Zárójelentés. című kutatási pályázatról. Témavezető: Görgényi Miklósné Dr. Tari Irma. Bevezetés

Átírás

1 Zárójelentés Prdicsom (Lycopersicon esculentum Mill. L.) kklimtizácój ozmotikus és sóstressz htásár: kpcsoltok hormonhtások és jelátviteli utk között (OTA nysz.: T38392) című kuttási pályáztról Témvezető: Görgényi Miklósné Dr. Tri Irm Bevezetés A szlicilsv (SA) elsősorn iotikus stresszorok htásár mgsrendű növényeken kilkuló ún. hiperszenzitív rekción szereplő jelátviteli komponensként volt ismeretes (Rskin, 1992.). A termesztett növények rhizoszféráján tlálhtó mikroorgnizmusok is képesek z SA szintézisére, és megtlálhtó növények gyökérzetének exudátumán is (Chou és Ptrick, 1976.). Mivel szlicilsv és más enzoesv szármzékok erőteljesen efolyásolják növények növekedését, lleloptikus nygnk tekintendők. A növekedésgátló htást részen nnk tuljdonították, hogy z SA ht növények vízháztrtásár. Szlicilsvvl kezelt szój növények kontrollnál lcsony vízpotenciált és kise sztómkonduktnciát mutttk (Brkosky és Einhellig, 1993.). Az SA növekedésgátlást és sztómzáródást okozott lón is (Mnthe és mtsi, 1992.), gátolt plzmmemránn loklizálódó H + -ATP-áz ktivitását (Bourouloux és mtsi, 1998.) és +, Mg 2+, Cl - vlmint SO 2-4 felvételét (Bzirmkeng és mtsi, 1994.). A vízháztrtás mellett SA ht fotoszintézisre is. Árpán 1 μm-os SA kezelés csökkentette levél növekedését, klorofill és fehérje trtlmkt, fotoszintézis mximális seességét, és riulóz-1,5-iszfoszfát kroxiláz-oxigenáz (Ruisco) ktivitását (Pnchev és mtsi, 1996.). Ezzel ellentéten z SA úzán fokozt fotoszintetikus elektrontrnszportot (Shu és mtsi, 22.), és előkezelésen lklmzv feloldott fotoszintézisgátló hericid, prqut áltl indukált gátlást széndioxid fixációr (Anniev és mtsi, 22.). Fontos szerepe vn szlicilsvnk z oxidtív stresszel kpcsoltos folymtokn. Az egyik első enzim, melyről izonyították z SA gátló htását, H 2 O 2 -t ontó ktláz (CAT) volt (Chen és mtsi, 1993.; Dt és mtsi, 1998.), ár késő kiderült, hogy ez gátlás csk egyes izoenzimek esetéen érvényesül (Horváth és mtsi, 22.). Részen z SA ktlázt gátló htásávl mgyrázták H 2 O 2 -t szintjének megemelkedését és z oxidtív stresszt indukáló htást, mely iotikus stresszfolymtokn hiperszenzitív rekcióhoz vezet. A H 2 O 2 koncentrációjánk megnövekedéséhez Aridopsisn szuperoxid dizmutáz (SOD) ktivitás fokozódás is hozzájárul, míg ugyneen növényen z SA z ugyncsk H 2 O 2 -t ontó szkorát peroxidázt (APX) is gátolt hjtásn (Ro és mtsi, 1997.). Részen szuletális oxidtív stressz generálásávl és ennek következtéen redoxregulált, ntioxidáns enzimek expressziójánk fokozásávl hozzák összefüggése z SA-nk zon htásit, melyeket z iotikus stresszorok htásink mérséklése kpcsán tpsztlhtunk. A tárgykören z elsők között jelent meg z megfigyelés, hogy z előkezelésként lklmzott SA jelentősen jvított kukoric hidegtűrését (Jnd és mtsi, 1999.; Szli és mtsi, 2.) Az SA előkezelés fokozt növények rezisztenciáját z UV-B sugárzássl és z ózonnl (Ylpni és mtsi, 1994.), prquttl (Anniev és mtsi, 24.), 1

2 hőstresszel (Lrkindle és night, 22), vízhiánnyl (Bezrukhov és mtsi, 21.) vlmint nehézfém stresszel (Mishr és Choudhury, 1999.) szemen is. A korái vizsgáltokn z SA htási sóstressz vontkozásán ellentmondásosk voltk (Borsni és mtsi 21.), mivel hormont olyn növekedési fázisn lklmzták, mikor z esetleges ABS szintézist serkentő htás gátolj csírázást. A túl kisméretű növény számár lklmzott túl ngy koncentráció sem vezetett sóstresszel szemeni rezisztenci trtós fokozódásához (Shkirov és mtsi, 23.). A sóstressz áltl kiváltott primér htás N + ionok citoplzmá vló elépése után z ionegyensúly felorulás (Zhu, 21.). A mgsrendű növények citoplzmáj 1-2 mm + -ot és 1-1 mm N + -ot trtlmz, mely 2 mm-os külső N + koncentrációnál 8 mm-ig is emelkedhet. A N + ionok fiziológiásnál ngyo koncentráción mérgezőek sejt számár, megontják fehérjék szorosn kötött hidráturkát, ezáltl zok elvesztik ntív konformációjukt, helyettesítik z enzimek kofktorként szolgáló + ionokt, és legtöször enzimktivitás gátlást idéznek elő. A C 2+ -r vontkozó ionegyensúly felorulás pedig + /N + felvétel szelektivitását csökkenti záltl, hogy megszünteti C 2+ gátló htását N + citoplzmá történő elépését is közvetítő kis ffinitású + trnszporter fehérjére és feszültségtől független + cstornár (Mthuis és Amtmnn, 1999.). Az kklimtizáció során tehát elsődleges citoplzm ionegyensúlyánk helyreállítás. Ez N + trnszport szályozásán keresztül vlósul meg. A N + kizáródik citoplzmáól, h trnszporterek + -N + szelektivitás ngy, és káliumiont részesítik előnyen nátriumml szemen. A citoplzm nátriumion trtlmát csökkentik zok trnszporter molekulák is, melyek sejtkomprtmentumok, így vkuólum illetve z poplszt felé, ktív trnszporttl pumpálják ki N + iont. Ezek z ún. N + -H + ntiporter fehérjék, melyek közül plzmmemránn loklizálódó fehérjét SOS1-nek nevezik, vkuólum memránhoz kötöttet pedig NHX (NHE) trnszporter csládnk. Továi lehetőség gyökér terhelésének mérséklésére N + hjtás irányuló trnszportj xilémen keresztül. Az így hjtás kerülő N + mezofillum sejteken zután hsonló trnszporter fehérjék közvetítésével ugynúgy komprtmentizálódht, mint gyökéren. Ez egyen zt is eredményezi, hogy mezofillum sejtek vkuólumán felhlmozódó N + ion szervetlen ozmotikumként is szolgál. Ez különösen hlofitákr jellemző, míg olyn glikofit növényen, mint prdicsom, hjtásn sok nátriumot kkumuláló termesztett fjták inká szenzitívnek izonyultk (Jun és mtsi, 25.). Een z eseten nátrium kkumuláció z oxidtív stressz következtéen plzmmemrán szelektivitásánk csökkenésével, ezt követően vízvesztéssel és vízpotenciál csökkenéssel, mjd levélöregedési folymtok eindulásávl járt. A vd prdicsomfjok között, zonn kifejezetten hlofit krkterű, N + -ot kkumuláló fjokt is tlálunk, mint milyen például Lycopersicon peruvinum és L. pennellii (Rus és mtsi, 1999.; Chen és mtsi. 21.). A sóstressz htásár z egyik elsőként kilkuló változás turgornyomás csökkenése mitt ekövetkező sejtmegnyúlás gátlás, melyhez kpcsolódik sztómák záródását követően fotoszintézis htékonyságánk csökkenése és csökkent széndioxid sszimiláció. A Clvinciklus enzimei és fotofoszforiláció folymti is sóérzékenyek. A másodlgos htások közül legfontos megnövekedett külső sókoncentráció következtéen kilkuló ozmotikus stressz. Az ozmotikus stressz káros htásink kivédését z ozmotikus homeosztázis helyreállítás jelenti. Ennek egyik eleme lehet szervetlen ozmotikumok koncentrálódás, de rendkívül fontos z ún. komptiilis ozmotikumok, mint például z lcsony molekulsúlyú szénhidrátok (szchróz, glükóz, fruktóz, trehlóz), cukorlkoholok (mnnitol, szoritol, ononitol, pinitol), szerves svk, minosvk (prolin), quterner mmónium szármzékok (glicinetin, β-lninetin, prolinetin st.) szintézisének ktiválódás és kkumulációj (Szegletes és mtsi, 2.). A komptiilis 2

3 ozmotikumok olyn komprtmentumokn szolgálnk ozmotikumként, hol fehérjék szerkezete megőrzendő, így citoplzmán, kloroplsztiszn, mitokondriumn. Gykrn ozmoprotektív szerepük is vn, tehát elősegítik mkromolekulák ntív térszerkezetének fennmrdását záltl, hogy helyettesítik szorosn kötött vízmolekulákt mkromolekulák felszínén és ntioxidánsként is funkcionálhtnk (Ashrf és Hrris, 24.; Tri és mtsi, 24.). A másodlgos folymtok között másik fontos elem z iotikus stresszorok nemspecifikus htásként jelentkező oxidtív stressz. A rektív oxigén formák (ROS) egyik legfontos forrás fotoszintetikus és mitokondriális elektrontrnszport lánc. A fotoszintetikus elektrontrnszport során 2. fotokémii rendszeren keletkező szinglet oxigén mellett z 1-es fotokémii rendszer (PSI) is hozzájárul ROS kilkulásához. A PSI közvetlenül dht át elektronokt molekuláris oxigénnek, generálv ezáltl szuperoxid gyöknion, mjd z eől keletkező H 2 O 2 képződését kloroplsztiszn. A ROS inktiválásán enzimtikus (SOD, CAT, APX, monodehidroszkorát reduktáz, dehidroszkorát reduktáz, gluttion reduktáz (GR)) és nem enzimtikus mechnizmusok (krotinoidok, cukrok, cukorlkoholok, poliminok) is szerepelnek. A ROS eltávolítás már önmgán is tekinthető detoxifikációs mechnizmusnk. Tág értelemen zonn ide soroljuk stresszor htás ltt felhlmozódó káros nygcseretermékek eltávolítását és sérült molekulák leontását vgy jvítását is. Jónéhány detoxifikáló enzim gluttion (GSH)-függő, ezek közül legngyo jelentősége tlán gluttion S-trnszferázoknk (GST) vn. A GST-k elektrofil szusztrátokhoz GSH-t kötnek, mjd gluttionált metolitot z ún. ATP-kötő kzettávl rendelkező, ABC trnszporterek vkuólum szállítják. A GST-k ily módon központi szerepet töltenek e xenoiotikumok detoxifikálásán (Edwrds és mtsi, 2.). A stressz htásár indukálódó izoenzimeknek szerepük lehet citotoxikus lkenálok konjugálásán. Ezek vegyületek, mint például 4-hidroxinonenál, memránok oxidtív destrukciój következtéen keletkeznek, rendkívül toxikusk, és GST-k egy csoportj (phi GST-k) képes detoxifikálásukr (Gronwld és Plisnce, 1998.). Deoxifikációs funkciót etölthetnek z ldo-keto reduktázok is, melyek egyik nem túl régen izonyított funkciój, hogy redukálják lipidperoxidáció mérgező termékeként keletkező ldehideket, így 4-hidroxinonenált (Oerschll és mtsi, 2.). A sikeres kklimtizáción fontos szerepe vn stresszor htásár indukálódó génexpressziós változásoknk, melyeket különöző stresszhormonok szintézisének fokozódás is közvetíthet. Ezek közül z egyik legfontos z szcizinsv (ABS). H z kklimtizáció sikeres, új stedy stte egyensúlyok mellett növény növekedni kezd stresszor jelenlétéen, illetve stresszor htásánk megszűnte után helyreállítj metolikus folymtit és növekedését. A hosszútávú előkezelésként lklmzott SA sóstresszel szemeni védő htását tudomásunk szerint sját eredménynek tekinthetjük (Tri és mtsi, 22). A tljn lévő SA koncentrációk ngyságrendekkel lcsonyk z irodlmi áttekintésen felsorolt hivtkozások ngy részéen hsznált koncentrációkhoz képest ( M). A növényeken zonn környezeti stresszhtásr kilkulht olyn SA koncentráció, mi 1-4 M-os exogén SA oldtól felvételre kerül (Freemn és mtsi, 25.). Ezért kísérleteinken z SA-t jóvl lcsony koncentrációintervllumn hsználtuk ( M), és hosszú időtrtmú előkezeléseket végeztünk. A mgs sótrtlmú tljok, z elsivtgosodó területek mezőgzdsági hsznosításánk lehetősége olyn növényi genotípusok kiválsztását igényli, melyek jól írják ezeket szélsőséges feltételeket. Ismernünk kell zokt fiziológii és molekuláris folymtokt, melyek z egyed szintjén lehetővé teszik kedvezőtlen feltételek közti túlélést, és fontos ezeknek mechnizmusoknk z összehsonlítás sikeresen 3

4 kklimtizálódó vd fjok fiziológii folymtivl is. Próálkoztunk tehát olyn eu-stresszt kiváltó kezelésekkel, mi jvítj növények rezisztenciáját iotikus stresszorokkl szemen. Az lleloptikus htást kiváltó szlicilsv hozzájárulht növények áltlános stresszrezisztenciájánk fokozódásához. Mivel prdicsomot gykrn hidropónikus, tlj nélküli kultúrán termesztik, és gykrn csk mgs sótrtlmú öntőzővíz áll rendelkezésre, kísérleteinken prdicsom sóstressz rezisztenciájánk jvítását tűztük ki célul. érdésként vetettük fel, hogy z SA előkezelés efolyásolj-e, s h igen, milyen mechnizmussl prdicsom növények sóstresszel szemeni rezisztenciáját? Ezek z eredmények részen elméleti lpot nyújtnk szlicilsv áltl kiváltott priming megértéséhez, részen tová fejleszthetők gykorltn is hsználhtó technológiává. Célkitűzések Céljink következőken fogllhtók össze: Összehsonlítottuk három, tljnélküli kultúrán is termesztett prdicsom genotípus (Lycopersicon esculentum Mill. L. cv. Rio Fuego, Riss és Profilo) só- és nem ionos ozmotikus stresszel szemeni érzékenyéségét. A 5, 1 és 2 mosm NCl és PEG 6-es kezelések után meghtároztuk reltív növekedési seesség csökkenését, vízpotenciál és ozmotikus potenciál változást, N +, + trtlmkt és zok rányát, klorofill fluoreszcenci indukciós és kioltási prmétereket, vlmint z oxidtív stressz htásár indukálódó jellegzetes enzimek ktivitását (gluttion S-trnszferáz, fenillnin mmóni-liáz). Ennek lpján kétféle stresszor htásár átmeneti, tehát sem erőteljes rezisztenciár, sem erőteljes szenzitivitásr nem utló válszt muttó Rio Fuego fjtát válsztottuk kísérleti ojektumul. A továikn hosszú időtrtmú szlicilsv előkezelés htásit elemeztük. Okoz-e változást z SA előkezelés növények vízháztrtási prmétereien, vízpotenciálján, ozmotikus potenciálján, és fotoszintézis htékonyságát is meghtározó sztómkonduktncián? Hogyn ht z SA + ( 86 R + ) felvételére előkezelésen és direkt htásként? Vizsgáltuk z előkezelések htását klorofill fluoreszcenci indukciós és kioltási prméterekre, és próáltunk összefüggést tlálni prméterek és z előkezelt növények sóstressz rezisztenciáj között. Történik-e z SA előkezelés htásár ozmotikus dptáció? Fokozz-e z SA szervetlen ozmotikumok kkumulációját? Hogyn efolyásolj z SA előkezelés sóstressznek kitett növények gyökeréen és hjtásán + /N + rányt, illetve z N + hjtás irányuló trnszportját? Vn-e htás z előkezelésnek szerves ozmotikumok szintézisére és kkumulációjár? H igen, melyek ezek szerves ozmotikumok illetve ozmoprotektív nygok: szchróz, glükóz, fruktóz, szoritol, poliminok. Vizsgáltuk glükóz metolizmus egyik kulcsenzimének, hexokináz ktivitásánk változását z előkezelések htásár. Hogyn ht z SA előkezelés szoritol szintézisét ktlizáló ldózreduktáz ktivitásár prdicsom gyökéren és hjtásn? Feldtul tűztük ki z enzim tisztítását mmónium szulfátos kicspássl és ioncserés kromtográfiávl, z enzimkinetiki prméterek meghtározását hjtásól és gyökéről tisztított enzimpreprátumml különöző szusztrátok jelenlétéen. Vizsgáltuk továó NCl és SA in vitro htását z enzimktivitásr. Hogyn ht z SA nem enzimtikus és enzimtikus ntioxidáns védőmechnizmusokr [krotinoid, szoritol, polimin és prolintrtlom, SOD, CAT, 4

5 APX, peroxidáz (POX) és gluttion reduktáz (GR) ktivitás] és detoxifikáción szerepet játszó enzimek ktivitás (GST)? Miképpen efolyásolj z előkezelés ugynezeket prmétereket sóstressznek kitett növényeken? érdésként vetődött fel, hogy sóstressz kklimtizáció szempontjáól z SA előkezelés htásár ekövetkező ozmotikus (és/vgy térfogti) dptáció vgy z ntioxidáns mechnizmusok ktiválódás meghtározó? Mi szerepe z SA-nk z kklimtizáció sikerességét meghtározó szcizinsv (ABS) ioszintézisének indukcióján és z ABS trtlmk változásán? Hogyn ht z SA z ABS ioszintézis egyik regulációs pontját jelentő ldehid oxidáz izoenzim (AO1) ktivitásár? érdésként merült fel, hogy csökken-e z irodlmi dtoknk megfelelően z etiléntermelés z SA előkezelt növények gyökeréen ill. hjtásán? Vn-e szerepe z etilénnek z SA-indukált kklimtizáción? Hogyn ht kis koncentrációjú etilén z kklimtizációs folymtokr? Az SA, z ABS és z etilén áltl indukált jelátviteli utk kölcsönhtását vizsgáltuk szövettenyészeten és levélől készült protoplszt tenyészeten. Milyen kezelésekkel fordíthtó meg sejthlált okozó SA koncentrációk htás? Végül célül tűztük ki z SA áltl indukált kklimtizációs folymtok összehsonlítását sótoleráns, vd prdicsom fj, L. pennellii sóstresszre dott, z irodlomn leírt válszrekcióivl. 5

6 Anygok és módszerek A növények nevelése ísérleteinken Lycopersicon esculentum Mill. L. cvr. Rio Fuego prdicsom növényeket hsználtunk fel. A csírázttás három npon keresztül sötéten, 26 ºC-on történt. Ezt követően növények két hetes korukig perliten mjd vízkultúrán, üvegházi körülmények között növekedtek. A növényeket 12 órás nppli, 12 órás éjszki periódus, 3 mol m -2 s -1 fényintenzitás és 55-6 %-os reltív pártrtlom mellett neveltük. Az SA kezelést növények 4 hetes korától 7 hetes koráig végeztük, M-os koncentráció intervllumn, miől előkísérletek után részletes vizsgáltokr 1-7 és 1-4 M-os koncentrációkt válsztottuk ki. A sókezelés 7 hetes korn történt 1 mm-os NCl lklmzásávl, mintákt sókezelés előtt és megkezdése után 7-1 nppl vettük. A mérésekre gyökereket és csúcstól számított két legfitl, de már teljesen kifejlett levelet hsználtuk. Ez áltlán 4-5. levélemelet volt. A nem ionos ozmotikus stressz kiváltás 6-es átlgos mólsúlyú polietilén glikolll (PEG 6, FLUA) történt, melyet tápoldt mértünk úgy, hogy z oldt ozmózisos nyomás 1 mosm legyen. A vízkultúrákt een kísérleten, és továikn is minden PEG-kezelés esetén kvárium pumpávl levegőztettük. A vízháztrtási és növekedési prméterek meghtározás A levelek vízpotenciálját nyomáskmr segítségével htároztuk meg (PMS Instruments Co., Corvllis, Oregon, USA), sejtextrktum ozmotikus potenciálját utomt ozmométerrel mértük (Digitl Automtic Osmometer, Mikro GMS). A sztómkonduktnciát levelek dxiális és xiális felszínének közepén stedy-stte porométerrel (PMR-2, PP Systems) htároztuk meg. + ( 86 R + ) felvétel mérése A + felvétel monitorozásához 86 R + izotópos jelölést lklmztunk (Zsoldos, 1993). A felvételi oldt 1 mm Cl-ot,,5 mm CCl 2 -ot és 185 kbq/l ktivitású 86 RCl izotópot trtlmzott. A 3 hetes prdicsom növényeket felvételi oldtn egyidejűleg vgy z izotópos felvételt megelőzően 24 óráig 1-7 és 1-4 M-os SA-vl kezeltük. A felvételi kísérlet időtrtm 6 ór volt. A kísérletek értékelését PACARD PRIAS PL folydék szcintillációs számlálóvl végeztük. Az elemtrtlmk meghtározás tomszorpciós spektroszkópiávl Az elemtrtlmk meghtározás Hitchi Z-82, Zeemn polrizált spektrofotométerrel, levegő-cetilén láng lklmzásávl történt (Trivedi és Erdei, 1992.) A poliminok nlízise A poliminokt Flores és Glston (1982.) módszerével htároztuk meg. A poliminokt HPLC-n (JASCO HPLC system, Jpán), reverz fázisú kolonnán (Apex octdecyl 5 µ; 25x4.6 mm), cetonitril:víz 45:55 (v:v) elegyével válsztottuk el, és UV detektor segítségével 254 nm-en zonosítottuk. Etilénprodukció meghtározás 6

7 A növényi részek etiléntermelését Hewlett-Pckrd 589 series II gázkromtográf segítségével, lángionizációs detektorrl, lumínium-oxiddl töltött oszlopon mértük. A legfitl, teljesen kifejlett levélől illetve gyökérzetől készített 1 g friss tömegű növényi nyg áltl 1 ór ltt sötéten termelődő etilént kvntifikáltuk. A termelt etilén mennyiségét stndrd állpotú, ismert koncentrációjú etilénől készített klirációvl történő összehsonlítás után nl (g friss tömeg) -1 h -1 értéken dtuk meg (Tri és Mihlik, 1998.). Pigment nlízis és fluoreszcenci indukciós prméterek meghtározás A klorofill és krotinoid trtlmkt Lichtenthler (1987.) szerint htároztuk meg. A klorofill fluoreszcenci-méréseket pulzus mplitúdó-modulált fluoriméter, PAM-2 (Wlz, Effeltrich) segítségével végeztük. A 2 percig sötétdptált mintákon z Fv/Fm-et, z Fo-t, fénydptált mintákon z effektív kvmtumhsznosítást ((Fm -Fs)/Fm = F/Fm ), z elektrontrnszport seességét (ETR), stedy stte fluoreszcenciát (Fs), fotokémii kioltási prmétert (qp=(fm -Fs)/(Fm -Fo)) és nem fotokémii kioltást (NPQ=(Fm-Fm )/Fm ) htároztuk meg, z ktív fény erőssége 7 μmol m -2 s -1 volt (Várdi és mtsi, 2.). Az szcizinsv trtlom mérése kompetitív ELISA-vl A növényi nyg 1 g-ját 1 mm-os NHCO 3 és methnol 2:8 (v:v) elegyéen extrháltuk, mi 1 ml-ként 1 mg utilált hidroxitoluolt (BHT) trtlmzott. Az ABS trtlmkt Phytodetek, ABA kompetitív ELISA kit segítségével (Ct. Numer: PD 9347/96) htároztuk meg. A stndrd görét (+) cisz/trnsz szcizinsv felhsználásávl gyártó áltl leírt módon,64-1 pmól ml -1 ABS koncentráció intervllumn készítettük el. Az lklikus foszftáz rekció ktivitását 45 nm-en mértük Dyntech ELISA leolvsó segítségével. Az szcizin-ldehid oxidáz (AO) (EC ) ktivitás mérése ktivitás gélen A növényi mint 1 g-ját jégen hűtött rendszeren 2 ml extrkciós pufferen eldörzsöltük. A homogenizátumot hűtött centrifugán 12 g-vel, 4 C-on, 2 percig centrifugáltuk. A továikn szuperntnst gélelektroforézisre hsználtuk. A fehérjetrtlom meghtározás után (Brdford, 1976.) hjtásól 4 μg, gyökéről 1 μg fehérje került felvitelre zseenként polikrilmid gélre. Az elektroforézist 7,5 %-os ntív polikrilmid gélen 3 óráig 4 C-on végeztük (Lemmli, 197.). Az elektroforézis után gélt,2 M-os foszfátpufferen (ph 7,5) mostuk 1 percig, mit enyhe rázás mellett z enzimrekció szusztrátjivl történő kezelés követett szohőmérsékleten. Az enzimrekcióhoz 1 mm-os indol-3-ldehid vgy -nftldehid szusztrátot hsználtunk Sgi és mtsi. (1999) szerint. A keletkező színrekció kvntifikálását ODA Elektroforézis Dokumentációs és Anlízis Rendszer (EDAS) 29 felhsználásávl, ODA 1D Imge Anlysis szoftver (Estmn odk Compny, 2-21) segítségével végeztük. Az összes cukortrtlom, szchróz, glükóz és fruktóz és szoritol meghtározás A hexokináz (EC ) ktivitás mérése Az összcukor mennyiségének meghtározásár Duois-féle (1956) fenol-kénsvs módszert hsználtuk. 7

8 A szd glükóz, fruktóz és szchróz mennyiségét Boehringer-Mnnheim/R- Biophrm ktlógusszámú, NADPH UV-szorpcióján lpuló szchróz, glükóz, fruktóz meghtározásár kidolgozott teszttel végeztük gyártó utsítási lpján. A szoritol meghtározás Boehringer-Mnnheim/R-Biophrm ktlógusszámú szoritol/xilitol meghtározásár kidolgozott teszttel történt. A hexokináz extrkciój és mérése (Whittker és mtsi, 21.) áltl leírtk szerint történt. Az ldóz reduktáz (ALR) (EC ) enzim mérése Az ldóz reduktáz izoenzimek tisztítás 4 illetve 8 %-os mmóniumszulfátos kicspássl, mjd dilizált cspdék feloldás után specifikus ktivitás meghtározásávl történt. A tisztított levélkivont kinetiki prmétereinek meghtározás (m, Vmx) nftldehid, D,Lglicerinldehid és NADPH felhsználásávl történt. A levélen és gyökéren tlálhtó izoenzimeket DEAE Sephdex A2512 nioncserélő oszloppl válsztottuk el. A NCl enzimktivitásr gykorolt in vitro htását 5-45 mm intervllumn, szlicilsvét,5-1.5 mm között htároztuk meg. Az ldóz reduktáz (ALR) (EC ) enzim ktivitásánk meghtározás növényi kivontól Vn der Jgt és mtsi (1992) áltl leírtk szerint történt. Az ntioxidtív enzimek ktivitásánk meghtározás Szuperoxid-dizmutáz (SOD) (EC ) ktivitást nitrolue-tetrzólium (NBT) rioflvin jelenlétéen történő fotokémii redukciójánk gátlás lpján htároztuk meg (Dhinds és mtsi, 1981.). A ktláz (CAT) (EC ) és peroxidáz (POX) (EC ) ktivitás mérését Updhy és mtsi (1985) szerint végeztük. Az szkorát peroxidáz (APX) (EC ) ktivitását z szkorinsv oxidációjánk követésével 29 nm-nél mért szorpció csökkenésől számítottuk 1 perc inkuáció után (Pnchuk és mtsi, 22.). A gluttion reduktáz (GR) (EC ) ktivitását Smith és mtsi (1988) szerint htároztuk meg. A mlondildehid (MDA) trtlom mérése A lipidperoxidáció omlástermékeinek mérését, mi elsősorn mlondildehid, tioritursvs módszerrel végeztük. A rekciótermékek menyiségét 532 nm-en htároztuk meg. A mlondildehid trtlmkt 155 mm -1 cm -1 millimoláris extinkciós koefficiens felhsználásávl számítottuk (Heth és Prker, 1968.). Protoplszt szuszpenzió készítése A levél protoplsztok izolálás 75 oldtn, o és Michyluk (198) leírás szerint történt. A protoplsztok életképességét Evns-lue festéssel htároztuk meg (Bker és Mock, 1994.). Sttisztiki nlízis A kísérleteket 3-5-ször ismételtük. A kísérleten megdott átlgértékek 3-6 egymástól függetlenül készített ismétlés átlgi sztenderd hiávl. A kontrolltól vló szignifikáns különséget Student-féle t-teszttel htároztuk meg P.5 (*),.1 (**) vgy.1 (***) vlószínűségi szinteken. Más eseten SigmStt 3.1 progrmml Duncn-féle tesztet lklmztuk P.5 tekintve szignifikánsnk. 8

9 Eredmények 1. A 1 mm NCl kezelés és PEG 6 áltl kiváltott nem ionos ozmotikus stressz htásár muttott növekedésgátlás, vízpotenciál csökkenés, hjtásn mért N + kkumuláció és fluoreszcenci indukciós prméterek lpján három genotípus, Riss, Profilo és Rio Fuego közül nem ionos ozmotikus és sóstresszre jól, de nem szélsőségesen regáló Rio Fuego fjtát válsztottuk kísérletünk ojektumként. Az eredményekről készült cikk enyújtásr előkészített formán vn (Szepesi et l. 26. Comprison of slt stress response of three tomto genotypes).. 2. A szlicilsv prdicsom növények vízháztrási prmétereire gykorolt htását három hetes előkezelések formáján végeztük. Megállpítottuk, hogy z SA z irodlmi dtoknk megfelelően csökkenti kezelt növényeken vízpotenciált, gátolj + ( 86 R + ) felvételt (1. és 2. ár), és gyors sztómzáródást idéz elő. Az egyik legfontos ozmotikum, kálium felvételének gátlásávl csökken szövetek vízmegtrtó képessége. Hossz távon zonn, z irodlomn ismertektől eltérően, z előkezelt növényeken ozmotikus és/vgy térfogti dptációvl helyreállt, sőt, kontrollnál kevésé negtívvá vált vízpotenciál, és + kivételével z iontrtlmkn sem volt szignifikáns változás Vízpotenciál (MP) M SA 1-4 M SA ** * ** * *** -.7 ** ** *** N pok 1. ár. 1-7 M-os és 1-4 M-os szlicilsv (SA) előkezelés htás 4 hetes prdicsom növények vízpotenciál változásár z idő függvényéen. (Átlg±SE, n=1, *-gl jelölt kezelt mint z znpi kontrolltól P,5 (*),.1 (**) vgy,1 (***) vlószínűségi szinteken szignifikánsn különözik) Direkt htás Utóhtás Hjtás Gyökér friss -1 tömeg mól) g 2 friss -1 tömeg mól) g 12 8 ) + felvétel R 86 (+ ( 1 ) + felvétel R 86 (+ ( M SA 1-4 M SA 1-7 M SA 1-4 M SA 9

10 2. ár. 1-7 M-os és 1-4 M-os szlicilsv (SA) elő- és egyidejű kezelések htás 4 hetes prdicsom növények + ( 86 R + ) felvételére és kkumulációjár gyökéren és hjtásn. Az izotóp felvétele 1 óráig történt. özvetlen htás: fekete oszlop; előkezelés: szürke oszlop (Átlg±SE, n=4). A különöző etűvel jelzett átlgok szignifikánsn különöznek egymástól P,5 vlószínűségi szinten, mit Duncn teszt segítségével htároztunk meg. A,5 vlószínűségi szinten nem különöző átlgértékeket nem jelöltük. 3. A továikn z SA előkezelés htását z egy hetes, 1 mm-os NCl kezelést követő eredményekkel együttesen fogllom össze. Rendkívül htékonynk izonyult 1-4 M-os SA-vl történő előkezelés sóstressz htásink kivédéséen. A felvett N + -ot z előkezelt növények jóvl ngyo rányn szállították hjtás, mit kezeletlenek (3. ár), és ott, hlofit krkterű, vd prdicsomfjokhoz (L. pennellii, L. peruvinum) hsonlón, ozmotikumként hsználták, mi továi jelentős reltív víztrtlom és vízpotenciál emelkedést jelentett 1-4 M-os SA-vl előkezelt, sóstresszelt növényeken (Szepesi és mtsi, 25.). + és N + trtlom ( mól) g -1 szárz tömeg mm NCl: + N + 1 mm NCl: N + de c d Hjtás e + és N + trtlom ( mól) g -1 szárz tömeg cd c d c c Gyökér d 1-7 M SA 1-4 M SA 1-7 M SA 1-4 M SA 3. ár. 1-7 M-os és 1-4 M-os szlicilsv (SA) előkezelés htás 8 hetes prdicsom növények hjtásánk és gyökerének kálium és nátrium trtlmár 1 hetes, 1 mm-os NCl kezelést követően (Átlg±SE, n=4). A különöző etűvel jelzett oszlopok z ANOVA-t követő Duncn teszt lpján,5 vlószínűségi szinten szignifikánsn különöznek. A tesztet + és N + trtlmkr külön végeztük el. Ez ugynkkor csökkenti gyökér N + terhelését, mi detoxifikációs mechnizmusok sikeressége szempontjáól rendkívül fontos. Ez + /N + rányok változásán is jól tükröződik. A gyökéren z előkezelés htásár sóstressz ltt z lcsony + trtlmk mellett is megmrd + /N + rány. 1

11 4. Annk izonyítékául, hogy 1-4 M-os SA-vl kezelt növények jon tolerálják hjtás mgs N + koncentrációit, mint kontroll, levelek sóérzékeny növényekre jellemző sárgulásán kívül fluoreszcenci indukciós és kioltási prmétereket és lipidperoxidáció lkulását vizsgáltuk (1. és 2. tálázt). 1. tálázt. A klorofill (+) és z összes krotinoid trtlom μg g -1 friss tömeg, mlondildehid (MDA) trtlom μmol g -1 g friss tömeg értéken vlmint l/l rány SA-vl előkezelt, fitl prdicsom leveleken egy hetes, 1 mm-os NCl kezelés után. l (+) l/l rotinoidok MDA ontroll () 1716.± ± ± ±.3 + NCl ± ± ± 3.6 c.36± M SA ± ± ± ± M SA + NCl ± ± ±29.6 c.18± M SA ± ± ± ± M SA + NCl ± ± ±1.9.2±.2 (Átlgok±SE, n=6). A különöző etűvel jelzett átlgok szignifikánsn különöznek egymástól P,5 vlószínűségi szinten, mit Duncn teszt segítségével htároztunk meg. Sóstressz ltt csökkent 1-4 M-os SA előkezelés htásár klorofill (+) trtlom viszont nőtt l/l rány. Ez rr utl, hogy SA előkezelés inká l destrukcióját fokozt. Az egyhetes sókezelés kontrollhoz képest lecsökkentette l/l rányt, ez tendenci zonn z előkezelt növényeken megfordult. A fotoszintetikus pigmentek szintézisének gátlás és/vgy degrdációjánk fokozódás jellemző szárzság, de különösképpen sóstressz ltt. A degrdáció áltlános fokozódás dptív htású is lehet, mivel növény fényegyűjtés csökkenésével fotoinhiiciós károsodást csökkenti Szignifikánsn megemelkedett 1-4 M-os SA-vl előkezelt növények krotinoid trtlm is sóstressz ltt. Ez zon túl, hogy krotinoidok fontos ntioxidánsok, mgs krotinoid trtlom sótoleráns prdicsom genotípusok fiziológii mrkerének is dódott. Ugyncsk rezisztencimrker stresszor htás ltt csökkent lipidperoxidáció is, mit szignifikánsn kise mlondildehid trtlom tükröz (Jun és mtsi, 25). Hsonló eredményeket kptk sóstressz kezelés htásár L. pennelliien is (Shlt és mtsi 21). 2. tálázt. A lorofill fluoreszcenci indukciós prméterek (F v /F m rány, qp, Φ PSII és z NPQ) változás 7 npos, 1 mm-os NCl kezelést követően 1-7 és 1-4 M-os SA-vl előkezelt prdicsom növények legfitl, kifejlett leveleien. F v /F m qp Φ PSII NPQ ontroll (C).765±.1 ns.582±.5.252±.1 c.599±.1 + NCl.773±.1 ns.447±.3.232±.2 c.67± M SA.784±.1 ns.625±.6.349±.3.538± M SA + NCl.764±. ns.561±.1.311±.1.534± M SA.775±. ns.519±.2.298±.2.58± M SA + NCl.793±.1 ns.637±.2.374±.2.549±.3 11

12 (Átlgok±SE, n=4). A különöző etűvel jelzett oszlopok szignifikánsn különöznek egymástól P,5 vlószínűségi szinten, mit Duncn teszt segítségével htároztunk meg. Az áltlunk hsznált SA koncentrációknál fotoszintézis fényrekciói nem gátlódnk drámin, hogyn zt fluoreszcenci indukciós prméterek, köztük z Fv/Fm változtlnság, z effektív kvntumhsznosítás, F/Fm SA előkezelés htásár történő növekedése, fotokémii (qp) és nem fotokémii kioltás (NPQ) rányánk fotokémii jvár történő eltolódás muttj (2. tálázt). Az F v /F m változtlnság rr utl, hogy z SA kezelés és sóstressz áltl kiváltott oxidtív stressz nem okozott olyn változást kloroplsztiszn, mi jelentős fotoinhiiciót eredményezne. A PSII primér fotokémii folymtink htékonyság (Φ PSII ), z effektív kvntumhsznosítás és qp növekvő értékei z NPQ-vl szemen sótoleráns növényekre jellemző változások. A sóstresszelt kontroll növényeken z előkezeltekkel szemen ugynkkor kise volt z effektív kvntumhsznosítás vlmint fluoreszcenci kioltásán ngyo volt hődisszipáció (NPQ) rány, mint fotokémii folymtoké. A SA előkezelés után prdicsom növények fluoreszcenci indukciós prmétereien történő változások különöző fjok toleráns genotípusin figyelhetők meg. Sótoleráns rizs genotípusok sóstressz ltt ngyo effektív kvntumhtékonyságot (Φ PSII ) és kise nem fotokémii kioltást (NPQ) mutttk, mint szenzitív genotípus (Dionisio-Sese és Toit 2). A rizs sótolernciáját fokozni lehetett kloroplsztisz glutmin szintetázát kódoló trnszgén túlexpresszálttásávl. Ez utói fotorespirációs kpcitást növeli meg fotorespirtórikus mmóni eltávolításávl. Az elektrontrnszport túlredukáltságánk kiküszöölésével fotorespiráció jelentős szerepet kp sóstressz tolernci kilkításán trnszgénikus rizs növényeken, mi Φ PSII és qp növekedéséen is megnyilvánul (Hohsid és mtsi 2). 5. A nátriumon kívül z előkezelt növényeken z ozmotikus dptációhoz hozzájárulhtnk z odhtó cukrok is. Az SA előkezelés htásár mind hjtásn, mind gyökéren megnő z oldhtó cukrok mennyisége. Eltérő tendenciát mutt zonn z egyes hexózok és szchróz koncentrációjánk változás (Tri és mtsi, 24). A hjtásn szchróz koncentrációj csökken z előkezelés htásár, mjd tová csökken sóstressz ltt. A gyökéren ezzel szemen z előkezelés megemeli szchróz koncentrációt, és ez tendenci megmrd 1 mm-os NCl jelenlétéen is. Ez jó összhngn vn zzl, hogy szénhidrátok szchróz formán trnszportálódnk gyökére, és itt különöző sejtkomprtmentumokn loklizálódó invertáz izoenzimek áltl ktlizált hidrolízis után lkulnk csk hexózokká (4. ár). Ezzel szemen hexózok, glükóz, de különösképpen fruktóz mennyisége megemelkedik z előkezelt növények hjtásán, mely emelkedés mértéke sókezelés htásár ugynitt kissé csökken. A gyökéren 1-7 M-os SA előkezelés htásár elsősorn fruktóz koncentrációján történt szignifikáns csökkenés, míg sóstressz hexóz trtlmkt áltlánosságn is csökkentette gyökéren. Mivel hexózok ktolikus folymtok történő lépése szorosn kpcsolódik hexokináz enzim áltl ktlizált foszforilálási rekcióvl, ezért megvizsgáltuk z enzim ktivitását hjtásn és gyökéren is. 12

13 Oldhtó cukor (mg) friss tömeg -1 (g) Hjtás. oldhtó cukortrtlom c c só stressz c Oldhtó cukor (mg) friss tömeg -1 (g) Gyökér: oldhtó cukortrtlom só stressz 1-7 M SA 1-4 M SA 1-7 M SA 1-4 M SA Szchróz (μmól) friss tömeg -1 (g) Hjtás: szchróztrtlom só stressz c c Szchróz (μmól) friss tömeg -1 (g) Gyökér: szchróztrtlom c só stressz 1-7 M SA 1-4 M SA 1-7 M SA 1-4 M SA 4. ár. 1-7 M-os és 1-4 M-os SA előkezelés htás 8 hetes prdicsom növények összes oldhtó cukor, szchróz, glükóz és fruktóz trtlmár 1 hetes, 1 mm-os NCl kezelést követően (Átlg±SE, n=3). A különöző etűvel jelzett átlgok szignifikánsn különöznek egymástól P,5 vlószínűségi szinten, mit Duncn teszt segítségével htároztunk meg. A hexokináz ktivitás hjtásn nem változik szignifikánsn, gyökéren zonn z előkezelés htásár mérsékelt, sóstressz áltl megnövelt ktivitásn pedig drámi csökkenés figyelhető meg z SA- előkezelt növényeken. A glükóz foszforilációj egyúttl metolikus folymtok, elsősorn glükolízise vló elépését is jelenti. A hexokináz ktivitás csökkenése tehát szénhidrát megőrző htású is lehet. Jun és mtsi (25.) szerint, jó sótolernciávl rendelkező prdicsom növényeket mgs szchróztrtlom jellemzi sóstressz ltt. ontroll növényeinken 1 mm-os NCl htásár olyn szchróz trtlmk lkultk ki (~14 mg g -1 friss tömeg), milyen értékek jellemezték Jun és mtsi (25.) áltl leírt, termesztett, jo sótűrő képességű genotípusokt. ontroll növényeink zonn láthtón sóérzékenyek. A szlicilsvs kezelés zonn megváltozttt ezt, hiszen szchróz helyett iokémiilg és fiziológiilg eltérő szerepű fruktóz kkumulálódik hjtásn. Az ozmotikus potenciál kilkításán pedig L. pennelliihez hsonlón elsősorn szervetlen N + dominál (Pérez-Alfoce et l. 1993). 6. Az ozmotikus dptáción cukrokon kívül különöző cukorlkoholok is részt vehetnek. A prdicsom levélen és termésen is kimutthtó szoritol, nem ismeretes zonn z SA htás szoritol szintézisére és kkumulációjár. A hjtásn és gyökéren is leglá két különöző ldóz reduktáz (ALR) izoenzim jelenlétét lehetett detektálni DEAE ioncserés kromtográfiávl, -1, M-os lineáris Cl grádienssel (5. ár). 13

14 .6 8 protein trtlom (mg ml -1 ) (mg/ml) Cl spec.ct specifikus ktivitás (nm min -1 mg -1 ) Frkciók 5. ár. A prdicsom gyökérextrktum ldózreduktázánk tisztítás DEAE ioncserés kromtográfiávl. O: fehérjetrtlom, mg ml -1 ; : specifikus ktivitás, nmól min -1 mg fehérje -1 ) Ezért nem meglepő, hogy különöző szusztrátokkl kissé eltérő ktivitásokt kptunk. A 8%-os mmóniumszulfátos kicspást követő dilízis után levélen 2,45-szoros tisztítást lehett elérni, mi z ezt követő dilízissel még tová volt növelhető 7,17-szorosr. A gyökéren lévő tisztított enzimmel meghtároztuk z enzim különöző szusztráttl muttott M és V mx értékeit. Az dtokt 7. tálázt trtlmzz. 3. tálázt. Prdicsom gyökéről kivont ldóz reduktáz enzim kinetiki prméterei különöző szusztrátokkl. Gyökérkivont Szusztrát M V mx (mm) (nm min -1 mg -1 protein) NADPH 1,84 35,71 glükóz-6-p, D,L-glicerinldehid 1,2 1,7 2-nftldehid,21 24,88 Az enzim elfogdt DL-glicerinldehidet és 2-nftldehidet is szusztrátnk, kis M érték mitt zonn vlószínűleg glükóz-6-foszfát természetes szusztrát. A gyökéről kivont enzim ktivitását in vitro 5 mm-tól csökkentette NCl, és.5 mm-tól kezdve szlicilsv, míg hjtás enzimét ugynezen SA koncentráció ktivált. Az SA előkezelés hjtásn szignifikánsn megemelte z enzim ktivitását, mely sókezelt mintákn is megmrdt. Ezzel szemen gyökereken z SA inká gátolt z enzimktivitást. A gyökéren z SA előkezelés önmgán is gátló htást gykorolt z extrhálhtó enzimktivitásr, zonn NCl jelenlétéen htás megfordult, és 1-4 M-os SA-vl előkezelt mintán már erőteljes ktiválást mérhettünk (6. ár). 14

15 Aldóz reduktáz ktivitás (nmól) min -1 (mg protein) Hjtás: ldóz reduktáz ktivitás c só stressz Aldóz reduktáz ktivitás (nmól) min -1 (mg protein) Gyökér: ldóz reduktáz ktivitás só stressz c 1-7 M SA 1-4 M SA 1-7 M SA 1-4 M SA 6. ár. 1-7 M-os és 1-4 M-os SA előkezelés htás 8 hetes prdicsom növények levél és gyökér ldózreduktáz ktivitásár glicerinldehid szusztráttl 1 hetes, 1 mm-os NCl kezelést követően (Átlg±SE, n=3). A különöző etűvel jelzett átlgok szignifikánsn különöznek egymástól P,5 vlószínűségi szinten, mit Duncn teszt segítségével htároztunk meg. Az ugynezen mintákól szármzó szoritoltrtlmk hjtásn közelítőleg követték z ALR ktivitás változásit. A gyökéren z SA előkezelések nem okoztk szignifikáns szoritoltrtlom változást, és ez csk minimálisn módosult NCl jelenlétéen is. A keletkezett szoritol mennyisége zonn, hsonlón z irodlmi dtokhoz, nem elegendő rr, hogy ozmotikumként számítás jöhessen. Ngyo jelentősége lehet nnk, hogy szoritol szintézis hozzájárul redukált NADPH oxidációjához, mi stresszor htás ltt fontos lépés NADP + reciklizációj szempontjáól. A szoritol töek között ntioxidánsként is szerepelhet. 7. Detoxifikációs mechnizmusok: rektív oxigénformák eltávolítás A szlicilsvról közismert, hogy oxidtív stressz generálásávl progrmozott sejthlált indukál hiperszenzitív rekció során. Az iotikus stresszorokkl szemeni védőhtást is z ntioxidáns enzimrendszer ktiválásávl mgyrázzák. Vizsgáltuk legfontos, rektív oxigénformák eltávolítását ktlizáló enzimek ktivitását z SA-vl előkezelt növényeken z egyhetes sókezelést követően (4. tálázt). Ezek htások hjtásn és gyökéren eltérnek. 4. tálázt. 1-7 M-os és 1-4 M-os szlicilsv (SA) előkezelés htás 8 hetes prdicsom növények gyökérzetének és hjtásánk ktláz (CAT), szuperoxid dizmutáz (SOD), gujkol peroxidáz (POX) és gluttion reduktáz (GR) ktivitásár (U mg -1 protein) (Átlg±SD, n=3). CAT SOD POX GR (U mg -1 protein) Gyökér ontroll 4.6± ± ±63.81 c 11.12±.65 + N 2.67± ± ± ±.36 c 1-7 M SA 1.33±.57 c 7.81± ± d 3.67±.11 c 1-7 M SA + N 2.51± ± ± ± M SA 2.71± ± ± ± M SA + N 2.71± ± ± ±.8 15

16 Hjtás ontroll 1.37± ± ± 4.9 c 4.84±.13 c +N.7± ± 11.4 c ± ± M SA 1.14± ± 21.9 c 156.8±15.1 c 6.38± M SA + N.34± ±16.34 c 45.± ± M SA 1.48± ± ± ± M SA + N.65± ± 11.1 c ± ±.7 Az SA előkezelés gyökéren szignifikánsn csökkentette ktláz ktivitását, hjtásn viszont nem okozott jelentős változást. A sóstressz z SA előkezelt növények gyökerei kivételével minden eseten tová csökkentette CAT ktivitást. Csökkenés figyelhető meg SOD ktivitásn hjtásn és gyökéren, 1-7 M SA előkezelésnél. A sóstressz mindenütt továi SOD ktivitás csökkenést eredményez. A hjtásn tehát 1 mm NCl htásár lecsökkent, hidrogénperoxidot ontó ktlázktivitás, és csökkent SOD ktivitás vlón kiindulópontj lehet rektív oxigén formákt generáló rekciósornk. A H 2 O 2 eltávolítását végezhetik különöző peroxidázok, melyek közül kloroplsztiszn, mitokondriumn és peroxiszómákn kiemelt szerepe vn z szkorát peroxidáznk (APX). A gujkol peroxidáz ktivitás mind hjtásn, mind gyökéren mgs volt 1-4 M-os SA-vl előkezelt növényeken, mit hjtásn minden mintán, gyökéren kontroll és 1-7 M os SA előkezelésnél sóstressz fokozott. Az oxidtív stresszel szemeni kklimtizáción szereplő egyik kulcsenzim, z APX ktivitás hjtásn lecsökkent z SA előkezelés htásár, ezzel szemen gyökéren igen jelentős ktivitásnövekedés figyelhető meg. Sóterhelésnél mind hjtásn, mind gyökéren fokozódik z APX ktivitás, mi z SA előkezelt mintákn kontrollénál szignifikánsn mgs értékeket eredményez (7.ár). U x 1 fehérje -1 (mg) Hjtás: szkorát peroxidáz ** ns *** só stressz ns *** U x 1 fehérje -1 (mg) Gyökér: szkorát peroxidáz *** *** *** só stressz *** ***. 1-7 M SA 1-4 M SA. 1-7 M SA 1-4 M SA 7. ár. 1-7 M-os és 1-4 M-os SA előkezelés htás 8 hetes prdicsom növények levelének és gyökérzetének szkorát peroxidáz ktivitásár 1 hetes 1 mm-os NCl kezelést követően (Átlg±SE, n=3). A *-gl jelölt kezelt mint kezeletlen kontrolltól P,5 (*),.1 (**) vgy,1 (***) vlószínűségi szinteken szignifikánsn különözik. A dehidroszkorinsv gluttionnl történő redukcióját végző gluttion reduktáz ktivitás hjtásn nem változik, gyökéren inká csökken z előkezelések htásár, ár 1-4 M-nál ez minimális. A sóstressz hjtásn emeli, gyökéren gátolj z enzimktivitást kontroll növényeken. A 1-4 M-os SA előkezelésnél hjtásn 1 mm NCl htásár GR 16

17 ktivitás szignifikánsn növekszik, gyökéren pedig nem csökken kontrollhoz képest (8. ár). Mivel mgs NCl koncentrációk elsősorn gyökér szöveteit károsíthtják, ezért lényeges gyökér kklimtizációs folymtát kiemelten és elsődlegesen kezelni. Megállpíthtjuk, hogy gyökéren z előkezelések htásár csökkenő CAT ktivitás H 2 O 2 kkumulációhoz vezethet, mit jelentősen fokozódó ktivitású POX és/vgy APX ontht le. Az szkorát reciklizációját iztosító GR ktivitásánk jelentős csökkenése sóstressz ltt, illetve ktiválódásánk elmrdás 1-7 M-os SA előkezelésnél, előidézheti z kklimtizáció sikertelenségét 1-7 M-os SA-vl előkezelt növényeken, mi mgs GR ktivitás mellett 1-4 M-os SA-vl előkezelt növényeken nem következik e. 15. Hjtás: gluttion reduktáz só stressz 15. Gyökér: gluttion reduktáz só stressz U x fehérje -1 (mg) c U x fehérje -1 (mg) c c M SA 1-4 M SA 1-7 M SA 1-4 M SA 8. ár. 1-7 M-os és 1-4 M-os SA előkezelés htás 8 hetes prdicsom növények levelének és gyökérzetének gluttion reduktáz ktivitásár 1 hetes, 1 mm-os NCl kezelést követően (Átlg±SE, n=3). A hjtásn sóstressz gátolj CAT ktivitását. Itt elsősorn gujkol peroxidáz járulht hozzá H 2 O 2 leontásához. Az ntioxidtív kpcitást zonn nem enzimtikus komponensek, mint például szignifikánsn megnövekedett krotinoid trtlom is növeli 1-4 M-os SA előkezelésnél. Mrkáns, z idő függvényéen zonos irányú változások következnek e L. pennellii vd prdicsom gyökeréen z ntioxidtív enzimek ktivitásánk változásán 1 mm-os NCl kezelés htásár z 5. np után (Shlt és mtsi, 21). Az idézett szerzők L. esculentumml szemen z szkorát peroxidáz és CAT ktivitásánk szignifikáns növekedését, és GR nem szignifikáns csökkenését detektálták sókezelt L. pennellii növények gyökereien. Hsonlóképpen, vd prdicsomfjn csökkent lipidperoxidáció, kise MDA trtlom mérhető. Az APX és GR ktivitásn és z MDA trtlomn hsonló irányú változások történtek 1-4 M-os SA előkezelés htásár L. esculentum cv. Rio Fuego termesztett fjtán is. A polimintrtlom növekedése sóstressz htásár kilkuló dptív válsznk tekinthető. A leveleken sóstressz következtéen csökken Put trtlom kontrolln és 1-7 M-os SA előkezelésnél, míg 1-4 M-nál szignifikáns emelkedést kptunk. A gyökereken 1-4 M-os SA előkezelés megemeli Put mennyiségét, mi 1 mm NCl jelenlétéen lecsökken (9. ár). A poliminok spektrumán megfigyelhető változás igen lényeges sóstresszel szemeni ellenállóság kilkulásán. Fontos tényezői z ntioxidáns védőmechnizmusoknk, mi részen közvetlen ROS kioltó htásuk következménye, ugynkkor szerepet játszhtnk z ntioxidtív enzimek ktiválásán. A Put ngyon htásosnk izonyult z APX, GR és SOD ktivitásánk fokozásán (Tng és Newton, 17

18 25.). Ugynkkor gátolt hiperszenzitív rekció ROS-generáló enzimét, NADPH oxidázt dohány mikroszóm frkción, ezáltl mérsékli O 2 - képződését. (Ppdkis és Rouelkis-Angelkis, 25.). 1 mm NCl Shoot: A Putreszcin ( mól) g -1 friss tömeg Hjtás: A Putreszcin ( mól) g -1 friss tömeg Gyökér: B 1-7 M SA 1-4 M SA 1-7 M SA 1-4 M SA Spermidin ( mól) g -1 friss tömeg Hjtás: C ns ns ns ns ns ns Spermidin ( mól) g -1 friss tömeg Gyökér: D c 1-7 M SA 1-4 M SA 1-7 M SA 1-4 M SA Spermin ( mól) g -1 friss tömeg Hjtás: E Spermin ( mól) g -1 friss tömeg Gyökér: F M SA 1-4 M SA 1-7 M SA 1-4 M SA 9. ár. 1-7 M-os és 1-4 M-os SA előkezelés htás 8 hetes prdicsom növények levelének és gyökérzetének putreszcin (A, B), spermidin (C, D) és spermin (E, F) trtlmár 1 hetes, 1 mm-os NCl kezelést követően (Átlg±SE, n=4). A különöző etűvel jelzett oszlopok szignifikánsn különöznek egymástól P,5 vlószínűségi szinten, mit Duncn teszt segítségével htároztunk meg. Így 1-4 M-os SA-vl előkezelt gyökereken sókezelés kezdetekor mért mgs Put trtlom fontos tényező gyökércsúcsi sejtek elhlásánk megkdályozásán. A poliminonok, mint poliktionok kpcsolódnk nukleinsvkhoz, foszfolipidekhez, fehérjékhez és egyé nionos komponensekhez sejten, ezzel együtt védő funkciót is ellátnk. ülönösen fontos plzmmemrán integritásánk és szeletív permeilitásánk megőrzése. Put-tl kezelt prdicsom levelek hidegstressz rezisztenciáj 18

19 jelentősen megemelkedett záltl, hogy polimin jelenlétéen megmrdt plzmlemm szelektív permeilitás, míg Put nélkül sejtek kieresztették elektrolit trtlmukt (im és mtsi, 22.). Növekedett Put trtlom 2 mm-os NCl kezeléskor L. pennellii sótoleráns prdicsom fjn, míg L. esculentumn Put trtlom csökkenését írták le hsonló körülmények között (Snt-Cruz és mtsi, 1999.). Megállpíthtjuk tehát, hogy 1-4 M-os SA előkezelés termesztett prdicsom levélen toleráns vd fjhoz hsonló változást idézett elő sótolernci kilkulásához döntően hozzájáruló Put kkumuláción. 8. A 1 mm-os NCl-dl kiváltott sóstressz és PEG 6-rel kiváltott nem ionos ozmotikus stressz kivédéséen SA előkezeléseknek eltérő szerepe vn. A nem ionos ozmotikus stresszel szemeni kklimtizáción htékony volt 1-7 M-os SA előkezelés, mi nem ktivált előzetesen z ntioxidáns enzimeket, viszont elsősorn szénhidrát kkumuláción lpuló ozmotikus dptációt indukált. A sóstessz kklimtizáció fokozásához z ntioxidtív védőmechnizmusok ktiválódásár is szükség vn, mi 1-4 M-os SA előkezelésnél következett e (Szepesi és mtsi, 25.). 9. Az SA előkezelés fokozt z szcizinsv szintézisét. Ennek lpj z SA htásár ekövetkező vízpotenciál csökkenés, mi z ABS ioszintéziséen szerepet játszó enzimek közül töet, így z szcizinldehidet ABS-sá lkító szcizinldehid oxidáz (AO) enzimet is indukálj. Az ABS szintézise zonn nemcsk z ozmotikus stressz áltl szályozódik, hnem oxidtív stressz áltl is regulált. Aszcizinsv trtlom (pmol) g -1 friss tömeg c c Gyökér 1-7 M SA 1-4 M SA 1. ár. 1-7 M-os és 1-4 M-os SA előkezelés htás 8 hetes prdicsom növények gyökérzetének szcizinsv trtlmár 1 hetes 1 mm-os NCl kezelést követően (Átlg±SE, n=4). Fekete oszlop: kontroll és SA előkezelt; szürke oszlop: sókezelt mint. A különöző etűvel jelzett oszlopok szignifikánsn különöznek egymástól P,5 vlószínűségi szinten, mit Duncn teszt segítségével htároztunk meg. 19

20 A 1-4 M-os SA előkezelés fokozt z ldehidoxidáz 1 (AO1) ktivitását is gyökéren (11. ár), és z előkezelés htásár új izoenzimek is megjelennek (AO2-4). 1-7 M SA 1-4 M SA AO1 AO2 AO3 AO4 11. ár. Az ldehid oxidáz izoenzimek (AO1-4) ktivitásánk változás 1-7 és 1-4 M-os SA előkezelést követően ktivitás gélen prdicsom gyökéren. Szusztrát: 1 mm-os nftldehid. A fenti témkören készült cikk közlésre enyújtv (Szepesi és mtsi, 26 Slicylic cid improves the cclimtion of Lycopersicon esculentum Mill. L. to high slinity y pproximting its slt stress response to tht of the wild species Lycopersicon pennellii). 1. Megállpítottuk, hogy hsznált SA előkezelések nem gátolták prdicsom növényeken z etilénprodukciót. Eredményeink zt muttták, hogy z etilén prekurzorávl, z 1-minociklopropán-1-kronsv lcsony koncentrációivl z SA-hoz hsonlón fokozni lehetett prdicsom növények stresszrezisztenciáját, minek lpj z ntioxidáns mechnizmusok ktiválódás és z szcizinsv szintézis indukciój volt (Bjkán, 24.). 11. Prdicsom levélől protoplszt szuszpenziót készítettünk, és vizsgáltuk SA, z SA jelenlétéen mérhető etilén, z ACC-indukált etilén, poliminok és z ABS htását z SAindukált sejthlálr. A sejtek életképességét z Evns-kék festődés hiány muttj (12. ár). 12. ár. A mezofillum protoplsztok 1-2 M-os SA oldtn inkuálv Evns kéken kékre festődnek mjd lizálnk. 2

21 Összefogllás 1. A szlicilsv előkezelés lklms volt prdicsom növények ionos és nem ionos ozmotikus stressz kklimtizációjánk jvításár. 2. A szlicilsv kezelés önmgán is ozmotikus stresszt váltott ki, mi második stresszor előtt már ktivált legfontos védekezési mechnizmusokt. 3. Ezek első eleme z ozmotikus és/vgy térfogti dptáció. A 1 mosm PEG 6-rel kiváltott nem ionos ozmotikus stressz kklimtizációt már 1-7 M-os előkezelés is jvított, elsősorn z előzetes ozmotikus dptáció mitt, mi főleg z oldhtó cukrok kkumulációján lpult. 4. Másik fontos tényező z ntioxidáns mechnizmusok ktiválás. A 1 mm NCl-dl kiváltott sóstresszel szemen 1-4 M-os SA előkezelés volt htékony, mely z ntioxidáns enzimrendszereket, elsősorn z szkorát peroxidázt és guikol peroxidázt ktivált gyökéren, és nem csökkentette drámin ktláz és gluttion reduktáz ktivitást. Ugynz z előkezelés megnövelte nem enzimtikus ntioxidánsok, mint pl. krotinoidok és putreszcin mennyiségét hjtásn, sóstressz ltt. 5. Hrmdik fontos eleme szlicilsv htásánk z ABS szintézisének indukciój és hormon kkumuláció fokozás z előkezelés ltt, ezáltl már második stresszor htás előtt indukálódnk z ABS jelátviteli út elemei és z így szintetizálódó védőfktorok. Az ABS szintézisének fokozódás z szcizinldehid oxidáz AO1 izoenzime ktiválódásánk következménye. 6. Az SA előkezelés termesztett prdicsomn hlofit vd prdicsomfjhoz, L. pennelliihez hsonló fiziológii változásokt indukált. Elősegítette N + hjtás irányuló trnszportját és ott szervetlen ozmotikumként vló felhsználását, mi hlofitákhoz hsonlón megnövelte e reltív növekedési seességet sóstressz ltt. Megjegyzések Egyetemi okttó lévén ngyon fontosnk trtom, hogy fenti pályázt ngyn segítette Fehérné iss Griell és Gémes tlin iológi-kémi illetve iológi tnár szkos hllgtók szkdolgoztánk elkészítését. Diplommunkát készített témáól Szepesi Ágnes, Bjkán Szilvi és is Gyöngyi iológus hllgtó. Az utói két hllgtó 24-es helyi diákköri konferencián Biokémi-Növényélettn szekción 1. illetve 2. helyezést ért el, mindketten doktorndusz hllgtói Biológus doktori iskolánk. Ugyncsk doktori disszertációt készít témáól Szepesi Ágnes is, ki várhtón 26-n e tudj fejezni munkát. Nem hgyhtó szó nélkül z sem, hogy z OTA támogtást töször is pénzügyi megszorítás súlytott. Ennek kpcsán először 25 %-os ÁFA evezetését, mjd 14 és 1 % elvonását kellett elszenvednünk. Ennek ellenére, kuttási feldtokn nem szerettünk voln pénzügyi támogtáshoz hsonló redukciót végrehjtni. A pályázt során egyszer kértem pénzügyi rovtok átcsoportosításár vontkozó módosítást, mit megkptunk, és mit hálásn köszönök. Ennek ok z volt, hogy költségterven szereplő BOEWIN 2x2 cstornás dtállomást felsőokttás finnszírozási viszonyi és z egyetemek pénzügyi mozgásán tpsztlhtó nomáliák mitt egy más pályáztól kellett kifizetnünk. A Beruházás rovtn megmrdó 645 eftmrdvány Dologi kidásokhoz történő átcsoportosításár z engedélyt megktuk Irodlom 21