott ellenanyag-kötés kíséri Az enzimaktivitás és a konformációs állapot összefüggései VII Denaturáló western blottal kimutattuk, hogy a dck-fehérje mennyisége a BAPTA-AM-mel kezelt sejtek kivonataiban ugyanannyi, mint a kontroll vagy a CdAval, illetőleg aphidicolinnal stimulált sejtekében (42/A. ábra). Pozitív kontrollként a trombinnal emésztett rekombináns dck feltüntetett mennyiségeit használtuk. A dckaktivitásokban mért jelentős eltéréseket (42/D. ábra) tehát ebben az esetben sem magyarázhatta az enzim megváltozott expressziója (vö. a 27. és 28. ábrákkal). Meglepő módon egy teljesen más profilt kaptunk akkor, amikor ugyanazokat a sejtkivonatokat natív körülmények között futtattuk és blottoltuk. A sávok egyöntetű intenzitása helyett egyenes arányosság fedezhető fel az adott sejtkivonat enzimaktivitása és a natív western blotton az anti-dck-antitesttel azonosított sávok intenzitása között (42/B. ábra). A BAPTA-AM-mel kezelt sejtek kivonatából nagyon gyenge antitestkötődési jelet észleltünk, míg a CdA-val és az aphidicolinnal kezelt sejtek extraktumai adták a legerősebb szignált. Az SDS-blot viszont minden mintában ugyanannyi dckfehérjét mutatott ki. Ez az ellentmondás annak ismeretében oldható fel, hogy natív körülmények között az immunreaktív jel intenzitása nemcsak a fehérje mennyiségét, hanem az antitestnek az epitophoz való hozzáférését is tükrözi. Mivel a fehérjemennyiség minden mintában ugyanannyi volt, a natív blotton észlelt különbségek a dck megváltozott konformációjának és a C-terminális epitop amellyel szemben az 88

89 antitest készült módosult hozzáférhetőségének a következményei lehettek. Megjegyzendő, hogy a denaturáló blot ábrán bemutatott felvételének expozíciós ideje (15 mp) jóval rövidebb volt a natív felvételénél (5 perc), ami kísérletes bizonyítékát adja annak, hogy a dck tökéletesen denaturált konformációjában az epitop az antitest számára sokkal inkább hozzáférhető, mint natív állapotban. denaturáló western blot 42. ábra. Összefüggések a dck aktivitása és natív 30 kda immunreaktivitása között VII A Humán tonzilla-limfocitákat két órán keresztül natív blot inkubáltunk az alábbiak szerint (a felsorolt számok az A, B és D ábrarészek jelölésének felelnek meg): 4: kezeletlen kétórás kontroll; 5: 2 μm CdA; 6: 2 μg/ml aphidicolin; 7: 2 μm B C 300 CdA + 50 μm BAPTA- AM; 8: 2 μg/ml aphidicolin μm BAPTA-AM; 9: 50 μm BAPTA-AM. 100 Az inkubálást D követően sejtkivonatokat készítettünk, amelyek fehérjekoncentrációját 5 μg/μl-re állítottuk be, majd minden kivonatból μg fehérjét futtattunk és blottoltunk mind denaturáló ( denaturáló western blot ; 15 exponálás), mind pedig natív körülmények között ( natív blot ; 5 perces exponálás). Az 1 3. sávokban 30, 20, illetve 10 ng rekombináns dck-t futtattunk. C részábra: 20 μg humán tisztított dck-t 12%-os natív poliakrilamid-gélen futtattunk és Coomassie Brilliant Blue-val festettük. D részábra: a 4 9. pontok szerint kezelt sejtek nyerskivonatából mért dck-aktivitások a kezeletlen kontroll (4) értékének (3,32 ± 0,07 pmol dcmp/ 10 6 sejt/ perc) %-ában kifejezve. dck aktivitás (%) natív Coomassie festés Natív körülmények között a dck-specifikus antitest nem ismerte fel a rekombináns dck-t (42/B. ábra, 1 3. sávok), tehát a pozitív kontroll hiányában nem lehettünk egészen biztosak abban, hogy a sejtkivonatból azonosított fehérje valóban a dezoxicitidin-kináz. A szignál specificitásának bizonyítására a humán léptumorból tisztított dck [37] 20 μg-nyi mennyiségét futtattuk 12%-os natív gélen és Coomassie Brilliant Blue-val festettük meg (42/C. ábra). Két sáv festődött a fehérje dimer és monomer alakjának megfelelően. Mivel a B és C gélek összetétele és futtatási paraméterei tökéletesen megegyeztek, valamint a western blottal és a fehérjefestéssel megjelenített sávok elektroforetikus mintázata is teljes mértékben azonos volt, megállapítható, hogy a natív western blottal azonosított fehérje minden valószínűség 89

90 szerint a dck. A 42/B. ábráról az is leolvasható, hogy az alkalmazott kezelésektől függetlenül a dck domináns formája a dimer volt (felső sáv), és nem figyelhető meg jelentős átrendeződés a monomer/dimer formák arányában. Annak is megpróbáltunk utánajárni, hogy natív körülmények között miért nem láttunk kölcsönhatást a rekombináns dck és az antitest között. A rekombináns és a tisztított humán dck epitopjának hozzáférhetőségét dot-blot immunfestés segítségével hasonlítottuk össze natív, redukáló és denaturáló körülmények között. Mindkét fehérjepreparátum azonos mennyiségű dck-fehérjét tartalmazó egy-egy mintáját 8,8-as ph-jú Tris-HCl pufferben tartottuk (43. ábra: natív ), 100 mm-os DTT-vel kezeltük ( +DTT ), illetve kombinált hő- és kémiai denaturációnak vetettük alá ( +SDS ). Amint a 43. ábra mutatja, az antitest a natív és a DTT-vel kezelt humán enzimet egyenlő mértékben ismerte fel, míg a natív + DTT + SDS maximálisan denaturált fehérje rekombináns jóval erősebb jelet adott. Ezzel dck szemben a rekombináns fehérje egyáltalán nem hozott létre humán tisztított dck immunkomplexet az antitesttel, ám denaturált állapotában ábra. Különböző dck-fehérjepreparátumok ( + SDS ) a denaturált humán immunfestése VII ng rekombináns dck-t, illetve tisztított humán dck-t tartalmazó egy egy dck-val megegyező mértékben fehérjemintát 10 percig szobahőmérsékleten kötötte az antitestet. Itt inkubáltunk 75 mm-os, 8,8 ph-jú Tris-HCl pufferben ( natív ), 100 mm-os DTT-ben ( +DTT ), illetve 60 jegyezném meg, hogy a mm ph 6,8 Tris-HCl, 100 mm DTT és 2% SDS kísérlethez használt rekombináns tartalmú oldatban ( +SDS ). Ezt követően az SDS-t tartalmazó mintákat 2 percig forraltuk, majd a többi dck-preparátum specifikus mintával együtt az ábráról leolvasható elrendezésben nitrocellulóz membránra cseppentettük és beszárítást aktivitása a humán tisztított követően a dck-specifikus antitesttel western blottot enzim aktivitásának csupán 1/5 végeztünk (előhívás: 10 perc). része volt. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a dezoxicitidin-kináz legalább két különböző konformációs állapotban létezhet, amelyekhez eltérő katalitikus aktivitás rendelhető, továbbá az enzim aktivitása és az epitop hozzáférhetősége között összefüggés van. A rekombináns enzim natív körülmények között olyan kompakt 90

91 konformációt vesz fel, amelynek aktivitása minimális, és epitopja csak denaturált állapotban hozzáférhető az antitest számára A konformációs változás követése limitált proteolízissel II A fehérjék térszerkezetében bekövetkező változások gyakran járnak együtt a proteázokkal szemben mutatott rezisztenciájuk megváltozásával. A natív immunfestés során észlelt konformáció-változás tényét kontroll és CdA-val kezelt sejtek nyerskivonatainak részleges tripszinizálásával és a keletkező dck-fragmentek western blottal való azonosításával is alátámasztottuk (44. ábra). Habár a két emésztési mintázat nagyon hasonló, a CdA-val aktivált dck fragmentálódása időben elhúzódó. A kezeletlen sejtekből izolált enzim emésztése már egy percen belül megindult, amint azt a két alacsonyabb molekulatömegű peptid megjelenése mutatja, melyek közül a felső fragment kilencperces emésztés nyomán teljesen eltűnt. Ezzel szemben az aktivált dck emésztése során ugyanezek a történések jóval később, a 3. és a 45. percben következtek be. Az itt megfigyelt emésztési mintázat valószínűleg a dck amino-terminálisához legközelebb található bázikus szigeteknél ( 6 KR 7 és 17 RGTRIKK 23 ) történő hasítás eredménye. Az aktivált enzim fokozottabb tripszin-rezisztenciája is arra utal, hogy a dck aktiválódását stabil konformáció-változás kíséri. 31 kda CdA kontroll 44. ábra. A dck térszerkezetének vizsgálata limitált proteáz-emésztéssel II 2 μm CdA-val kezelt, illetve kontroll limfociták nyerskivonatait 2 μg tripszinnel emésztettük a feltüntetett ideig. A reakciókat 8 μg tripszin-inhibitorral állítottuk le, majd a mintákból dckellenanyaggal western blottot készítettünk. 91