Hosszútávú szalicilsav előkezelés hatása paradicsom növények sóstressz akklimatizációjára

Átírás

1 SZEGEDI TUDOMÁNYEGYETEM Hosszútávú szalicilsav előkezelés hatása paradicsom növények sóstressz akklimatizációjára Doktori (Ph.D.) értekezés Szepesi Ágnes Témavezető: Dr. Görgényi Miklósné Dr. Tari Irma egyetemi docens Készült a Szegedi Tudományegyetem, Természettudományi és Informatikai Kar, Növényiológiai Tanszékén Szeged 29.

2 Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék TARTALOMJEGYZÉK... 2 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BEVEZETÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS Stresszfolyamatok és a sóstressz A sóstressz : a Na + akkumuláció és tolerancia mechanizmusai növényeken Az aszcizinsav, mint általános stresszhormon Az aszcizinsav ioszintézis szaályozása aiotikus stresszorok által A xantofill ciklus valamint az ABS ioszintézis és jelátvitel kapcsolata A prolin, mint kompatiilis ozmotikum hatásai Szalicilsav fiziológiai hatásai növényeken Az oxidatív stressz A Halliwell-Asada-Foyer ciklus Nem enzimatikus antioxidánsok: az aszkorinsav Az aszkorát és a H 2 O 2 kapcsolata Aszkorát-deficiens mutánsok Az aszkorát és a glutation kapcsolata A glutation (GSH) CÉLKITŰZÉSEK ANYAGOK, MÓDSZEREK ÉS A KÍSÉRLETI RENDSZER ISMERTETÉSE Növények nevelési paraméterei Alkalmazott kezelések Alkalmazott módszerek Vízháztartási paraméterek vizsgálata K + ( 86 R + ) felvétel mérése Az elemtartalmak meghatározása atomaszorpciós spektroszkópiával A fluoreszcencia indukciós paraméterek meghatározása Klorofill és karotinoid tartalmak meghatározása Az aszcizinsav tartalom mérése kompetitív ELISA-val Az aszcizin-aldehid oxidáz (AO) (EC ) aktivitás mérése aktivitás gélen Az összes cukortartalom, a szacharóz, a glükóz és a fruktóz meghatározása A szoritol tartalom meghatározása Az aldóz reduktáz (ALR) (EC ) enzim aktivitásának meghatározása nyers növényi kivonatól Poliaminok analízise HPLC-vel

3 Tartalomjegyzék Prolin tartalom meghatározása A szaad prolin tartalmat Bates (1973) szerint határoztuk meg. K. 1 g friss növényi anyagot homogenizáltunk 3 %-os vizes szulfoszalicilsavan. A szűrt homogenátumot (2 ml) reagáltattuk 2 ml savas ninhidrinnel és ecetsavval 1 C-on 1 óráig, és a reakciót leállítottuk jeges vízfürdően. A reakcióelegyet 4 ml toluollal extraháltuk és erősen vortexeltük 1-15 s-ig. A toluol tartalmú kromofórt a vizes fázisól kivontuk és melegítettük szoahőre. Az aszoranciát felvettük 52 nm-en, toluolt használva vakként. A prolin koncentrációt (μmol g -1 friss tömeg) standard göre alapján határoztuk meg Malondialdehid (MDA) tartalom mérése Az antioxidatív enzimek aktivitásának meghatározása Szuperoxid-dizmutáz (SOD) (EC ) Kataláz (KAT)(EC ) Guajakol peroxidáz (POD) (EC ) Glutation reduktáz (GR) (EC ) APX-aszkorát peroxidáz (EC ) Nem enzimatikus antioxidánsok vizsgálata fotometriás módszerrel Az összes aszkorát és a redukált aszkorát tartalom meghatározása Összes glutation és oxidált glutation tartalom meghatározása Protoplasztok készítése paradicsom növények leveléől, majd a protoplasztok kezelése Protoplaszt életképesség vizsgálata sejtvitalitást jelző festékkel (FDA-fluoreszcein diacetát) A H 2 O 2 felszaadulás detektálása paradicsom növények leveléől izolált protoplasztokan Protoplaszt NO (nitrogén-monoxid) tartalom meghatározása DAF-2DA (diamino fluoreszcein diacetát) festékkel EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK A szalicilsav, mint allelopatikus anyag A szalicilsav hatása paradicsom növények vízháztartására A sóstressz akklimatizáció folyamatai a szalicilsavval előkezelt növényeken Ozmotikus adaptáció: inorganikus ozmotikumok akkumulációja Stresszrezisztencia markerek változása: fotoszintetikus pigmenttartalmak, fluoreszcencia indukciós paraméterek, lipidperoxidáció a SA-előkezelt paradicsoman a sóstressz alatt Organikus ozmotikumok: szénhidrátok akkumulációja Az aszcizinsav tartalom változása az előkezelések hatására és a sóstressz alatt Detoxifikációs mechanizmusok: reaktív oxigéngyökök eltávolítása Enzimatikus antioxidáns védekezési rendszer Nem enzimatikus antioxidáns védekezési rendszerek ÖSSZEFOGLALÁS SUMMARY KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS FELHASZNÁLT IRODALOM MELLÉKLETEK PUBLIKÁCIÓS LISTA

4 Tartalomjegyzék 12. DÍJAK, ELISMERÉSEK:

5 Rövidítések jegyzéke Rövidítések jegyzéke AAO aszcizinaldehid oxidáz ABS aszcizinsav ALR aldóz reduktáz BHT utilált hidroxitoluol KAT kataláz DHA dehidroaszkorát DHAR dehidroaszkorát reduktáz DPI difenilén jodónium DTNB 5,5 -ditio-isz(2-nitro-enzoesav) DTT ditiothreitol GPX glutation peroxidáz (EC ) GR glutation reduktáz, GSSG reduktáz (EC ) GSH glutation (γ-glutamil-ciszteinil-glicin), redukált forma GSSG glutation-diszulfid, oxidált forma GST glutation S-transzferáz (EC ) MCSU Mo-kofaktor szulfuriláz MDA monodehidroaszkorát MDHAR monodehidroaszkorát reduktáz MTT 3[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólium-romid NBT tetrazólium kék (nitrolue tetrazolium) NCED 9-cisz-epoxikarotinoid dioxigenáz NHE Na + /H + antiporter a vakuólum memránon NPQ a klorofill a fluoreszcencia nem fotokémiai kioltási paramétere NSC nem szelektív kation csatorna PMSF fenil-metil-szulfonil-fluorid POD guajakol peroxidáz PSII 2. fotokémiai rendszer PVPP polivinil-polipirrolidon qp fotokémiai fluoreszcencia kioltás 5

6 Rövidítések jegyzéke ROS SA SIPK SOD SOS1 SOS2 SOS3 ZEP reactive oxygen species, reaktív oxigénformák szalicilsav szalicilsav-aktivált protein kináz szuperoxid dizmutáz Na + /H + antiporter a plazmamemránon Ser/Thre protein kináz kalmodulinszerű Ca 2+ -kötő fehérje zeaxantin epoxidáz 6

7 Bevezetés 1. Bevezetés A magas sókoncentrációtól származó sóstressz a jelenleg művelés alatt álló területek egyharmadát érinti, így rendkívűl fontos a sótolerancia mechanizmusának megismerése, stressztoleráns fajok szelektálása, vagy iotechnológiai módszerekkel való előállítása. A sótolerancia javítására a paradicsom esetéen is rendelkezésre állnak a hagyományos nemesítési módszerek, próálkoztak genetikailag módosított növényekkel és gyakori a nevelési feltételek változtatása is, amely sótűrőé teheti a kérdéses genotípust (Cuartero és mtsai, 26). Ez utói szintén hagyományosnak tekinthető, olyan edzési eljárásokat jelent, amelyek növelik a növénykék aiotikus stressztoleranciáját. Ilyenek például a csíranövény koran alkalmazott előzetes sókezelés (Cayuela és mtsai, 21), szárazságstressz (Gonzalez-Fernandez, 1996), illetve lehet javítani az oltványok sóstressz toleranciáját sótűrő alanyra történő oltással (Santa-Cruz és mtsai, 22; Estaň és mtsai, 25). A szalicilsav kezelést (SA), mint a sóstressz akklimatizációt javító kémiai edzést, kísérleteink előtt nem alkalmazták egyértelműen sikeresen, hiszen a hatás sokszor ellentétessé vált, és a SA kezelés gátolta az ezt követő csírázást vagy a vegetatív fejlődést. A SA szerepe jól ismert a iotikus stressztolerancia jelátviteli folyamatáan. Az utói éveken azonan egyre tö izonyíték merül fel a különféle aiotikus stresszfaktorok elleni védekezésen etöltött funkciójáról is (Yalpani és mtsai, 1994; Janda és mtsai, 1999; Mishra és Choudhury, 1999; Bezrukhova és mtsai, 21; Larkindale és Knight, 22; Ananieva és mtsai, 24). A külsőleg adott SA sóstressz ellen nyújtott védő hatásáról már tö munka született, viszont az eredmények ellentmondóak voltak, mivel a SA hatása függ a kezelés módjától, a növény fejlődési stádiumától és a koncentráció nagyságától. Magas (> 1-3 M) SA koncentrációk kivédhetetlen oxidatív stresszt jelentenek a növény számára, viszont az általunk alkalmazott alacsonya koncentrációkkal (1-7 M és 1-4 M SA) olyan edzési eljárás dolgozható ki, amely lehetővé teszi a munkáman alkalmazott sóstresszel (1 mm NaCl) szemeni tolerancia kialakítását talaj nélküli kultúrákan nevelt paradicsoman. Munkáman célul tűztem ki az alacsony koncentrációan és hosszútávú előkezelésen alkalmazott SA hatásainak vizsgálatát paradicsom növények sóstressz akklimatizációjára. A SA szekunder metaolit, amely a növényi fenolvegyületek csoportjáa tartozik. Allelopatikus anyagnak tekinthető, mivel gátolhatja a környezetéen élő más fajok csírázását, gátolja 7

8 Bevezetés növekedésüket is, aminek egyik oka, hogy szaályozza a növények vízháztartását csökkentve a vízpotenciált és a sztómakonduktanciát. Hasonló hatást feltételeztünk a paradicsomnál is, ahol 1-7 M és 1-4 M SA előkezelés hatására csökkenés történt a K + ( 86 R + ) felvételen, a káliumtartaloman és a kezelés hatására a vízpotenciál is negatívaá vált a hajtásan. A vízpotenciálcsökkenés következtéen megnőtt a SA előkezelt növényeken az aszcizinsav (ABS) stresszhormon koncentrációja, ami sztómazáródást eredményezett mindkét SA koncentráció esetéen. Az irodalmi adatoktól eltérően a kísérleteinken azonan az alacsony koncentrációan és hosszútávú előkezelésen alkalmazott SA hatására megtörtént az ozmotikus és/vagy térfogati adaptáció és ezt követően a vízpotenciál (ψ v ) növekedése az előkezelések végére. A vízháztartással kapcsolódó paraméterek változása (ψ v, ozmotikus potenciál, ψ π, sztómakonduktancia csökkenés) a két előkezelésként alkalmazott SA koncentrációnál nagyon hasonló volt. Az ozmotikus adaptáció ellenére az ABS koncentrációja a 1-4 M-os SA-val előkezelt növényeken továra is szignifikánsan megemelkedett, ami lehetővé tette az ABS jelátviteli út tartós ekapcsoltságát, és az ABS-indukálta védekezési mechanizmusok aktiválódását ennél a koncentrációnál. Az ABS ioszintézisének szaályozódása tehát nemcsak a SA-által kiváltott hidraulikus és ozmotikus stressz által, hanem más tényezők által is szaályozott a 1-4 M-os SAval előkezelt paradicsoman. Mivel az ABS ioszintézis utolsó lépését az aszcizinaldehid oxidáz (AAO) enzim katalizálja, nem denaturáló poliakrilamid gélen vizsgáltuk meg az enzimaktivitás változásait. Eredményeink alapján a gyökéren négy, a hajtásan két erőteljes, gyakran egyeeső sáv mutatható ki. Szignifikáns AAO aktivitás fokozódás történt az előkezelések hatására, ami elsősoran a 1-4 M SA-nál jelentős, így feltételezhető, hogy a SAindukált ABS akkumulációan az AAO-ra gyakorolt pozitív regulációs hatásnak is szerepe van. Sikeres akklimatizáció csak a 1-4 M SA előkezelt növényeken történt a 1 mm NaCl által indukált sóstresszel szemen, ami sem a kontroll, sem a 1-7 M-os SA-val előkezelt mintáknál nem következett e. A sóstressz alatt, néhány halofita vagy halofita jellegű paradicsom fajhoz hasonlóan, a nátriumionok az előkezelt növények hajtásáan akkumulálódtak és ozmotikumként működtek, de a 1-4 M-os előkezelésnél nem voltak megfigyelhetőek a tölet nátrium káros tünetei. Ez jól izonyítható a különöző stresszmarkerek kontrollhoz közelítő értékeivel a 1-4 M-os SA-val előkezelt mintákan a sókezelést követően. A fotoszintézis primer fotokémiai folyamatai (F v /F m, Φ PSII, qp) is a kontrolléval azonos, vagy jo hatékonysággal 8

9 Bevezetés működtek. A sóstressz alatt az előkezelt növényeken a levelek nagyo ABA akkumulációját követte a megemelkedett putreszcin és karotinoid tartalom, valamint a csökkent lipidperoxidáció. Az ozmotikus stressz kivédése a hajtásan az inorganikus ozmotikumként ható nátriumion akkumuláció mellett kompatiilis ozmotikumok, így oldható cukrok felhalmozódásával valósult meg. A leveleken elsősoran glükóz és fruktóz, a gyökéren a szacharóz járult hozzá a sejtek ozmotikus potenciáljához. A kompatiilis ozmotikumok közül levélen a szoritol tartalom megemelkedését is tapasztaltuk az előkezelt növényeken. Mivel a szoritol a mért koncentrációk mellett nem lehet számottevő az ozmotikus adaptáció kialakításáan, feltételezhető, hogy a szoritol szintézisét is katalizáló aldóz reduktáz aktivitás növekedése a NADPH reciklizációjáan lehet jelentős. A szalicilsav az irodalomól ismert módon mindkét koncentrációnál gátolta a paradicsom hajtásáan a kataláz aktivitást, ami összhangan van azzal, hogy az előkezelés alatt reaktív oxigénformák (ROS), így O 2 és H 2 O 2 keletkeznek. Ennek következtéen a növényeken aktiválódnak az antioxidáns védőmechanizmusok. Célom volt az antioxidáns védekezési rendszer enzimatikus és nem enzimatikus komponensei változásának vizsgálata a sóstressz 1 hete alatt, az aszkorát-glutation ciklus egyes elemeinek nyomonkövetése. Megállapítottam, hogy a hajtás és a gyökér eltérő oxidatív stresszválaszának alapjául elsősoran az szolgálhat, hogy a nem enzimatikus antioxidánsok, így a glutation és az aszkorinsav mennyisége a 1-4 M-os SA kezelés hatására elsősoran a gyökéren emelkedik meg szignifikánsan sóstressz alatt. Ugyanitt szignifikánsan megemelkedik a rendszer visszaredukálódását szaályozó glutation reduktáz (GR) aktivitás is. Ha a reaktív oxigénformák mennyisége túllépi a kioltó mechanizmusok kapacitását, az oxidatív stressz programozott sejthalált (PCD) indukál. Protoplasztokon, mint sejtszintű modell rendszeren vizsgálható a SA lehetséges szerepe a PCD-en, ehhez különöző festési eljárások és gátlószerek állnak rendelkezésre. A prolin, mint a SA előkezelések után a sóstressz alatt felhalmozódó kompatiilis ozmotikum az irodalmi adatok alapján védi a fotoszintetikus apparátust, valamint ROS kioltóként is működhet. Alacsony koncentrációan alkalmazott prolin javította a paradicsom protoplasztok életképességét, amit FDA festéssel határoztam meg. Két különöző prolin koncentráció alkalmazásával megvizsgáltam a prolin lehetséges szerepét az oxidatív stressz kivédéséen, ehhez a NO és a H 2 O 2 szinteket határoztuk meg, és gátoltuk a H 2 O 2 keletkezését difenilén jodónium, a NADPH oxidáz és más, H 2 O 2 -ot generáló flavoprotein 9

10 Bevezetés enzimek gátlószere segítségével. A szalicilsav előkezelések hatására akkumulálódó, a sótolerancia kialakításáan résztvevő anyagok (ABS, prolin, oldható cukrok, szoritol) közötti interakció a paradicsom mezofillum sejtjeien sóstresszt követően hozzájárulhat az általunk detektált tolerancia kialakításához. 1

11 Irodalmi áttekintés 2. Irodalmi áttekintés 2.1 Stresszfolyamatok és a sóstressz A stressz, mint fogalom meghatározása Selye János nevéhez fűződik. Definíciója szerint az élő szervezetek valamennyi adaptációs reakciójának a stressz a foglalata, azaz a stressz egy fajlagos tünetcsoportan megnyilvánuló állapot, amely magáan foglal minden nem-fajlagosan előidézett elváltozást egy iológiai rendszeren elül (Selye, 1956). A stressznek tehát sajátos ismertető jelei vannak, és a különféle, fajlagos, a stresszorra jellemző, specifikus hatást kiváltó folyamatok válaszreakcióinak egy része azonos. A stresszhatásra ekövetkező tünetegyüttes az adaptációs szindróma, amely egymást követő folyamatokól épül fel: Canon-féle vészreakció, ellenállás vagy rezisztencia, kimerülés (1. ára). 1. ára: A növényi stresszválasz általános sémája (Larcher, 1994.) Lichtenthaler (1996) szerint minden olyan körülmény vagy anyag, ami kedvezőtlen hatással van a növények anyagcseréjére, növekedésére vagy fejlődésére, stressznek tekinthető. Növényi stresszhatást különöző természetes és antropogén stresszfaktorok válthatnak ki. 11

12 Irodalmi áttekintés A gyenge stressz hatását az akklimatizáció, a rezisztenciát fokozó és javító mechanizmusok részen kompenzálják. Az erős stressz jelentős károkat okozva végső soron a növényi sejt és egyed halálához is vezethet. A Selye-féle általános stresszelmélet tö kutatás által eigazolódott (Lichtenthaler, 1996). Stressz hatására az élő szervezet anyagcseréjéen, így a növényeken is izonyos reakcióutak felgyorsulnak vagy gátlódnak, ami olyan köztes- és végtermékek felhalmozódását, esetleg megjelenését eredményezi, amelyek az ismert iokémiai reakcióutakat valamelyik iránya eltolhatják. Ezek közül a iokémiai folyamatok közül az oxidációs-redukciós állapot változások az egyik leggyorsaan lejátszódó molekuláris szintű változások a szervezeten, amit összefoglaló néven oxidatív stresszhatásnak is neveznek. Az oxidatív stressz kiváltói főleg a reaktív oxigénformák (angol rövidítéssel: ROS), de általánosan megállapítható, hogy a legtö stressznek van oxidatív komponense is (Asada, 1994; Foyer és Harinson, 1994), amely indukálja a növények antioxidáns védekezési rendszerét. A növényélettani vizsgálatok közül a stresszkutatások kimagasló fontosságát napjainkan tö tényező is indokolja: a gloális klímaváltozás, felmelegedés; a szikes, sós talajok kialakulása; az arid (sivatagos) zónák kiterjedése, környezetszennyezés valamint az az igény, hogy olyan stressznek ellenálló növényfajták legyenek előállíthatók, amelyek kedvezőtlen környezeti feltételek mellett is megfelelő terméshozamot képesek produkálni A sóstressz : a Na + akkumuláció és tolerancia mechanizmusai növényeken Ha a környezet sókoncentrációja meghaladja a növények optimális fejlődéséhez szükséges koncentráció értéket, sóstresszről eszélünk. A talajoldatokan levő ionok közül a Mg 2+, Ca 2+, SO 2-4, és a Cl - ionok járulnak hozzá leginká a teljes szalinitáshoz, természetesen ehhez járul a Na + ion is, amely szodicitás esetén önmagáan okozza a sóstresszként ható magas sókoncentrációkat legtöször klorid anionnal. A sóstressz a jelenleg művelés alá vont területek egyharmadát érinti (Flowers és Yeo, 1997), ami a Föld felszínének megközelítőleg 6 %-a (Szaolcs, 1994). Természetes élőhelyek is rendelkezhetnek magas sótartalommal, így az ár-apály által érintett tengerparti zónák, sós mocsarak, száraz, félsivatagi vidékeken kialakuló, visszahúzódó felszíni vizek parti zónái (Kaszpi-tenger, Holt-tenger) és a mérsékelt égövi szikes területek növényei. A világon a 12

13 Irodalmi áttekintés mezőgazdaságilag művelt területek 4 %-án a talaj magas sótartalma a növénytermesztés eredményességét fokozódó mértéken csökkenti. Hazánkan különösen nagy arányan, az ország területének 1 %-án fordulnak elő sós területek, amelyek továi terjedése éghajlati és emeri hatásra várható. Az ilyen területeken használt öntözővíz szintén magas sókoncentrációval ír (9 mg l -1 ). Amellett, hogy a termesztett növények sótoleranciájának fokozása a fentiek miatt óriási gyakorlati jelentőségű, a sótolerancia kutatása a növényiológiai alaptudományokat is nagyan gazdagítja: a génszaályozástól az ásványi anyagok felvételéig sokféle területet felölel. A sóstressz kutatása gyarapítja a szárazság- és a hidegstresszel kapcsolatos ismereteinket is, mivel szoros összefüggés mutatkozik e három aiotikus stressz között. Fontos feladat a sótolerancia mechanizmusának megismerése, valamint olyan növények szelekciója, esetleg transzgénikus növények előállítása, amelyek ezeken a területeken gazdasági növényként termeszthetők. Munkáman a NaCl magas koncentrációi által okozott stresszre használom a sóstressz kifejezést. A növényi sótűrés kutatásáan azonan mindig szem előtt kell tartani, hogy sokgénes tulajdonságról van szó. Valószínű tehát, hogy a sótolerancia kialakításához a növény egyes szerveinek jól szaályozott együttműködésére van szükség. A sótolerancia vizsgálatához kitűnő ojektumot jelentenek a halofita növényfajok, amelyek megfigyelése révén megismerhetjük a növények természetes adaptációs mechanizmusait. Hasonlóképpen kevés az ismeretünk azokról a speciális feltételekről, melyekkel a magas sótartalmú talajok nagyo hányadát kitevő szódás talajokon élő növényeknek kell megirkózniuk. A növényeket sótoleranciájuk szerint tö kategóriáa oszthatjuk. A halofita, sókedvelő növények csoportja 2 és 5 mm NaCl koncentráció mellett is képes növekedésre. Ezen csoporton elül az euhalofiták optimális növekedésükhöz magas, akár 3 mm-os NaCl koncentrációt is igényelnek. A második csoporta tö halofita és néhány glikofita génusz tartozik, ezek közös jellemzője az erőteljes növekedésgátlás 2 mm-os NaCl oldaton, illetve a növekedés megszűnése e koncentráció fölött, de még mindig képesek külső tünetektől mentes vegetatív fejlődésre és termésképzésre. A harmadik csoporta tartozó glikofita növények számára a 8 mm-os vagy annál nagyo NaCl koncentráció már mérgező, citoplazmájukan felorul az ionegyensúly, súlyos stressztüneteket mutatnak, illetve e fölött a koncentráció fölött el is pusztulnak (Flowers és mtsai, 1997; Hasegawa és mtsai, 2). A sóstressz által kiváltott primér hatás a Na + ionok citoplazmáa való elépése után az ionegyensúly felorulása (Zhu, 21). A 13

14 Irodalmi áttekintés magasarendű növények citoplazmája 1-2 mm K + -ot és 1-1 mm Na + -ot tartalmaz, amely 2 mm-os külső Na + koncentrációnál 8 mm-ig is emelkedhet. A Na + ionok mérgezőek a sejt számára, megontják a fehérjék szorosan kötött hidráturkát, ezáltal azok elveszítik natív konformációjukat, helyettesítik az enzimek kofaktoraként szolgáló K + ionokat, és legtöször enzimaktivitás gátlást idéznek elő. A Ca 2+ -ra vonatkozó ionegyensúly felorulása pedig a K + /Na + felvétel szelektivitását csökkenti azáltal, hogy megszünteti a Ca 2+ gátló hatását a Na + citoplazmáa történő elépését is közvetítő, kis affinitású K + transzporter fehérjére és a feszültségtől független K + csatornára (VIC, voltage independent channel)(maathuis és Amtmann, 1999). Az akklimatizáció során tehát elsődleges a citoplazma ionegyensúlyának a helyreállítása. Ez a Na + transzport szaályozásán keresztül valósul meg. A Na + elépése a gyökérsejtek citoplazmájáa történhet még az ún. nem szelektív kationcsatornán (NSC) keresztül (Amtmann és Sanders, 1999), de a nagy affinitású K + transzporter fehérje (HKT1) is szállít Na + ionokat (Ruio és mtsai, 1995). A Na + kizáródik a citoplazmáól, ha a transzporterek K + -Na + szelektivitása nagy, és a káliumiont részesítik előnyen a nátriummal szemen. A citoplazma nátriumion tartalmát csökkentik azok a transzporter molekulák is, amelyek a sejtkompartmentumok, így a vakuólum illetve az apoplaszt felé, aktív transzporttal pumpálják ki a Na + iont. Ezek az ún. Na + -H + -antiporter fehérjék, amelyek közül a plazmamemránan lokalizálódó fehérjét SOS1-nek nevezik, a vakuólum memránhoz kötöttet pedig NHX (NHE) transzporter családnak. A Na + transzport mechanizmusát molekuláris szinten legjoan a sóstresszre különösen nagy érzékenységet mutató Araidopsis SOS (salt overly sensitive) mutánsok segítségével ismertük meg (Zhu és mtsai, 1998). A Na + elépése a plazmamemránon keresztül a citoplazmáa valószínűleg a sóstressz szenzorául is szolgál, és ennek követekeztéen megemelkedik a citoplazma szaad Ca 2+ ion koncentrációja. A kalcium jelet a kalmodulinszerű, SOS3 kalcium szenzor fehérje érzékeli, ami ezáltal aktiválódik, és kötődik a SOS2 Ser/Thre protein kinázhoz. A SOS3 kötődése után aktiválódó SOS2 kináz foszforilálja, ezáltal aktiválja a SOS1-et, a Na + -ot a citoplazmáól kijuttató transzport fehérjét. A citoplazmatikus Na + koncentrációt ugyancsak csökkenti a hasonló mechanizmussal működő, a tonoplasztan lokalizálódó, Na + -H + NHX antiporter fehérjék csoportja. Így már a gyökérsejteken is tö hatékony mechanizmus működik a citoplazmatikus [Na + ] csökkentésére. Továi lehetőség a gyökér terhelésének mérséklésére a Na + hajtása 14

15 Irodalmi áttekintés irányuló transzportja a xilémen keresztül. Az így hajtása kerülő Na + a mezofillum sejteken hasonló transzporter fehérjék közvetítésével ugyanúgy kompartmentalizálódhat, mint a gyökéren. Ez egyen azt is eredményezi, hogy a vakuóluman felhalmozódó Na + ion szervetlen ozmotikumként is szolgál. Ez különösen a halofitákra jellemző, míg olyan glikofita növényen, mint a paradicsom, a hajtásan sok nátriumot akkumuláló, termesztett fajták inká szenzitívnek izonyultak (Juan és mtsai, 25). Een az eseten a nátrium akkumuláció az oxidatív stressz következtéen a plazmamemrán szelektivitásának csökkenésével, ezt követően vízvesztéssel és vízpotenciál csökkenéssel, majd a levélöregedési folyamatok eindulásával járt. A vad paradicsomfajok között azonan kifejezetten halofita karakterű, Na + -ot szervetlen ozmotikumként akkumuláló fajokat is találunk, mint amilyen például a Solanum peruvianum és a S. pennellii (Rus és mtsai 1999; Chen és mtsai, 21). A sóstressz hatására az egyik elsőként kialakuló változás a turgornyomás csökkenése miatt ekövetkező sejtmegnyúlás gátlás, amelyhez kapcsolódik a sztómák záródását követően a fotoszintézis hatékonyságának csökkenése és a csökkent széndioxid asszimiláció. A Calvinciklus enzimei és a fotofoszforiláció folyamatai is sóérzékenyek (Chaves és mtsai, 29). A másodlagos hatások közül legfontosa a megnövekedett külső sókoncentráció következtéen kialakuló ozmotikus stressz. Az ozmotikus stressz káros hatásainak kivédését az ozmotikus homeosztázis helyreállítása jelenti. Ennek egyik eleme a szervetlen ozmotikumok koncentrálódása, de rendkívül fontos az ún. kompatiilis ozmotikumok szintézise is. Ezek közé tartoznak az alacsony molekulasúlyú szénhidrátok (szacharóz, glükóz, fruktóz, trehalóz), a cukoralkoholok (mannitol, szoritol, ononitol, pinitol), a szerves savak és aminosavak (pl. prolin), vagy a kvaterner ammónium származékok (glicinetain, β-alaninetain, prolinetain, st.) (Szegletes és mtsai, 2). A sótolerancia kialakítására irányuló hagyományos és géntechnikai nemesítés egyik legfontosa irányvonala az ozmotikusan aktív szerves vegyületek szintézisének mesterséges fokozása. E molekulák némelyike normális anyagcsere-folyamatokan is részt vesz vagy szaályozó szerepet tölt e, így felhalmozásuk e folyamatokra is kihatással lehet. Az ozmoprotektív vegyületek felhalmozásával-, átalakításával kapcsolatos ismereteink jelentős része sejtkultúrák, levélszegmensek, prokarióta rendszerek vizsgálatáól származik. A kompatiilis ozmotikumok azokan a kompartmentumokan szolgálnak ozmotikumként, ahol a fehérjék szerkezete megőrzendő, így a citoplazmáan, kloroplasztiszan, mitokondriumokan. Gyakran ozmoprotektív szerepük is van, tehát elősegítik a makromolekulák natív 15

16 Irodalmi áttekintés térszerkezetének fennmaradását azáltal, hogy helyettesítik a szorosan kötött vízmolekulákat a makromolekulák felszínén és antioxidánsként is funkcionálhatnak (Tari és mtsai, 23; Ashraf és Harris, 24). Az ozmotikus stressz növényfajtól illetve fajon elül alfajtól vagy genotípustól függően indukálja ezen kompatiilis ozmotikumok ioszintéziséen szereplő kulcsenzimek expresszióját, amely iztosítja az adott genotípus sikeres akklimatizációját a szélsőséges körülmények között. Ilyen kulcsenzim lehet például az aldo-keto reduktázok csoportja, amelyek ozmotikus stressz hatására fokozott expressziót mutathatnak, illetve új izoenzimeik expresszálódhatnak. Működésük eredményeképpen cukoralkoholok szintetizálódnak, mint például az aldóz-6-foszfát reduktáz által katalizált reakcióan a szoritol-6-p, amelyől a 6-os helyzetű foszfátcsoport egy foszfatáz enzim által katalizált lehasítása után szoritol keletkezik (Zhou és mtsai, 22). A 15 mm NaCl-dal kezelt Solanum tuerosuman az inozitol a raffinóz családa tartozó oligoszacharidok szintézisét katalizáló enzimek génjeinek upregulációja következtéen, a megnövekedett raffinóz poolól származik (Legay és mtsai, 29). A sóstressz által indukált másodlagos folyamatok között másik elem az aiotikus stresszorok nem-specifikus hatásaként jelentkező oxidatív stressz. A reaktív oxigénformák elsősoran azokan a redox folyamatokan keletkeznek, ahol az elektrontranszport túl gyors a természetes elektronakceptorként szereplő iológiai molekula reoxidációjához képest (Vranová és mtsai, 22). Ilyenkor megfelelő redoxpotenciálú donor esetén az elektront a molekuláris O 2 is felveheti, ami szuperoxid gyökanion (O 2- ) képződéséhez vezet. A folyamat olyan redox reakciók sorozatát indítja el, ami hidrogén-peroxid (H 2 O 2 ), hidroxil gyök vagy protonáció után hidroperoxil gyök keletkezését eredményezi. A ROS jelentős forrása sóstressz alatt a fotoszintetikus és a mitokondriális elektrontranszportlánc. A fotoszintézis 2. fotokémiai reakcióit követő töltésrekomináció után a triplet állapotú P68 a gerjesztési energiát átadhatja az oxigén molekulának, ami az igen reaktív szinglet oxigén ( 1 O 2 ) keletkezéséhez vezet. A fotoszintetikus elektrontranszport során 2. fotokémiai rendszeren keletkező szinglet oxigén mellett az 1-es fotokémiai rendszer (PSI) is hozzájárul a ROS kialakulásához. A PSI közvetlenül adhat át elektronokat a molekuláris oxigénnek, generálva ezáltal a O 2 -, majd az eől keletkező H 2 O 2 képződését a kloroplasztiszan. A fotoszintetikus elektrontranszport végső elektronakceptora, a NADPH pool túlredukáltságának elkerülésére a C 3 -as növényeken kialakult a fotorespiráció jelensége, amely a még mindig reaktív H 2 O 2 képződéséhez vezet a peroxiszómákan. Más 16

17 Irodalmi áttekintés eseten, így az Araidopsisan a ROS akkumulációja sóstressz alatt a plazmamemránhoz kapcsolt NADPH oxidázok aktiválódásának eredménye (Leshem és mtsai, 27; Sakamoto és mtsai, 28). A memránokat, nukleinsavakat, fehérjéket degradáló és inaktiváló reaktív oxigénformák eltávolítása a sikeres akklimatizáció egyik legfontosa feltétele. A memránlipidek peroxidációját, a proteinek oxidációját, az enzimgátlást valamint a DNS és RNS károsodást okozó, a kioltó mechanizmusokat túllépő oxidatív stressz programozott sejthalálhoz vezet. (A reaktív oxigénformák eltávolításáan szerepet játszó rendszerekről a 2.6 pontan eszélünk részletesen.) A sóstressz akklimatizáció harmadik fontos szakasza a káros anyagcseretermékeket eltávolító, detoxifikáló mechanizmusok aktiválódása. A glutation nemcsak antioxidánsként tölt e fontos szerepet, hanem a detoxifikáló mechanizmusoknak is meghatározó tényezője (Noctor és mtsai, 1998; 22). Jónéhány detoxifikáló enzim GSH-függő, ezek közül legnagyo jelentősége talán a glutation S-transzferázoknak (GST) van. A GST-k aktívak a hericid detoxifikációan és szintén fontos tényezők a transzgénikus dohány növények chilling és sóstressz toleranciájáan (Roxas és mtsai, 1997; Basantani és Srivastava, 27). Az apoptózis szaályozóiként is működhetnek (Kampranis és mtsai, 2). A GST-k elektrofil szusztrátokhoz GSH-t kötnek, majd a glutationált metaolitot az ún. ATP-kötő kazettával rendelkező ABC transzporterek a vakuóluma szállítják. A GST-k ilyen módon központi szerepet töltenek e a xenoiotikumok detoxifikálásáan, természetes szusztrátjaik közül az auxinokat, citokinineket és az antociánokat kell megemlíteni (Edwards és mtsai, 25). Az antocianinok nem-enzimatikus szusztrátjai a GST-knek, és miután kötődnek az enzimekkel, a vakuóluma transzportálódnak (Mueller és mtsai, 2). Ezeknek a vízoldékony antioxidánsoknak a mennyisége szintén megnőtt sóstressz esetén paradicsom növényeken (Eryilmaz, 26), és akkumulációjukat izonyítottuk SA előkezelés hatására és az ezt követő sóstressz alatt a Rio Fuego paradicsom fajtáan is (Szepesi és mtsai, 28). Az antocianinok nemcsak hatékony ROS-kioltók, de felülszaályozzák a phi-típusú GST-ket a humán retinális pigment epiteliális sejt kultúrákan (Milury és mtsai, 27). In vitro szignifikánsan gátoltak egy GST izoenzimet, amit rozs növényől tisztítottak (Zachariah és mtsai, 2), így modulálhatják a GST-k aktivitását. Néhány GST gén, pl. a GST6, Araidopsisan is szaályozódik SA vagy H 2 O 2 által. A GST6 promótere tartalmaz egy 2 pnyi oktopin szintáz (ocs) elemet, ami kötőhelye a 17

18 Irodalmi áttekintés ZIP fehérjéknek, de válaszol a H 2 O 2 -ra is, így a GST6 promótere indukálódik gyökereken SA és H 2 O 2 által (Chen és Singh, 1999). Néhány GST izoenzim és az antocianinok szintézise is indukálható H 2 O 2 -dal (Lois, 1994). A stressz hatására indukálódó izoenzimeknek szerepük lehet a citotoxikus alkenálok konjugálásáan. Ezek a vegyületek, mint például a 4-hidroxinonenál, a memránok oxidatív destrukciója következtéen keletkeznek, rendkívül toxikusak, és a GST-k egy csoportja (phi- GST-k) képes a detoxifikálásukra pl. Sorghuman (Gronwald és Plaisance, 1998). GSH-val működnek az aktívan lélegző növényi sejteken keletkező formaldehid és a metilglioxál detoxifikálásáan szereplő enzimek, a formaldehid dehidrogenáz illetve a glioxaláz I, valamint a citotoxikus hidroperoxidokat, töek közt zsírsav hidroperoxidokat GSH-val alkohollá redukáló glutation peroxidázok is (Dixon és mtsai, 1998). Detoxifikációs funkciót etölthetnek az aldoketo-reduktázok is, amelyek egyik nem túl régen izonyított funkciója, hogy redukálják a lipidperoxidáció mérgező termékeként keletkező aldehideket, így a 4-hidroxinonenált (Oerschall és mtsai, 2). A sikeres akklimatizációan fontos szerepe van a stresszor hatására indukálódó génexpressziós változásoknak, amelyeket különöző stresszhormonok szintézisének fokozódása is közvetíthet. Ezek közül az egyik legfontosa az aszcizinsav (ABS). Ha az akklimatizáció sikeres, új steady state egyensúlyok mellett a növény növekedni kezd a stresszor jelenlétéen, illetve a stresszor hatásának megszűnte után helyreállítja metaolikus folyamatait és növekedését Az aszcizinsav, mint általános stresszhormon Az aszcizinsav ioszintézis szaályozása aiotikus stresszorok által A környezeti hatásokra a növények részen a génexpressziós mintázatuk megváltoztatásával válaszolnak, mely végső soron sejt-, illetve növényszintű adaptív válaszokhoz vezet. Az aiotikus stresszhatásokra, az ionos és nem ionos ozmotikus stresszre, illetve a szárazság következményeként szintetizálódó ABS fontos szaályozója a gyors és a hosszútávú válaszreakcióknak. Az ABS leggyorsaan kialakuló hatása a sztómák záródása, amit a talaj 18

19 Irodalmi áttekintés víztartalmának továi csökkenésével a hajtásnövekedés gátlása követ (Wilkinson és Davies, 22). A talajan kialakuló szárazság vagy a sóstressz hatására először a gyökéren fokozódik az ABS szintézis és emelkedik meg az ABS koncentráció. Ezt követi a hormon transzportja a xilémen keresztül a hajtása, ahol sztómazáródást indukál. A szárazságstressz alatt a sztómazárósejtek tehát elsősoran a zárósejt apoplasztjáan kialakuló ABS koncentrációra reagálnak, ami nem feltétlenül mutat közvetlen korrelációt a levelek endogén ABS tartalmával (Correira és Pereira, 1995). Az erőse vízhiány a levél ABS szintézisét is fokozza (Wilkinson és Davies, 22), az aszcizinaldehid oxidáz (AAO3) és a MoCo szulfuriláz (ABA3) gének expressziója dehidrációra és magának az aszcizinsavnak a hatására is indukálódik a leveleken (Xiong és mtsai, 21). Az ABS a növényeken a C4-es karotinoidokól képződik, és szintézisének kezdeti lépései a kloroplasztiszhoz (gyökéren a plasztiszhoz) kötődnek. A β-karotin hidroxilálódás útján zeaxantinná alakul, amely két lépésen, anteraxantinon keresztül violaxantinná epoxidálódik. A reakciót a zeaxantin epoxidáz (ZEP) enzim katalizálja, amely a kloroplasztisz sztrómájáan található. A fenti reakciósornak a xantofill-ciklus részeként fontos szerepe van a kloroplasztiszan a fölösleges fényenergia disszipálódásáan is (Eskling és mtsai, 1997). Az ABS közvetlen prekurzora az all-transz-violaxantinól vagy az all-transz-neoxantinól keletkező 9-cisz-violaxantin és a 9 -cisz-neoxantin, amit a 9-cisz-epoxikarotinoid dioxigenáz (NCED) izomerizációval xantoxinná, az aszcizinaldehid előanyagává alakít. Az ABS tö lépésen közvetlenül az aszcizinaldehid oxidációjával alakul aszcizinsavvá, ezt a reakciót az aszcizinaldehid oxidáz (AAO) katalizálja. Az AAO molidén kofaktor (MoCo)-tartalmú hidroxiláz, amelyet multigén család kódol, és az enzim töféle szusztrátot elfogadva töféle fiziológiai folyamatan szerepelhet (Mendel és Hänsch, 22). A paradicsom (Solanum lycopersicum Mill. L.) flacca nevű mutánsa ABS deficiens, és a mutáció az AAO enzim Mo-kofaktorát szulfuriláló MoCo-szulfuriláz (MCSU) aktivitását érinti (Sagi és mtsai, 1999). Sagi és mtsai (1999) a paradicsom levélen kettő, gyökéren négy izoenzim jelenlétét detektálták aldehid oxidáz (AO) aktivitásgélen, indol-3-aldehid szusztráttal. Megállapították, hogy a sztómazáródást nem mutató, ezért állandóan hervadt fenotípusú flacca mutánsan az ABS tartalom minimális. A hormon hiányát az aktivitás gélen a gyökéről és a hajtásól is hiányzó legkise moilitású fő sáv, az ún. AO1 aktivitásának hiánya okozza. Immunolottal a fő sáv három fehérjére ontható. Az AO1 aktivitás tehát közvetlenül 19

20 Irodalmi áttekintés meghatározta a szövetek ABS tartalmát. Min és mtsai (2) három feltételezett funkcionális AO gént klónozott (TAO1, TAO2 és TAO3) paradicsomól, és vizsgálták a gének szövetspecifikus expresszióját, amely jó összhangan volt az aktivitás gélen kapott eredményekkel. NaCl hozzáadása a gyökérközeghez indukált egy gyors, átmeneti és szövetspecifikus emelkedést az árpa növények leveleinek ABS tartalmáan, de ez 24 óra múlva a kezeletlen szintre csökkent (Fricke és mtsai, 26). Meg kell jegyeznünk, hogy az AO izoenzimek elnevezése között van némi konfúzió. Az Araidopsis aa3 mutánsa ABS deficiens. Az Araidopsisan ez a mutáció az AO aktivitáshoz szükséges S-ligand eépülését katalizáló MoCo szulfuriláz enzim mutációját jelenti (Schwartz és mtsai, 1997). A lúdfűen az ABA3 gén által kódolt fehérjét AAO3-nak nevezik. Az Araidopsisan található négy aldehid oxidáz gén (AAO1-4) közül az AAO3 kódolja az aszcizinaldehidet ABS-sé alakító izoenzimet (Sekimoto és mtsai, 1998; Seo és mtsai, 2). Az AAO3 homodimer fehérje natív gélen az izoformák közül a legkise moilitású. Az AAO3 homodimer és az AAO3/AAO2 heterodimer fehérje, amely a második legkise moilitású sáv, elfogadja az aszcizinaldehidet szusztrátként, míg az AAO2/AAO2 homodimer nem (Koiwai, és mtsai, 24). A ZEP, az NCED és az AAO által katalizált reakciók az ABS ioszintézis regulációs pontjai. A ZEP és az NCED gének expresszióját növeli az ozmotikus, a só- és a szárazság stressz. Az Araidopsis-an a ZEP, a MCSU és AAO3 gének expresszióját pedig az elői stresszorokon túl maga az ABS is fokozza (Xiong és mtsai, 22; Yesergenova és mtsai, 25, Ma és mtsai, 26). Emelkedett AAO aktivitás szintén megfigyelhető sóstressznek kitett orsó növények leveleien és gyökeréen (Zdunek-Zastocka, 28). Ennek alapján az ABS ioszintéziséen az ozmotikus stressz komponenst is tartalmazó stresszhatásokra egy pozitív visszacsatolásos modell alakítható ki, amely szerint az NCED enzim ozmotikus stressz hatására történő aktiválódása mérsékelt ABS koncentrációnövekedést eredményez. Ez azután a ZEP és AAO aktiválásával gyors és erőteljes hormon koncentrációnövekedéshez vezet, mint ahogyan ez a fiziológiai kísérleteken tapasztalható. Az ABS kiemelt szerepet tölt e a sóstressz jelátvitelen, és számos sóreszponzív gén erősen indukálódik ABS hatására. Szaályozó géneket és jelátviteli komponenseket kódoló géneket (pl. DREB2A, MYB és NAC gének) vagy a celluláris védelemen résztvevő géneket (LEA gének vízmegkötő, ionkötő vagy chaperon funkciókkal) azonosítottak az ABS-függő vagy ABS 2

21 Irodalmi áttekintés által indukált korai válasz gének között (Fujita és mtsai, 26). Az S-adenozil-metionin dekaroxiláz, ami egy lényeges enzime a poliaminok (spermidin, Spd; spermin, Spm) ioszintézisének, sókezelés hatására indukálódott paradicsom növények gyökeréen (Ouyang és mtsai, 27). Továá, az arginin dekaroxiláz és spermidin szintáz (Zmspd 1,2), a poliaminok szintézisének továi kulcsenzimei is transzkripcionális szinten, ABS által szaályozódnak (Jiménez-Bremont és mtsai, 27). A poliamin akkumuláció a növények adaptív válaszának tekinthető sóstresszt követően. Mint polikationok, a poliaminok képesek kötődni olyan anionokhoz, mint a DNS, RNS, a foszfolipidek negatív töltései, stailizálva ezeket a makromolekulákat és a memránokat A xantofill ciklus valamint az ABS ioszintézis és jelátvitel kapcsolata A fotoszintetikus apparátusan hatékony megoldások alakultak ki a fotoszintetikus folyamatok által nem hasznosuló fényenergia tölet eltávolítására. Erre azért van szükség, mert nagy fényintenzitáson vagy az aiotikus stresszorok hatásaként a fotoszintetikus elektrontranszport lánc túlredukáltsága következtéen az elektron a molekuláris O 2 -re adódhat, amely a koráiakan leírtak szerint ROS generálásával oxidatív stresszt vált ki. A növényt érő fényenergia feleslege tehát destruktív folyamatokhoz vezet, amit fotoinhiiciónak nevezünk. Az excitált klorofill-a által elnyelt fényenergia leadódhat fluoreszcens fény- és hőkiocsájtás formájáan és felhasználódhat a fotokémiai reakciókan. Mindkét utói csökkenti a fluoreszcenciát. A fluoreszcencia kioltásának fotokémiai (qp) vagy nem fotokémiai, hődissszipációs útja (qn vagy NPQ), és ezek egymáshoz viszonyított aránya információt szolgáltat a fotoszintetikus apparátus működésének hatékonyságáról. Az aszoreált fényenergia leadásának egyik legfontosa részét jelenti a hő formájáan történő energiadisszipáció. Az egyik védelmi lehetőség a két fotokémiai rendszer közötti energiaeloszlás szaályozása, ez úgy valósul meg, hogy a 2-es fotokémiai rendszer fényegyűjtő komplexe (LHCII) foszforilációt követően a PSI-hez kapcsolódik. A gerjesztési energia nem fotokémiai kioltásához a fény ekapcsolása után a sztróma és a lumen közötti ph grádiens kialakulása is hozzájárul. 21

22 Irodalmi áttekintés A keletkező szaad gyökök és redukált oxigénformák kioltását a kloroplasztisz nem enzimatikus antioxidáns rendszerei, a tokoferol, aszkorinsav, karotinoidok végezhetik, de fontos szerepe van a ROS kioltásan a 2.6. pontan részlezett enzimatikus rendszereknek is. A karotinoidok azonan speciális védőfunkcióval is rendelkeznek, amelyet a xantofill ciklus tesz lehetővé. A fény ekapcsolása után a lumen ph-jának csökkenése aktiválja az elsősoran az LHCII-höz kötődő xantofillok interkonverzióját. Ezt a folyamatot a magasarendű növényeken a lumenen lokalizálódó, redukált aszkorinsav koenzimmel működő violaxantin de-epoxidáz enzim katalizálja. Az enzimet az alacsony, 5,2-es ph aktiválja, aminek következtéen kapcsolódik a tilakoid memránhoz (Eskling és mtsai, 1997) és kétlépéses reakcióan a violaxantint (V) anteraxantinon (A) keresztül zeaxantinná (Z) alakítja (Büch és mtsai, 1994; Hager és Holocher, 1994; Pfündel és Bilger, 1994). 2. ára. Az aszcizinsav (ABA) ioszintézis regulációja a fotoszintézis által. A violaxantin de-epoxidázt (VDE) aktiválja a tilakoid lumen savanyodása és a redukált, protonált aszkorinsav (AscH) jelenléte, míg a zeaxantin epoxidáz (ZE) NADPH-t igényel. Fotooxidációs feltételek mellett a redukált aszkorát a ROS kioltó folyamatokan is elhasználódik és dehidroaszkoráttá (DHA) alakul. A violaxantinól (neoxantinól) izomerizáció után a 9-ciszepoxikarotinoid dioxigenáz (NCED) xantoxint, az ABS ioszintézis intermedierjét hozza létre. Az ABS reaktív oxigénformák, mint jelátviteli komponensek közvetítésével génexpressziót indukál (Baier és Dietz, 25). A ciklus zárását a kloroplasztisz sztrómáan található, NADPH-függő zeaxantin epoxidáz (ZEP) teszi lehetővé, amelynek ph optimuma 7,5 körüli értéknél van. A zeaxantin mennyisége jól korrelál a hődisszipáció fokozódásával, egyen tehát jó fluoreszcencia kioltó. A V+A+Z pool 22

23 Irodalmi áttekintés nagysága és a ciklus hatékony működése tehát fontos részét képezi az aiotikus stresszorokhoz való akklimatizációs folyamatoknak. A violaxantin de-epoxidáz enzim működéséhez szükség van a dehidroaszkorát pool folyamatos visszaredukálódására és a redukált aszkorát lumene irányuló transzportjára, ennek hiányáan a ciklus szétkapcsolttá válik (Baier és Dietz, 25). A violaxantin akkumulációja serkenti az aszcizinsav szintézist. Az aszkorinsav ioszintézis mutánsokan, amelyek a vad típus aszkorinsav tartalmának csupán 3 %-ával rendelkeznek, az NCED expressziójával párhuzamosan az endogén ABS tartalom is megemelkedik (Pastori és mtsai, 23). A fotoszintetikus elektrontranszporttól függő ABS ioszintézis mellett az ABS jelátvitel is redox-regulált (Meinhard és Grill, 21). Az ABS viszont megnöveli jóhéhány antioxidáns enzim, így az aszkorát peroxidáz 2 (APX2) (Cheong és mtsai, 22; Chang és mtsai, 24) és a kloroplasztiszan lokalizált glutation peroxidáz (GPX1) (Milla és mtsai, 23) expresszióját A prolin, mint kompatiilis ozmotikum hatásai A prolin (Pro) az egyik leggyakraan előforduló ozmolit, amely felhalmozódik aktériumokan, moszatokan, gerinctelen állatokan és növényeken is víz-, illetve sóstressz során. Sótoleráns növényeken élesen megnő a Pro szintje. A Pro ioszintézise glutaminól vagy ornitinől történik, de az endogén Pro szintet a kataolizmus seessége is meghatározza. A glutaminsavól történő Pro ioszintézis seességmeghatározó enzime a Δ 1 -pirrolin-5-karoxilát szintetáz (P5CS), amelynek expresszióját (P5CS1) Araidopsisan fokozza a só- és ozmotikus stressz (Székely és mtsai, 28). A Pro védi a memránokat és fehérjéket a magas inorganikus sókoncentráció és az extrém hőmérsékleti értékek károsító hatásaival szemen, szaályozza a citoszolikus ph-t és hidroxil gyök kioltóként is működik (Matysik és mtsai, 22). A glutaminsavól kiinduló Pro ioszintézis során a P5CS NADPH-t fogyaszt, a keletkező Pro azonan visszaalakulhat P5C-vá. A megfelelő lépést katalizáló Pro dehidrogenáz NADP + -t használ, így szaályozza a redox töltést, azaz a NADP + /NADPH redox rendszer redukáltsági állapotát, aminek fontos szerepe lehet az anyagcsere szaályozásáan (Delauney and Verma 1993). 23

24 Irodalmi áttekintés Lehetséges, hogy a Pro aszolút mennyiségénél fontosa a ioszintézis és leontás körforgása a környezeti stresszhatásokhoz való adaptálódásan, mivel ez is hozzájárul a NADP + szint fenntartásához. A töi ozmolithoz hasonlóan a stresszhatás megszűnését követően a Pro leontása is szén-, nitrogén- és energiaforrásul szolgálhat a növekedés helyreállításához (Lea, 1993). A sótoleranciára való nemesítés során a szerves ozmotikumok, így a Pro szintézisének géntechnológiai úton való fokozása csak korlátozott eredményekkel kecsegtet. Egyetlen ozmoprotektív vegyület fokozott és állandó szintézise a növény sótoleranciáját nem feltétlenül növeli, sőt, ellenállóképességét csökkentheti az erőforrásoknak más vegyületek szintézisétől való elirányítása miatt. Valószínűnek látszik, hogy a sótolerancia az ozmoprotektív vegyületek szintézisének közvetlen fokozása révén nem növelhető, vagy az ily módon létrehozott fajták és változatok szaadföldi környezeten nem nevelhetők (Deuschle és mtsai, 21). A SA is növelte a Pro akkumulációt a normál vagy sóstresszelt úza növényeken (Shakirova és mtsai, 23) Szalicilsav fiziológiai hatásai növényeken A szalicilsav (SA, o-hidroxienzoesav) elsősoran a iotikus stresszorok hatására a magasarendű növényeken kialakuló ún. hiperszenzitív reakcióan szereplő jelátviteli komponensként volt ismeretes (Raskin, 1992). Mikróák is képesek a szintézisére. A Mycoacterium smegmatitis 3,6 mg (g száraz tömeg ) -1 nap -1 mennyiségen szintetizálja a SA-t (Hudson és Bentley, 197). A termesztett növények rhizoszférájáan található mikroorganizmusok is szintetizálnak SA-t, és megtalálható a növények gyökérzetének exudátumáan is (Chou és Patrick, 1976). A kukorica és a mungó a rhizoszférájáan 31 és 141 µg SA-t találtak 1 g száraz talajan (Pareek és Gaur, 1973). Allelopatikus anyagoknak nevezzük azokat a mikroorganizmusok vagy a növények által a gyökérközege kiválasztott vegyületeket, amelyek a szomszédos növények növekedését gátolják. Mivel a szalicilsav és más enzoesav származékok erőteljesen efolyásolják más növények növekedését, allelopatikus anyagnak tekinthetők. A növekedésgátló hatást részen annak tulajdonították, hogy a SA hat a növények vízháztartására. A szalicilsav kezelés a hajtás és gyökér növekedésének gátlását okozta, csökkentette a hajtás száraz tömeget különöző fajokan, és gátolta az aktív ionfelvételt (Harper és Balke, 1981). Exogén szalicilsavval kezelt szója 24

25 Irodalmi áttekintés növények a kontrollnál alacsonya vízpotenciált és kise sztómakonduktanciát mutattak (Barkosky és Einhellig, 1993). A SA növekedésgátlást és sztómazáródást okozott lóaan (Manthe és mtsai, 1992), gátolta a plazmamemránan lokalizálódó H + -ATP-áz aktivitását (Bourouloux és mtsai, 1998) és a K +, Mg 2+, Cl - valamint SO 2-4 felvételét (Baziramakenga és mtsai, 1994). Vita van azonan aan a vonatkozásan, hogy a szalicilsav milyen fiziológiai folyamatok gátlásával éri el az allelopatikus a hatást. Az egyik elképzelés szerint ez a jelenség a SA sztómaregulációra és ezen keresztül a szomszédos növény vízháztartására gyakorolt hatásának a következménye (Barkosky és Einhellig, 1993), míg más elképzelés szerint a sztómazáródást sokkal kise SA koncentrációk kiváltják, mint amelyek szignifikánsan gátolják a növekedést (Manthe és mtsai, 1992). A vízháztartás mellett a SA hat a fotoszintézisre is. Árpáan 1 µm-os SA kezelés csökkentette a levél növekedését, a klorofill- és fehérjetartalmakat, a fotoszintézis maximális seességét és a riulóz-1,5-iszfoszfát karoxiláz-oxigenáz (Ruisco) aktivitását (Pancheva és mtsai, 1996). Ezzel ellentéten a SA úzáan fokozta a fotoszintetikus elektrontranszportot (Sahu és mtsai, 22), és előkezelésen alkalmazva feloldotta a fotoszintézisgátló hericid, a paraquat által indukált gátlást a széndioxid fixációra (Ananieva és mtsai, 22). Az exogén SA kezelés fokozta a CO 2 fixálás seességét, a Ruisco és a foszfoenol-piroszőlősav karoxiláz enzim aktivitását Cd stressz alatt kukoricáan (Krantev és mtsai, 28) és orsóan (Popova és mtsai, 28). Fontos szerepe van a szalicilsavnak az oxidatív stresszel kapcsolatos folyamatokan. Az egyik első enzim, amelyről izonyították a SA gátló hatását, a H 2 O 2 -t ontó kataláz volt (Chen és mtsai, 1993; Dat és mtsai, 1998), ár késő kiderült, hogy ez a gátlás csak egyes izoenzimek esetéen érvényesül (Horváth és mtsai, 22). Részen a SA katalázt gátló hatásával magyarázták a H 2 O 2 -t szintjének megemelkedését és az oxidatív stresszt indukáló hatást, amely a iotikus stresszfolyamatokan a hiperszenzitív reakcióhoz vezet. A H 2 O 2 koncentrációjának megnövekedéséhez Araidopsisan a SOD aktivitás fokozódása is hozzájárul, míg ugyaneen a növényen a SA az ugyancsak H 2 O 2 -t ontó aszkorát peroxidázt (APX) gátolta a hajtásan (Rao és mtsai, 1997). Az 1 mm SA megemelte a szuperoxidgyök generáló enzim, a NADPH oxidáz aktivitását úza növényeken (Agarwal és mtsai, 25). Részen a szuletális oxidatív stressz generálásával, és ennek következtéen a redoxregulált, antioxidáns enzimek expressziójának fokozásával hozzák összefüggése a SA-nak azon 25