Szent István Egyetem

Átírás

1 Szent István Egyetem AZ IVARÉRÉS IDEJÉT MEGHATÁROZÓ QTL EK GENETIKAI TÉRKÉPEZÉSE TYÚKBAN Doktori értekezés tézisei Szabó Gyula MBK Gödöllő 2004

2 A doktori iskola Neve: Állattenyésztés tudományi Doktori Iskola Tudományága: Mezőgazdaságtudomány Vezetője: Dr. Horváth László tanszékvezető egyetemi tanár az MTA doktora Szent István Egyetem, Mezőgazdaság és Környezettudományi kar, Halgazdálkodási Tanszék Témavezető: Dr. Varga László tudományos főmunkatárs, Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont, Géntérképezés állatokon csoport A programvezető aláírása A témavezető aláírása

3 1. A munka előzményei, a kitűzött célok A genetika és molekuláris genetika fejlődésével számos olyan módszer és technika alakult ki, melyek segítségével megismerhetjük a tulajdonságok kialakításáért felelős géneket, megtudhatjuk mi az a DNS által hordozott információban létrejött változás, ami hat a tulajdonság kialakulására. A korszerű genetikai markerek megjelenésével a genetikai térképezésben is kialakultak olyan technikák, melyek igen hatékony eszközt jelentenek a tulajdonságok hátterének felderítésében. Amennyiben már feltérképeztük egy gén helyét, a hozzá két oldalról legközelebb levő markergének felhasználhatók a MAS ban (Marker Assisted Selection = markerek segítségével végzett szelekció). Ezzel a technikával a markergéneken kimutatott genotípusokkal ellenőrízhetjük, mely utódok örökölték a legkedvezőbb allélkombinációt. Ezáltal célzottabban van lehetőségünk egyes tulajdonságok öröklődésének ellenőrzésére és ennek alapján ezeket az állatokat akár még a fenotípus kifejlődése előtt is előszelektálni tudjuk. Ezeket a hatékony technikákat akarták alkalmazni a klasszikus tenyésztési munka sikeres folytatása mellett a Bábolna TETRA SL tojóhibrid tenyésztői is. A tenyésztési és a genetikai paramétereket figyelembe véve az ivarérés ideje az a tulajdonság, melyen keresztül a leghatékonyabban emelhető a Bábolna TETRA SL tojástermelőképessége molekuláris genetikai módszerek segítségével. Ennek a célnak az eléréséhez ki kellett, hogy alakítsak egy olyan módszert, amely alkalmazkodik a kétvonalas tojóhibrid tenyésztés gyakorlati adottságaihoz, alkalmassá teszi a reciprok rekurrens szelekcióban kialakított tesztkeresztezések állományait a genetikai térképezésre. Először az alkalmazandó módszer elemeit egy kész kísérleti elrendezésben kellett megvalósítanom. Csoportunk egy fontos kutatási témájában, az egéren végzett genetikai térképezésben nyílt lehetőség arra, hogy a módszer elemeit kipróbálhassam. Ebben a munkában egy célzottan kialakított F2 térképezési populáció egyedein sikerült megvalósítani a genetikai térképezés hatékonyságát növelő technikákat, és tesztelni a 1

4 módszerek alkalmazhatóságát. Második lépésben a módszereket a gyakorlatból származó, daughter design elrendezésű TETRA SL keresztezési állomány igényeihez kellett igazítsam. Az alkalmazandó technikákkal olyan mértékben lehet növelni a termelésből származó állományokon végzett genetikai térképezés hatásfokát, hogy nincs szükség speciális keresztezési álomány előállítására ahhoz, hogy a QTL ek pozícióját felderítsem. Az alapvető célkitűzésem eléréséhez a következő feladatokat kell elvégezni. Térképezési populáció meghatározása a TETRA SL állománynál: A reciprok rekurrens nemesítés tesztpopulációjából ki kell választanom azokat a családokat, melyeken a genetikai térképezési munka a leghatékonyabban elvégezhető. DNS izolálás: Gyors, olcsó és a lehető legkevesebb káros anyagot igénylő DNS preparálási módszert kell ki dolgoznom, melyel megfelelő mennyiségű és minőségű DNS izolálható. Hatékonyság növelése szelektív genotípus meghatározással, DNS poollal az F2 kísérleti elrendezésben A térképezési állomány méretéhez képest meg kell határozni a vizsgálandó egyedek számát. Ezeknek a csoportoknak a mintáiból kell kialakítanom azokat a kevert DNS mintákat, más néven poolokat, melyeken a vizsgálatokat el tudom végezni. Szelektív DNS pool technika részleteinek kidolgozása a TETRA SL állományra A vizsgálatokra alkalmas családok egyedei közül kell kiválasztanom azokat, melyek a genetikai térképezés szempontjából a legtöbb információt hordozzák. Ezeknek az egyedeknek a DNS eiből hozom létre a kevert mintákat. Genetikai térkép szerkesztése: A tyúkról ismert legtöbb információt összesítő, átfadés mentes genetikai térképet kell szerkesztenem. Markerháló kialakítása: Ahhoz, hogy a QTL ek pozícióját biztonságosan meg tudjam határozni, 2

5 kell választanom egy olyan markergén szettet, mely megfelelően kis térközökkel, egyenletesen fedi le az alkalmazott genetikai térképet. A kimutatás optimalizálása: A kiválasztott markerek kimutatását úgy kell optimalizálnom, hogy könnyen, hatékonyan, nagy számban vizsgálhatók legyenek. Heterozigóta kakasok kiválasztása a TETRA SL állomány esetében: A családok kakas őseinek genotípusa alapján kell kiválasztanom azokat a családokat a térképezési populációból, melyeknél a heterozigóta kakas ős alléleinek öröklődését megfelelően viszgálni tudom az utódokban. A pool minták vizsgálata: A kevert DNS mintákban kell megbecsülnöm az apai marker allélek gyakoriságát a kimutatást befolyásoló tényezők korrigálása után. Meg kell határozzam a kakasallélek gyakoráságának egyedcsoportok között megfigyelhető különbségét. Az empírikus hiba meghatározása: Meg kell határoznom azt a varianciát, melyet az allélgyakorisági különbségek akkor is mutatnának, ha nem befolyásolná őket egy genetikailag kapcsoltan öröklődő QTL, az értéküket csak a véletlen alakítaná. Hipotézisvizsgálatok: A vizsgálatok különböző szintjein meg kell fogalmaznom azokat az alapfeltételezéseket melyek teljesülését statisztikai próbákkal igazolom. Meg kell határoznom a statisztikailag igazolható eredmények csoportját. A valós eredmények becslése: Meg kell becsülnöm azoknak a valós eredményeknek a számát, melyek egy feltételzett QTL el való genetikai kapcsoltságra utalnak. FDR számítás: Meg kell határozzam azt a téves elfogadási arányt, melyet még elviselhetőnek tartok. Meg kell határoznom a téves eredmények mértékét az elfogadhatónak itélt adatok között. A kimutatás erejének meghatározása: A becsült valós eredmények számát össze kell vetnem az adott FDR szintig elfogadott eredmények között becsült valós eredmények számával. Ez az arány a kísérlet ereje, mely megmutatja, hogy mennyi 3

6 valós eredményt tudok kimutatni a becsült lehetőségekhez képest. 2. Anyag és módszer Először a Compact egér genetikai térképezésére kialakított állományán használtam a szelektív genotípus meghatározás és a kevert DNS módszereit [VARGA és mtsai, 1997], [SZABO és mtsai, 1998]. Ezen az állományon teszteltem a módszer alkalmazhatóságát, hatékonyságát. Ebben a rendszerben a pool mintákon kapott eredmények csak egy előszűrést jelentettek a markerlókuszok között. A poolba tartozó egyedek egyedi genotípus meghatározása igazolta és támasztotta alá a pool eredményeket és ezekből kaptuk magát a végeredményt is. Az egyedi adatok tették lehetővé a fenotípusra hatással levő feltételezett Cmpt gén genetikai pozíciójának meghatározását. A TETRA SL állományon végzett genetikai térképezésben hasznosítottam az előző állományon kapott tapasztalatokat. Ebben az esetben maguk a pool eredmények azok, melyekből végkövetkeztetéseket vonunk le, ezért ezeket az adatokat jóval összetettebb számítási módszerekkel jellemeztük, igazoltuk A keresztezés egyedei, vérminták, egyedi és kevert DNS minták Az egér keresztezés ~8200 egyedet számláló F2 nemzedékén határoztam meg a vizsgálatra alkalmas csoportokat. A vizsgált fenotípust leginkább és legkevésbé mutató egyed mintájából alakítottam ki a kevert DNS mintákat. A TETRA SL állomány esetében a genetikai térképezést az apai vonalból származó egyes kakasok F1 lányain végeztem, melyek együtt ~ vérmintát jelentenek. A vizsgálatokra azokat a családokat választottam ki, melyek utódai között a legnagyobb szórást tapasztaltam a fenotípusos értékek tekintetében. Ezekből a családokból kiválasztottam a 20 leghosszabb (high pool), és 20 legrövidebb (low pool) ivarérési időt mutató egyedek és ezek mintáiból preparálás és hígítás után egyenlő térfogatok hozzáadásával készítettem el a kevert DNS mintákat. A TETRA SL állomány esetében a vérmintákból az általam kidolgozott 4

7 módszerrel DNS t preparáltam. Kidolgoztam egy olyan vérből kiinduló genomiális DNS preparálási technikát, amely az irodalomban leírt két módszert ötvöz, felhasználva mindkettő előnyös elemeit [MILLER és mtsai, 1988] [LAHIRI és NURNBERGER, 1991]. 5 l jó minőségű, nem alvadt vér sejtes elemeinek lizálása (10 mm TrisHCl, 10 mm EDTA ph: 7,5; 10 perc; RT) után a sejtmagokat centrifugálással (~10000g, 3 perc) elkülönítettem a keletkezett sejttörmeléktől, majd a sejtmagokat is feltártam és Proteinase K kezeléssel emésztettem a DNS mellett jelenlevő fehérjéket (125,0 mm Tris ph:7,5; 62,25 mm KCl; 62,25 mm MgCl 2 ; 6,225 mm NaCl; 2,5 mm EDTA; 0,6% SDS; 15 g/ml ProtK; 1 óra; 55 C). A feltárt DNS t 1/20 térfogatnyi 7,5 M ammónium acetát és 1/2 térfogatnyi túltelített konyhasó (5 6 M NaCl) oldattal és 1 térfogatnyi izopropanollal precipitáltam. A kicsapódott DNS t centrifugálással (~10000g, 3 perc) ülepítettem, majd 1 térfogatnyi 70% ot etanollal végzett öblítés után beszárítottam és a pelletet 100 l térfogatba oldottam vissza. A DNS tisztaságát és mennyiségét fotometriás eljárással állapítottam meg 280 és 260 nm hullámhosszon. A mintákat egységesen 0,05 g/ l koncentrációra hígítottam és a kevert DNS minták kialakításához illetve a PCR reakciókba közvetlenül ezeket használtam A vizsgálatokhoz felhasznált genetikai térképek, mikroszatellitek Az egérnek a munkánk kezdetekor is egységes és fejlett genetikai térképe volt, mely nagyszámú már feltérképezett mikroszatellit lókusz információit tartalmazta. Nem okozott tehát nagy gondot annak az 56 mikroszatellitnek a kiválasztása, melyek a keresztezési állományon informatívak voltak és a termékeik megfeleltek az alkalmazott elválsztási és kimutatási technika adottságaihoz. Nem volt ennyire egyszerű a helyzet a tyúk esetében. Munkánk megkezdésekor a világ három nagy baromfi géntérképező csoportja (Wageningen, Hollandia [CROOIJMANS és mtsai, 1996], [GROBET és mtsai, 1998]; East Lansing (ELMAP) [CRITTENDEN és mtsai, 1993], USA; Compton, Nagy Britannia [BUMSTEAD és PALYGA, 1992]) által készített géntérképek számos helyen különböztek egymástól a feltérképezett lókuszok és a kimutatott kapcsoltsági csoportok számában, 5

8 helyzetében. Kellet tehát készítenem egy, az információkat összesítő genetikai térképet. A vizsgálandó régiók kiválasztásakor az ELMAP ból indultam ki, mivel ez tartalmazta a legtöbb információt. Az összes olyan területen választottam mikroszatellit markert, melyeken legalább az egyik térkép információt közölt úgy, hogy a markerek közötti távolság kb. 30 cm legyen. Vizsgálataimhoz a National Animal Genetic Research Program (NAGRP, USA) által terjesztett mikroszatelliteket használtam [CHENG és CRITTENDEN, 1994], [CROOIJMANS és mtsai, 1997] 2.3. A PCR termékek elválasztása, a kimutatás körülményei A felhasznált mikroszatelliteknél a primerek és a termék szekvenciájából kiindulva számításokkal meghatároztam az optimális feltapadási hőmérsékletet. Ilyen módon egyrészt lehetőségem van arra, hogy a PCR reakció optimális hőmérsékletét kiszámoljam, másrészt előre jelezhetem azt, hogy a számításba vett reakció komponensek arányának megváltoztatásával mennyiben változik az optimális érték. A komponensek változtatásával így egységesítem több marker, eredetileg különböző optimális körülményét, ami megkönnyítette a munkámat. A PCR reakció elegyében felhasznált anyagok végkoncentrációja a következőképpen alakult: 10 ng/ l Templát DNS 1x reakció puffer 200 nm mindkét primer 1 4 mm MgCl 2 a kiszámolt optimális mennyiségtől függően 0,8 mm dntp 0,05 u/ l Taq polimeráz Az egéren végzett poolminták vizsgálatakor a nuklotidok mellé radioaktív foszforral jelölt dctp kevertem a PCR reakcióba, és a termékeket akrilamid gélen választottam el és röntgen film segítségével jelenítettem meg [VARGA és mtsai, 1997]. A tyúkon kimutatott mikroszatellitek esetében a primerek egyike 6

9 floreszcens festékkel van jelölve. A PCR reakció után a termékeket ABI Prism 310 Genetic Analiser kapilláris elektroforézis berendezéssel választottam el, amely a floureszcens festék által emittált sugárzás alapján detektálja a fragmenteket Az allél gyakoriságok meghatározása Az egéren végzett vizsgálatok esetében az elválasztás után képzett radiogramm alapján értékeltem az allélgyakorisági különbségeket a vizsgált csoportok között. A denzitometriás mérések alapján kerestem azt a mikroszatelitet, melynél a legnagyobb volt az adott régióban az allél gyakoriságokban tapasztalt különbség, ezek azok a lókuszok, melyek a legközelebb helyezkednek el a feltételezett QTL hez [VARGA és mtsai, 1997]. A TETRA SL állományon végzett vizsgálatok esetében a kakas allélek gyakoriságának számítási folyamata szintén a PCR reakcióban amplifikálódott mikroszatellit fragmentek mennyiségéből indul ki. Az elvélasztás után a megfelelő fragmenthossznál detektált fluoreszcens festék intenzitás alapján becsülöm meg az allél mennyiségét. A kimutatást befolyásoló hatások korrigálása után határozom meg a kakasnak megfelelő allélek DNS poolokban becsülhető gyakoriságát. A következőkben bemutatott számításkat csak a tyúk állományon kapott adatok elemzésekor alkalmaztam. A PCR során keletkező áltermékek főtermékhez viszonyított relatív intenzitása, a főtermékben meglevő repetitív régió ismétlődésszámával van korrelációban [LIPKIN és mtsai, 1998], [MURRAY és mtsai, 1993]. Az egyes áltermék típusok relatív intenzitását a bennük meglevő ismétlődés számmal összefüggésben miroszatellitenként külön külön vizsgáltam. Az adatpárokra illeszthető regresziós egyenes egyenletét felhasználva kiszámítható minden főtermékhez a hozzá tartozó áltermékek relatív intenzitása még akkor is, ha esetleg nincs az adott mérethez tartozó konkrét kísérleti eredmény. Ezekkel az értékekkel kell korrigálni azoknak a főtermékeknek az intenzitását melyekkel megegyező hosszúságú áltermék is képződött a PCR reakcióban. Másrészt ennek a képletnek a segítségével kiszámíthatom az összes áltermék mennyiségét és ezzel megnövelve a főtermék mennyiségét 7

10 megkapom az ahhoz tartozó összes termék mennyiségét. RI n, i =m n b RI n, i : az n ismétlődést tartalmazó főtermék "i" edik áltermékének relatív intenzitása. n: a főtermékben megfigyelhető ismétlődések száma. i: a főtermék és álterméke közötti ismétlődésszám különbség (lehet: 1; 2; 3). m: az adatpontokra illesztett egyenes meredeksége. b: az egyenes y tengely metszéspontja. 1. Képlet: Az áltermékek adataira illesztett regressziós egyenes egyenlete [LIPKIN és mtsai, 1998]. Az allélok korrigált intenzitásainak ismeretében meg kell határozni a poolon belüli relatív arányukat (F n ). Ezt úgy számíthatom ki, hogy az adott allél korrigált össz intenzitását viszonyítom a reakcióban képződött összes termék korrigált intenzitásához. k F n =CT n / i=1 CT n F n : az allél frekvenciája a poolon belül. CT n : a korrigált intenzitáshoz tartozó összes termék. k: a poolban megfigyelt allélok száma. 2. Képlet: A kakas allél poolon belüli gyakorisága [LIPKIN és mtsai, 1998]. Az előbbi számításokkal meghatároztam, hogy a vizsgálatokban tapasztalt intenzitás mekkora része (F) rendelhető a kakas alléloknak (L: long,hosszú; S:short,rövid) ) megfelelő fragmentekhez az egyes poolokban (H:high; L:low). Ezután kiszámítom a két utódcsoport között tapasztalható gyakoriságok különbségeit. 8

11 D L =F L H F L L D S =F S H F S L D= D L D S 2 D L : Allél frekvencia különbség a hosszabb kakas allél esetében a két pool között D S : Allél frekvencia különbség a rövidebb kakas allél esetében a két pool között D: A frekvencia különbségek átlaga. 3. Képlet: A kakas allél gyakoriságok különbsége [LIPKIN és mtsai, 1998] Az allél gyakoriság külö nbségek standard hibájának meghatározása A stansard hiba számítása három elemből épül fel. Meghatározom a hosszabb (SE 2 D L ) illetve a rövidebb alléloknál (SE 2 D S ) a két pool között megfigyelhető különbségek standard hibáját és ezekből kivonom a két különbség között megfigyelhető kovariancia értékét (CovD L D S ). SE 2 (D): SE 2 (D L ): SE 2 (D S ): CovD L D S : SE 2 D = SE 2 D L SE 2 D S 2 Cov D L D S 4 Az allél különbségek átlagának standard hibája A hosszabb allél közötti különbségek standard hibája A rövidebb allél közötti különbségek standard hibája A hosszabb illetve a rövidebb alél különbségek között megfigyelhető kovariancia 4. Képlet: Az empirikus standard hiba képlete [LIPKIN és mtsai, 1998]. A két allél különbség között megfigyelhető kovarianciát azokon a vizsgálati eredményeken határozom meg, melyek nem mutatnak statisztikailag igazolható kapcsoltságot. A rövidebb allélok között tapasztalt allél differenciák standard hibáját a következő számítással határozom meg. 9

12 SE 2 D S =SE 2 F S(H) SE 2 F S(L) SE 2 (D S ): A rövidebb allél közötti különbségek standard hibája SE 2 (F S(H) ): A rövidebb allél high poolban megfigyelt frekvenciájának standard hibája SE 2 (F S(L) ): A rövidebb allél low poolban megfigyelt frekvenciájának standard hibája 5. Képlet: A kakasnak megfelelő allél gyakoriság két pool közötti különbségének hibája [LIPKIN és mtsai, 1998]. A megfelelő adatok behelyettesítésével a hosszabb allélok közötti különbségekre is kiszámolható ez a hiba (SE 2 (D L )). A poolban megfigyelt allél frekvenciák hibáját a következőképpen határozom meg. V BS(H) : V T : SE 2 F S(H) =V BS(H) V T A rövidebb allél binomiális mintavételezésből származó hibája a high poolban A technikai hiba 6. Képlet: A kakasnak megfelelő allél poolon belüli gyakoriságának hibája [LIPKIN és mtsai, 1998]. A megfelelő adatok behelyettesítésével a hosszabb allélok frekvenciájára is kiszámolható ez a hiba (SE 2 (F L(H) )). Az egyes allél gyakoriságok standard hibája lényegében két komponensből áll össze a binomiális mintavételi hibából, illetve a technikai hibából A binomiális variancia A binomiális eloszlás szabálya segítségével kívánom meghatározni azt a varianciát, mely akkor is megfigyelhető, ha nincs genetikailag kapcsolt QTL a marker mellett, az allél eltérés csak a véletlenből adódik. N (H) : M S : V BS(H) = [0,25 / N (H) M S 1 M S ] 4 Az egyedek száma a high poolban A rövidebb allél becsült gyakorisága a tyúkok között 7. Képlet: A binomiális mintavételezésből származó hiba [LIPKIN és mtsai, 1998]. 10

13 Ennek a hibaelemnek az értéke egyrészt függ a poolba sorolt egyedek számától, másrészt a tyúkoktól örökölt, kakasszerű allélek arányától. Az előbbi adott, míg az utóbbit számítani kell. Amennyiben a poolban megfigyelhető két kakasra jellemző allél gyakoriságának összege meghaladja az összes allél gyakoriság 50% át, akkor a többlet a tyúkoktól kell, hogy származzon. Ez alapján becsülöm a poolban megfigyelhető, tyúkoktól származó, kakasra jellemző allélok gyakorisága (M L ; M S ). M L =F L(H) F L(L) 0,5 ; M S =F S(H) F S(L) 0,5 8. Képlet: A kakasra jellemző allélok becsült gyakorisága a tyúkokon belül [LIPKIN és mtsai, 1998] A technikai hiba Ha nem megfelelően készítjük el a pool mintákat, a bennük szereplő egyedek genotípusai nem egyenlő arányban képviseltetik magukat, ami befolyásolja az allélek poolon belül megfigyelt gyakoriságát. Az egér vizsgálatok esetében a pool vizsgálatok után a kevert DNS minták kialakításakor kiválsztot csoportot egyedileg is megvizsgáltuk adott mikroszatellitekre. A feltételezett QTL egyedi genotípusokból következtetett pozíciója igazolta, pontosította a poolminták eredményeiből következtetet kromoszóma szakaszt. A pool minták megefleleően reprezentálták a csoportokba tartozó egyed genotípusát [SZABO és mtsai, 1998]. A TETRA SL vizsgálatok esetében jóval kisebb, egyedből álló csoprtokból képeztünk poolokat. Mivel így ez egyedek részaránya nagyobb, ezekben az esetekben jóval nagyobb lehet a rossz összekeverésből származó torzító hatás. Több esetben meghatároztam a poolhoz tartozó egyedek markerlókuszon megfigyelt genotípusát egyedileg és az ebből kiszámolt allél gyakoriságokat összevetettem azzal, amit a pool vizsgálatban kaptam. A két érték között megfigyelt különbségből származó variancia lesz a technikai hiba egyik komponense. 280 adatpárt tudtam összevetni az egyedi genotípus és a kevert DNS módszer között. Az adatok között tapasztalt variancia 0,0043 nak adódott. A másik technikai hiba elem, melyet a TETRA SL vizsgálatok esetében határoztam meg az allél gyakoriságot kimutató lépések egységessége, 11

14 ismételhetősége. Ezt a technikai hibaelemet az egyedi vizsgálatok eredményéből becsülöm. Azt feltételeztem, hogy az egyedileg kimutatott kakas allélok arányában megfigyelhető variancia megmutatja a kimutatás hibáját, ez a hiba megjelenhet a pool mintákban megfigyelt allél intenzitások vizsgálatakor is. Összesen ~3000 egyedi genotípus adatból képzett 131 csoportban vizsgáltam a kimutatás ismételhetőségét. A csoportokban megfigyelhető varianciák átlaga 0,0012. A két elemet összeadva a kísérletben a technikai hibából származó variancia 0,0055 nek adódott A kísérleti eredményekkel végzett hipotézisvizsgálatok Az egéren végzett vizsgálatok esetében a markergéneken kapott eredményeket az egyedi genotípusok felhasználásával végzett haplotípus elemzéssel igazoltam, pontosítottam. Ezért a pool eredmények szatisztikai vizsgálatára nem volt szükség. A TETRA SL vizsgálatok esetében azonban a poolmintákon kapott adatokból közvetlenül következtetek a feltételzett QTL helyzetére. Ezekben az esetekben ezért igazolnom kell a kapott eredményeket A kakas marker eredmények statisztikai vizsgálata Statisztikai döntésemben alaphipotézisem, hogy a high és low pool között nincs különbség a kakastól örökölt markerallélok megoszlásában (D=0), az adott markergén nincs kapcsoltságban a tulajdonságot meghatározó QTL el. Alaphipotézisemet elvetem akkor, ha Z D a kísérleti hibával standardizált különbség nagyobb, mint a standard normál eloszlás statisztikai biztonsági szintnél vett értéke. Z D = D SE D Z 1 /2 SE(D): D standard hibája Z 1 α /2 : A standard normál eloszlás ordinátájának az a pontja, ahol az eloszlás és Z 1 α /2 közötti területe egyenlő 1 α/2 vel. α: tévedési valószínűség 9. Képlet: A kakas marker teszteken alkalmazott z próba [LIPKIN és mtsai, 1998]. 12

15 A markereken összesített eredmények statisztikai vizsgálata Egy adott mikroszatelliten kapott Z D értékek négyzetösszegeit, a χ 2 eloszlás α nál vett értékével hasonlítom össze. Alaphipotézisem ebben az esetben is az, hogy az adott mikroszatelliten m kakas összesített eredménye nem mutat kapcsoltságban QTL el és ezt a feltételezésemet elvetem, ha m i=1 Z 2 i D 2, d.f.=m Z D : a próbastatisztika értéke χ 2 α: a Chi eloszlás értéke α nál α: tévedési valószínűség m: a próba szabadságfoka. 10. Képlet: A markereken alkalmazott illeszkedésvizsgálat [LIPKIN és mtsai, 1998] A hipotézis vizsgálatokban kapott eredmények értékelése A valós eredmények számának értékelése Közvetett módon is meg tudom becsülni a kísérletemben meglevő ténylegesen valós eredmények számát. Mivel a valós eredmények QTL hatást mutatnak, ezért a hipotézis vizsgálatok során kiszámolt P értékek nem véletlenszerűen oszlanak el 0 és 1 között, hanem az alacsony P értékek között lesznek. Ezek számának egyszerű kiszámítási módja, ha a 0,5 feletti P értékek számának kétszeresét levonom az összes kísérlet számából, ekkor megkapom az alacsony P tartományban meglevő többletet Az FDR számítása Sok vizsgálatot végezve jelentős lehet a tévesen elvégzett hipotézisvizsgálatok száma. A téves felderítési arány (false discovery rate FDR [WELLER és mtsai, 1998]) segítségével meg tudom becsülni, hogy eredményem hányad része lehet tévesen elvetett hipotézis. Amennyiben eldöntöm, hogy vizsgálatainkban q szinten kívánom meghatározni az eredményeink között a tévesen elvetett hipotézisek számát ekkora FDR értéket kívánok megengedni, akkor keresem a 13

16 növekvő P szerint rendezett sorból azt a legmagasabb i=t sorszámmal rendelkező P (t) értéket, melynél még igaz, hogy q n P t /t 11. Képlet: FDR (false discovery rate). A téves döntések száma az első i vizsgálat között a növekvő sorba rendezett P listából [BENJAMINI és mtsai, 2001] Ez az a pont ahol az első i elvetett hipotézis között még kevesebb mint q téves eredmény van. Mosig és munkatársai szerint abban az esetben, ha a hipotézisvizsgálatok között az elfogadott hipotézisek száma nagy, ez a számítás nem teljesen kielégítő, mivel a téves döntések aránya az összes hipotézis száma alapján van megítélve (np (t) ) [MOSIG és mtsai, 2001]. A kísérletben lesznek olyan eredmények, melyek QTL hatását mutatják, valós eredmények (n 1 ) és lesznek olyanok, melyek nem mutatnak QTL hatást, nem valósak (n 2 ). Mivel a tévesen elfogadott hipotéziseket valójában nem mutatnak QTL hatást, nem valósak ezért pontosabb, ha a téves felderítési arányt a következőképpen határozzuk meg: q n 2 P t /t 12. Képlet: AdjFDR (adjusted false discovery rate). A téves döntések pontosított száma az első i vizsgálat között a növekvő sorba rendezett P listából [MOSIG és mtsai, 2001] A kimutatás ereje Ha öszevetem a közvetett módszerrel becsült valós eredmények számát azoknak az eredményeknek a számával, melyeket az elemzések során igazolhatónak és valósnak tartok, akkor képet kaphatok arról, hogy az elméletileg feltételezetthez képest mennyi eredményt tudok kimutatni, vagyis mekkora a kimutatásom ereje. 14

17 Q=n m /n 1 n m =t n 2 P t Q: A kimutatás ereje n m : Az adott FDR szintig elvetett hipotézisek közül a valós eredmények száma n 1 : Az elvetett hipotézisek becsült száma n 2 : Az elfogadott hipotézisek becsült száma P (t) : A hipotézis vizsgálatokban kapott azon P érték, ahol még igaz a 11. illetve 12. képlet 3. Eredmények 13. Képlet: A kimutatás erejének meghatározása Mivel az egér géntérképezési munka mintegy előkísérlete volt a tyúkállományon tervezett kísérleteknek, ezért az egéren végzett vizsgálatok eredményei nem mutatom be részletesen csak azokat, melyeket hasznosítani tudtam a tyúkon végzett munkában Térképezési populáció kialakítása, szelektív DNS poolozás Az egér vizsgálatok esetében alkalmazott szelektív genotípus meghatározás módszerével ~8200 ról 200 ra csökkentettem a vizsgálandó minták számát. Ezt a mennyiséget is drasztikusan tovább csökkentettem a kevert DNS eljárással, így csak két minta vizsgálatával kellett elvégezni a nagy léptékű genetikai térképezést [VARGA és mtsai, 1997]. A TETRA SL vizsgálatok esetében is alkalmaztam a szelektív DNS pool módszerét azzal a különbséggel, hogy itt a térképezési állomány több független családból áll össze, ezért több DNS poolt is kellett képezni. Meghatároztam annak a 24 kakasnak és a hozzájuk tartozó kb utódnak a szubpopulációját, melyen a legnagyobb hatékonysággal végezhető a tulajdonság hátterének felderítése. A szelektív genotípus meghatározás elméletének megfelelően az egyes családokon belül a 20 legrövidebb és a 20 leghosszabb ivarérést mutató egyedet választottam ki. Ezzel méginkább megnöveltem annak a valószínűségét, hogy a csoportok között az egyedek QTL genotípusa eltér. Sikerült tehát a genetikai térképezés szempontjából legnagyobb gentikai 15

18 információt hordozó utódcsoportokat elkülöníteni és a vizsgálandó egyedek számát 40% ra csökkentenem. Elkészítettem mindkét egyedcsoport DNS pool mintáját, így családonként nem 40 egyedet kell genotipizálnom, hanem csak két mintát kell vizsgálnom és ezeken belül becsülni az apai allélek gyakoriságát. Összességében tehát a szelektív DNS pool módszer alkalmazásáva 100 ról 2 re csökkentettem a családonként vizsgálandó minták számát. Ez a teljes kísérletre vetítve azt jelenti, hogy az elvégzett 671 családvizsgálatnál a több mint genotipizálás helyett csak 1342 pool eredménnyel végeztem el a kapcsoltsági vizsgálatokat DNS izolálás Kidolgoztam egy olyan vérből kiinduló genomiális DNS preparálási technikát, mellyel sikerült a vizsgálatokhoz szükséges nagy mennyiségű vérmintából gyorsan, alacsony költség mellett, jó minőségű genomiális DNS t izolálni. Az 5 l vérből preparált, 100 l végtérfogatú minták átlagos koncentrációja 0,71 g/ l nek, tisztasága pedig 1,74 nek (OD260/280) adódott A genetikai térkép, markerek Sikerült összeállítanom egy olyan konszenzus térképet, amely 44 kapcsoltsági csoportot tartalmazott, és ezek összesen 3824 cm genetikai hosszúságú örökítő anyagot mutattak. Ezeken meghatározható kb. 400 rendelkezésemre álló mikroszatellit marker pozíciója. Az idő közben megjelent Consensus2000 térkép adatai alapján frissített genetikai térkép 26 kromoszómát és 27 kapcsoltsági csoportot foglal magában, összesen 4200 cm genetikai hosszúságot mutat. Kétszáznál is több mikroszatellit markert választottam ki a kísérletek során a genetikai térképen elfoglalt pozíció alapján, amelyekből több mint 160 at vizsgáltam meg a kísérleti populáció kakas egyedein. Összességében 105 mikroszatellit marker lókusszal a legfrissebb Consensus2000 genetikai térkép által mutatott 4200 cm távolságból 3442 cm t tudtam kapcsoltsági vizsgálatokat végezni, mely a teljes genetikai információnak több mint 82 % át lefedi. Ezek között az átlagos genetikai 16

19 távolság 20 cm ami azt jelenti, hogy egy feltételezett QTL lókusz legfeljebb átlagosan 10 cm távolságra lehet egy szomszédos markerlókusztól Egyedi genotípus eredmények a vizsgált marker lókuszokon Az egér kísérletben azokon a lókuszokon végeztem el az egyedi genotípizálást, melyeken a pool vizsgálatok alapján kapcsoltságot tételeztem fel. Az egyedi eredmények itt pontosították, alátámasztották a pool adatokat [VARGA és mtsai, 1997], [SZABO és mtsai, 1998]. Mivel tehát ebben a rendszerben az egyedi genotípus eremények egy további lépést jelentettek és nem a poolokkal végzett genetikai térképezés részei, ezért az ezeket nem részletezem. A TETRA SL állományon megvizsgált 162 mikroszatellit markeren összesen több mint 3000 kakas genotípus eredményem van és ezek között a heterozigóta kakasokon részaránya mikroszatellitenkénti átlagban 0,45 volt. Ez az érték az egyes kakasok esetében 0,33 és 0,53 között volt amiből általánosságban levonható az a következtetés, hogy a kakasokhoz tartozó valamennyi családban hasonló hatékonysággal tudom elvégezni a vizsgálatokat ezeken a markerlókuszokon A markerallélok áltermékei a tyúk vizsgálatok alapján A vizsgálataim során azt tapasztaltam, hogy n 1, n 2, n 3 és nagyon ritkán n 4 hosszúságú (n: az ismétlődések száma a mikroszatellit szekvenciájában) áltermékek képződése mutatható ki. A mikroszatellitek nagyban különböznek egymástól az áltemékeik tekintetében. Kiszámoltam, hogyan viszonyul a n 1, n 2, n 3 valamint n 4 áltermék a főtermék mennyiségéhez a különböző mikroszatellitek esetében, az eltérő mérettartományokban (különböző n esetében). Az így elkészített regressziós egyenesek egyenletét használtam fel a kísérletekből származó alapadatok korrigálására A pool mintákon végzett vizsgálatok Az egér vizsgálatok esetében 56 mikroszatellit markeren végeztük el a pool vizsgálatokat, melyek mindegyik esetben a populációban szegregáló 17

20 két szülői allél egyértelműen meghatározható és elkülöníthető volt [VARGA és mtsai, 1997]. A tyúkon végzett kapcsoltsági vizsgálatokba bevont 109 mikroszatellit markeren összesen 671 vizsgálatot végeztem a kiválasztott családok egyedeiből képzett high és low pool mintákon. Minden esetben egyértelműen meghatározható volt a kakasra jellemző allél. Minden esetben jól elkülönültek a mikroszatellit allélra jellemző fragmentméretek a képződött áltermékektől, a korrekció minden esetben egyértelműen elvégezhető volt. A vizsgálatokban először meghatároztam a pool mintákból kimutatott mikroszatellit allélok főtermékeit. A főtermékeknek megfelelő csúcsok azonosítása után elvégeztem az adott mikroszatellitre jellemző áltermékek miatt szükséges korrekciókat. Megbecsültem a kakastól örökölt markerallélok gyakoriságát a poolmintákon belül. Kiszámoltam a hosszabb és a rövidebb kakas allélnak megfelelő allél gyakoriságok két pool között megfigyelhető különbségét (D L, és D S ). Ennek két értéknek az átlaga lesz a további számításokk alapadata (D) Az empirikus standard hiba meghatározása Az ez után bemutatott számításokat csak a tyúkállományon kapott eredmények esetében végeztem el. Az empirikusan meghatározott standard hiba alapvetően három komponensből áll: a binomiális mintavételezésekből származó varianciából, a technikai hibaelemekből és a D L és D S értékek között megfigyelhető kovariancia értékéből. Utóbbit azokban a vizsgálatokban határoztam meg, melyek nem mutatnak statisztikailag igazolható kapcsoltságot. A vizsgálatok egyharmadánál a tyúkokban becsült kakasszerű két allél gyakorisága 1/3 és 2/3, vagy annál még közelebbi arányt mutatott közelítve az 1/2; 1/2 arányt. Az ebből származó binomiális mintavételi variancia 0,055 és 0,0625 között mozog ezek esetében, ami jelentősnek mondható. Két elem befolyásolja a technikai hiba mértékét a pool vizsgálatokban. Az egyik a poolok összeállításakor fordulhat elő, a másik a poolokban 18

21 meglevő allél gyakorisági különbségek kimutatásának ismételhetőségéből adódik. A poolok összeállításából származó hiba meghatározásához negyven kakas marker vizsgálatban összesen 280 adatpárt tudtam összevetni az egyedi genotípus és a kevert DNS módszer között. Az adatok között tapasztalt variancia 0,0043 nak adódott. Ekkora varianciával járul hozzá tehát becslésem szerint a poolok kialakításakor felmerült hiba az összes technikai hibához. A ~3000 kakas egyedi genotípus eredményből mikroszatellitenként és azon belül genotípusonként képzett összesen 131 csoportban vizsgáltam a kimutatás ismételhetőségét. A csoportokban megfigyelhető varianciák átlaga 0,0012 nek adódott. Ezt az értéket használtam fel a technikai hiba második elemeként. A két elemet összeadva a kísérletben technikai hibából származó variancia 0,0055 nek adódott. Ezt mint konstans értéket adtam hozzá a kakas marker vizsgálatok során egyedileg meghatározott binomiális variancia elemhez és ezekből az alapadatokból határoztam meg minden kísérletre külön külön az empirikusan standard hibát. Miután a standard hiba egyik komponensét, a D L és D S közötti kovarianciát épp azokon az eredményeken kell számolni, melyekre maga a standard hiba vonatkozik, ezért iterációs megközelítést alkalmaztam. Az elfogadott hipotézisek csoportján belül az empirikus hiba átlaga 0, A pool vizsgálatokból származó eredményeken végzett hipotézisviszgálatok és azok elemzése A D értékékek vizsgálatára z próbát alkalmaztam. A pool vizsgálatban kapott allél különbségek átlagát (D) elosztottam a standard hibával SE(D) és az így standardizált értékkel végeztem el a statisztikai próbát. Az iterációs számítás végeredményeként 45 pool vizsgálat esetében vetettem el nullhipotézisemet 0,05 tévedési szint mellett és 18 esetben 0,01 szint mellett. Ennyi eredményt tartok statisztikailag igazolhatónak az adott tévedési szintek mellett. A 671 pool marker vizsgálatban 39 eredménnyel van több a P<0,5 tartományban ahhoz képest, mintha az adatok egyenletes oszlanának meg 19

22 0 és 1 között. Becslésem alapján ennyi valós eredmény van az összes vizsgálat között. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a marker mellett egy, a tulajdonságot befolyásoló QTL van, bár nem mindegyik került a szignifikancia szint alá A markereken összesített adatok és hipotézis vizsgálatok eredményei és azok elemzése Négy mikroszatellit esetében csak egy vizsgálati eredménnyel rendelkezem (ADL0235, LEI0098, MCW0014, MCW0217). Így 105 marker esetében tudtam összesítve értékelni kettő vagy több eredményt, melyek egységességét χ 2 próbával ellenőríztem. Tizenkettő mikroszatellit marker esetében vetettem el nullhipotézisemet 0,05 szinten és 7 esetében 0,01 szinten, ezek statisztikailag igazolhatóak, viszont az alacsony (<0,5) P tartományokban, egy egyenletes eloszláshoz képest megfigyelt többlet alapján 13 valós eredményt tudok becsülni. Az FDR számítások adatai azt mutatják, hogy a hipotézisvizsgálatokban elfogadott eredmények száma túlértékelt. Még 0,2 téves felderítési arány mellett is csak 7 vizsgálat mondható elfogadhatónak és ezek közül is csak 6 a valós. Nem csökken jelentősen az elfogadhatok száma az alacsonyabb FDR szinteken sem. A 0,05 és 0,1 FDR szintekhez tartozó eredmények nem különülnek el, mindekettőhoz ugyanaz a kritikus P érték tartozik, ugyanúgy 5 eredményt tarthatok elfogadhatónak valamint valósnak is mindkét esetben A kimutatás ereje Mivel a markeren összesített vizsgálatokban a 0,05 és 0,1 FDR szintekhez tartozó kritikus P érték azonos, ugyanannyi eredményt mutatok ki, ezért a kimutatás ereje is azonos. Mindkét esetben a feltételezett eredmények közül csak 38% ot tudok valósnak kimutatni, 13 ól 5 öt. A 0,2 FDR szintet alkalmazva sem növekedik meg jelentősen a valós eredmények aránya, 7 eredményből 6 ot tartok valósnak. Így a kimutatási erő 47% ra való növekedése sem jelentős. Mindösszességében azt lehet mondani, hogy bár alacsony hatékonysággal tudom csak kimutatni a feltételezett valós eredményeket, de az igazolt eredmények döntő többsége valós. 20

23 3.11. Új tudományos eredmények 1.A térképezési populáció kialakítása a szelektív DNS pool módszer alkalmazása, genomiális DNS preparálás: A TETRA SL állományon meghatároztam a teljes keresztezési anyak kb. 8% át kitevő térképezési populációt, melyen a fenotípusos variancia alapján a leghatékonyabban elvégezhető a genetikai térképezés. A szelektív DNS poolozás módszerével elértem, az egér vizsgálatok esetében hogy a térképezési állományok öszes egyedéhez képest az egér vizsgálatoknál kb 1500 szor, a tyúk vizsgálatoknál pedig kb. 50 szer kevesebb minta vizsgálatát kell elvégeznem ahhoz, hogy a kapcsoltsági értékeléseket megfelelően el tudjam végezni. A TETRA SL állományon végzett vizsgálatokhoz saját fejlesztésű módszerrel megfelelő mennyiségű és minőségű DNS t izoláltam a lehető legkevesebb veszélyes anyag felhasználása mellett. 2.Genetikai térkép kialakítása, az alkalmazott markerháló: Meglevő adatok felhasználásával szerkesztettem egy tyúk genetikai térképet, melyet idő közben többször frissítettem. Ha az irodalomban elfogadott 30 cm ra becsülöm azt a genetikai távolságot, melyen egy markerlókusszal ellenőrízni tudom a genetikai kapcsoltságot akkor elmondhatom, hogy a tyúk vizsgálatok esetében alkalmazott genetikai térkép által mutatott terület 82% án van értékelhető vizsgálati eredményem. 105 markeren több család eredményét összesítve vizsgálhattam a kapcsoltsági eredményt. 3.Kakas genotípusok, a vizsgálandó családok száma, pool vizsgálatok: A kakas mintákon a 162 mikroszatelliten végzett több mint 3000 egyedi genotipizálás eredményeként elmondható, hogy az egyes kakasok esetében a markerlókuszokon tapasztalt heterozigozitási értékek 0,33 és 0,53 között mozognak. A kapcsoltsági vizsgálatokba bevont 109 markerlókuszon a heterozigozitás 0,51 nek adódott. A TETRA SL állományban 109 mikroszatellit lókuszon, 671 high és low pool eredményen kimutattam az öröklődő mikrozsatellit elléleket, melyek a kakasra illetve a tyúkokra jellemzőek. Meghatároztam a kakasallélek között tapasztalható gyakorisági különbséget és a különbségek átlagát. 4.Hipotézis vizsgálatok, a kísérletben meglevő valós eredmények 21

24 számának becslése: A családok poolmintáin végzett allélgyakorisági különbségek átlagára felállított alaphipotézisem volt, hogy ez a különbség nulla. Alaphipotézisem helyeségét egymintás z próbával teszteltem. Számításaim szerint a 105 mikroszatellit esetében, melyeknél több eredmény is összesíthető 0,05 tévedési valószínűséget alkalmazva 12 mikroszatellitnél feltételezem, hogy kapcsoltan öröklődik QTL el. Becslésem szerint a markeren összesített eredmény számításba bevont 105 mikroszatellit lókusz között 13 olyan eredmény becsülhető a teljes kísérletben, mely kapcsoltságot mutat. Ezzel a módszerrel közvetett módon megbecsültem a valós eredmények számát. 5.FDR kalkulációk, a kimutatás ereje: A kísérlet egészében megbecsült valós eredmények számát mely 13 nak adódott összevetettem azzal a számmal, melyet adott FDR szinteknek megfelelően alfogadott eredmények között becsültem valósnak, ezzel meghatároztam a kimutatás erejét. FDR=0,05 szinten 5 eredményt tudok elfogadni, melyek közül valószínűleg mind (4,91) valós. Ezt összevetve a korábban becsült 13 eredménnyel azt mondhatom, hogy a kimutatás ereje 0,38. FDR=0,2 szinten 7 eredményt tudok elfogadni, melyek közül kb. 6 (6,07) valós. Ezt összevetve a korábban becsült 13 eredménnyel azt mondhatom, hogy a kimutatás ereje 0, Következtetések és javaslatok A munkámban bemutatott módszer alkalmas mennyiségi tulajdonságokat meghatározó QTL ek felderítésére az állattenyésztés gyakorlata során kialakított állományon. A szelektív genotípus meghatározás és a kevert DNS módszer együttes alkalmazásával drasztikusan le lehet csökkenteni a vizsgálandó minták számát, tehát nagylétszámú térképezési állományon is igen hatékonyan lehet vizsgálatot végezni. A munka továbbvitele szempontjából egyrészt lehetőség van arra, hogy akár ugyanezen a kísérleti állományon egy másik értékmérő tulajdonságot meghatározó QTL eket derítsünk fel. Másrészt lehetőség van arra, hogy 22

25 egy hatékonyabb kísérleti elrendezésel pontosabban lehessen behatárolni a tulajdonság kifejeződését meghatározó QTL ek helyzetét. Ebben a rendszerben már nem kell a teljes genomra kiterjedő kapcsoltsági vizsgálatokat végezni, a vizsgálandó régiókat be lehet szűkíteni az általam meghatározott pozícióknak megfelelően. Az így kimutatott közeli, szoros kapcsoltságban levő markerlókuszok alkalmasak lehetnek, hogy a megfelelő QTL allélek öröklődését a generációk között nyomon követhessék a nemesítők, ezéltal állomány szinten befolyásolni tudják a tulajdonság megjelenését. 5. Publikációk Közlemények a Ph. D. témájában Közlemény folyóiratban Varga L., Gy. Szabó, A. Darvasi, G. Müller, M. Sass and M. Soller (1997) Inheritance and mapping of Compact (Cmpt), a new mutation causing hypermuscularity in mice. Genetics 147, Szabó Gy., Dallmann G., Müller G., Patthy L., Soller M. and Varga L. (1998) A deletion in the myostatin gene causes the Compact (Cmpt) hypermuscular mutation in mice. Mammalian Genome 9, Előadás Varga L., Müller G., Major F., Schlote W, Sághy T., Szabó Gy, Fekete S., Soller M. (1993) Az egér kompakt mutációjának öröklésmenete és genetikai térképezésének terve. XI. Állat biotechnológiai kerekasztal konferencia, Mosonmagyaróvár. Varga L., Müller G., Szabó Gy., Darvasi A. és Soller M. (1994.) Az egér compact mutációjának térképezése. A magyar genetikusok egyesületének III. konferenciája. Debrecen. p11. Varga L., Müller G., Szabó Gy., Darvasi A. és Soller M. (1995) Egy kiváló húsformákat mutató fenotipus genetikai térképezése. XI. Állatbiotechnológiai Kerekasztal, Gyöngyös Szabó Gy., Dallmann G., Müller G., Patthy L., Soller M. és Varga L. (1998) A miosztatin gén deléciója okozza a compact egér erőteljes izmoltságát. Magyar Biokémiai Egyesület Mol. Biol. Szakosztálya 3, 23

26 Munkaértekezlet. Sárospatak, május Varga L., Szabó Gy., Dallmann G., Patthy L., Soller M. és Müller G. (1999) A miosztatin gén deléciója okozza a compact egér hipermuszkuláris Cmpt mutációját. IV. Magyar Genetikai Kongresszus. Siófok, április Szabó Gy., Korom E., Soller M. és Varga L. (2002) Az ivarérésre ható QTL ek térképezése tyúkon. Magyar Biokémiai Egyesület Mol. Biol. Szakosztálya 7, Munkaértekezlet. Keszthely, 2002 május Varga L, Müller G, Szabó Gy, Pinke O, Korom E, Kovács B, Patthy L és Morris S. (2003) A hiperizmoltság genetikai hátterének felderítése Compact egéren.v. Magyar Genetikai Kongresszus. Siófok, 2003.április 13. Poszter Korom E, Nagy T, Kovács B, Komlósi I, Mihók S, Szabó Gy és Varga L (2003) Tyúk mikroszatellitek felhasználása pulyka populáció genetikai jellemzésére. V. Magyar Genetikai Kongresszus. Siófok, 2003.április 13. Közlemények más témában Közlemény folyóiratban Varga, L., Müller, G., Szabó, Gy., Pinke O, Korom, E., Kovács, B., Patthy, L. and Soller, M. (2003) Mapping modifiers affecting muscularity of the myostatin mutant (MstnCmpt dl1abc) Compact mouse Genetics, 165, (IF: 4,48) Varga L, Pinke O, Müler G, Kovács B, Korom E, Szabó G és Soller M. (2004): Mapping a syntenic modifier on mouse chromosome 1 influencing the expressivity of the Compact phenotype in the myostatin mutant (MstnCmpt dl1abc) Compact mouse. Genetics Oct 1 [Epub ahead of print] Előadás Tóth P., Szabó Gy. és Varga L. (1994) Rhesus majmok rokonsági kapcsolatainak meghatározása etológiai és molekuláris genetikai módszerekkel. A magyar genetikusok egyesületének III. konferenciája. Debrecen. p25. 24

27 Szabó Gy., Takács E., Gera I., Bodó I. és Varga L. (1995) Háziállatok hatékony származásellenőrzése mikroszatellitekkel. XI. Állatbiotechnológiai Kerekasztal, Gyöngyös. Tóth P., Szabó Gy. és Varga L. (1996) Determination of kinship and preferential relationships in a rhesus group by behavioral and molecular genetic methods. XVIth. Congress of the International Primatological Society and XIXth Conference of the American Society of Primatologists. Madison, Wisconsin USA. Varga L., Szabó Gy., Darvasi A., Müller G., Sass Miklós és Soller M. (1997) "Cmpt", egy új, hústermelésre erősen ható gén felfedezése. XIII. Állat biotechnológiai Kerekasztal, Salgótarján. Szabó Gy., Dallmann G., Müller G., Patthy L., Soller M. és Varga L. (1998) A Compact egérben az újonnan felfedezett miosztatin gén természetes mutációja okozza a fokozott izmoltságot. XIV. Állatbiotechnológiai Kerekasztal, Hódmezõvásárhely, október Varga L., Szabó Gy., Dallmann G., Müller G., Patthy L. és Soller M (1999) Miosztatin mutáció egérben és szarvasmarhában. MTA Állatorvosi Bizottsága akadémiai beszámoló, Budapest, január 25. Varga L., Müller G. és Szabó Gy. (2002) Miosztatin modifikátor gének térképezése egéren. Magyar Biokémiai Egyesület Mol. Biol. Szakosztálya 7, Munkaértekezlet. Keszthely, 2002 május Pinke O, Huszti K, Korom Et, Kovács B, Müller G, Szabó Gy, Varga L (2004) Komplex fenotípusos tulajdonságok feltérképezésre alkalmas populáció kialakítása egéren. Innováció, a tudomány és a gyakorlat egysége az ezredforduló agráriumában Agrárgazdasági modellek a 21. század mezőgazdaságában cimű nemzetközi konferencia április 16. Varga László, Pinke Orsolya, Müller Géza, Kovács Balázs, Korom Edit, Szabó Gyula (2004) Térképezhető e a szintenikus modifikátor? Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztályának 9. Munkaértekezletére Sopron, 2004 május Poszter Kovács B, Korom E, Yue G. H., Szabó Gy, Orbán L és Varga L (2003) Mikroszatellit markerek izolálása pulykából. V. Magyar Genetikai 25

28 Kongresszus. Siófok, 2003.április 13. Korom Edit, Nagy Tibor, Kovács Balázs, Komlósi István, Mihók Sándor, Szabó Gyula, Varga László (2003):Tyúk mikroszatellitek alkalmazása pulyka populáció genetikai jellemzésére. EU Konform Mezőgazdaság és Élelmiszerbiztonság jun.5. Gödöllő. Pinke O., Huszti K., Korom E., Kovács B., Szabó Gy. és Varga L. (2003) Komplex fenotípusos tulajdonságok feltérképezésére alkalmas speciális populáció lérehozása. "BIOMODELLEK 2003 Laboratóriumi állatok biológiája, tenyésztése és felhasználása" tudományos tanácskozás, 2003 november 13. Budapest Pinke Orsolya, Huszti Katalin, Korom Edit, Kovács Balázs, Szabó Gyula Müller Géza, Varga László (2004) A Compact modifikátor gének finomfelbontású térképezése "Advanced Intercross Lines" speciális populáció segítségével. Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztályának 9. Munkaértekezletére Sopron, 2004 május