Ghidán Ágoston Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei. Semmelweis Egyetem Doktori Iskola

Átírás

1 VanA gént hordozó enterococcus törzsek epidemiológiája: Magyarországon izolált törzsek molekuláris jellemzése, antibiotikum érzékenysége és filogenetikai vizsgálata Ghidán Ágoston Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Pathológiai Tudományok Interdiszciplináris Doktori Iskola 8/3 program: Mikroorganizmusok és anyagaik hatásának molekuláris, celluláris és organizmus szintű vizsgálata Programvezető: Prof. Dr. Rozgonyi Ferenc, MD, PhD, DSc Témavezetők: Prof. Rozgonyi Ferenc, MD, DSc, PhD Prof. Sebastian G.B. Amyes, MSc, DSc, Dhc, PhD, FRCPath, FIBiol Budapest 2007

2 BEVEZETÉS Az enterococcusok gyakran okoznak nozokomiális fertőzéseket, húgyúti infekciókat, valamint gyakran megtelepednek a műanyag katétereken és implantátumokon. A glycopeptid antibiotikumok (vancomycin, teicoplanin, avoparcin) közül a vancomycin és teicoplanin a multirezisztens Gram-pozitív baktériumok okozta fertőzések kezelésében játszanak szerepet, ami elősegítette a glycopeptid rezisztens baktériumok elterjedését, szóródását, megnehezítve az általuk okozott fertőzések kezelést (1). A vancomycint és a teicoplanint a humán terápiában alkalmazzák, az avoparcint pedig az állattenyésztők, mint hozamfokozót használták/használják az állatok takarmányozása során. Az első vancomycinrezisztens Enterococcus törzset (VRE) 1988-ban izolálták Európában (2, 3). Tizenkilenc évvel az izolálást követően ezen törzsek világszerte elterjedtek. A glycopeptid-rezisztens (GRE) törzsek elterjedését elősegíttette az, hogy glycopeptid antibiotikumokat alkalmaztak Staphylococcus sp. és Clostridium difficile okozta fertőzések kezelésére (4). A VRE törzsek potenciális veszélyt jelentenek, ugyanis a vancomycin rezisztenciájáért felelős gének átkerülhetnek más baktériumokba is, mint például a methicillin-rezisztens Staphylococcus aureusba (CDC, 2002 MMWR 51, ), így csökkentve a terápiás lehetőségeket. Összefüggést lehetet kimutatni az avoparcin felhasználás és a humán mintákból izolált glycopeptid rezisztens enterococcusok között (5, 6). Az Európai Bizottság 1997 áprilisában betiltotta az avoparcin használatát, mint hozamfokozó szert az Európai Unió területén, majd egy évvel később Magyarországon is tiltólistára került ez az antibiotikum. A glycopeptid rezisztenciáért az enterococcusokban a van gének a felelősek. Világszerte a vana és vanb gének okozta rezisztencia a legelterjedtebb. A vana gén által kódolt rezisztenciára a magas szintű vancomycin és teicoplanin rezisztencia a jellemző és leggyakrabban Enterococcus faecium és Enterococcus faecalis törzsekben található (7). Ez a gén volt jelen a hazai legelső VRE klinikai izolátumban is. A vanb gént egy évvel a vana után fedezték fel. Ezt a gént hordozó törzsekre a mérsékelt vancomycin rezisztencia és teicoplanin érzékenység jellemző (7). Később más van géneket is leírtak, úgy mint: vanc, vand, vane, vang (9, 10, 11, 12). Az állati eredetű rezisztens törzsek is gondot jelenthetnek, mert kontaminált élelmiszerrel bekerülhetnek az ember tápcsatornájába. Az antibiotikum érzékenység monitorozása a vágóhídi egészséges állatok mintáiból kitenyésztett törzsekből nagyon hasznos, mert 1

3 információt kaphatunk arról, hogy a haszonállatokban található baktériumtörzsek milyen kockázattal bírnak az népességre. CÉLKITŰZÉSEK A munkánk célja egy epidemiológia felmérés volt az Országos Állategészségügyi Intézetbe beküldött egészséges broiler csirkéből izolált VRE törzsek között, az avoparcin betiltása után. A vizsgálatba bevont törzseket között gyűjtötték az Antibiotikum Monitoring Rendszeren belül. A felmérésbe bevontuk a rendelkezésünkre álló humán mintákból származó VRE törzseket is. Az antibiotikum érzékenység meghatározása után a VRE törzseket genus és species szinten azonosítottuk biokémiai reakciókkal, valamint PCRel. Mivel a van gének a felelősek a vancomycin rezisztenciáért, ezen gének meglétét vizsgáltuk PCR-el, úgy az állati eredetű, mint a humán mintákból. Mivel a vágóhídról beküldött minták eredete rögzítve volt megyei bontásban, így vizsgálhattuk, azt hogy melyik megyékben fordul elő gyakrabban VRE törzs. Ahhoz, hogy megtudjuk, hogy a vancomycinrezisztens törzsek milyen rokonságban állnak egymással, rokonsági fok meghatározást végeztünk pulzáló mezejű gélelektroforézissel (PFGE). Speciális program segítségével törzsfát szerkesztettünk és választ kaptunk arra, hogy egy törzs terjedt-e szét az országban vagy különböző eredetű törzsek jelentek meg. Elméleti úton igazoltuk, hogy az avoparcin felhasználásának hatása volt a VRE törzsek kiszelektálódására. A klasszikus biokémiai és molekuláris meghatározás során egy biokémiai azonosítási folyamatábrát szerkesztettünk, ami segíti az enterococcusok species szintű azonosítását. DNS feltárás hatékonyságát növeltük a laboratóriumunkban alkalmazott PFGE vizsgálathoz felhasznált protokollban. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Baktérium törzsek A vizsgálatba bevont állati eredetű törzsek egészséges broiler csirkék vékonybelének mintáiból származtak, amelyeket különböző vágóhidakról küldtek be az Országos Állategészségügyi Intézetbe. A béltartalmat foszfát pufferrel a tízszeresére hígítottuk, majd egy cseppet a szuszpenzióból Enterococcosel és 0,5 g/l kálium-tellurittal dúsított Columbia agarra szélesztettünk. Azok a telepek, amelyek a tellursó jelenlétében képződtek, kataláz és amiláz negatívok, eszkulin 2

4 pozitívak voltak Enterococcus faecalisnak határoztuk meg (13, 14). A többi kinőtt telepeket genus szinten PCR-el határoztuk meg (15, 16, 17). A vancomycin-rezisztens törzseknél a van gén jelenlétét szintén PCR módszerrel határoztuk meg. A laboratóriumunkban molekulárisan is igazolt első magyarországi vancomycin-ezisztens E. faecalis törzs egy diabéteszes lábfekélyéből származott. A hagyományos módszerekkel történő meghatározást még Rapid ID 32 Strep (BioMérieux) panellel is elvégeztük a gyártó által javasolt protokoll szerint. A törzs antibiogramja ATB STREP teszt kittel készült. (18). A vizsgálatunkba bevont, PCR-el is igazolt második VRE törzset egy Neisseria meningitidis által okozott agyhártyagyulladásban szenvedő beteg elhalt bőrszövetéből izolálták (19). Antibiotikum érzékenység meghatározás Az Országos Állategészségügyi Intézetben a törzsek antibiogramját korong diffúziós módszerrel határozták meg az NCCLS útmutatója alapján. A vancomycin és teicoplanin minimális gátló koncentrációja (MIC) Müller-Hinton agaron, agar hígításos módszerrel lett meghatározva BSAC előírás alapján (British Society for Antimicrobial Chemotherapy Working Party, 1991) Denley multipoint inokulátor segítségével. Az baktériumszuszpenzió csepp megszáradása után a táptalajokat 37 C-on inkubáltuk órán át. A MIC érték az a legalacsonyabb antibiotikum koncentráció volt, amelyik gátolta a baktériumok növekedését. A MIC 50 és a MIC 90 értékét az az antibiotikum koncentráció adja, amelyik a vizsgált törzsek növekedését 50 illetve 90%-ban gátolja. A glycopeptid rezisztens törzsek azonosítás PCR segítségével A bakteriális DNS-t a PCR vizsgálathoz forralással nyertük ki. Egy kacsnyi baktériumot 0,1 ml steril desztillált vízben elszuszpendáltunk, majd 99 C-on tartottuk 15 percen át egy Perkin-Elmer PCR készülékben. A forralási idő lejárta után a szuszpenziót centrifugáltuk 6000 rpm-mel egy percen át (Sorvall RMC-14), hogy a sejtfaltörmeléktől megszabaduljunk. A felülúszóból 2,5 μl-t használtunk fel, mint templát DNS-t a PCR reakcióban. 3

5 Az azonosításhoz használt PCR primerek A genus szintű meghatározáshoz a konzervatív 16S rrns gén szekvenciájára tervezett primereket használtuk (17). A species szintű meghatározáshoz az enterococcusok superoxiddizmutáz génjére (soda) tervezett primereket alkalmaztuk (20). A glycopeptid rezisztencia meghatározása PCR segítségével A magas vancomycin és változó teicoplanin rezisztenciával bíró törzsek feltételezhetően a VanA fenotípusba tartoztak. Ezt igazoltuk genotípusosan is, ugyanis a törzsekben PCR segítségével megtaláltuk a vana gént (21). Ahhoz, hogy biztosak legyünk abban, hogy más van gént a törzsek nem hordoznak, megvizsgáltuk a törzseket PCR-el még a vanb, vanc 1 és vanc 2 génekre is. Mindegyik PCR terméket 1,5%-os agaróz gélelektroforézissel megfuttattuk TEA pufferben és 100-bp DNS marker jelenlétében. Futtatás után a gélt 0,5mg/L ethidium-bromiddal láthatóvá tettük UV fény alatt. A géleket digitális fényképezőgéppel lefotóztuk és archiváltuk. Pulzáló mezejű gélelektroforézis (PFGE) PFGE technikát alkalmaztunk a törzsek rokonsági fokának vizsgálatához. A kromoszomális DNS készítéséhez a laboratóriumunkban használt házi metodikát alkalmaztuk. A géldugókat 10 U SmaI enzimmel emésztettük 25 o C-on 2 órán keresztül. A futtatás 1% gélben történt, CHEF-DR II készülékben (Bio-Rad), 6 V/cm feszültséggel, 10 órán át, 14 o C-on, 5s/15s és 6 V/cm feszültséggel 13 órán át, 14 C-on, 15s/60s pulzáló időkkel (22). Minden futtatás magában foglalta a megfelelő molekulasúly-markereket is. A gél lefényképezése után (Kodak DC290) a PFGE profil analízise a Diversity Database (Bio-Rad) és a Fingerprinting II (Bio-Rad) programmal történt. Egy PFGE genotípus definíciója a törzsek legalább 90%- os rokonsága volt a beállított statisztikai paraméterekkel (UPGMA/Dice coefficient) elkészített dendrogramban, 2,5%-os sáv pozíció tolerancia mellett. 4

6 EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS A humán vana pozitív enterococcus törzsek antibiotikum rezisztenciája Az első, 1998-ban izolált, hazai humán VRE törzsnek a vancomycin MIC értéke >256 mg/l volt, a teicoplanin MIC értéke 96 mg/l ért el. Ez a törzs érzékeny volt ampicillinre, cotrimoxazole-ra és rifampicinre. A cefuroxime, erythromycin, lincomycin, vancomycin, teicoplanin, tetracyclin és oxacillin in vitro hatástalannak bizonyult. A második, 2001-ben izolált, hazai VRE törzs multirezisztens volt és csak az ampicillin és a rifampicin volt in vitro hatásos. A vancomycin MIC értéke 256 mg/l, a teicoplanin MIC értéke 32 mg/l volt. A PCR vizsgálattal mindkét törzsből a vana gént tudtuk kimutatni. A hazai broiler csirkékből izolált Enterococcus sp. törzsek antibiotikum érzékenysége A vizsgált időszakban ( ), összesen 562 törzset izoláltunk és néztük meg korongdiffúzióval az antibiotikum érzékenységet. Hét törzs kivételével mindegyik törzs érzékeny volt az ampicillinnel szemben ben és 2003-ban egy-egy törzs volt csak érzékeny az ampicillinnel szemben. Mindegyik törzs érzékeny volt a vizsgált időszakban gentamicinre. Streptomycinre 2001-ben 4, 2002-ben 1 törzs mérsékelt érzékenységet mutatott. A rezisztens törzsek előfordulása az alábbi módon változott: 2001-ben 8, 2002-ben 7, 2003-ban 6 és 2004-ben 1 törzs. Erythromycinnel szemben a rezisztencia aránya megegyezett a tetracyclinnel szembeni rezisztencia gyakoriságával, az érzékenység csökkenő tendenciát mutatott 2003-ban és 2004-ben. Mindegyik vizsgált évben a tetracyclin rezisztencia magasabb volt mint 50%. Korong diffúzióval 2001-ben 34 törzs volt vancomycin mérsékelten érzékeny és 68 törzs volt rezisztens. A rezisztencia csökkenő tendenciát mutatott évről-évre, 2004-ben már csak 2 törzsre volt hatástalan a vancomycin. DNS feltárása a PCR-es vizsgálatokhoz Számos metodikát leírtak az enterococcusok DNS feltárásához a nemzetközi irodalomban. Néhány metodika időigényes vagy nagyon drága. Kezdetben a S. aureusra leírt protokollt alkalmaztuk, ami 45 perc alatt volt kész és csak Tris puffert, lysostaphint és proteinase K-t igényelt. Mivel a lysostaphin drága ezért kipróbáltunk egy egyszerűbb és olcsóbb eljárást. A baktérium desztillált vizes szuszpenzióját felforraltuk. Az oldat sok baktérium 5

7 sejtmaradványt tartalmazott (sejtfal törmelék, fehérjék), ezért 6000rpm-el 1 percen át centrifugáltuk. A felülúszót használtuk a további vizsgálatokhoz. Az oldatban a DNS -20 Con évekig stabil marad. Mivel ugyanolyan jó eredményt kaptunk, mint a lysostaphin - proteinase K metodikával, a továbbiakban már csak ezt az eljárást használtuk. DNS feltárása a PFGE vizsgálatokhoz A PFGE vizsgálatokhoz sokkal nagyobb tisztaságú DNS-re van szükség, mint a PCR-hez. A laboratóriumunkban nagyon sok metodikát kipróbáltunk, de egyik sem vált be. Vagy nagyon sok reagenst igényel vagy a protokoll volt túlságosan bonyolult és hosszú. Az a metodika, amit alkalmaztunk, eredetileg S. aureusra volt optimalizálva. Előnye ennek az eljárásnak, hogy nagyon gyorsan lehet a DNS-t feltárni (8 órán belül kész), és csak 3 puffert igényel. A sejtfal feltárását a lysostaphin végzi. Ez az enzim, mint kiderült nem minden enterococcus sejtfalát emészti le, ezért a metodikán módosítottunk. A lysostaphin mellé még lizozimot adtunk, és hosszabb inkubációs időt biztosítottunk az enzimkeveréknek a sejtfal elbontására. Ez a változtatás elegendőnek bizonyult, mert azoknak a törzseknek a sejtfalát is feltárta, amit a lysostaphin önmagában nem tudott. A lysostahpin enzim egy glicil-glicin endopeptidáz és a pentaglicin híd glicin molekuláit lehasítja. A lizozim a peptidoglikán N-acetil muraminsav és N-acetil glukózamin közti kötést hidrolizálja. A lysostaphin-rezisztens törzsek sejtfal struktúrája ismeretlen maradt. Broiler csirkékből izolált vana pozitív enteroccocus törzsek identifikálása genus és species szinten PCR-el A törzsek van génekre tervezett primerekkel való vizsgálata során beigazolódott, hogy a vancomycin rezisztenciáért a vana gén felelős. Más van gént nem sikerül kimutatni a törzsekből. Minden törzset PCR-el megvizsgáltunk, hogy valóban enterococcus-e, a species szintű azonosítást szintén PCR segítségével végeztük el. Ezzel a módszerrel három enterococcus speciest találtunk: Enterococcus faeciumot, Enterococcus duranst és egy Enterococcus mundtii törzset ben 11 vancomycin rezisztens E. faecium törzset találtunk, 2002-ben 9-t. A vancomycin-rezisztens E. durans törzsek esetében 2001-ben 13 törzset, 2002-ben 11 törzset találtunk ban és 2004-ben nem találtunk egyetlen egy vancomycin-rezisztens E. feacium vagy E. durans törzset sem. Az egyetlen E. mundtii törzset 2001-ben izoláltuk. Az 6

8 összes megvizsgált VRE törzs között nem találtunk E. faecalist. A törzsekből vana gént csak a 2001 és 2002-es izolátumokból tudtunk kimutatni. A broiler csirkékből izolált VRE törzsek MIC értékei vancomycinnel és teicoplaninnal szemben 2001-ben 11 VRE E. faeciumot izoláltunk és mindegyik törzs (100%) vancomycin MIC értéke nagyobb volt, mint 256 mg/l. Egy évvel később már csak egy törzsnek (11%) volt magasabb a vancomycin MIC értéke mint 256 mg/l. A törzsek 78%-nak a MIC értéke vancomycinnel szemben 256 mg/l, és egy törzsnek (11%) pedig 64 mg/l volt. A vancomycin-rezisztens törzsek teicoplanin MIC megoszlása már változatosabb volt. 27%-a törzseknek 2001-ben nagyon magas MIC értékkel rendelkezett teicoplaninnal szemben (>256 mg/l). Egy törzsnek (9%) 256 mg/l, 4 törzsnek (36%) 128 mg/l, 1 törzsnek (9%) 64 mg/l és 2 törzsnek (18%) 32 mg/l volt a teicoplanin MIC értéke ben egy törzsnek (11%) volt a teicoplanin MIC értéke nagyobb, mint 256 mg/l. Egyetlen törzsnek sem volt a teicoplanin MIC értéke a 256, 128 vagy 64 mg/l tartományban. Egy törzsnek (11%) 32, 5 törzsnek (55%) 16 mg/l és 2 törzsnek (22%) 8 mg/l volt a teicoplanin minimális gátló koncentrációja ben a legtöbb törzsnek a teicoplanin a gátló koncentrációja nagyobb volt, mint 32 mg/l re a domináns koncentráció már csak 16 mg/l volt. A vancomycin-rezisztens E. durans VRE törzseknek 2001-ben a vancomycin MIC értéke egy kivételével (8%) magasabb volt, mint 256 mg/l ben a VRE törzsek vancomycin MIC értékei 64 és >256 mg/l között oszlottak meg. Csak egy törzsnek (9%) volt a vancomycin MIC-e >256, 2 törzsnek (18%) 256, 3 törzsnek (27%) 128, 5 törzsnek (45%) 64 mg/l. A vancomycin-rezisztens E. durans törzsek teicoplanin rezisztencia megoszlása heterogénebb volt ben 5 törzsnek (38%) volt a teicoplanin MIC értéke nagyobb, mint 256 mg/l. Egy törzsnek (8%) 256 mg/l, 2 törzsnek (15%) 128, 2 törzsnek (15%) 64, 3 törzsnek (23%) 16 mg/l volt a teicoplanin MIC értéke ben a MIC értékek az alsóbb tartományba estek. Csak két törzsnek (18%) volt magasabb a MIC értéke, mint 256 mg/l. Egyetlen egy törzsnek sem volt 256, 128 vagy 64 mg/l a teicoplanin gátló koncentrációja. Egy törzs (9%) 32 mg/l MIC értékkel rendelkezett és a domináns kategória 4 törzzsel 7

9 (36%) a 8 mg/l tartomány volt. Ebben az évben megjelentek a teicoplanin érzékeny törzsek is. Azt a MIC értéket, amelyik a törzsek 50 illetve 90 %-át gátolja MIC 50 vagy MIC 90 nevezzük ben az E. faecium törzsek vancomycin MIC 50 és MIC 90 értéke nagyobb volt, mint 256 mg/l ben a vancomycin MIC 50 és MIC 90 értéke 256 mg/l volt. Az E. durans törzsek 2001-ben a vancomycinnel szemben mind a MIC 50 és a MIC 90 nagyobb volt, mint 256 mg/l in 2001, amíg 2002-ben már csak 128 illetve 256 mg/l volt. Az állati eredetű VRE törzseknek földrajzi megoszlása ben két-két vancomycin-rezisztens E. faecium törzset izoláltunk Baranya, Borsod- Abaúj-Zemplén és Pest megyéből, egy-egy törzset Győr-Moson-Sopron, Jász-Nagykun- Szolnok és Somogy megyéből. Egyetlenegy VRE törzset sem találtunk Bács-Kiskun és Komárom-Esztergom megyékben ben három E. faecium törzset találtunk Veszprém, két törzset Fejér és egy-egy törzset Bács-Kiskun, Győr-Moson-Sopron, Hajdú-Bihar és Komárom-Esztergom megyében. Baranya, Borsod-Abaúj-Zemplén, Pest, Jász-Nagykun- Szolnok és Somogy megyében abban az évben nem tudtunk VRE törzseket izolálni. Baranya, Borsod-Abaúj-Zemplén és Pest megyékből 2001-ben két-két VRE E. durans törzset találtunk. Egyet-egyet Győr-Moson-Sopron, Jász-Nagykun-Szolnok és Somogy megyében. Három izolátum származott Veszprém megyéből 2002-ben. Két törzs Fejér és egy-egy törzse Bács-Kiskun, Győr-Moson-Sopron, Hajdú-Bihar, Jász-Nagykun-Szolnok és Komárom-Esztergom megyéből ben és 2002-ben egyetlen VRE törzset sem találtunk Békés, Csongrád, Nógrád, Szabolcs-Szatmár-Bereg, Tolna és Zala megyében. Vas megyében találtuk az egyetlen VRE E. mundtii törzset 2001-ben. A VRE törzsek filogenetikai vizsgálata Először a rendelkezésünkre álló Diversity-Database (Bio-Rad) programot használtuk a PFGE gélképek feldolgozásához. A software nem képes a DNS sávokat automatikusan felismerni, hanem kézi azonosítást igényel. Ez nagy hátrányt és pontatlanságot jelent a törzsfák szerkesztése közben. Néha lehetetlen, hogy a baktériumok tulajdonsága alapján válogassuk le törzseket és úgy szerkesszük meg a dendrogramot. A Bio-Rad Magyarország Kft. jóvoltából kipróbálhattunk egy működő próbaverziójú Fingerprinting II programot, amivel a dendrogrammokat elkészíthettük. Napjainkban ez az egyik legjobban elterjedt 8

10 software, nagyon sok kiegészítő funkcióval, így különböző szempontok alapján válogathattuk le a törzseket. A DNS sávokat automatikusan felismeri és a marker figyelembevételével azonosítani is tudja azokat. A vancomycin-rezisztens E. faecium és E. durans törzsek dendrogramjainak szerkesztése a DNS sávmintázatán alapult. A törzseket az izolálás éve és species alapján dolgoztuk fel ben 11 vancomycinrezisztens E. faecium törzset izoláltunk nagyon magas vancomycin MIC (>256 mg/l) értékkel. Abban az évben egy pár identikus törzset találtunk. Az egyik törzs Borsod-Abaúj- Zemplén a másik Pest megyéből származott. Mindkét törzsnek a vancomycin MIC értéke azonos volt, de a teicoplanin gátlókoncentráció különbözött (32 és 128 mg/l). Egy másik törzspárnál a hasonlóság nagyon magas volt (95%), de nem voltak identikusak. A törzsek Jász-Nagykun-Szolnok és Borsod-Abaúj-Zemplén megyékből származtak. Abban az évben két-két E. faecalis törzset izoláltunk Baranya, Pest és Borsod-Abaúj-Zemplén megyékből. Ezek a törzsek nem voltak identikusak, ami a poliklonális terjedésüket támasztja alá és 2001-ben az E. faecium törzsekre jellemző volt ben kilenc vancomycin-rezisztens E. faecium törzset találtunk. Négy törzsnek a DNS mintázata megegyezett. A MIC értékük vancomycinnel szemben mindegyiknek azonos volt (256 mg/l) de a teicoplanin MIC értékben különbségek voltak (8 és 16 mg/l). Ezek a törzsek Komárom-Esztergom, Győr-Moson-Sopron, Bács-Kiskun és Fejér megyékből származtak. A felsorolt megyék Bács-Kiskun kivételével Magyarország észak-nyugat régiójában találhatók és mindegyik szomszédos egymással. Ezek a tények arra engednek következtetni, hogy a törzsek 2002-ben valószínűleg monoklonális eredetűek. Egy másik identikus törzspár Veszprém megyéből származott, ami a feltételezésünket tovább erősíti. Hajdú-Bihar és Bács-Kiskun megyék kivételével mindegyik megye a Magyarország nyugati régiójában található meg ben egyetlen vancomycin-rezisztens E. faecium törzs származott Hajdú-Bihar megyéből, azonban csak 35%-ban volt hasonló a többi törzsekkel és szemben a többi E. faecium törzsekkel a teicoplanin MIC értéke nagyon magas volt (>256 mg/l) ben 13 vancomycin-rezistens E. durans törzset izoláltunk Magyarország különböző megyéiből. Hazánk keleti régiója is képviselve volt Szabolcs-Szatmár-Bereg, Békés és Csongrád megyékkel. Egyetlen törzs sem volt identikus a másikkal. Egy kivételével mindegyik törzsek nagyon magas vancomycin MIC értéke volt (>256 mg/l). A MIC érték 9

11 szempontjából kivételezett törzsnek 32 mg/l volt a vancomycin MIC értéke. A teicoplanin MIC értéke 16 és >256 mg/l között változott. Ezek az adatok a poliklonális terjedés valószínűségét támasztják alá ben 11 VRE E. durans törzset találtunk és egy sem volt identikus a másikkal. Két törzs 90%-os rokonságban állt egymással és mindkettőnek a vancomycin MIC értéke 64 mg/l, amíg a teicoplanin gátló koncentrációja 8 illetve 4 mg/l volt. Ezek a törzsek Borsod-Abaúj- Zemplén és Hajdú-Bihar megyéből, az ország keleti régiójából származtak. KÖVETKEZTETÉSEK Nagyszámú enterococcus törzset vizsgáltunk egészséges hazai vágóhídi broiler csirkékből és szerencsére csak nagyon kevés humán mintákból származó vana törzsekkel tudtuk összehasonlítani. Az állati eredetű törzsek az ország több pontjáról kerültek gyűjtésre. Ezeknek a törzseknek a meghatározását, antibiotikum érzékenység, feno- és genotípus vizsgálatát végeztük el az irodalomban megtalálható leírások, útmutatók alapján molekuláris módszereket is alkalmazva. Az enterococcus törzsek azonosítása hagyományos módszerekkel a rutin laborokban máig nem megoldott, ezért PCR segítségével azonosítottuk a törzseket. E. faecium species esetén a ddl E. faecium, az E. durans törzs esetén a sod gént amplifikáltuk. Az azonosítás során felállítottunk egy biokémiai sémát ami a hagyományos meghatározást a laborokban segítheti. A vágóhídi állatokból származó törzsek antibiotikum rezisztenciájának vizsgálata a Magyarországi Antibiotikum Monitoring Rendszeren belül történt. Nagyon fontos volt az állati eredetű törzsek antibiotikum érzékenységének a vizsgálata, hogy tisztában legyünk a különböző antibiotikumokkal szembeni rezisztencia szintekkel és hogy nyomon követhessük ennek a változását évről-évre. A humán mintákból is ki tudtunk mutatni vancomycin-rezisztens enterococcust és PCR-el elsőként igazoltuk, hogy vana gén hordozó, ami azt jelentette, hogy országunkban is megtalálhatóak a VRE törzsek. Az antibiotikum meghatározás után nagyon magas szintű vancomycin rezisztenciát találtunk évekkel az avoparcin betiltása után is. A vizsgálat során magas arányban kaptunk tetracyclin és erythromycin rezisztenciát. Ennek a háttérében talán a kapcsolt rezisztencia (azonos transzpozon?) állhat, amit a továbbiakban vizsgálni szeretnénk. 10

12 A vancomycin rezisztencia molekuláris vizsgálata során megállapíthatjuk, hogy a vana gén domináns a broilercsirkékből származó enterococcus mintákban. Két humán vana gént hordozó törzset találtunk, ami Magyarországon ritka, napjainkban inkább vanb előfordulással lehet számolni. Az állati eredetű mintákban vancomycin-rezisztens E. faecium, E. durans és egyetlen E. mundtii törzset izoláltunk. A nemzetközi irodalomban is nagyon ritka a vana pozitiv E. mundtii törzs előfordulása. A kereskedelmi kittek nem képesek ezt a speciest meghatározni. A vizsgálatainkból arra következtetünk, hogy a leggyakoribb speciesek mellett más speciesek is hordozhatják a van gént, ezért a laboratóriumoknak fel kellene készülniük e törzsek kimutatására is. A filogenetikai vizsgálatokra támaszkodva megállapítható, hogy a vancomycin-rezisztens E. faecium törzsek többnyire monoklonálisak vagy legalábbis egy domináns törzs szóródott az ország nyugati felében. Ahhoz hogy egyértelműen ezt ki lehessen jelenteni további vizsgálatokra van szükség. A forrás lehetett takarmány, telepen található tárgyak, állatgondozók vagy az alkalmazott technológia. Másrészről a vancomycin-rezisztens E. durans törzsek poliklonális eredetűek. Ahhoz, hogy ezt egyértelműen igazolni tudjuk, tervezzük a transzpozon amplifikálást (Long-PCR), majd emésztőenzimmel darabokra hasítjuk a terméket és összehasonlítjuk a sávokat (PCR-RFLP). Összefoglalásként elmondhatjuk, hogy az avoparcin betiltása után a broilercsirkék mintáiból a VRE törzsek előfordulásának gyakorisága csökkent, amit a vizsgálatainkkal igazolni tudtunk. Mielőtt még Magyarországon a VRE törzsek gondot jelenthettek volna a lehetséges rezervoárját e törzseknek felszámolták, ezzel magyarázható az, hogy miért nem tudtunk nagyobb számban izolálni humán mintákból ilyen törzseket. Az Antibiotikum Monitoring hálózat tevékenységét folytatni kell, és az állatorvosoknak valamint a humán orvosoknak együtt kell működniük, hogy a VRE törzsek terjedését, szóródását meggátolják a humán populációban. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Először is hálás köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőimnek, Dr. Sebastian G.B. Amyes és Dr. Rozgonyi Ferenc professzoroknak, az útmutatásukért, kutatási ötleteikért, 11

13 bátorításukért az egész doktori munka során és biztosították a lehetőséget, hogy laboratóriumaikban dolgozhattam. Nagyon köszönöm Juhászné dr. Kaszanyitzky Évának, dr. Knausz Mártának és dr. Csiszár Károlynak, hogy a törzseket a laboratóriumunkba elküldte és azokkal dolgozhattunk. Külön köszönöm dr. Dobay Orsolyának a nyelvi lektorálásért és a folyamatos ösztönzésért, ami nélkül a dolgozat nem készült volna el. Dr. Knausz Mártának és dr. Csiszár Károlynak köszönöm, hogy a törzseket a rendelkezésünkre bocsátotta. Köszönöm dr. Anderlik Piroska professzor asszonynak, hogy ötleteivel, tanácsaival segítette a dolgozat elkészülését. Köszönöm Dr. Jeney Csabának, hogy bevezetett az általános és molekuláris laboratóriumi munka technikai fogásaiba. Dr. Szentandrássy Júliának köszönöm, hogy segített az Enterococcus mundtii törzs identifikálásában. Szeretnék továbbá köszönetet mondani Pesti Józsefnének, Volter Imrénének és Kardos Szilviának a laboratóriumi munkában nyújtott gyakorlati segítségéért, Bajár Jánosnénak az adminisztratív teendők pontos bonyolításáért. A technikai segítségért külön köszönet Muk Andrásnak és Fekete Gábornak. Köszönöm a családomnak, hogy türelemmel viselték a dolgozat elkészülését. Ez a munka a GB-30/2003 számú Brit-Magyar Kormányközi TéT pályázat és a T32473, M36764, T46186 számú OTKA pályázatok anyagi támogatásával valósulhatott meg. FELHASZNÁLT IRODALOM 1. Ziglam HM, Finch RG. (2001) Limitations of presently available glycopeptides in the treatment of Gram-positive infection. Clin Microbiol Infect, 7: Leclercq R, Derlot E, Duval J, Courvalin P. (1988) Plasmid-mediated resistance to vancomycin and teicoplanin in Enterococcus faecium. N Engl J Med, 319: Uttley AH, Collins CH, Naidoo J, George RC. (1988) Vancomycin-resistant enterococci. Lancet, 1: French GL. (1998) Enterococci and vancomycin resistance. Clin Infect Dis, 27:

14 5. Wegener HC, Aarestrup FM, Jensen LB, Hammerum AM, Bager F. (1999) Use of antimicrobial growth promoters in food animals and Enterococcus faecium resistance to therapeutic antimicrobial drugs in Europe. Emerg Infect Dis 5: Collignon PJ. (1999) Vancomycin-resistant enterococci and use of avoparcin in animal feed: is there a link? Med J Aust, 171: Woodford N. (1998) Glycopeptide-resistant enterococci: a decade of experience. J Med Microbiol, 47: Williamson R, Al-Obeid S, Shlaes JH, Goldstein FW, Shlaes DM. (1989) Inducible resistance to vancomycin in Enterococcus faecium D366. J Infect Dis, 159: Leclercq R, Dutka-Malen S, Duval J, Courvalin P. (1992) Vancomycin resistance gene vanc is specific to Enterococcus gallinarum. Antimicrob Agents Chemother, 36: Perichon B, Reynolds P, Courvalin P. (1997) VanD-type glycopeptide-resistant Enterococcus faecium BM4339. Antimicrob Agents Chemother, 41: Fines M, Perichon B, Reynolds P, Sahm DF, Courvalin P. (1999) VanE, a new type of acquired glycopeptide resistance in Enterococcus faecalis BM4405. Antimicrob Agents Chemother, 43: Depardieu F, Bonora MG, Reynolds PE, Courvalin P. (2003) The vang glycopeptide resistance operon from Enterococcus faecalis revisited. Mol Microbiol, 50: Ike Y, Hashimoto H, Clewell DB. (1987) High incidence of hemolysin production by Enterococcus (Streptococcus) faecalis strains associated with human parenteral infections. J Clin Microbiol, 25: Facklam RR, Collins MD. (1989) Identification of enterococcus species isolated from human infection by a conventional test scheme. J Clin Microbial, 27: Devriese LA, Pot B, Van Damme L, Kersters K, Haesebrouck F. (1995) Identification of enterococcus species isolated from foods of animal origin. Int J Food Microbiol, 26: Kaszanyitzky EJ, Tarpai A, Janosi S, Papp M, Skare J, Semjen G. (2002) Development of an antibiotic resistance monitoring system in Hungary. Acta Vet Hung, 50: Deasy BM, Rea MC, Fitzgerald GF, Cogan TM, Beresford TP. (2000) A rapid PCR based method to distinguish between Lactococcus and Enterococcus. Syst Appl Microbiol, 23: Ghidan A, Jeney C, Marodi CL, Csiszar K, Rozgonyi F. (2000) PCR detection of the vana gene in a vancomycin-resistant Enterococcus faecalis clinical isolate from Hungary. J Antimicrob Chemother, 46: Knausz M, Gartner B, Fomotor I, Ghidan A, Kamotsay K, Rozgonyi F. (2003) Vancomycin-resistant Enterococcus faecalis colonization during recovery from Neisseria meningitidis cerebrospinal meningitis. Acta Microbiol Immunol Hung 50: Jackson CR, Fedorka-Cray PJ, Barrett JB. (2004) Use of a genus- and species-specific multiplex PCR for identification of enterococci. J Clin Microbiol, 42:

15 21. Dutka-Malen S, Evers S, Courvalin P. (1995) Detection of glycopeptide resistance genotypes and identification to the species level of clinically relevant enterococci by PCR. J Clin Microbiol, 33: Murchan S, Kaufmann ME, Deplano A, de Ryck R, Struelens M, Zinn CE, Fussing V, Salmenlinna S, Vuopio-Varkila J, El Solh N, Cuny C, Witte W, Tassios PT, Legakis N, van Leeuwen W, van Belkum A, Vindel A, Laconcha I, Garaizar J, Haeggman S, Olsson-Liljequist B, Ransjo U, Coombes G, Cookson B. (2003) Harmonization of pulsed-field gel electrophoresis protocols for epidemiological typing of strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus: a single approach developed by consensus in 10 European laboratories and its application for tracing the spread of related strains. J Clin Microbiol, 41: SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Az értekezés témájával összefüggő Cikkek 1. Ghidan A, Jeney Cs, Marodi CL, Csiszár K, Rozgonyi F. (2000) PCR detection of the vana gene in a vancomycin-resistant Enterococcus faecalis clinical isolate from Hungary. J Antimicrob Chemother, 46: Kaszanyitzky EJ, Tenk M, Ghidan A, Fehervari GY, Papp M. (2007) Antimicrobial susceptibility of enterococci strains isolated from slaughter animals on the data of Hungarian resistance monitoring system from 2001 to Int J Food Microbiol, 115: Knausz M, Gartner B, Fomotor I, Ghidan A, Kamotsay K, Rozgonyi F. (2003) Vancomycin-resistant Enterococcus faecalis colonization during recovery from Neisseria meningitidis cerebrospinal meningitis. Acta Microbiol Immunol Hung. 50: Rozgonyi F, Ostorhazi E, Marodi CL, Ghidan A. (2001) Resistance to beta-lactams and glycopeptides in staphylococci and streptococci. Acta Microbiol Immunol Hung, 48: Ghidan A, Kaszanyitzky EJ, Dobay O, Nagy K, Amyes SGB, Rozgonyi F. (2007) Distribution and genetic relatedness of vancomycin-resistant enterococci (VRE) isolated from healthy slaughtered chicken in Hungary from 2001 to Acta Vet Hung. (in press) Idézhető kongresszusi absztraktok 1. Rozgonyi F, Knausz M, Fömötör I, Gartner B, Ghidan A. (2000) Vancomycinresistant Enterococcus faecalis superinfection during recovery from Neisseria meningitidis cerebrospinal meningitis. Spanish J Chemother, 13, Suppl. 2:

16 2. Ghidan A, Jeney Cs, Csiszár K, Rozgonyi F. (2000) Detection of vancomycin resistance in Enterococcus faecalis using the PCR method. Acta Microbiol Immunol Hung 47/2-3: Ghidan A, Csukás Zs, Kamotsay K, Maródi CL, Rozgonyi F. (2001) Antibiotic susceptibility of Enterococcus strains isolated from clinical specimens between Jubilee Meeting of the Hungarian Society for Microbiology, Balatonfüred, October , Acta Microbiol. Immunol. Hung., 50, 220, Szabó J, Ghidan A, Dombrádi Zs, Tóth Á, Borbély Á, Miszti C, Andirkó I, Rozgonyi F. (2005) Occurence of vancomycin resistance of enetrococci isolated in Hungarian teaching hospital, Debrecen. Acta Microbiol Immunol Hung, 52: Ghidan A, Dobay O, Kaszanyitzky EJ, Nagy K, Rozgonyi F, Amyes SGB. (2006) Identification and genotyping of vancomycin-resistant enterococci isolated from slaughtered poultry in Hungary from 2001 to Clin Microbiol Infect, 12: suppl. 4, CD-ROM. Az értekezés témájával nem összefüggő Cikkek 1. Knausz M, Ghidan A, Grossato A, Rozgonyi F. (2005) Rapid detection of methicillin resistance in teicoplanin-resistant coagulase-negative staphylococci by a penicillin-binding protein 2' latex agglutination method. J Microbiol Methods, 60: Dobay O, Rozgonyi F, Ghidan A, Matuz M, Nagy K, Amyes SG. (2006) The first steps towards fluoroquinolone resistance in Hungarian pneumococci. J Chemother. 18: Idézhető kongresszusi absztraktok 1. Rozgonyi F, Ghidan A. (1999) A Betadine mikrobiológiája. Sebkezelés Sebgyógyulás 2: Anderlik P, Antmann K, Ghidan A, Rozgonyi F. (1999) Tüdőkórházban izolált Staphylococcus aureus törzsek részletes bakteriológiai vizsgálata. Táplálkozás Allergia Diéta 4: Antmann K, Anderlik P, Ghidan A, Rozgonyi F. (2000) Characterization of Staphylococcus aureus strains isolated from air and patients during a hospital surveillance. Acta Microbiol Immunol Hung 47/2-3: Rozgonyi F, Ghidan A. (2000) The effect of iodine polyvinylpyrrolodine (Betadine) on multiple antibiotic resistant bacteria and Candida albicans. Acta Microbiol Immunol Hung 47/2-3: Knausz M, Ghidan A, Rozgonyi F. (2001) Nosocomial catheter colonization by teicoplanin-resistant coagulase-negative staphylococci in immunocompromised patients. Clin Microb and Infec, 7: Supl. 1: Ghidan A, Maródi CL, Csukás Zs, Kamotsay K, Szabó D, Ostorházi E, Rozgonyi F (2002) Incidence of antibiotic resistance in Staphylococcus aureus strains in Hungary with special reference to MRSA. Int J Antimicrob Ag, 19, Supl.1: S94. 15

17 7. Kristóf K, Kamotsay K, Ghidan A, Rozgonyi F. (2002) Multirezisztens Staphylococcus epidermidisek dominanciája perinatális intenzív centrumok betegeinek hemokultúrás anyagában. Klin Kísérl Lab Med 29/1: Kristóf K, Kamotsay K, Ghidan A, Rozgonyi F. (2002) The predominance of multiple resistant Staphylococcus epidermidis in bloodstream infections of neonates in neonatal intensive care units. Clin Microb and Infec, 8: Suppl. 1: Kristóf K, Kardos S, Cser V, Ghidan A, Rozgonyi F. (2003) The impact of multiple resistant S. haemolyticus in NICU-acquired infection. Antibiotika Monitor, 19: Kristóf K, Szabó Zs, Cser V, Kardos Sz, Ghidan A, Rozgonyi F. (2005) Phenotypical differences in antibiotic resistance between MRSA and MSSA strains isolated from clinical samples of patients treated at the clinics of the Semmelweis University. Clin Microbiol Infect, 11: Suppl. 2: Cekovska Z, Petrovska M, Panovski N, Popovska-Jovanovska K, Ghidan A, Rozgonyi F. (2006) Distribution of MRSA in the Clinical Center Skopje from 2002 to 2005 and prevalence of meca asociated type of resistance in intensive care. Book of Abstracts p