Dr. Horváth Barnabás Témavezető: Dr. Ésik Olga Budapest 2005

Átírás

1 AZ ETS-1 TRANSZKRIPCIÓS FAKTOR FEJ-NYAKI CARCINOMÁKBAN, MELANOMÁBAN ÉS PERITUMORALIS FIBROBLASTOKBAN, VALAMINT A HISZTAMIN HATÁSA AZ ETS-1 EXPRESSZIÓJÁRA Dr. Horváth Barnabás Témavezető: Dr. Ésik Olga Budapest 2005 Szigorlati bizottság: Dr. Kádár Anna egyetemi tanár Dr. Répássy Gábor egyetemi tanár Dr. Pápai Zsuzsa főorvos Opponensek: Dr. Élő János c. egyetemi tanár Dr. Darvas Zsuzsa egyetemi docens Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Klinikai Orvostudományok Doktori Iskolája Sugárterápia Program.

2 TARTALOMJEGYZÉK 1. ÖSSZEFOGLALÁS 4 SUMMARY 6 2. BEVEZETÉS 8 3. A KUTATÁS KIINDULÓPONTJA ÉS A VIZSGÁLT MOLEKULÁK ÁLTALÁNOS JELLEMZŐI Ets-1 transzkripciós faktor MMP-3 proteolitikus enzim E-cadherin adhéziós molekula Ki-67 proliferációs marker Hisztamin CÉLKITŰZÉSEK Ets-1, E-cadherin és Ki-67 vizsgálata betegekből származó tumor mintákban Ets-1 és MMP-3 RT-PCR vizsgálata műtéti anyagon Műtéti anyagon végzett ets-1, E-cadherin és Ki-67 immunhisztokémiai vizsgálat In vitro vizsgálat humán melanoma sejtvonalon és humán 25 fibroblast tenyészetben Humán melanoma sejtvonalakon végzett RT-PCR vizsgálat és flow-citometria Humán fibroblast tenyészetben végzett RT-PCR, flow-citometria és immuncitokémiai vizsgálat MÓDSZER Immunhisztokémia Betegek és tumor minták, Ets-1, E-cadherin, Ki Immunhisztokémiai festés Immunreakció értékelése Melanoma sejtvonalak Sejttenyészet RT.PCR Betegek és tumor minták RT-PCR Fluoreszcens immuncitokémia Az ets-1 és MMP-3 mennyiségi változásának detekciója flowcitometriával 30 2

3 6. EREDMÉNYEK Betegekből származó tumor mintákon végzett kísérletek Ets-1 immunpozitivitás megjelenése a fej-nyaki daganatokban E-cadherin immunpozitivitás megjelenése fej-nyaki daganatokban Az ets-1 és E-cadherin expresszió összevetve a klinikopatológiai adatokkal Az ets-1 és E-cadherin expresszió összehasonljtása az N(0) és N(+) csoportban valamint a primer tumorokban és a metasztázisokban A Ki-67 index az N(0), N(+), ets-1 negatív és pozitív és az E-cadherin megtartott és csökkent csoportban Kaplan-Meier túlélési becslés Szemikvantitatív RT-PCR, Ets-1, MMP Melanoma sejtvonalakon és fibroblast sejt tenyészetben végzett kísérletek Melanoma sejtvonalakon végzett RT-PCR és flow-citometria eredményei Iimmunfluoreszcens festődés Szemikvantitatív RT-PCR Flow-citometria MEGBESZÉLÉS Fej-nyaki planocellularis carcinomákon végzett kísérletek Humán melanoma sejtvonalakon és fibroblast tenyészetben végzett vizsgálatok KÖVETKEZTETÉSEK, LEGFONTOSABB ÚJ EREDMÉNYEK KÖSZÖNETNYILVÁNíTÁS RÖVIDTÉSEK JEGYZÉKE IRODALOMJEGYZÉK AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁBAN MEGJELENT PUBLIKÁCIÓK 73 3

4 1. ÖSSZEFOGLALÁS A fej-nyaki planocellularis carcinomák, a fejlett diagnosztikus és terápiás lehetőségek mellett is nagy kihívást jelentenek a modern gyógyászatban. Különösen nagy gondot okoz az esetek jelentős részében kialakuló metasztázisok kezelése. A metasztázis képzésben résztvevő olyan molekulákat választottunk a kutatás tárgyául, mint az extracelluláris mátrix (ECM) bontásában részvevő MMP-3, és ennek regulációjában vezető szerepet játszó ets-1 transzkripciós faktor, valamint az epithelialis sejtek egymás közötti kapcsolatát biztosító E-cadherin és a tumor proliferációt mutató Ki-67. Munkánk második részében olyan kérdéssel foglalkoztunk, mint a hisztamin közvetlen metasztázist fokozó hatása. Első lépésben az ets-1 és MMP-3 jelenlétét igazoltuk a tumor mintákban reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technikával, majd vizsgáltuk az ets-1, E-cadherin és Ki.-67 molekula megoszlását immunhisztokémiai technikával. Második lépésben, in vitro modellben, humán melanoma sejtvonalakon és primer humán fibroblast tenyészetben potenciális kapcsolatot kerestünk az alkalmazott hisztamin és az ets-1 expresszió között. A melanomában bekövetkező, feltételezett H2 receptor mediált ets-1 változást flow citometriával igazoltuk, majd bázikus fibroblast növekedési faktor (bfgf) és hisztamin jelenlétében ill. ezek hiányában vizsgáltuk fibroblast tenyészetben az ets-1 és MMP-3 mrns szintjét RT-PCR-el valamint az ets-1 és MMP-3 protein mennyiségét flowcitometriával és fluoreszcens immuncitokémiával. A betegekből származó tumorminták feldolgozása alapján megállapítottuk, hogy mind az ets-1, mind a MMP-3 jelen van a fej-nyaki carcinomákban. Az ets-1 expresszió és a klinikopatológiai faktorok, valamint a metastasis és a Ki-67 között nem találtunk összefüggést. Az E-cadherin expresszió csökkenése szignifikáns kapcsolatot mutatott a metasztázissal és a túléléssel, valamint a Ki-67 proliferációs index-el. Az in vitro vizsgálatok egyértelmű összefüggést bizonyítottak a hisztamin valamint az ets-1 expressziója között mind melanomában mind a fibroblastokban, valamint igazolták, hogy a bfgf képes a peritumoralis fibroblastokban a hisztamin termelődésének fokozására. Az eredmények arra utalnak, hogy a Ki-67 proliferációs index és az E-cadherin expresszió mérése hasznos technika lehet a magas kockázatú betegcsoport kiválasztásában, akiknél erélyesebb onkológiai kezelés szükséges. Bár az in vitro 4

5 kísérletek klinikai interpretációja nagy körültekintést igényel, az eredmények mégis azt sugallják, hogy a különböző forrásokból származó hisztamin szintje mennyisége a daganaton belül növelheti a tumorsejtek invazívitását. 5

6 THE ETS-1 TRANSCRIPTION FACTOR IN HEAD AND NECK CARCINOMA, MELANOMA AND PERITUMORAL FIBROBLASTS, AND THE EFFECT OF HISTAMIN ON THE EXPRESSION OF ETS-1 1. SUMMARY Even with the development of diagnostic tools and therapy, the head and neck squamous cell carcinoma is a great challenge to modern medicine. A particularly difficult problem is the curing of the regional metastasis that is present in the overwhelming majority of cases. We examined molecules involved in the metastatic process, including MMP-3 that takes part in the remodeling of extracellular matrix, ets-1 transcription factor that regulates expression of MMP-3, E-cadherin that is responsible for homotypic cell-cell adhesion, and cell proliferating marker Ki-67. In the second part of our work, we studied the direct influence of histamine on the metastatic process. By using RT-PCR on tumor samples from patients who underwent radical surgery, at the first stage we confirmed the presence of ets-1 transcription factor and MMP-3. Using immunohistochemistry, we detected ets-1, E-cadherin and Ki-67 expression in paraffin-embedded specimens of HNSCC. At the second stage we looked for a potential relationship between exogenously added histamine and expression of ets- 1 transcription factor in melanoma cell lines and cultured human mucosal fibroblasts. To simulate stromal reaction in vitro, cultured human mucosal fibroblast was used. The level of ets-1 and MMP-3 mrna was compared using RT-PCR, as was their protein using flow-cytometry, in the presence or absence of bfgf (10 ng/ml) and histamine (1µM). The change of ets-1 level mediated by the H2R in melanoma cells was confirmed by flow-cytometry. By using RT-PCR on tumor samples from patients who underwent radical surgery, we confirmed the presence of ets-1 transcription factor and MMP-3. Correlation between ets-1 expression and clinicopathologic background, metastasis and Ki-67 labeling index was not significant. Reduced expression of E- cadherin showed significant correlation with metastasis, survival, and Ki-67 labeling index. Our results revealed a clear positive correlation between the effect of histamine and induced ets-1 mrna and protein expression in melanoma sell lines and fibroblasts. Our investigations clearly demonstrated that bfgf can stimulate histamine expression 6

7 in fibroblasts. This study demonstrated that the Ki-67 labeling index and expression of E-cadherin may be a useful measurement in identifying high-risk patients who need more aggressive therapy. It is very difficult to translate results of in vitro studies, but these results suggest that a high level of histamine arising from several sources, in tumor tissue may accelerate invasiveness of carcinoma. 7

8 2. BEVEZETÉS Az évente kórismézett összes rosszindulatú daganat 2-5%-a a fej-nyaki területről indul ki (14). Az incidencia világviszonylatban kb új megbetegedést jelent évente (92). A fej-nyaki malignomák több mint 95%-a planocellularis carcinoma, vagy ahogy az angol nyelvű irodalomban gyakrabban használják squamous cell carcinoma, ill. ennek variánsai (34). A fej-nyaki rákban szenvedő betegek esetében a gyógykezelés sikertelensége és a vele kapcsolatos halálozás meghatározó oka a regionális nyaki nyirokcsomó metasztázis, amely közel 50%-al csökkenti a betegek 5 éves túlélési esélyét (88, 108). Következésképpen a fej-nyaki carcinomák esetén a túléléssel legszorosabb kapcsolatban lévő független prognosztikai tényező a regionális nyaki metasztázisok jelenléte vagy hiánya (63). A fej-nyaki rákok ill. a regionális és távoli metasztázisok diagnosztikájában és kezelésében az utóbbi évtizedekben több területen is jelentős előrehaladás történt. A kifinomult képalkotó eljárások képesek már pár milliméter átmérőjű metasztázisok kimutatására, és a primer tumorok kiterjedésének, a környező anatómiai struktúrák érintettségének pontosabb megítélésére is. Sebészi téren, elsősorban a rekonstrukciós technikák fejlődésével, lehetőség nyílt egyre előrehaladottabb tumorok ablasticus eltávolítása. Az intenzív kutatások és a klinikai megfigyelések nyomán az elmúlt évtizedekben a nyaki metasztázisok műtéti kezelésében is paradigma váltás történt. A korábbi, még Halsted által a XIX. század végén az emlő tumorok sebészi kezelése során kialakított (36), és 1906-ban Crile majd 1951-ben Martin és munkatársai által a fej-nyaki daganatsebészetbe átültetett modell és eljárás, a radicalis nyaki block dissectio (27, 73) mellett és helyett számtalan indikáció, de elsősorban a klinikailag negatív nyak, az un. N0 nyak esetében, a Boca és munkatársai (11) valamint Byers és munkatársai (22) által ajánlott módosított radicalis nyaki block dissectio, ill. a csak bizonyos nyaki nyirokcsomó csoportok eltávolítását célzó selectiv nyaki block dissectio terjedt el. A nem sebészi kezelési módszerekben is jelentős fejlődés ment végbe a múlt század második felében. Ezekkel összefüggésben az általános klinikai gyakorlat jelenleg 3 alapvető megközelítést ismer: definitív kezelés (egyedüli sugárkezelés, integrált 8

9 kemoterápia és radioterápia); más difinitív terápiához csatlakozó adjuváns kezelés (preoperatív vagy postoperatív irradiáció, indukciós vagy adjuváns kemoterápia); és a palliatív kezelés. Természetesen a három alapvető stratégia között átfedések lehetségesek (56). A klinikai radioterápiában csak a kilovoltos röntgensugárzás volt elérhető addig, amíg a cobalt források, a betatron és a lineáris gyorsítók kifejlesztésével meg nem jelentek a megavoltos sugárforrások az 1940-es évekre. Az új, nagyenergiájú sugárforrások, a korszerű besugárzás tervezés, kedvezően befolyásolták a tumoros betegek irradiációs kezelésének eredményeit. A mélyebb penetráció, a jelentősen csökkent mellékhatások lehetővé tették a fej-nyaki régió mélyebb területein elhelyezkedő daganatok sikeres sugárkezelését. A korszerű irradiációs technikák javították a lokális kontrollt, és csökkentették a komplikációkat. Jelenleg a fej-nyaki planocellularis daganatok jelentős részében az elsődleges ellátáshoz hozzátartozik a sugárterápia. A modern kemoterápia, a malignus daganatok gyógyszeres kezelése több mint 50 éve, a mustárnitrogének alkalmazásával kezdődött, de a legutóbbi időkig a fej-nyaki planocellularis carcinomák eredményes kezelésére érdemi hatása nem volt. Tradicionálisan a kemoterápiát az irradiáció és vagy a sebészi kezelés sikertelensége esetén használták, palliatív szándékkal (7). Az múlt század 90-es évek elejétől kezdődően, nagy beteganyagot kezelő, kiemelt onkológiai centrumok eredményeinek metaanalízise alapján, az irradiációval együtt alkalmazott, főleg platina bázisú concomittáló kemoradioterápia az előrehaladt fej-nyaki rákban szenvedő betegek túlélését értékes százalékokkal javított (20). Mindezen fejlődés ellenére a túlélési statisztikák adatai továbbra sem tükröznek lényeges változást. Az utóbbi évek ( ) adatai alapján a gégerákos férfiak 5 éves túlélése az USA-ban 65,1%, Angliában 67,1%, Európában 62,3%, míg az oropharyngealis rákok esetében az USA-ban 58,7%, Angliában 42,1%, Európában 33,1% (85, 86). Áttanulmányozva nagy amerikai statisztikákat, ahol talán a fent említett fejlődés a legteljesebben érvényesült, az ötvenes évekkel összehasonlítva az 5 éves túlélésben a gége rákok esetében 15%-os, míg a szájüregi és garat rákok esetén 14%-os javulás mutatkozik (85). 9

10 Az elmúlt évtizedek molekuláris biológiai vizsgálatai egyértelműen bizonyították, hogy a metasztázis képződés, egy többlépcsős, kaszkádszerű folyamat, amelyben nem csak kizárólag a daganatsejt, ill. a daganatsejthez kapcsolódó faktorok vesznek részt, hanem döntő szerepük van a rosszindulatú elváltozást körülvevő szöveti struktúrák, a gazdaszervezet reakcióinak is (35). A heterogén primer tumorban jelenlévő, metasztázis képzésre alkalmas tumorsejt szubpopuláció, egy szekvenciálisan egymásra épülő többszörös tumor-gazdaszervezet kölcsönhatásban válik le a primer daganatról, vándorol át az extracelluláris mátrixon, jut át a bazális membránon és kerül a vér vagy a nyirokkeringésbe, majd jut el, erős szelekciós nyomás alatt a célszövetbe és képezhet metasztázist (70). Klinikailag jól ismert jelenség, hogy a fej-nyaki rákok, az esetek túlnyomó többségében, elsősorban limfogén úton képeznek áttétet, és csak az előrehaladottabb folyamatoknál jelentkezik a hematogén szóródás, amit részben magyaráznak az utóbbi évek vizsgálatai, amelyek szerint több daganatféleség, köztük a fej-nyaki planocellularis carcinomák is képesek limfangiogenezisre, ezzel megteremtve a lehetőséget a limfatikus disszeminációra (120). Tímár és mtsai összefoglaló cikkükben részletesen elemzik a hematogén és limfogén metasztázis képződés közötti eltéréseket. Napjainkban a nyaki áttét diagnosztikája a tapintáson ill. a radiológiai képalkotó eljárásokon alapul (123). A fejlett diagnosztikai lehetőségek, mint a CT, MRI, vagy az ultrahang vezérelt vékonytű aspirációs citológiai vizsgálat ellenére, amelynek szenzitivitása 48-76%-os, a nyaki metasztázisok gyakran csak akkor kerülnek klinikai észlelésre, ha már relatíve nagyok (113, 117). Másrészről sok beteg esik át szükségtelen electiv nyaki block dissectión, az azzal együtt járó indokolatlan műtéti terheléssel és esetleges maradandó funkciókárosodással, az okkult metasztázisoktól való félelem miatt (22, 108). A primer fej-nyaki daganat áttétképző képességének megítélésére az elmúlt évtizedekben, mind klinikai, mind hisztológiai, mind molekuláris szinten több próbálkozás is történt. Ismereteink szerint azonban idáig nem sikerült olyan tényezőt találni, amely rutinszerűen bekerült volna a mindennapi klinikai gyakorlatba, és valós segítséget adna a terápiás döntésekben. A kézikönyvek a prognosztikai faktorokat többféle felosztásban tárgyalják. Itt mi csak a metasztázis képzéssel összefüggő, primer 10

11 tumorhoz kapcsolódó, leggyakrabban vizsgált tényezőket említjük, mivel saját vizsgálatainkat is ebben az irányban végeztük. A fentieket célzó vizsgálatok egy része, alapvetően morfológiai jegyek jelenlétével vagy hiányával összefüggésben határozza meg a primer daganat metasztatikus kézségét, bár ezeknek a vizsgálatoknak jelentős részében is már a módszerek molekuláris szintűek. Martinez-Gimeno a nyirokcsomó metasztázis kialakulásának előrejelzésére, egy a microvascularis invázió jelenlétét vagy hiányát, a szövettani gradinget, a tumor vastagságát, a gyulladásos infiltráció mértékét, a tumor interfázist, és a perineuralis invázió mértékét magában foglaló, ezeket számszerűsítő, majd különböző valószínűségi csoportokba foglaló rendszert dolgozott ki (74). A tumor és a stroma határán, az invázió megjelenési formáinak is jelentőséget tulajdonítanak a metasztatikus kézség szempontjából. A tentacularis típusú, ujjszerű nyúlványok formájában infiltráló daganat (diffuse spread), nagyobb valószínűséggel képez metasztázist, mint a lekerekedett határokat mutató, expanzívan infiltráló típus (pushing type) (78, 131, 28). A tumor szövet mélységi penetrációját vizsgálták Mohit-Tabatabai, Spiro és Rasgon, akik szájfenéki, szájüregi ill. pharyngealis planocellularis carcinomák esetében találtak összefüggést a nyaki metasztázisok megjelenésének valószínűsége és a primer tumor vastagsága között (81, 112, 93, 49). Bár számos beszámolóban szerepel a tumor grading és a metasztázis valószínűsége közötti kapcsolat, az irodalomi vélemények ebben a kérdésben is erősen megosztott (80, 78, 49). Az angiogenezis a metasztázis képződés egyik alapfeltétele. A tumor angiogenetikus potenciálja jól kvantifikálható az erek jelölésére alkalmas endothelialis antigénekkel, a rutinszerűen használt paraffinba ágyazott metszetekben is. Míg Gasparini majd Williams közvetlen kapcsolatot igazoltak a microvessel density (MVD) és a metasztázis valamint a prognózis között fej-nyaki rákokban, addig Gluckman 53 korai szájüregi carcinomában nem tudta kimutatni ugyan ezt az összefüggést (44, 128, 49). A vascularis invázió, mint a nyaki metasztázisokra hajlamosító tényező, szintén vitatott jelentőségű az irodalomban. Számos tanulmány hangsúlyozza a primer 11

12 tumorban észlelt perineuralis invázió és a nyaki nyirokcsomó metasztázis kapcsolatát (39, 127), azonban mind ez utóbbiról, mind a daganat körüli stromát infiltráló gyulladásos sejtek prognosztikai értékéről ellentmondóak a beszámolók (39, 78). A DNS tartalom fej-nyaki planocellularis carcinomákban betöltött prognosztikai szerepével összefüggésben is történtek vizsgálatok. Wolf és mtsai. 94 gégerákban szenvedő beteg anyagát feldolgozva azt tapasztalták, hogy az aneuploid tumorokban szignifikánsan magasabb a nyaki metasztázis incidenciája, mint a diploid tumorokban (129). Más szerzőknek azonban nem sikerült igazolni ugyanezt az összefüggést (68). Az utóbbi években a molekuláris prognosztikai faktorokat is kiterjedten vizsgálják, fókuszálva a protooncogénekre és suppressor génekre, valamint a tumor és környezete kölcsönhatásában szerepet játszó növekedési faktorokra. A p53 tumor suppressor gén negatívan szabályozza a sejtciklust és a genom épségéért felelős. A p53 funkció csökkenését kapcsolatba hozzák a fej-nyaki tumor agresszivitásának növekedésével, a kemoterápiával és irradiációval szembeni rezisztencia fokozódásával, a tumor neovascularisatioval, és a rossz prognózissal (56), azonban a p53 onkoprotein abnormalitásainak gyakorisága ellenére, önmagában a prognosztikai jelentősége a klinikumban kevés (33). A tumor progresszió, az invázió, és a metasztázis klinikailag legalább olyan jelentős, mint a tumor indukció. Jól ismert, hogy az invázió és metasztázis képződés szoros kapcsolatban áll az angiogenezis hatékonyságával. Az egyik legismertebb angiogenesist reguláló növekedési faktor a vascular endothelial growth factor (VEGF) emelekedett expresszióját mutatták ki, metasztatikus fej-nyaki laphámrákokban (3). Hasonló eredményeket közöltek Smith és mtsai, akik 65, II-IV stádiumú oropharyngealis planocellularis carcinomában szenvedő beteg anyagát vizsgálva szoros párhuzamot találtak a VEGF expresszió és a túlélés, valamint a távoli metasztázisok között (110). Az előzőekkel szemben más szerzők, 156 fej-nyaki rákban szenvedő beteganyagban nem tudtak összefüggést kimutatni az VEGF expresszió és a klinikai lefolyás között (102). Összességében azonban a legtöbb vizsgálat szerint az emelkedett VEGF szint jelzője a súlyosabb klinikai lefolyásnak és roszabb túlélésnek. A sejtciklus G1 fázisában, reguláló szerepet játszó ciklin D1 prognosztikai szerepéről is ellentmondásos vizsgálatokat publikáltak. Míg egyes szerzők szignifikáns kapcsolatot találtak a ciklin D1 dereguláció és a túlélés között (2), addig más 12

13 vizsgálatok ennek ellentmondanak. Muller és mtsai, egy az előzőeknél lényegesen nagyobb anyagon, 280 fej-nyaki planocellularis carcinomában szenvedő betegnél, nem tudtak korrelációt bizonyítani a cyclin D1 csökkenés és a túlélés között (82). Az epidermal growth factor receptor (EGFR), és a ligandja a transforming growth factor-α (TGF-α) gyakran mutat fokozott expressziót fej-nyaki laphám rákokban (51). Több klinikai vizsgálat igazolta a fokozott EGFR expresszió és a klinikai lefolyás közötti szignifikáns kapcsolatot (130, 4). A fej-nyaki planocellularis carcinomák invazivitásával szorosabb kapcsolatba hozott markereket is vizsgáltak. A metasztázis képződés folyamatában jelentős szerepük van az adheziós mulekuláknak. Részben ezeknek a molekuláknak a funkciócsökkenése teszi lehetővé a tumorsejt leszakadását a primer tumorról, és részben ezeknek a molekuláknak a jelenléte szükséges a daganatsejt aktív mozgásához és az ECM-on történő áthaladásához. A későbbiekben részletes tárgyalásra kerülő E-cadherinen kívül, fejnyaki rákokban az integrinekkel kapcsolatban vannak bizonyító vizsgálatok, miszerint gyakran megfigyelhető a β1-integrin csökkent és az α 6 β 4 -integrin fokozott expressziója (120). Az epidermális sejtekre jellemző a konstitutív CD44 expresszió. Általános jelenség a fej-nyaki rákokban a CD44 megjelenésének csökkenése. A fentiek mellett az irodalomban még számtalan tényezőt vizsgáltak, amely prognosztikai értékkel bírhat a fej-nyaki rákok esetében, de jelenleg nem rendelkezünk megbízható diagnosztikus eszközzel arra, hogy a fej-nyaki daganatok metasztatizáló potenciálját előre jelezzük, pedig egy ilyen módszer rendkívüli jelentőséggel bírna a klinikumban. A metasztázis képzésért felelős molekuláris mechanizmusok szabályozásának megismerése, egyrészről új támadáspontokat nyithat az eredményesebb gyógyszeres tumorkezelés előtt, másrészről esetleges kulcs molekulák megtalálásával és jelenlétük kvantifikálásával lehetőség nyílhat prognosztikailag értékes adatok megszerzésére, és segítségünkre lehet az agresszívebb kezelést igénylő magasabb kockázatú betegcsoport meghatározásában. 13

14 3. A KUTATÁS KIINDULÓPONTJA ÉS A VIZSGÁLT MOLEKULÁK ÁLTALÁNOS JELLEMZŐI A kutatásnak irányt szabó kérdésfelvetések alapvetően klinikusi megközelítésűek. A metasztázis képzésben bizonyítottan részvevő olyan molekulákat választottunk a kutatás tárgyául, amelyek az irodalmi adatok és a molekulák eddig megismert szerepe alapján ígéretesek lehetnek a fej-nyaki planocellularis carcinomák metasztázis mechanizmusának kutatásában, és a későbbiekben prognosztikai jelentőséggel bírhatnak. További szempont volt, hogy a molekulák között már ismert kapcsolat legyen. Munkánk második részében a hisztamin direkt inváziót és metasztázist fokozó hatásásával foglalkoztunk, az előzőekben vizsgált molekulákon keresztül, és amely téma a nemzetközi irodalomban is nagyon szegényesen reprezentált Ets-1 transzkripciós faktor Az ets-1 gén, amelyet korábban az E26 avian leukémia retrovírus egyik oncogénjeként (v-ets) ismertünk (69), az utóbbi évek vizsgálatai szerint szerepet játszik olyan mindennapos fiziológiai folyamatokban, mint a sejtproliferáció vagy a differenciáció (84). Emberben az ets-1 expressziót elsőként T és B lymphocytákban mutatták ki, de emellett más szövetekben is expresszálódik. Folkman (1971) nevéhez fűződik a megállapítás, miszerint az angiogenezis nélkülözhetetlen a tumor növekedéséhez és a metasztázis képzéshez (24). Ismereteink szerint az ets-1 transzkripciós faktor jelentős szerepet játszik az angiogenezisben. Az érképzésben résztvevő két alapvető sejttípusban, az endothelben és a vascularis simaizom sejtekben, angiogen faktorok, mint VEGF, bfgf, angiotensin II, endothelin- 1, tumor necrosis factor α és hidrogén peroxid hatására, expresszálódik az ets-1 (30), amely ezeknek a sejteknek a proliferációjához, migrációjához és inváziójához vezet. Az ets-1 gátlása, ets-1 elleni anti-sense oligonukleotid szekvenciával megakadályozza az endothel sejtek migrációját, és angioge faktorokra való válaszkézségét (133). Wernert és mtsai. igazolták, hogy az ets-1 gén a fentiek mellett részt vesz a tumort környező stromának a tumor invázióra adott válaszreakciójában, a tumor indukálta angiogenezisben is (126). Vizsgálatok bizonyították, hogy az ets-1 részt vesz a VEGF és receptorának regulációjában. Ets-1 elleni direkt antisense DNS hatására gátlódik az 14

15 endothel sejtekben a VEGF expresszió (121). A tumor és környezetében meglévő hypoxia rendkívül erős stimulátora az ér újdonképződésnek. A csökkent oxigén ellátottság aktiválja a hipoxia indukálta transzkripciós faktorokat (HIF), amelyek több további angiogen faktor expresszióját fokozzák, mint a VEGF, nitric oxid szintetáz (NOS), platelet-derived growth factor (PDGF) (107). Oikawa igazolta, hogy az ets-1 promoteréhez a HIF-1 direkt módon kötődik és aktiválja az ets-1 transzkripcióját (89). Az ets-1 szerepet játszik az invázióban és metasztázis képzésben. Az ets-1 gén által kódolt transzkripciós faktor fehérje képes kötődni az upa gén enhanceréhez, valamint az MMP-3 és MMP-1 gén promoteréhez, és feltételezhetően ezeknek a géneknek az expressziójának aktiválásán keresztül vesz részt a tumoros invázió szabályozásában (91). Az ets-1-nek szerepe van a lymphoid sejtek fejlődésében, a T és B sejtek differenciációjában, valamint számos T sejt specifikus gén expresszióját szabályozza, és részt vesz a B sejtekben az immunglobulin nehéz lánc enhancer gén regulációjában (30). Az apoptosisban betöltött szerepével kapcsolatban úgy tűnik, hogy a szinergistaként a wildtipe p53-al aktiválja a p53-responsive pro-apoptoticus géneket, mint a bax, bid, és bcl2 (105). ECM bontásában résztvevő proteinázok invázió, metasztázis morfogenezis embrionális fejlődés Ets-1 bid, bax, bcl2 haemopoeticus sejt differenciáció apoptosis proteinázok, VEGF angiogenezis 1. Ábra Az ets-1 transzkripciós faktor funkciói 15

16 Számos emberi daganatban bizonyították az ets-1 transzkripciós faktor jelenlétét (I. táblázat) ; gyomor (84), tüdő (12), prostata (26), pancreas (59), oesophagus (101), máj (90), bőr angiosarcoma (83), szájüregi carcinoma (91), extrahepaticus epeút carcinoma (60) és meningeoma (66), emlő carcinoma (111). Emlő carcinomában végzett vizsgálatokban az ets-1-t független prognosztikai tényezőnek találták (111), míg tüdő és szájüregi rákok esetén az ets-1 expresszió és a metasztázis között volt szignifikáns kapcsolat (12, 91). Epitheliális tumorokban az ets-1 kettős szerepet tölt be. Egyrészről hozzájárul a tumor növekedéséhez és az oxegenizáció javításához, indukálva a tumor vascularisatiót, másrészről elősegíti a tumor inváziót aktiválva az ECM bontásában résztvevő proteázokat a tumorban és a peritumorális fibroblastokban. 16

17 17

18 3.2. MMP-3 proteolitikus enzim Az ECM az első barrier, amellyel az invázióban lévő daganatjest találkozik. A tumor sejtnek az ECM komponenseit bontó proteolitikus enzimekre van szüksége ahhoz, hogy lehetővé váljon a további migrációja.az invázió és a metasztázis képződés folyamatában a tumorsejteknek adhéziós receptorok közvetítette kölcsönhatásba kell lépniük az ECM-fehérjékkel. Ezért a kölcsönhatásért az integrinek felelősek, amelynek ligandjai az ECM összetevői. Ennek a tumorsejt-ecm kapcsolatnak a következményeként a mátrix lebomlik az adott helyen, lehetővé téve a daganatsejt aktív továbbhaladását. Az ECM bontásában, több más proteolitikus enzim család mellett, jelentős szerepe van a mátrix metalloproteinázoknak (MMP). Jellemzőjük, a katalitikus doménen elhelyezkedő Zn 2+ kötő alegység, amely nélkülözhetetlen a katalitikus funkcióhoz (19). Aktiválódásukhoz más proteinázok aktivitása és valószínűleg a környezet alacsonyabb ph-ja szükséges (118). Az MMP családba tartozik a MMP-3 vagy stromelysin-1, amelynek szubsztrátjai proteoglycanok, fibronectin, gelatinok, továbbá a basál membrán fő alkotó eleme a IV collagen és a V collagen (9, 87). A tumorsejt és a környező stroma sejtjeinek interakciója fontos szerepet játszik a tumorok növekedésében és a metasztázisok kialakulásában (136). A fibroblast, mint a stroma meghatározó sejtje, felelős a kötőszövetből, a tumor invázió kapcsán, felszabaduló proteázokért (119, 100, 50). Wernert és mtsai. igazolták, hogy a MMP-3 mrns legfőbb forrása a peritumorális fibroblastok (126). A MMP-3 hasítja az E-cadherin extracelluláris doménjét, ezzel indukálva egy progresszív fenotípus változást, amely a sejt-sejt kontaktus elvesztésétől, a citokeratin csökkent expresszióján, a vimentin megjelenése és a keratinocyta növekedési faktor expressziójának aktiválásán keresztül, a MMP-ok fokozott termelődéséhez vezet (71). Immundeficiens egerek emlősejt tenyészetében észlelték, hogy a MMP-3 képes a nem invazív sejteket, inflitratív növekedésű daganat kialakítására késztetni, ezzel igazolva a MMP-3 proinvazív aktivitását (72). A MMP-3 ténylegesen az un. hit-and-run mechanizmussal hat, vagyis a MMP-3 folyamatos expressziója nem szükséges a tumor fenotípus vagy az általa kiváltott genetikai változások fenntartásához (8). 18

19 3.3. E-cadherin adhéziós molekula A gerincesek többségében a sejtek közötti kapcsolat megteremtésében alapvető fontosságú molekulák egyik, Ca 2+ függő csoportjának legjelentősebb képviselői a cadherinek. Ezeknek a transzmembrán glikoproteineknek szerepe van a morfogenezisben és a differenciált fenotípus megtartásában (40). Az E-cadherin többféle epithelialis sejt jellegzetes sejtadhéziós molekulája, amely felépítésében a plazmamembránt egyszer átérő glikoprotein. Öt extracelluláris doménnel, és egy a catenineken keresztül az actin citoskeletonhoz kapcsolódó citoplazmaticus doménnel rendelkezik. Az extracellularis részleten helyezkednek el a feltételezett Ca 2+ kötőhelyek. Ca 2+ hiányában a cadherin molekula szerkezete megváltozik, és proteolitikus enzimek hatására lebomlik. Szerepe elsősorban az azonos sejtek, sejt-sejt, homofil kötődésben van (115). Csökkent vagy hiányzó E-cadherin expressziót írtak le fej-nyaki planocellularis carcinomában (106, 15, 16, 77, 116, 6, 65), prostata (99), oesophagus (104), gyomor (109), colon (124) és tüdő carcinomában (18, 10) 3.4. Ki-67 sejtproliferációs marker A proliferativ daganatsejt frakció mértékének prognosztikai jelentősége a fej-nyaki planocellularis carcinomákban még nem tisztázott ill. vitatott. A Ki-67 proliferációs marker meghatározását 1983-ban írták le, és alkalmazása általánossá vált, mivel relatíve gyors és költségkímélő, mégis megbízható módszer a daganat proliferáló frakciójának meghatározásában (46, 45). A Ki-67 nuclearis antigen jelen van a sejtciklus S, G2 és M fázisában, de hiányzik a G0 fázisban. A Ki-67 nuclearis antigén expressziója fokozódik a sejtciklus előrehaladtával, számottevően az S fázis második felében és maximumát a G2M fázisban éri el (103) Hisztamin A hisztidin dekarboxileződésével létrejövő kis molekula tömegű biogén amin, a hisztamin, a biológiában széles körben előforduló kémiai mediátor, amely egyrészt neurotranszmitter, a gastrointestinális és simaizom funkció mediátora, másrészt fő szerepet játszik az allergiás reakcióban, a gyulladásban és a sejt proliferációjában is. Az a hipotézis, miszerint a hisztamin részt vesz a carcinogenezisben és a tumor sejt 19

20 proliferációban már a hatvanas években megszületett (64), bár mind a mai napig számtalan nyitott kérdés maradt hátra. A hisztidin decarboxileződését katalizáló hisztidin dekarboxiláz (HDC), mint a hisztamin bioszintézisért felelős enzim, specifikus markere a hisztamin szintézisnek. Irodalmi adatok igazolják, hogy emlő és colon carcinomában, melanomában, lymphomában és leukémiában, mind a HDC-t kódoló mrns, mind a HDC protein szintje és következményesen a hisztamin szintézis, szignifikánsan magasabb, mint a környező ép szövetekben (31). A daganaton belüli hisztamin koncentráció mérésére is történtek vizsgálatok, bár meggyőző eredmények elsősorban emlő, bőr és colon carcinomák esetében állnak rendelkezésünkre. Chanda és Ganguly, Reynolds és mtsai. valamint Garcia-Caballero, kis eltérésektől eltekintve, egyaránt magasabbnak találták a hisztamin koncentrációt az emlő tumorban, mint a környező ép szövetekben (25, 95, 42, 43). Reynolds és mtsai. igazolták, hogy elégséges magas koncentrációban van jelen a hisztamin az emlő carcinomában ahhoz, hogy gátolja a lymphocyta aktivációt (95). Értékes információkat adna a hisztamin in situ kimutatása tumoros szövetmintában, a tumor és a tumorhoz asszociált sejtekben történő megoszlás megítélésére, de a gyorsan bomló kis molekula tömegű hisztamin és a strukturális szövet eltérő fixációs technikái miatt ez rendkívül körülményes, és tudomásunk szerint eddig ilyen jellegű sikeres vizsgálat nem történt. A hisztamin szerepe a tumor genezisben és a metasztázis képződésben még nem tisztázott. Falus és mtsai. igazolták, hogy a hisztamin hatása a melanoma sejtek proliferációjára az aktuális hisztamin receptor típus megoszlás függvénye, ugyanakkor a hisztamin indirekt úton irányítja a helyi T sejt polarizációt a Th2 predominancia irányában (32). Experimentális carcinomákban a hisztaminnak, mint egy autocrin növekedési faktornak a legfontosabb hatása, hogy a H2 receptorokon keresztül stimulálja a proliferációt (31). Hasonlóan a hisztamin kettős hatására az immunrendszerre, ahol a H2 receptoron keresztül immunszupresszor és a H1 receptorokon keresztül immunstimuláló, a daganatok proliferációjára is ambivalens hatása van. Amíg a hisztamin a H2 receptoron keresztül serkenti a sejt proliferációt, addig a H1 receptorokon keresztül a tumor növekedését gátolja (32, 17). Az invázió és metastasis képzés folyamata nagymértékben függ a daganat angiogen potenciáljától. Vizsgálatok igazolták a hisztamint mint angiogen faktort, de az 20

21 angiogenezis folyamatában betöltött specifikus működése még ismeretlen. Zaubermann több mint harminc éve publikálta megfigyelését, miszerint a hisztamin nyúl corneában angiogenezist indukál (134). Újabb vizsgálatok alapján a hisztamin érújdonképződést kiváltó hatását valószínűleg a nitrogén oxid generálásával kapcsolatban fejt ki (38). A hisztamin egyik fő forrását jelentő hízósejtekkel kapcsolatos első megfigyelés Ehrlich (1879) nevéhez fűződik, miszerint a hízósejtek nagy számban vannak jelen a tumorhoz közeli területeken. Pár évvel később Westphal (1890) a doktori téziseiben rögzítette a hízósejt akcelerációt a tumor közvetlen környezetében (29). Az utóbbi időben több munkacsoport is igazolta azt az eredeti megfigyelést, hogy a hisztamin egyik fő forrásának számító hízósejtek felszaporodnak számos solid tumor környezetében, sőt colorectalis daganatok esetében prognosztikai jelentőséggel is bírnak (37, 62). A hisztamin kapcsolata az invázióval és a metasztázis képzéssel nem tisztázott. Mint angiogen faktor, indirekt úton erősíti az invázió mechanizmusát, azonban, a metasztázis kaszkád által modellezett folyamatokra gyakorolt, direkt metasztázist befolyásoló hatását eddig nem vizsgálták. A hisztamin jelentőségét a daganatokkal kapcsolatban mutatja, hogy bizonyos malignomák esetén már hisztaminnal kapcsolatos terápiás próbálkozások is történtek. Összevethető vizsgálatok eddig gyomor, colorectalis és emlő carcinoma cimetidin adjuváns kezelésével kapcsolatban állnak rendelkezésünkre. Az első beszámoló a H2 receptor antagonista cimetidin terápiás hatásáról gyomor carcinomában szenvedő betegekben Tonnesen-től származik 1988-ból (122). A cimetidint naponta 2 alkalommal adták 400 mg dózisban, a sebészi tumor-eltávolítást követően 2 évig, randomizált placebo kontrollált vizsgálatban. A túlélés az első évben 17%-al, a harmadik évben 6%- al, az ötödik évben 2%-al volt jobb, mint a placebóval kezelt csoportban. Ugyanakkor Hallissey egy 442 gyomor carcinomás beteganyagot magában foglaló vizsgálatban 400 ill. 800 mg cimetidin, napi kétszeri adásával, sem talált a túlélésben értékelhető eltérést, 44 hónap, az átlagos követési idő alatt (55). A Tonnesen vizsgálatához hasonló eredményket ért el a túlélésben Adams, cimetidin perioperativ adjuváns alkalmazásával, colorectalis rákban szenvedő betegek esetében (1). Ezt az eredményt később igazolta több kutatócsoport is, beszámolva a műtét alatt ill. közvetlen a műtétet követően 21

22 adjuvánsan alkalmazott szelektív H2 receptor antagonista cimetidin túlélést szignifikánsan növelő hatásáról három éves követési időn belül (114, 76). 22

23 4. CÉLKITŰZÉSEK 4.1. Ets-1, E-cadherin és Ki-67 vizsgálata betegekből származó tumor mintákban: A vizsgálat alapvetően kép lépcsőből tevődött össze. Első lépcsőben retrospectiv vizsgálatban jól dokumentált és kórlefolyásában szorosan követett fej-nyaki planocellularis carcinomában szenvedő betegek, kuratív szándékú műtétje során eltávolított specimenek feldolgozásával, vizsgáltuk az adott molekulák jelenlétét, megoszlását, részben RT-PCR részben immunhisztokémiai technikával Ets-1 és MMP-3 RT-PCR vizsgálata műtéti anyagon Műtét során eltávolított tumormintákból, RT-PCR vizsgálattal igazoltuk az ets-1 mrns jelenlétét, majd összevetettük 4 metasztatizáló (M 1-4 ) és 4 nem metasztatizáló (N 1-4 ) esetben RT-PCR vizsgálattal detektált ets-1 és MMP-3 mrns értékeit. Megfogalmazott kérdések: Kimutatható-e az ets-1 transzkripciós faktor mrns-e a tumormintákban, az ép nyálkahártyába? Van-e eltérés a nem metasztatizáló N(0) és metasztatizáló N(+) tumorminták ets-1 és MMP-3 mrns tartalmában? Műtéti anyagon végzett ets-1, E-cadehrin és Ki-67 immunhisztokémiai vizsgálat Az E-cadherin által közvetített intratumorális sejt-sejt közötti adhesiót, a Ki-67 által detektált tumor proliferativ aktivitását, valamint az ets-1 transzkripciós faktor által közvetített mátrix remodelláló képességet vizsgáltuk immunhisztokémiai módszerrel, mint a fej-nyaki planocellularis carcinomák agresszivításának lehetséges markereit. Megfogalmazott kérdések: Van-e összefüggés a primer tumorokban észlelt ets-1 és E-cadherin expresszió és a betegek klinikopatológiai adatai között? Van-e statisztikailag értékelhető eltérés az ets-1, E-cadherin és Ki-67 expresszióban az N(0) és N(+) csoport között? Van-e statisztikailag értékelhető eltérés az ets-1 és E-cadherin expresszióban a primer tumorok és metasztázisok között? 23

24 Van-e statisztikailag értékelhető eltérés az ets-1 pozitív és negatív, valamint az E-cadherin megtartott és csökkent csoport kumulatív túlélése között? 24

25 4.2. In vitro vizsgálat humán melanoma sejtvonalon és humán fibroblast tenyészetben Humán melanoma sejtvonalakon végzett RT-PCR vizsgálat és flow-citometria A műtéti anyagon végzett vizsgálatok tapasztalatainak valamint irodalmi adatok felhasználásával első lépésben metasztatikus fenotípussal rendelkező humán melanoma sejtvonalakon vizsgáltuk az ets-1 gén expresszióját, ill. hisztaminnal való kapcsolatát RT-PCR-el és flow citometriával. Ezt követően, a H2 receptornak a folyamatban történő részvételét igazoltuk flow citometriával. Megfogalmazott kérdések: A hisztamin befolyásolja-e a melanoma ets-1 expressziót? A hisztamin hatása a melanoma sejtek ets-1 expressziójára H2 receptor mediált-e? Human fibroblast sejttenyészetben végeztt RT-PCR, flow-citometria és immuncitokémiai vizsgálat Második lépésben in vitro fibroblast sejttenyészetben modelleztük az ets-1 transzkripciós faktor, az ECM bontásáért felelős MMP-3 és hisztamin közötti kapcsolatot. Annak vizsgálatára, hogy a hisztamin befolyásolja-e a peritumorális fibroblastok MMP-3 termelését, in vitro modellben, primer humán fibroblast tenyészetben, a melanomához hasonlóan, potenciális kapcsolatot kerestünk az alkalmazott hisztamin és az ets-1 ill. a MMP-3 expresszió között. Rekombináns bázikus fibroblast növekedési faktor (bfgf) és hisztamin jelenlétében ill. ezek hiányában vizsgáltuk fibroblast tenyészetben az ets-1 és MMP-3 mrns szintjét reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technikával valamint az ets-1 és MMP-3 protein mennyiségét flow-cytometriával. A hisztamin feltételezett hatásának in situ, sejten belüli vizualizálására fluorescens immuncitokémiai vizsgálatot végeztünk a fibroblast tenyészetben. A modell belső kontrolljaként Wernert és mtsai. által bfgf-ral végzett kísérlet szolgált. A hisztamin befolyásolja-e a fibroblastok ets-1 és MMP-3 expresszióját? A bfgf hatással van-e a fibroblast hisztamin termelésére? 25

26 5. MÓDSZER 5.1. Immunhisztokémia Betegek és tumor minták Ets-1, E-cadherin, Ki-67: Ets-1 esetében 40 beteg (32 férfi, 8 nő), E-cadherin esetében 98 beteg (87 férfi, 11 nő), műtét során eltávolított anyagát vizsgáltuk, akik planocellularis carcinoma miatt curativ szándékú sebészi beavatkozáson estek át az Országos Gyógyintézeti Központ, Fül-Orr-Gégészeti Osztályán, 1993 és 2001 között. A daganatok lokalizáció (mesopharyngealis, laryngealis, hypopharyngealis) és kiterjedés szerinti (T1-T4) beosztását, valamint a nyaki metasztázisok meghatározását N0-tól N3-ig a UICC TNM Classification of Malignant Tumors (1987) szerint végeztük. A szövettani grading megadása a következők alapján történt: grade 1: jól differenciált, grade 2: közepesen differenciált, grade 3: rosszul differenciált. A hisztológiai diagnózist az OGYK Patológiai Osztályán végezték. Az intraoperativ eltávolított specimenekből a tumoros infiltráció macroscopos vizsgálattal meghatározott punctum maximumából végeztük az immunhisztokémiai vizsgálatot. Figyelembe véve a klinikai tapasztalatot, miszerint a nyaki metastasisok bizonyos esetekben hónapokkal a primer tumor radicalis műtéti eltávolítását követően jelentkeznek, a feldolgozás során az ets-1 és E-cadherin esetében a primer tumor mintákat két csoportra osztottuk: N(0) csoport (n=48), ahol klinikailag vagy a block dissecatum feldolgozása után nem volt szinkron nyaki metasztázis és 2 éves követési idő alatt sem jelentkezett, N(+) csoport (n=50), ahol a diagnózis felállításakor ill. a nyaki dissecatum feldolgozásánál, vagy a következő 2 év alatt jelentkezett nyaki metasztásis. Ezeket az adatokat nem a többi klinikopatológiai paraméterrel együtt kezeltük. Megítélésünk szerint ezzel a felosztással a vizsgálat szempontjából jobban tükrözzük a primer daganatok valós metasztatikus potenciálját, mint a hagyományos klinikai vagy patológiai N beosztással Immunhisztokémiai festés: A 3 µm vastagságú, paraffinba ágyazott metszeteket silános lemezen (poly L- lisyn Silan), 60 C -os termosztátban 24 óráig polimerizáltuk. Depparaffináltuk xilolban, leszálló alkoholsorban és mostuk TBS-ben(pH 6,7). Az endogén peroxidáz blokkolást 26

27 3%-os vizes hidrogén peroxiddal végeztük. Antigén feltárást Antigen unmasking solutio-val (Novocastra, H 3300), mikrohullámú kuktában, 700 W-on 20 percig. Az aspecifikus fehérje blokkolást normál lószérummal 10 percig, végeztük. A metszeteket inkubáltuk a primer, egérben termelt monoklonális, E-cadherin (H-108), Ki-67 (BioGenex), és nyúlban termelt poliklonális Ets-1 antitesttel (c-20, Santa Cruz Biotech. Inc.), 1:200 hígításban, 60 percig. Cadensa pufferes kétszeri mosást következett. A metszeteket biotinnal konjugált univerzális, lóban termelt (anti egér/nyúl/patkány/kecske) immunglobulin G-vel (Vectastain Kit, Universal Quick Kit, PK 7800) mint szekunder antitesttel, kötöttük. Majd ismételt Cadensa pufferes mosást alkalmaztunk. Utána streptavidinnel konjugált tormaperoxidázzal (Vectastain Kit, Universal Quick Kit, PK 7800) 5 percig inkubáltuk. Cromogénnek Vector NovaRED Substrat Kit, SK 4800 alkalmaztunk 5 percig, az előhívás mindig mikroszkópos ellenőrzés mellett történt. Háttérfestésre hemalaunt (Gill 2) alkalmaztunk 1 percig, majd csapvízben kékitettük 5 percig. A dehidrálást felszálló alkoholsorban 3x5 percig, terpineolban, és xilolban 3x 5 percig végeztük, végül, pertx-el fedtük. A metszeteket fénymikroszkóppal vizsgáltuk (Nikon Alfa-phot 2) Az immunreakció értékelése: Az értékelést a pozitívan festődő tumorsejtek százalékában adtuk meg, 2000 tumorsejt leszámolása alapján: E-cadherin megtartott 50%, és E-cadherin csökkent <50%, a Sato és mtsai. által alkalmazott skála szerint (104), míg a Ki-67 esetében a pozitív nukleáris festődés százalékos megoszlása alapján Ki-67 indexet vettünk fel. Bár mind a tumor sejtekben, mind a környező stromában észleltünk festődést, az ets-1 expressziót csak a tumor sejtekben számszerűsítettük a festődő sejtek arányában, Pande és mtsai. által javasolt skála szerint: - negatív, + 0-tól 10%, től 50%, +++ >50% (91). 5.2.Melanoma sejtvonalak A HT-168 és a HT-168/M1 sejtvonalak az A2058 sejtvonalból származik a magas metasztatikus kapacitás alapján szelektálva immunszuprimált CBA/Ca egéren. Az A2058 sejtvonal agyi metasztázisból származik. A WM983B sejtvonal bőr 27

28 metasztázisból, míg a WM35 sejtvonalat korai primer tumorból izolálták. A humán melanoma sejtvonalakat Dr. Tímár József bocsátotta rendelkezésünkre (Országos Onkológiai Intézet, Budapest). A sejteket RPMI-1640 médiumon tenyésztettük 10%-os borjú savóval Sejttenyészet Hypopharynx carcinoma miatt végzett műtét során közvetlen a peritumorális területről vett humán nyálkahártya primer fibroblast tenyészetet indítottunk, RPMI médiumon (Sigma, Saint Louis, Missuri, USA) 10% borjú szérummal és antibiotikummal. Amikor a tenyészet elérte a subconfluens szintet, 3 frakciót képeztünk, majd a sejteket mostuk és inkubáltuk RPMI médiumon külön-külön 10 ng/ml recombináns humán bfgf (Sigma, Saint Louis, Missuri, USA) és 1µM hisztamin jelenlétében. A sejtenyészet harmadik kezeletlen frakciója szolgált kontrollként. Mindhárom frakcióból a sejtek egyik csoportját hat órával később RNS kivonásra, míg a másik csoportját 20 órával később flow-cytometriai vizsgálatra készítettük elő. Négy órával a flow-cytometriai vizsgálatra való előkészítést megelőzően 10µg/ml Brefeldin A-t (Sigma, Saint Louis, Missuri, USA) adtunk a sejtekhez, a protein szekréció megakadályozására. Az in vitro kísérlet elrendezését mutatja a 2. ábra. Brefeldin A HA HA 6 óra 16 óra 20 óra bfgf bfgf kontroll Fibroblast RT-PCR FACS tenyészet 2. Ábra A fibroblast tenyészeten végzett kísérlet elrendezése Fluoreszcens im muncitokém ia 28

29 5.4. RT-PCR Betegek és tumor minták Ets-1, MMP-3: Az ets-1 és MMP-3 mrns igazolására véletlenszerűen 3 tumormintát, 1 ép algarati nyálkahártya részletet, és mivel az aktivált lymphocyták magas szinten expresszálják az ets-1 mrns-t, pozitív kontrollként tonsilla szövetet választottunk. Metasztatizáló (M) esetnek vettük, ha a műtét időpontjában már volt igazolt nyaki metastasis, amely szintén eltávolításra került. Nem metasztatizáló (N) esetnek tekintettük, ha a diagnózist és a műtétet követő 2 éves követési időszakban nem jelentkezett áttét RT-PCR A műtéti anyagon végzett RT-PCR esetében, intraoperativ vett és folyékony nitrogénben tárolt, majd homogenizált tumor szövetekből, a primer fibroblast tenyészet esetében a tenyészetből TRI-reagent (Sigma, Saint Louis, Missuri, USA) segítségével izoláltuk az RNS tartalmat a megadott protokoll szerint. Az RT PCR-t Pharmacia Ataq gene Controller-ben végeztük. Az RT reakcióhoz 20 µl össztérfogatban a következőket mértük össze: Mg 2+ (25 mm) 4µl, 10 x puffer 2 µl, dntp (4x 10mM) 2 µl, RN-ase inhibitor 1µl (20 U/µl) (Promega Corp. Madison WI, USA), oligo-dt primer 1µl (Promega Corp. Madison WI, USA), Mu-LV reverz transzkriptáz 0,5 µl (25 U/µl), DEPC-es víz és 1µg az összes izolált RNS-ből. Az RNS mintákból 1 µg-ot írtunk át reverz transzkripcióval cdns-sé 42 0 C-on 30 perc, 99 0 C-on 5 perc, majd a kész mintákat -80 C-on fagyasztottuk. A PCR reakcióhoz szükséges oldat összetevői a következők voltak: 10 x puffer (5 µl), 1mM MgCl 2, dntp, Taq DNS polymerase (5 µl) (Promega Corp. Madison WI, USA), pmol sense és antisense primer és a cdns, összességében 50 µl. Az alábbi oligonukleotid primer szekvenciákat alkalmaztuk az RT-PCR során: (a) humán Ets-1 (33) 5 -GGGTGACGACTTCTTTG-3 (sense primer) és 5 - GTTAATGGAGTCAACCCAGC-3 (antisense primer), 247 bp.; (b) MMP GCTGCAAGGGGTGAGGACAC-3 (sense primer) és 5 - GATGCCAGGAAAGGTTCTGAAGTG-3 (antisense primer), 222 bp. (c) GAPDH 5-29

30 ACGCATTTGGTCGTATTGGG-3 (sense primer) és 5 - TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3 (antisense primer), 231 bp.. A PCR amplificatio 28 ciklusban történt, thermal cyclerben, minden ciklusban: denaturatio 94 C -on 1 percig, annealing 57 C -on 30 másodpercig, primer extensio 72 C -on 1 percig. Minden amplificált mintából 15 µl-t, 2% agaróz gélen megfuttattunk. A DNS-t ethidium bromid festéssel vizualizáltuk. A denzitometriás értékelést Scion Image software-el végeztük (Scion Corp., 82 Worman s Mill Court, Siut H, Frederick, Maryland 21701, USA) 5.5. Fluoreszcens immuncitokémia Az intraoperativ körülmények között indított primer emberi fibroblast tenyészetet 1µM hisztamin jelenlétében inkubáltunk 20 órán keresztül, majd fixáltuk 4%-os paraformaldehiddel. Az indirekt fluoreszcens festést humán ets-1 (c-20, Santa Cruz Biotech. Inc) elleni nyúl antitesttel és humán MMP-3 (Santa Cruz Biotech. Inc) elleni kecske antitesttel végeztük, 1:300 higításban. Az előbbi antitestekkel 30 percig inkubáltuk a sejteket, majd mostuk PBS-ben. Ezt követően fluoreszcein isothiocyanattal konjugált (FITC) (Sigma, Saint Louis, Missouri, USA) anti-nyúl ill. anti-kecske IgG-el inkubáltuk további 30 percig, 1:5000 hígításban, majd confocalis mikroszkóppal vizsgáltuk Az ets-1 és MMP-3 mennyiségi változás detekciója flow-cytometriával Polyclonális nyúl anti-humán ets-1 antitest (c-20, Santa Cruz Biotech. Inc.) és polyclonális kecske anti-humán MMP-3 antitestet (Santa Cruz Biotech. Inc.) használtunk indirekt jelzéssel az intracellularis ets-1 és MMP-3 detekcióra. A fixálást 4%-os parafolmaldehidben, 4 0 C-on 10 percig végeztük, majd intenzív mosást követően, 0,1%-os saponinos permeabilizálás után a sejteket anti-humán ets-1 ill. MMP-3 antitesttel jelöltük 1:100 higításban. A sejteket 30 percig inkubáltuk szobahőmérsékleten, majd ismételt mosás után, FICT-conjugált nyúl ill. kecske IgG-vel (Sigma, Saint Louis, Missuri, USA) 1:1000 hígításban. Ezt követően a sejteket további 30 percig inkubáltuk 20 o C-on. Végül a sejteket mostuk, majd fixáltuk. Legalább sejtet analizáltunk, FACS Calibur (Beckton Dickinson) flow citométerrel. A mérések 30