A SMARCB1 gén genetikai és epigenetikai vizsgálata epithelioid sarcomában

Átírás

1 A SMARCB1 gén genetikai és epigenetikai vizsgálata epithelioid sarcomában Doktori értekezés Papp Gergő Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola Témavezető: Hivatalos bírálók: Dr. Sápi Zoltán egyetemi tanár, D.Sc. Dr. Patócs Attila egyetemi docens, Ph.D. Dr. Szőke János főorvos, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Schaff Zsuzsa egyetemi tanár, MTA tagja Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Borka Katalin egyetemi adjunktus, Ph.D. Dr. Lazáry Áron tudományos igazgató, Ph.D. Budapest 2014

2 1. TARTALOMJEGYZÉK 1. TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BEVEZETÉS Az epithelioid sarcoma A SWI/SNF kromatin-átrendező komplex A SMARCB1 gén Nevezéktan A SMARCB1 gén funkciói SMARCB1 deficiens tumorok Epigenetikai szabályozó mechanizmusok Hiszton metiláció DNS metiláció A mikrorns-ek (mirns-ek) mint poszttranszkripcionális szabályozó molekulák A mirns-ek jellemzői és képződésük folyamata A mirns-ek nevezéktana A mirns-ek szerepe a daganatképződésben CÉLKITŰZÉSEK MÓDSZEREK Vegyszerek, oldatok, pufferek Szövetminták Immunhisztokémia

3 5. 4. Floureszcens In Situ Hibridizáció (FISH) DNS és RNS izolálás Polimeráz láncreakció (PCR) A PCR termékek elválasztása, detektálása és tisztítása A SMARCB1 gén szekvencia analízise A DNS biszulfit konverziója Metiláció-specifikus PCR (MSP) Lézer mikrokimetszés (LCM- Laser Capture Microdissection) Reverz transzkripció (RT) In silico mirns target predikció Sejtkultúra és mirns tranziens transzfekció Valós-idejű kvantitatív PCR (q-rt-pcr) Immuncitokémia Statisztikai módszerek EREDMÉNYEK Szövettani és immunhisztokémiai vizsgálatok SMARCB1 genetikai vizsgálatok Fluoreszcens In Situ Hibridizáció A SMARCB1 gén szekvencia analízise A FISH eredmények validálása A SMARCB1 mrns expressziós szintjének meghatározása SMARCB1 epigenetikai vizsgálatok SMARCB1 promóter metiláció EZH2 mediálta H3K27 trimetiláció A SMARCB1 mrns-t célzó mirns-ek azonosítása

4 In silico target predikció Target predikciós programokkal kiválasztott mirns-ek expressziója epithelioid sarcomában A mirns-ek hatásának funkcionális vizsgálata sejttenyészetekben A mir-206, mir-381, mir-671-5p és mir-765 géncsendesítés hatása a SMARCB1 génexpresszióra A mir-206, mir-381 és mir-671-5p géncsendesítés hatása a SMARCB1 fehérje expressziójára MEGBESZÉLÉS KÖVETKEZTETÉSEK ÖSSZEFOGLALÁS SUMMARY IRODALOMJEGYZÉK SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Az értekezés témájában megjelent közlemények Egyéb témában megjelent közlemények KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

5 2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ABL: ANOVA: APC: ATP: BAF: BCR: CDK: cdns: Cp: DAB: DAPI: ddntp: DNS: dntp: EDTA: EED: EMA: Abelson murine leukemia viral oncogene varianciaanalízis ( Analysis of variance ) Adenomatous polyposis coli adenozin-trifoszfát Brg1/Brm Associated Factors Breakpoint cluster region Ciklin dependens kináz complementary DNS crossing point 3-3 diamino-benzidin 4',6-diamidino-2-fenilindol didezoxiribonukleotid-trifoszfát deoxiribonukleinsav dezoxiribonukleotid-trifoszfát etilén-diamin-tetraecetsav embryonic ectoderm development Epithelialis Membrán Antigén ESR1: ösztrogén receptor 1 ( oestrogen receptor 1 ) EZH2: Enhancer of zeste homologue 2 FBS: fötális borjú szérum ( fetal bovine serum ) 5

6 FFPE: FISH: FLI1: GAPDH: H3K27me3: formalin-fixált, paraffinba ágyazott ( formalin-fixed paraffin embedded ) fluoreszcens in situ hibridizáció Friend leukemia integration 1 transcription factor glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz hiszton H3 lizin 27 trimetiláció HDFα: human dermal fibroblast α HMT: hiszton-metiltranszferáz IDI1: Inhibitor of Differentiation 1 INI1: INtegrase Interactor 1 LCM: LSGS: MEM: MET: mirns, mir: MLPA: mrns: MRT: MSP: NCBI: lézer mikrokimetszés ( laser capture microdissection ) Low Serum Growth Supplement minimum essential medium met proto-oncogene mikrorns multiplex ligációfüggő próba amplifikáció hírvivő ( messenger ) RNS malignus rhabdoid tumor metiláció-specifikus PCR National Center for Biotechnology Information NOTCH3: Notch homolog 3 NSD: nuclear SET domain 6

7 PBS: PcG: PCR: PRC: phosphate buffer saline Polycomb group polimeráz láncreakció Polycomb repressor complex PTK9: Protein tirozin kináz 9 q-rt-pcr: RISC: RNS: RT: SAP: SMARCB1: kvantitatív valós-idejű polimeráz láncreakció RNS indukált csendesítő komplex ( RNS induced silencing complex ) ribonukleinsav reverz transzkripció Shrimp alkalikus foszfatáz SWI/SNF-related, matrix-associated, actin-dependent regulator of chromatin, subfamily b, member 1 SNF5: Sucrose Non-Fermenting gene number 5 SUZ12: suppressor of zeste 12 TAE: TE: Tris-acetát-EDTA Tris-EDTA U: unit (nemzetközi egység) UTR: WHO: fehérjére át nem fordítódó mrns szakasz, ( untranslated region ) World Health Organization (Egészségügyi Világszervezet) 7

8 3. BEVEZETÉS Az epithelioid sarcoma Az Enzinger által 1970-ben azonosított epithelioid sarcoma [1] egy ismeretlen patogenezisű, jellegzetes, de ritka malignus lágyrész daganat, mely a sarcomák mintegy 0,6-1%-át [2], a gyermekkori nem rhabdomiosarcomatózus lágyrész sarcomák 4-8%-át [3] képezi napjainkban. A tumor két klinikopatológiai altípusát ismerjük, a klasszikus vagy disztális típust és a proximális (nagysejtes) variánst. A disztális altípus incidenciája körülbelül kétszer nagyobb a proximális típusénál [4]. Az elváltozás előfordulása altípustól függetlenül a férfiak körében közel kétszer gyakoribbnak számít, mint a nők körében [5]. A klasszikus típus az esetek több mint 70%-ában a 10 és 40 év (átlag 25,5 év) közötti korosztályt érinti [5]. A proximális variáns valamivel idősebb populációra jellemző, az érintett betegek több mint 80%-a 20 és 65 év (átlag 40 év) közötti kormegoszlású [6]. A klasszikus típusú epithelioid sarcoma főként a felső végtagok disztális részein fordul elő, az esetek több mint 60%-a az ujjakban és a kézben, ezt követik az alsó végtagi disztális és proximális, a felső végtagi proximális, végül a törzsi, feji és nyaki elhelyezkedések [7, 8]. A proximális típus leginkább a törzsi részek mélyebb lágyrész szöveteiben és a csípő/far tájékon jelenik meg, kisebb részben a combra, a fej és nyak régióra, a hónaljra és a végtagokra lokalizálódik [7, 8]. A felületi elhelyezkedésű lézióik szoliter vagy multiplex, lassan növekvő, rendszerint fájdalommentes és kemény csomókként ismeretesek. Az elváltozások gyakran nehezen gyógyuló bőr fekélyre emlékeztetnek. A mélyebb szövetekben előforduló típusok rendszerint nagyobb méretűek és infiltrálóbb tulajdonságúak [6]. Az ötéves betegségmentes túlélési arány 60-80% közé, a tízéves pedig 42-62% közé esik a nagyobb beteganyagokat tartalmazó vizsgálatok alapján [9, 10]. Metasztázisok a betegek mintegy 40-50%-ában alakulnak ki, rendszerint a tumorok ismételt kiújulásait követően és az áttétek leggyakrabban a tüdőt, valamint a regionális nyirokcsomókat érintik [11]. A tumor ötéves lokális kiújulásának rátája 35%-ra tehető [10]. Mindkét altípus esetén rossz prognosztikai faktornak számít a férfi nem, az előrehaladott kor, a proximális/axiális lokalizáció, az 5 cm-nél nagyobb tumorméret, a 8

9 magas mitotikus aktivitás, a nyirokcsomói érintettség, a proximális szöveti altípus rhabdoid morfológiával és a kiterjedt nekrózisok jelenléte [12]. A proximális típusú epithelioid sarcoma prognózisa szignifikánsan kedvezőtlenebb, mint a disztális típusé [3], viszont sokkal jobb, összehasonlítva a malignus rhabdoid tumor kimenetelével [12]. A tumorok széles sebészi eltávolítása a legelső és leginkább alkalmazott kezelési mód, de számos esetben használnak magas dózisú kemoradioterápiát [13, 14]. Azonban egy 11 beteget magába foglaló tanulmányban azt közölték, hogy sem a doxorubicin alapú kemoterápia, sem a sugárkezelés nem javította a tünetmentes túlélést [15]. Ugyanebben a tanulmányban javasolják a szerzők, hogy a betegek túlélését és életminőségét hatékonyan segítő kezelési stratégiák meghatározásához nagyobb szintű intézményi kollaborációk szükségesek a jövőben. Az epithelioid sarcoma sejtekre a multidirekcionális, de legfőképpen az epitheliális differenciáció jellemző. A disztális altípus (1a. ábra) legtöbbször centrális nekrózis körül, szinte néha granulómát utánzó viszonylag monomorph daganatsejtekből épül fel, relatíve alacsony mitotikus aktivitás és a daganatsejteket övező lymphoid sejtes beszűrődés jellemzi. Ezzel szemben az elsőként 1997-ben leírt proximális típusú epithelioid sarcoma (1b. ábra) [16] gyakrabban mutat rhabdoid morfológiát, azaz a sejtek széles citoplazmával rendelkeznek, a magok excentrikus elhelyezkedésűek, prominens nukleóluszok láthatók és magasabb a tumor mitotikus aktivitása [17] is. Ezen utóbbi típus akár éretlen laphámrákra vagy angiosarcomára is emlékeztethet. A rhabdoid morfológia [18] a rendkívül magas malignus potenciálú rosszindulatú, akár mezenchimális vagy epitheliális daganatok indikátorának tekinthető. Számos tanulmány rámutatott a rossz prognózis és a rhabdoid sajátosság közti összefüggésekre [19-23]. A jól elkülöníthető rhabdoid jellegű sejt (2. ábra) excentrikus sejtmaggal, szembetűnő nukleusszal rendelkezik, eozinofil citoplazmájában gömbszerű, pericentrikusan elhelyezkedő, citokeratin és vimentin intermedier filamentumokból felépülő inklúziós test (zárványtest) található [24]. Főként a proximális típusú epithelioid sarcoma elkülönítése okoz nehézséget más gyengén differenciált carcinomától és epithelioid malignus tumoroktól [13]. Az epithelioid sarcoma immunfenotípusát jellegzetes vimentin és epitheliális markerek: alacsony és magas molekulasúlyú citokeratinok, keratin 8, keratin 19 [21] és EMA [11] expressziója jellemzi (1c. és 1d. ábra). A carcinomákkal ellentétben az 9

10 epithelioid sarcomák mintegy 50%-a mutat CD34 immunpozitivitást (1e. ábra) [25]. Számos tanulmányban kimutatták a SMARCB1 nukleáris fehérje expressziójának hiányát az epithelioid sarcomák körülbelül 90%-ában (1f. ábra) [26, 27]. Az S100, desmin és FLI-1 immunhisztokémiai festések rendszerint negatívak bennük [28]. Bár a primer és metasztatizáló epithelioid sarcomán végzett citogenetikai vizsgálatok komplex eltéréseket találtak, különösen a 22q11 kromoszóma régiónak tulajdonítottak szerepet a tumor patogenezisében [29]. A 22q abnormalitások érintettségét a heterozigótaság vesztéses kísérletek is feltételezték [30]. A 22q11-12 régiót érintő genetikai változások a SMARCB1 tumorszupresszor gén mutációit, delécióit vagy más eltéréseit foglalták magukba. Ezeket a genetikai eltéréseket a gyerekkori vese és központi idegrendszeri rhabdoid tumorokban szintén megfigyelték [31]. Bár SMARCB1 inaktivációt az epithelioid sarcomák többségében [32] és a malignus rhabdoid tumorokban egyaránt leírtak, előbbiekben a SMARCB1 mutációk gyakorisága szignifikánsan alacsonyabbnak adódott [26, 27]. Mindez azt sugallja, hogy a SMARCB1 fehérje expresszió hiányáért felelős mechanizmusok eltérőek lehetnek a két említett entitásban. 10

11 1. Ábra: Disztális (a; 20x nagyítás) és proximális (b; 20x nagyítás) típusú epithelioid sarcoma H&E (hematoxilin-eozin) festett képe. A tumorsejtek jellegzetes vimentin (c; 20x nagyítás), citokeratin (d; 20x nagyítás) és CD34 (e; 20x nagyítás) pozitivitása, valamint SMARCB1 (f; 20x nagyítás) negativitása immunhisztokémiai reakciókkal kimutatva. 2. Ábra: Jellegzetes rhabdoid sejtek H&E festett morfológiai képe (100x nagyítás) 11

12 3. 2. A SWI/SNF kromatin-átrendező komplex A DNS nukleoszómákba való szerveződése, tehát maga a kromatin szerkezet gátolja a génkifejeződést azzal, hogy a transzkripciós faktorok, az aktivátorok és az RNS polimeráz nem fér hozzá a DNS-hez. A transzkripció előfeltétele a kromatin fellazulása. A génexpressziót befolyásoló kromatin változások lehetnek: kromatinátépítés (chromatin-remodeling), hisztonok módosulása vagy DNS metiláció. Ezidáig összesen öt ATP függő kromatin-átépítő komlexet ismerünk: SWI/SNF, ISWI, NuRD, INO80 és SWR1. Ez egy új és összetett területe a biológiának, a legtöbb információval talán a SWI/SNF kromatin-átépítő komplexekről rendelkezünk. Eme komplexek az összes eukarióta szervezetben megtalálhatók és nagyfokú evolúciós konzerváltságot mutatnak. A SWI/SNF fehérje komplexek felépítését a 3. ábra mutatja be. A fehérje komplex ATP energiájának felhasználásával képes a nukleoszómákat áthelyezni és ezzel pl. a promótert hozzáférhetővé tenni [33, 34]. Ennek a dinamikus folyamatnak jelentős szerepe van a sejtek differenciációjában és jelátviteli útvonalaiban, valamint specifikus target gének transzkripciójának szabályozásában [35]. 3. Ábra: Az SWI/SNF komplexek felépítése. Evolúciósan konzervált központi alegységekből (zöld) és variábilis alegységekből (sárga) állnak. A BRG1-asszociált faktor (BAF) és a polybromo BRG1-asszociált faktor (PBAF) komplexek képezik a legfőbb alosztályaikat. Az AT-gazdag interaktív domént tartalmazó protein 1A (ARID1A) és az ARID1B (kék) a BAF komplexhez társultak, míg BAF200, BAF180, valamint bromodomain tartalmú protein 7 (BRD7) (piros) a PBAF komplexben egyediek. 12

13 A SWI/SNF komplexek számos variánsa ismert emlősökben, megkülönböztetésük szövet specifikus alegységeiknek megfelelően lehetséges. (1. táblázat) Az emlős SWI/SNF komplex az élesztővel homológ SWI2/SNF2 ATPáz fehérje családból (vagy SMARCA4/BRG1 vagy SMARCA2/BRM), SMARCB1, SMARCC1/BAF155 és SMARCC2/BAF170 központi alegységekből, valamint 4-8 szöveti származás alapján különböző további alegységből épül fel [36, 37]. A SMARCB1 az összes SWI/SNF variánsban központi alegységként szerepel. A fehérje szintúgy magasan konzervált, amint azt egér és humán aminosav szekvenciák mutatják. 1. Táblázat: SWI/SNF komponensek élesztőben, ecetmuslicában és emlősökben Emlős SWI/SNF alegységek Nem-gerinces ortológok Alegység neve Gén neve Saccharomyces Drosophila BAF250A ARID1A SWI1 OSA BAF250B ARID1B BAF200 ARID2 BAP170 BRM SMARCA2 SWI2/SNF2 BRM BRG1 SMARCA4 SWI2/SNF2 BRM BAF180 PBRM1 RSC1 Moira/BAP155 BAF170 SMARCC2 SWI3 Moira/BAP155 BAF155 SMARCC1 SNF12 BAP60 BAF60A SMARCD1 SNF12 BAP60 BAF60B SMARCD2 SNF12 BAP60 BAF60C SMARCD3 BAF57 SMARCE1 Dalao/BAP111 BAF53A ACTL6A BAP55 BAF53B ACTL6B ARP4 BAF47 SMARCB1 SNF5 SNR A SMARCB1 gén Nevezéktan A gén ortológját először mutáns élesztő szervezetek szacharóz fermentációra képtelen változataiban vizsgálták [38]. Ezáltal kapta a gén a Sucrose Non-Fermenting gene number 5 (SNF5) nevet, majd megállapították róla, hogy átírt fehérjéje a SWI/SNF 13

14 kromatin-átrendező komplex tagja [39]. A humán ortológot a humán immundeficiencia vírus integráz fehérjével kölcsönható proteinként azonosították, így nevezték el INtegrase Interactor 1-nek (INI1) [40]. Feltételezték, hogy az emlős SWI/SNF komplex szerepe valamennyiben eltér az élesztőben leírt funkcióktól, ezért a Brg1/Brm Associated Factors complex (BAF komplex) névváltoztatást javasolták. Majd a 47 kdaos molekula tömege miatt nevezték el BAF47-nek. A HGNC (HUGO Gene Nomenclature Committee) 2002-es évi szabályzata [41] alapján a gén megnevezésére elfogadott szimbólum a funkcionális szerepre utaló SMARCB1 ( SWI/SNF related, Matrix associated, Actin dependent Regulator of Chromatin, subfamily B, member 1 ) lett, mely név alapján a fehérje a SWI/SNF ATP-függő kromatin-átrendező komplex központi alegységeként működik [42] A SMARCB1 gén funkciói Korábban megjelent tanulmányok kimutatták, hogy a SMARCB1 gén a genom stabilitásának ellenőrzésében és a sejtciklus progressziójának szabályozásában vesz részt [43]. A SMARCB1 serkenti a p16/rb tumorszupresszor útvonalat, azáltal hogy aktiválja a CDKN2A-t és gátolja a CDK / ciklin D komplexet [44]. A SMARCB1 kiesés a sejtciklus progresszióját okozza részben a p16 INK4a leszabályozásával és az E2F és ciklin D1 felülszabályozásával (4. ábra) [45-48]. Bár a SMARCB1 vesztés kiváltotta abnormális proliferációs stimulus is serkenti a sejtciklus ellenőrző pontjait, ezáltal nyugalmi állapotot és apoptózist indukál. Így annak ellenére, hogy felülszabályozódnak a proliferációhoz asszociált útvonalak, a SMARCB1 biallélikus kiesése a primer sejtekben letálisnak bizonyul. Továbbá a SMARCB1 hiányos sejtek túlérzékenységet mutatnak a genotoxikus stresszre, emelkedett számú aberráns mitózissal bírnak és felhalmozzák a foszforilált p53-at. Mindez specifikus p53 target gének emelkedett expresszióját eredményezi utalva a SMARCB1 szerepére a DNS károsodásokra adott válaszban [49]. A SMARCB1 szerepét kimutatták az aktin citoszkeleton hálózat szabályozásában, továbbá azt találták, hogy vesztése aktiválja a RhoA jelutat és fokozott migrációval jár [50, 51]. Ezenfelül rhabdoid sejtvonalakban a SMARCB1 14

15 hiánya megakadályozta az interferon stimulálta gének aktivációját, ami az interferon kezelés lehetőségét vetheti fel [52] (4. ábra). 4. Ábra: A SMARCB1 vesztés tumor-asszociált hatásai SMARCB1 deficiens tumorok A SMARCB1 gén a 22q11.23 kromoszóma régióban helyezkedik el, és mint szupresszor gén vált ismertté malignus rhabdoid tumorokban (MRT) [53, 54]. Az MRT egy nagyon agresszív neoplázia gyermekek veséjében, extra-renális lágyrészeiben és agyszövetében. Ebben a daganattípusban a SMARCB1 gén mindkét allélját érintő, ún. biallélikus génkárosodás azonosítható, ami arra utal, hogy a tumorszupresszor funkcióvesztő mutációja hozzájárul a tumor onkogeneziséhez [53]. Azonban úgy tűnik, hogy a SMARCB1 gén további tumortípusok patogenezisében szerepet játszik. Az epithelioid sarcoma, a vese medulláris carcinoma, az epithelioid malignus idegsejt tumor, a mioepitheliális carcinoma és az extraszkeletális mixoid chondrosarcoma jelentik a daganatok azon csoportjait, melyek SMARCB1 aberrációkon osztoznak [55]. Az előzőleg említett entitások mindegyike mutathatja a SMARCB1 expresszió hiányát, jellemzőik lehetnek a rhabdoid citomorfológia és a néha átfedő immunhisztokémiai és szövettani tulajdonságok. 15

16 3. 4. Epigenetikai szabályozó mechanizmusok A genom a bázisok sorrendje által meghatározott genetikai információ mellett poszt-szintetikus módosításoknak köszönhető ún. epigenetikai többletinformációt is tartalmaz. Mindez a genetikai információ megfelelő helyen és időben történő hasznosításának koordinációját teszi lehetővé. Az epigenetikai információ elsősorban a gének expressziójának szabályozásában játszik szerepet. Fontosságát leírták az embriogenezis és a szöveti differenciálódás szabályozásában [56, 57], a kromoszómák megfelelő szerkezetének kialakításában [58], az X kromoszóma inaktiválásában [59] és a genomikus bevésődés (imprinting) kialakításában [60]. Ezeken felül az epigenetika fontos szerepet tölt be a tumorképzésben is [61, 62]. Az epigenetikai szabályozás a DNS metilációján vagy a különböző hiszton modifikációkon (acetiláció, metiláció, foszforiláció, ubikvitináció, stb.) keresztül valósulhat meg. A géncsendesítésben szerepet játszó Polycomb represszor fehérje komplexek [63, 64], valamint a microrns-ek (mirns) [65] is az epigenetikai szabályozás részének tekinthetőek Hiszton metiláció A génkifejeződés epigenetikai szabályozásának egyik mechanizmusa a hiszton fehérjék poszt-transzlációs módosítása. A módosítások lehetnek acetilációk, metilációk, foszforilációk, ubikvitinációk, sumoylációk, stb. [66]. Ezek közül a metiláció és az acetiláció a leggyakrabban tanulmányozott hisztonmodifikációs mechanizmus. A hiszton fehérjék acetilációja eltávolítja a pozitív töltéseket, ami által csökken a hiszton DNS-hez való affinitása, s így az RNS polimeráz és a transzkripciós faktorok könnyebben hozzáférnek a DNS szabályozó régióihoz, ami megnöveli az érintett génekről történő transzkripció végbemenetelének esélyét. A hisztonok metilációjához metil gyök (-CH3) hozzáadása az acetilációval rendszerint ellenkező hatású. A metilált hisztonok általában (nem mindig) erősebben kötődnek a DNS-hez. A metiláció célpontja a hisztonok N-terminálisán elhelyezkedő bázikus lizin, arginin és hisztidin 16

17 aminosavak. A metiláció eredményeként az aminosavak 1, 2 vagy 3 H atomja metilgyökre cserélődik, s így metil-lizin (me1), dimetil-lizin (me2) vagy trimetil-lizin (me3) molekulákat kapunk. A metiláció nem a hiszton töltését befolyásolja, hanem megváltoztatja a hisztonok egymással és a szabályozó fehérjékkel való kapcsolatát. A metiláció rendszerint erősíti a hiszton-dns kapcsolódást, s így csökkenti (meg is szüntetheti) egy DNS szegmens transzkripciós aktivitását. A legszélesebb körben tanulmányozott hiszton metilációs helyek a H3 lizin4 (H3K4; a H3 hiszton alegység 4. pozíciójában lévő lizin), a H3K9, a H3K27, a H3K36, a H3K79 és a H4K20. A metillizin molekula jellege, mintázata és a metiláció foka (me1, me2 vagy me3) különbféle génexpressziós állapotokkal hozható összefüggésbe. Például a H3K4me3 általában aktív transzkripciót eredményez [67], míg H3K27me3 negatívan szabályozza a génexpressziót, mivel a kompakt kromatin állomány létrejöttét segíti elő. A metilációt specifikus hiszton-metiltranszferáz (HMT) enzimek végzik. Hasonlóan az acetilációhoz, a metiláció is reverzibilis, a CH3 gyökök eltávolítását a hiszton farkak lizin és arginin aminosavairól a különféle hiszton demetiláz enzimek hajtják végre. Számos bizonyíték utal arra, hogy az aberráns hiszton metilációnak szerepe lehet a daganatképződésben. A hiszton metilációt módosító és a metilkötő fehérjék mutációi vagy kifejeződésük változásai korrelációt mutatnak a különböző daganatos megbetegedések növekvő incidenciájával [68, 69]. Például a H3K27me3 metiltranszferáz EZH2 (Enhancer of zeste homologue 2) felülszabályozódik számos tumor például prosztata [70], emlőrák [71], limfóma [72] és egyes lágyrész sarcomák, pl. synovialis sarcoma [73] esetében is. Az EZH2 overexpressziója korrelációt mutat az előrehaladott daganatos progresszióval, a tumor agresszív viselkedésével és előnytelen klinikai kimenetelével [74].Az EZH2 a Polycomb fehérje család (PcG-polycomb group) tagja, mely fehérjék a transzkripció gátlás epigenetikai szabályozói (5. ábra) és a sejtciklus regulációjában, a DNS károsodások kijavításában, a sejtek differenciálódásában, szeneszcenciájában és apoptózisában vesznek részt. A PcG fehérje család tagjai két, ún. multimer polycomb represszor komplexet (PRC-Polycomb Repressive Complex), a PRC1-et és a PRC2-t alkotják. Az EZH2 az EED (embryonic ectoderm development) és a SUZ12 (suppressor of zeste 12) alegységekkel funkcionális kölcsönhatásban szerepelve adják a PRC2 központi tagjait és katalitikus alegységeit (5. ábra). 17

18 5. Ábra: Az EZH2 által közvetített hiszton metiláció és transzkripció gátlás. A PRC2 komplex alegységeként az EZH2 az EED és SUZ12 fehérjékkel interakcióba lépve képes a hisztonok lizin oldaláncára metil csoportokat kötni, ezáltal a génkifejeződést szabályozni DNS metiláció Nem csupán a hisztonok, hanem a DNS is metilálódhat, melynek funkciója a kompakt kromoszómaszerkezet kialakítása és a transzkripció gátlása. Magasabb rendű eukariótákban metilált lehet a DNS CG dinukleotidban gazdag régiójában elhelyezkedő citozin pirimidingyűrűjének 5. szénatomja. Ennek a módosulásnak fontos szerepe van a gének expressziójában, különösen, ha egy génben CpG-gazdag régió (CpG sziget; a p azt jelzi, hogy a két nukleotid foszfodiészter kötéssel kapcsolódik egymáshoz) található. Ezek gyakran a gént szabályozó, ún. promóter régiójában találhatók. Normál, nem malignusan transzformált sejtekben a legtöbb CpG sziget nem metilált állapotban fordul elő [75]. Egy normálisan nem metilált CpG sziget kóros metilációja megakadályozza a gén transzkripcióját, amely nem ritka jelenség daganatos sejtekben. Ez a mechanizmus 18

19 tumorszupresszor gének inaktiváló mutációjával ekvivalens funkcióvesztést eredményez [75, 76]. A különbféle sarcomák esetében ismert már, hogy megnövekedhet bennünk bizonyos promóterek metilációja. Például, egy vizsgálat mintegy 98 tumor több mint 1000 CpG szigetének tanulmányozásával felfedte, hogy néhány malignus daganat (mell, fej és nyak, here) esetében alacsony szintű a metiláció, míg mások, köztük 22 primitív neuroektodermális tumor nagy frekvenciájú metilációt mutatott [77]. Továbbá számos sarcoma sejtvonalban és primer tumorban azonosítottak túlzott mértékben metilált, specifikus géneket, beleértve a kulcsfontosságú sejtciklus szabályzó CDKN2A gént és másokat [78, 79]. Mixoid/kereksejtes liposarcomában például kimutatták a fontos tumorszupresszorként ismert APC gén promóterének magas frekvenciájú CpGmetilációját [80] A mikrorns-ek (mirns-ek) mint poszttranszkripcionális szabályozó molekulák A mirns-ek jellemzői és képződésük folyamata A mirns-ek rövid, nukleotid hosszúságú, fehérjét nem kódoló, egyszálú ribonukleinsav (RNS) molekulák, amelyek az ún. RNS-interferencia endogén mediátorai. Irodalmi adatok szerint a humán génátiratok mintegy 30-50%-át szabályozzák [81, 82]. A mirns-ek speciális érési útvonalon keresztül nyerik el az effektor formájukat: pri-, pre-mirns formán át különböző enzim-komplexek hasításának segítségével duplaszálú, érett mirns-ekké alakulnak [83]. A származásuk szerint keletkezhetnek egyedi génekről (ún. intergénikus mirns-ek) vagy származhatnak intronikus régiókból is [84]. Attól függően, hogy egy átírási egységbe hány mirns tartozik, klasztereket különböztethetünk meg [85], pl.: mir es klaszter, melynek érett mirns-ei központi jelentőséget töltenek be az apoptotikus folyamatok szabályozásában [86]. A mirns génekről az RNS polimeráz II (pol II) a sejtmagban egy elsődleges vagy más néven primer (ún. pri-mirns) transzkriptumot ír át, mely a termodinamikai összefüggéseknek megfelelő, részleges kettősszálú 19

20 térszerkezetet vesz fel. Ennek hatására hajtű régiók alakulnak ki, melyekről az érett mirns-ek létrejöhetnek. A képződő duplaszálú prekurzor (ún. pre-mirns) alakot egy Drosha nevű RNáz III típusú enzim hasítja le a primer formáról. Az enzim általi felismerés és levágás szigorúan meghatározott szabályok szerint történik, azonban a részletek máig nem tisztázottak teljesen. A következő lépésben az állati sejtek esetében a sejtmagból a citoplazmába kerül a hurkos, kétszálú pre-mirns egy membránfehérje, az Exportin-5 segítségével. A növényi sejtekben ezzel szemben ez még a sejtmagi folyamat része. A citoplazmába került duplaszálú, hurkos forma ezután hasításon megy keresztül, melyet egy RNáz III típusú enzim, a Dicer végez el. A kétszálú, nukleotid hosszúságú termék a következő lépésben egy helikáz enzim segítségével egyszálúvá alakul, így beépülve egy fehérje komplexbe, a RISC-be [mely az RNS indukálta csendesítő komplex ( RNA induced silencing complex ) kifejezésből származik], és az mrns-ek repressziójában vagy azok hasításában vesz részt [87] A mirns-ek nevezéktana A szekvenciájukban különböző, érett mirns-eket a "mir-" előtag után feltüntetett sorszámmal különítjük el egymástól. A mir előtt feltüntetett "hsa-" előtag a mirns humán eredetére utal. Előfordulhat, hogy ugyanazon mirns-t egy fajon belül a genom különböző lókuszain elhelyezkedő több gén is kódol, és ezeket a mirns sorszáma után kötőjellel feltüntetett újabb számmal különítik el (pl. mir-6-1, mir-6-2). Az egy-két nukleotidban különböző mirns variánsokat betűjellel különítik el (pl.: mir-181a, mir-181b). Az is előfordul, hogy egyes mirns prekurzorok mindkét száláról érett mirns képződik. Amennyiben az egyik karról szintetizált mirns túlsúlyban van, a kevésbé domináns mirns-t csillaggal jelölik (pl.: mir-129, mir- 129*). Egy adott prekurzor 5 karjáról keletkező mirns-t a mirns sorszáma utáni -5p, míg a 3 végről képződő mirns esetén a -3p megjelölést alkalmazzák (pl.: mir-485-5p, mir-485-3p) [88, 89]. 20

21 A mirns-ek szerepe a daganatképződésben A mirns-ek tumorszupresszorok és protoonkogének poszt-transzkripciós gátlásán keresztül szabályozzák a jelátvitel és a sejtciklus folyamatait. Ebből következik, hogy expressziójuk változása a sejtosztódás egyensúlyának felborulásához, fokozott sejtproliferációhoz és daganatképződéshez vezet. A mirns-ek tumorigenezisben betöltött szerepére utal az is, hogy az ezeket kódoló gének több mint fele, olyan sérülékeny kromoszóma régiókban található, amelyek aberrációja gyakran megfigyelhető daganatokban. Az utóbbi években a tumorbiológiai kutatások egyre nagyobb hangsúlyt fektettek a különböző daganattípusok mirns expresszió alapján történő osztályozására. Az mrns expressziós mintázat alapján történő vizsgálatokkal szemben a mirns-ek előnye, hogy mivel egy mirns molekula egyszerre több száz cél mrns expresszióját szabályozhatja, így már jóval kisebb számú mirns marker is elegendő jól elkülöníthető csoportok felállításához [90, 91]. A mirns-ek patogenetikai szerepét elsőként B-sejtes krónikus lymphoid leukémia esetén igazolták [92]. Ezt követően azonban számos daganattípusban írtak le szignifikánsan megváltozó mirns expressziós mintázatot, többek közt pancreas [93], pajzsmirigy [94], tüdő [95], máj [96], gyomor [97], petefészek [98] és különböző idegrendszeri daganatok (glioblastoma multiforme, neuroblastoma) esetében is [99]. Daganatokban az ép szövethez képest változást mutató expressziójú mirns-ek a klasszikus onkogén-tumorszupresszor vonal alapján osztályozhatók. Azaz a tumorszövetben fokozott expressziót mutató mirns-ek onkogén (onkomir), míg a represszáltak tumorszupresszor tulajdonságúak. Mivel az in silico becslések alapján a mirns-ek egyszerre akár több száz protoonkogén és tumorszupresszor tulajdonságú célmolekulát is szabályozhatnak, így daganatképzésben betöltött szerepük tisztázásához elengedhetetlen célpontjaik és azok biológiai funkciójának azonosítása is. Mindez arra utal, hogy a mirns-ek expressziós mintázatának tanulmányozása különböző tumorok esetében több szempontból is nagy jelentőségű. Egyrészt közelebb vihet a daganatok patogenezisének pontosabb megértéséhez, másrészt segítségével olyan biomarkerek azonosíthatók, melyek alkalmazása nagymértékben megkönnyíti a tumorok pontos diagnosztizálását. Ilyen biomarkereket alkalmaznak többek közt a follicularis pajzsmirigytumorok esetében is. Ezek kórszövettani elkülönítése rendkívül 21

22 nagy gyakorlatot igényel, kétes esetekben azonban néhány mirns marker (mir-197, mir-221, mir-346) expressziójának vizsgálata segítheti a diagnózist, illetve a későbbi terápia megválasztását [100]. A mir-221 expressziójának változása azonban nem csak tumoros szövetekben, hanem a környező, szövettanilag még ép területeken is megfigyelhető. Ez felveti annak lehetőségét, hogy a mirns expresszió megváltozása a tumorképződés kezdeti jele, így segítéségével a betegség már korai stádiumban is felismerhető. A mirns expresszió vizsgálata a prognózis megállapításának szempontjából is jelentőséggel bír, mivel egyes daganatok esetében a tumor agresszivitása, az áttétképződés és a betegek túlélési ideje mind előrejelezhetőek a mirns profil alapján [101]. Végül, de nem utolsó sorban a változást mutató mirns-ek és az általuk szabályozott gének a jövőben a daganatterápia új célpontjait is jelenthetik. 22

23 4. CÉLKITŰZÉSEK Munkánk során az epithelioid sarcoma kialakulásában szerepet játszó genetikai és epigenetikai tényezők vizsgálatát tűztük ki célul. Azt szerettük volna megállapítani, vajon milyen biológiai mechanizmus állhat a SMARCB1 tumorszupresszor gén expressziójának eltűnése mögött ebben a daganat típusban. Főbb kérdéseink, feltételezéseink a következők voltak: 1. A SMARCB1 gén mutációs státuszának feltárásával arra kerestük a választ, vajon genetikai károsodások (kromoszóma deléciók, exon deléciók, intraexonikus aberrációk) tehetők-e felelőssé a gén funkciójának hiányáért epithelioid sarcomában. 2. Feltételeztük, hogy a SMARCB1 gén promóterében lévő CpG szigetek hipermetilációja okozhatja a génexpresszió tapasztalt gátlását. 3. Az EZH2 mediálta hiszton metiláció esetleges szerepét az EZH2 és a H3K27me3 epigenetikai marker fehérje expressziójának meghatározásával kívántuk vizsgálni. 4. Feltételeztük, hogy mirns-ek mint poszt-transzkripciós szabályozók felelősek a SMARCB1 gén csendesítéséért. Ennek kiderítéséhez célul tűztük ki a gén 3 UTR-jét potenciálisan felismerő mirns-ek azonosítását bioinformatikai módszerekkel. A lehetséges patogenetikai szereppel bíró mirns-eket mirnsexpressziós vizsgálatokkal kívántuk identifikálni. Az emelkedett expressziót mutató mirns-ek funkcionális hatását in vitro szövettenyészeteken kívántuk vizsgálni. 23

24 5. MÓDSZEREK Vegyszerek, oldatok, pufferek A különböző laboratóriumi vegyszereket (pl. Xilol, Etanol, stb) a MOLAR Chemicals Kft-től szereztük be. Minden a vizsgálatokban használt reagens molekuláris biológiai tisztaságú volt. A vizsgálatok során használt oldatok, pufferek elkészítéséhez és azok hígításaihoz háromszor desztillált (Millipore Co.), autoklávozott vizet használtunk. A szövettenyészeti tápfolyadékok a foetalis marhaszérum (FBS) és egyéb szövettenyészeti anyagok, mint antibiotikumok, tripszin-edta oldat (0,5 g/l tripszin, 0,2 g/l EDTA) a Sigma (St. Louis, MO, USA) és a Gibco BRL (Eggenstein, Németország) termékei voltak. A szövegben részletesen nem specifikált oldatok és pufferek összetétele: citrát: 10x-es (ph=6): 29,41g C 6 H 5 Na 3 O 7 *2 H 2 O SSC: 20x-os (ph=7): 175,3g NaCl; 88,2g C 6 H 5 Na 3 O 7 *2 H 2 O TAE: 10x-es (ph=8,0): 0,4M Tris-HCl, 0,02M EDTA, 11,4ml/l ecetsav TE: 1x-es (ph=8,0): 10mM Tris, 1mM EDTA Szövetminták Vizsgálatainkhoz összesen 36 epithelioid sarcomában szenvedő beteg formalinban fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) mintáját használtuk, melyből 17-et a Semmelweis Egyetem I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben, hatot az Országos Onkológiai Intézetben, kilencet a chicagói Egyetem Orvosi Központjában, hármat a rochesteri Mayo Klinika Patológiai Intézetében és egyet pedig a texasi Scott & White Egészségügyi Központban diagnosztizáltak és archiváltak. A diagnózisok a WHO (World Health Organization) kritériumainak megfelelően, hisztopatológiai és 24

25 immunfenotípus vizsgálatok alapján történtek. A vizsgált betegek klinikai adatai és immunhisztokémiai eredményei (SMARCB1 és CD34) a 2. táblázatban láthatóak. 2. Táblázat: A betegek klinikai adatai, SMARCB1 és CD34 immunhisztokémiai eredményeik; ES: epithelioid sarcoma Esetszám Nem Életkor Lokalizáció ES altípusa SMARCB1 CD34 1 férfi 42 nyirokcsomó metasztázis proximális férfi 69 jobb oldali lágyék régió proximális nő 30 jobb kéz proximális férfi 84 bal comb proximális nő 62 nagy cseplesz proximális férfi 29 bal alsó vagtag disztális nő 49 bal alsó vagtag disztális nő 30 bal oldali lágyék régió proximális nő 36 jobb comb disztális nő 40 ízület proximális férfi 29 fejtető disztális férfi 34 jobb oldali lágyék régió proximális nő 70 hüvely proximális nő 87 jobb kéz disztális nő 50 gáttájék proximális nő 43 bal hüvelykujj disztális férfi 83 jobb gyűrűsujj disztális férfi 29 bal alkar disztális férfi 48 pleura metasztázis proximális férfi 23 jobb alkar disztális férfi 17 bal alkar disztális nő 18 jobb alkar disztális férfi 42 bal hüvelykujj disztális nő 12 jobb kéz disztális férfi 12 fejtető metasztázis disztális nő 23 nyirokcsomó metasztázis disztális férfi 31 nyirokcsomó metasztázis disztális férfi 25 bal alsó végtag disztális nő 82 bal comb disztális nő 68 szeméremtest proximális férfi 28 jobb oldali lágyék régió proximális férfi 48 nyirokcsomó metasztázis proximális férfi 63 csípő régió proximális férfi 34 nyirokcsomó metasztázis proximális férfi 63 orr disztális férfi 52 bal kar disztális + + A tanulmányunkban kontrollként szerepelt két malignus rhabdoid tumor minta a Semmelweis Egyetem I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetéből származott. A diagnózis ezekben az esetekben is a WHO kritériumainak megfelelően lett felállítva. 25

26 5. 3. Immunhisztokémia A vizsgált FFPE szövetmintákból készült 2 μm vastagságú metszeteket 3 x 5 percig xilol oldatban, majd leszálló etanol sorban deparaffináltuk. Az immunhisztokémia módszer körülményeinek standardizálását Bond Max (Leica Biosystems, Newcastle, Egyesült Királyság) típusú immunfestő automatával teremtettük meg. Az antigén feltáráshoz a gyártó (Leica Biosystems) által ajánlott ph=6-os vagy ph=9-es feltáró oldatokat használtuk, melyekben a metszeteket 100 C-on 30 percig inkubáltuk. A felhasznált primer antitestek származási helye és alkalmazott hígítása a 3. táblázatban látható. 3. Táblázat: A primer antitestek adatai Primer antitest Származási hely Hígítás monoklonális egér anti-baf47 (SMARCB1; clone 25) BD 1:50 monoklonális egér anti-citokeratin (clones AE1/AE3) Dako 1:150 monoklonális egér anti-ema (clone E29) Dako 1:200 monoklonális egér anti-vimentin (clone V9) Dako 1:600 monoklonális egér anti-cd34 classii (clone QBEnd10) Dako 1:300 poliklonális nyúl anti-s100 Dako 1:1500 monoklonális egér anti-ezh2 (clone 11) BD 1:25 monoklonális nyúl anti-h3k27me3 (C36B11) Cell Signaling 1:200 A primer antitestekkel 25 percen át inkubáltunk, majd az immunreakciót a H 2 O 2 /DAB szubsztrát/chromogén kit (Leica Biosystems) segítségével hívtuk elő. Záró lépésként a sejtmagokat hematoxilinnal festettük. A SMARCB1 immunreakciók értékelése a sejtmagi expresszió megléte vagy hiánya alapján történt. Az EZH2 immunhisztokémia értékelését a Pacheo és mtsai. által leírt rendszer kismértékű módosításával végeztük el [102]. A sejtmagi reakciók intenzitásának meghatározása a következők szerint történt: nincs reakció= 0 pont, gyenge reakció= 1 pont, mérsékelt reakció= 2 pont, erős reakció= 3 pont. A pozitív reakció kiterjedésének elemzése a pozitív sejtek százalékos előfordulási arányán alapult: nincs reakció= 0 pont, 1-50% pozitív= 1 pont, 51-75% pozitív= 2 pont, >75% pozitív= 3 pont. Mindkét pontszám meghatározásához legalább 100 tumorsejtet számoltunk le. Ha a tumorsejtek több mint 30%-a erősebb magi 26

27 intenzitással rendelkezett, akkor a magasabb pontszámot használtuk. A két pontérték összege adta meg az adott minta végső pontszámát, ha ez az érték három felett volt, akkor az esetet EZH2 pozitívnak tekintettük Floureszcens In Situ Hibridizáció (FISH) A vizsgált FFPE szövetmintákból készült 2 μm vastagságú metszeteket 3 x 5 percig xilol oldatban, majd leszálló etanol sorban deparaffináltuk. Desztillált vizes mosást követően a feltárást mikrohullámú sütőben, forrásban lévő citrát pufferben végeztük 25 percen át, majd a mintákat hagytuk kihűlni. Újra desztillált vizes mosás következett. A minták előkezelését 2x-es SSC/0,1%-os Igepal (NP-40) detergens (Kreatech, Amszterdam, Hollandia) oldatában folytattuk 37 C-os vízfürdőben 15 percig inkubálva. Az emésztés pepszin oldatban (0,5 mg/ml; ph=1.0) 37 C-os vízfürdőben 15 percen át zajlott. Desztillált vizes mosás után a mintákat felszálló etanol sorban (70%, 80%, 100%) dehidratáltuk. A BCR/ABL Dual Color Translocation Probe Set (Abbott Molecular, Illinois, USA) előírásának megfelelően 4,5 μl DNS próbát adtuk hozzá a megjelölt (karcolt) sejt dús területekhez, melyet 18 x 18 mm-es fedőlemezzel és Fixogum ragasztóval (Marabu Co., Bietigheim, Németország) hermetikusan fedtük. A tárgylemezeket ezután egy ThermoBrite Denaturation/Hybridization System gép (Abbott Molecular) feltétjére helyeztük a DNS próbák és a sejtek DNS-ének párhuzamos denaturálása céljából (5 perc, 73 C), majd egy éjszakán át hibridizáltuk őket 37 C-on. A fedőlemez eltávolítása után a lemezeket 2 percre 0,4x-es SSC/0,1%-os Igepal 73 C-os oldatába, majd 2 percig 2x-es SSC/0,1%-os Igepal szobahőmérsékletű oldatába helyeztük. A készítményeket ezután szobahőmérsékleten, sötétben, levegőn szárítottuk, majd 10 μl Vectashieldben (a fluoreszcens festékek kiégését gátló anyag) oldott DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole; Vector Laboratories Burlingame, USA) rácsöppentése után fedőlemezzel fedtük. Az alkalmazott DNS próba BCR (SpectrumGreen-nel jelölt, zöld) és ABL (SpectrumOrange-vel jelölt, narancs) specifikus próbákat tartalmazott. A BCR próba a teljes 22q11.2 kromoszóma régiót lefedi, beleértve a BCR (22q11.23) mellett a SMARCB1 (22q11.23) gén régióját is. Ezáltal a SMARCB1 gén mono- vagy biallélikus deléciója a mintákban kimutatható. A 27

28 hibridizációs készítmények vizsgálata és a fotók készítése Nikon Eclipse E600 epifluoreszcens mikroszkóppal, VDS Vosskühler CCD-1300 monokróm kamerával és LUCIA Citogenetics szoftverrel történt DNS és RNS izolálás A tumorminták reprezentatív FFPE blokkjaiból 5 darab, 15 μm vastagságú metszetet készítettünk 1,5 ml-es sterilezett Eppendorf csövekbe. A xilolos és etanolos deparaffinálást követően RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit-tel (Ambion, Austin, USA) végeztük el a nukleinsavak izolálását a gyártó utasításainak megfelelően. A lézer mikrodisszekált minták esetén az RNS izoláláshoz RNAqueus-Micro Kit-et (Ambion), a DNS izoláláshoz pedig High Pure PCR Template Preparation Kit-et (Roche Applied Science, Indianapolis, USA) használtunk a gyártók protokolljai szerint. Szövettenyészeti sejtek esetén az RNS-t Purelink RNA Mini Kit-et (Invitrogen, Carlsbad, USA) használva izoláltuk. Az RNS kinyerésekor minden munkafolyamat során figyeltünk a steril/rnáz-mentes körülmények biztosítására, valamint beiktattunk DNáz kezelést is, mint a kit-ek opcionális lépését a reziduális DNS eltávolítására. A nukleinsavak koncentrációját NanoDrop 1000 (NanoDrop Technologies, Houston, USA) spektrofotométer segítségével mértük le 260 nm hullámhosszon. Az izolált DNS mintákat további felhasználásig 4 C-on, az RNS mintákat pedig -80 C-on tároltuk Polimeráz láncreakció (PCR) A polimeráz láncreakció (PCR) kisméretű (néhány száz - néhány ezer bázispár) DNS-szakaszok in vitro enzimatikus felszaporítására szolgáló módszer. Egy kiválasztott DNS-szakaszról két megfelelő iniciáló oligonukleotid (primer), Taq DNS polimeráz és DNS építőkövek (dntp-k) felhasználásával nagyszámú másolatot készíthetünk néhány óra leforgása alatt. A reakció három lépésből áll: 28

29 1. Denaturáció: A kettősszálú DNS-templát szálainak szétválasztása magas hőmérsékleten. 2. Anelláció: A reakcióelegyet hirtelen alacsonyabb hőmérsékletre hűtve lehetővé válik a primerek hibridizálása. 3. Elongáció (Szintézis): Az elegyet melegítve megkezdődik a DNS-szintézis. A polimeráz a hibridizált primerek 3 végeit meghosszabbítva létrehozza a templát DNS kiegészítő szálát. Az 1., 2. és 3. lépéseket ismételve az enzim az újonnan képződött szálakat is templátként használja, így ideális esetben a primerek által behatárolt DNS-rész mennyisége exponenciálisan nő (2n). A SMARCB1 PCR amplifikációja során a gén meghatározott szakaszaira (1-9 exon) specifikus primerek kiválasztása irodalmi adatok alapján [103], illetve a Primer Express 1.1 (Applied Biosystems) primer-tervező program segítségével történt. Az 1-es exonra terveztünk egy új primer párt, mivel az irodalomban feltüntetett oligonukleotidokkal nem lehetett a teljes 1-es exont amplifikálni és így szekvenálni sem. Az 1-es és a 9-es exonokat egy primer párral, a többi exont két primer párral sokszorosítottuk. Az általunk használt primerek lokalizációja, szekvenciája és PCR amplikonok hossza a 4. táblázatban látható. A PCR reakciók anellációs lépésének hőmérsékletét a primerek olvadási hőmérsékletei alapján határoztuk meg. Ennek megfelelően az anellációs hőmérséklet az 1-es exon esetében 60 C, míg a többi exon esetén 58 C volt. 29

30 4. Táblázat: A SMARCB1 PCR és szekvencia analízis során használt primerek adatai Lokalizáció Forward primer szekvencia Reverse primer szekvencia Amplikon hossza exon-1 5 tcctgatccctcgcagcc 3 5 cccgatgaatggagacgc bp exon-2a 5 gtggtgctgcgacccttat 3 5 tcttccacagtggctagtcg bp exon-2b 5 cgaggttctctgtacaagag 3 5 tacaaaccctcgtgaagacg bp exon-3a 5 cagcagagtgacccagtgat 3 5' acttctcatcgttgccatcc 3' 122 bp exon-3b 5 taaaagcctcggaagtggaa 3 5 ttcagaaaagaccccacagg bp exon-4a 5 tgactgggaggacttttcttg 3 5' tgttgatggttgtggagcat 3' 127 bp exon-4b 5 agctcccaccacttagatgc 3 5 gaactaaggcggaatcagca bp exon-5a 5 cgctgactgttgcttccat 3 5 agcttctgcccatcgatct bp exon-5b 5' ccagctgtgatccatgagaa 3' 5 aagcccgactgccttgta bp exon-6a 5 tcccttccctctcctgattt 3 5 gggtaggactcgatctgctg bp exon-6b 5 gatttgaacccgctgacg 3 5 cagtgctgggtgagaagtca bp exon-7a 5 gtcctttggttgttgcctca 3 5 cgatggtggtgacaaactcc bp exon-7b 5' accagagaagtttgccctga 3' 5 ggagatgagggagggagaga bp exon-8a 5 ctcactgcctcccctcct 3 5' ctccatctcagcgtctgtca 3' 123 bp exon-8b 5' agattgccatccggaacac 3' 5 cagagcccaggaccacag bp exon-9 5 ctccccactcctcttccag 3 5 ggcccaatcttctgagatgc bp A PCR reakció 20 μl-es végtérfogatban zajlott RedTaq ReadyMix (Sigma, St. Luis, MO) alkalmazásával, mely gyárilag tartalmaz Taq polimerázt, dezoxi-nukleotidtrifoszfátokat (dntp-ket) és MgCl 2 -ot. A reakcióelegy pontos összetétele az 5. táblázatban olvasható. 5.Táblázat: A PCR reakciók összetétele Komponens Bemérés Red Taq Ready Mix (2x) 10 µl Forward primer (10 µm) 1 µl Reverse primer (10 µm) 1 µl DNS templát ng Desztillált víz 20 µl-ig Az amplifikáció Veriti 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) készülékben történt 45 cikluson keresztül, a 6. táblázatban látható hőprofilnak megfelelően. A PCR termékek tárolása felhasználásukig 4 C-on történt. 30

31 6. Táblázat: A PCR reakció beállításai Folyamat Hőmérséklet Időtartam Ciklusszám Denaturáció 95 C 10 min C 15 sec. Anelláció 58/60 C 1 min. 45 Elongáció 72 C 30 sec. Végső elongáció 72 C 7 min A PCR termékek elválasztása, detektálása és tisztítása A PCR termékek elválasztása agaróz-gélelektroforézissel történt, 2 vegyes %-os (v%) agaróz gélben (2 g agaróz, 100ml 1x TAE puffer), ethidium-bromid (1μg/ml) jelöléssel. Futtató pufferként is 1x TAE oldatot (10x TAE törzsoldat: 0,4 M TRIS, 0,2 M ecetsav, 0,01 M EDTA) használtunk. A 100 V feszültségen 30 percen át zajló elektroforézist követően a migrációs mintázat UV fényben történő detektálásához KODAK Image Station 4000MM (Eastman Kodak Co., Rochester, USA) gédokumentációs rendszert használtunk. A PCR termékek tisztítása ExoSAP-IT (Affymetrix) kittel történt a gyártó utasítása alapján. Ez a kit két hidrolitikus enzimet tartalmaz: az exonukleáz I-et és a Shrimp alkalikus foszfatázt (SAP). Ezekre azért van szükség, mert eltávolítják a PCR reakció során fel nem használódott dntp-ket és primereket, melyek zavarhatják a későbbi szekvenáló reakciót. Az exonukleáz I az egyszálú DNS-t, a SAP pedig a megmaradt nukleotidokat bontja le nukleozidokra és foszfátra. 1. A futtatás utáni maradék PCR termékekhez (12 μl) 2 μl ExoSAP-ot adtunk perc inkubálás 37 C-on, ezen a hőmérsékleten optimális az enzimműködés perc inkubálás 80 C-on az enzimek inaktiválódása érdekében. 31

32 5. 8. A SMARCB1 gén szekvencia analízise A szekvencia analízis elvi alapja a Sanger által leírt ún. láncterminációs eljárás [104], melynek részletei a 6. ábrán láthatóak. Az adott minta szekvenálása a tisztított PCR termék és egy primer (forward vagy reverz orientációjú) felhasználásával történik. A speciális reakcióelegy kiemelt fontosságú komponensei a fluorokrómmal konjugált 2-3 didezoxi-nukleotid trifoszfát analógok (ddntp), amelyek a dezoxi-nukleotid trifoszfátokhoz (dntp) képest a nukleotid cukor komponensének hármas szénatomján sem hordoznak hidroxil funkciós csoportot. E funkciós csoport megléte esszenciális a következő nukleotid beépüléséhez; tehát az extenzió során egy ddntp beépülése egy adott pozícióba láncterminációt eredményez. A nagy számok törvénye alapján a megfelelő (komplementer) ddntp beépülése valamennyi pozícióban megtörténik az amplifikáció során. Így a szekvenáló reakció eredményeként a teljes szekvenálandó mintát reprezentáló, különböző hosszúságú termékekkel rendelkezünk. A termékek méret szerinti elválasztása kapilláris elektroforézissel történik, ami egy speciális összetételű polimerben zajlik. Tekintve, hogy a négy különböző ddntp (ddatp, ddgtp, ddctp, ddttp) különböző fluoreszcens molekulával van jelölve, a méret alapján történő szeparálás mellett a terminális nukleotidok azonosítása is lehetővé válik. Ez egy lézerrel történő gerjesztéssel, majd az emittált fény hullámhosszának azonosítása által történik. Ezek alapján a számítógép valamennyi termék esetében azonosítja a terminális nukleotidot és azok összeolvasásával valósul meg a szekvencia meghatározása. 32

33 6. Ábra: Egy didezoxi-nukleotid (ddatp) analóg szerkezete és a lánctermináció elve. A ddatp mintájára ddgtp, ddctp és ddttp analógok is szükségesek a szekvenáló reakcióhoz. A normál dezoxi-nukleotidhoz (dntp) képest a didezoxi-nukleotid analógok (ddntp) a dezoxiribóz hármas szénatomján sem hordoznak hidroxil csoportot. A hármas hidroxil csoport feltétlenül szükséges a következő nukleotiddal kialakítandó foszfodiészter kötéshez; hiánya láncterminációhoz vezet. A szekvenáló reakció során az elegy a normál dntp-k mellett ddntp analógokat is tartalmaz, amelyek különböző fluorokrómmal konjugáltak a négy különböző analóg esetében. A reakció során a ddntp-k beépülésének eredményeként eltérő hosszúságú, fluorescensen jelölt termékeket nyerünk. Ezután a termékek elválasztása kapilláris elektroforézissel zajlik. A szekvenciák meghatározását a tisztított PCR termékek direkt, mindkét irányból történő szekvenálásával végeztük el, Big Dye Terminator 3.1 (Applied Biosystems) kitet használva. A Veriti 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) PCR készülékben 35 cikluson át zajló szekvenáló reakció (ún. cycle sequencing) pontos összetétele és az amplifikáció hőmérsékleti paraméterei a 7. illetve 8. táblázatban 33

34 láthatóak. A szekvenáláshoz a PCR-rel megegyezően a 4. táblázatban felsorolt primereket használtuk. 7. Táblázat: A szekvenáló reakció összetétele Komponens Bemérés Big Dye Terminator 1 µl Big Dye Puffer (2,5x) 1 µl Primer (10µM) 2 µl PCR termék 3-5 µl 8. Táblázat: A szekvenáló reakció beállításai Folyamat Hőmérséklet Időtartam Ciklusszám Denaturáció 95 C 2 min C 30 sec. Anelláció 53/58 C 15 sec. 35 Elongáció 60 C 4 min. A szekvenáló reakció termékeinek tisztítása során a feleslegben megmaradt és a későbbiekben zavaróvá váló fluoreszcens komponensek eltávolítása történt. Ezt a lépést NucleoSEQ (Macherey-Nagel) oszloppal végeztük el a gyártó utasításai szerint. A tisztított termékeket 20 µl deionizált formamid (Ambion) oldatban vettük fel, majd 95 C-on 2 perces denaturációt követően az analízisükig jégen tartottuk azokat. A szekvenciák leolvasása kapilláris elektroforézis módszerével történt, az ABI 310 genetikai analizátor (Applied Biosystems, Foster City, USA) segítségével. A nyers adatok értékeléséhez a Sequencing Analysis 3.7 (Applied Biosystems), illetve a BioEdit (Isis Pharmaceuticals, USA) programokat használtuk. Az általunk nyert szekvenciákat az NCBI GenBank adatbázisában található, egészséges donoroktól származó referencia szekvenciákhoz illesztettük. A mutációk az elektroferogramokon dupla csúcsok formájában jelentkeztek, vagyis a vad és mutáns típust reprezentáló bázis egyaránt látható. Ez a mutációk heterozigóta jellegével, illetve a normál, mutációt nem hordozó sejteknek a tumorsejtek közötti jelenlétével magyarázható. A mutációk valós 34

35 meglétének bizonyításához a PCR termékből forward és reverz irányból való szekvenálást egyaránt végeztünk A DNS biszulfit konverziója A metiláció közvetett kimutatásának egyik legelterjedtebb formája a biszulfit átalakítás (7. ábra). A reakció során az 5. szénatomon metil csoportot tartalmazó citozinek nem változnak, míg a nem metilált citozin nukleotidok a nátrium-biszulfit hatására uracillá alakulnak. 7. Ábra: A biszulfit konverzió folyamata. Savas körülmények között, nátrium-biszulfit jelenlétében a metil csoporttal nem rendelkező citozin nukleotidok nukleofil támadást szenvednek, amely következtében uracillá alakulnak. Az 5-metilcitozin megakadályozza az aminocsoport deaminációját, ezért a molekula változatlan marad. A kép forrása: Így a metilálatlan citozin pozíciójában egy pontmutáció keletkezik, amely hagyományos molekuláris biológiai módszerekkel tovább vizsgálható. A DNS minták biszulfit konverzióját Cells-to-CpG Bisulfite Conversion Kit (Applied Biosystems) használatával végeztük a gyártói utasításoknak megfelelően. Mintánként 45 μl 12 ng/μl DNS oldathoz 5 μl Denaturation Reagent oldatot adtunk és 50 C-on 10 percen át denaturáltuk. 100 μl Conversion Reagent hozzáadását követően a konverziót a 9. táblázat hőprofilja alapján végeztük. 35

36 9. Táblázat: A biszulfit konverzió hőprofilja Hőmérséklet Időtartam 65 C 30 min. 95 C 1,5 min. 65 C 30 min. 95 C 1,5 min. 65 C 30 min. 4 C max.240 min. A konvertált terméket Cells-to-CpG oszlopon kötöttük meg, majd mosási és deszulfonálási lépés után a módosított és tisztított terméket 40 μl elúciós pufferben eluáltuk. A konvertált DNS-t ezután aliquotokban -20 C-on tároltuk Metiláció-specifikus PCR (MSP) A biszulfit módosított, metilált és nem metilált DNS PCR alkalmazásával megkülönböztethető. A metiláció-specifikus PCR (MSP) működési elve a 8. ábrán látható. Az egyszálú DNS-ben található metil-citozinok (5 m C) ellenállnak a biszulfit kezelésnek, és a PCR reakció során citozinként szaporodnak fel, míg a metilálatlan citozinok uracillá alakulnak és timinként amplifikálódnak. Fontos megjegyezni, hogy MSP alkalmazásával kizárólag a primerek bekötődési helyén lévő CpG szigetek metiláltságáról kapunk információt. 36

37 8. Ábra: A metiláció-specifikus PCR elve. Biszulfit kezelést követően a metilált specifikus primer (piros nyíl) csak a metilált DNS-hez kötődik, míg a nem metilált specifikus primer (kék nyíl) a nem metilált DNS-t ismeri fel és azt amplifikálja. Az ábrán a primer párok egyik-egyik tagja szerepel csak. A MSP-hez szükséges primereket manuálisan terveztük, úgy hogy azok szelektíven amplifikálják vagy a metilált vagy a nem metilált DNS-t. Összesen hét metiláció specifikus és hét nem metiláció specifikus primer párt terveztünk, melyeket a 10. táblázatban sorolunk fel. A metiláció specifikus primereinkkel a SMARCB1 promóterben lévő CpG szigetek mintegy 40%-áról szerzünk információt. Az FFPE eredetű DNS-ek minőségét a biszulfit konverzió tovább gyengíti, ezért rövid, bázispár közötti PCR amplikonokat választottunk. A primer párokat a BiSearch programmal ( a Primer search, epcr felületen ellenőriztük. A program primer páronként egy terméket jósolt, a várt lokalizációban. Technikai (negatív és pozitív) kontrolloknak a Semmelweis Egyetem Sejtanalitikai Laboratóriumától kaptuk a következő mintákat. Perifériás vér mononukleáris sejtjeiből izolált és Repli-g kit (Qiagen, Hilden, Németország) használatával a gyártó utasításai szerint amplifikált, ezáltal teljesen metilálatlan DNS termék szerepelt negatív kontrollként a MSP reakciónkhoz. Metilált pozitív kontrollként pedig az előbbi templát DNS CpG (M.SssI) Metiltranszferázzal (New England Biolabs, Ipswich, USA) a gyártó leírásainak megfelelően metilált terméket alkalmaztunk. A primerek tesztelését gradiens PCR módszerrel végeztük el. Az optimális anellációs hőmérsékletek a 10. táblázatban 37

38 láthatóak. A PCR reakciók 15 μl végtérfogatban 7,5 μl AmpliTaq Gold 360 Master Mix-et (Applied Biosystems), 1-1 μl forward illetve reverz primert (10μM), 15 ng összmennyiségű biszulfit konvertált terméket, valamint kiegészítésként PCR tiszta vizet tartalmaztak. Az amplifikáció Veriti 96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems) készülékben történt 35 cikluson keresztül, a 11. táblázatban látható hőprofilnak megfelelően. A reakció után a metilált, illetve a nem metilált DNS szakaszokat agarózgélelektroforézissel ethidium bromidos jelölést használva mutattuk ki. 10. Táblázat: A metiláció-szenzitív PCR-hez tervezett primerek adatai Primer neve* Forward primer, 5 3 # Reverz primer, 5 3 # Méret (bp) An. hőm. ( C) Genomiális pozíció M01 GTTGTTAAGATTTTGGCGTC TCCCGTTTCTTTACGTCTAA NM01 AGTGTTGTTAAGATTTTGGTGTT TCCCATTTCTTTACATCTAACTA M02 GATCGGTTTCGAGGTAGTTC CGCCCCGATAAATAAAAAC NM02 ATGATTGGTTTTGAGGTAGTTT CCCACCCCAATAAATAAAAAC M03 CGTTAACGTTAGCGTTTGC ACGAAATACGAACCGAACC NM03 TAGTGTTAATGTTAGTGTTTGT AAAACAAAATACAAACCAAACC M04 CGGTTGAGGCGTTAGTATTC CGAAACCGAAAAACGAAATA NM04 GTTTGGTTGAGGTGTTAGTATTT ACCAAAACCAAAAAACAAAATAC 51 53,5-143 M05 TCGTTCGTTTTTGTCGTC ATATAAAACTCGCCGTCGTC NM05 GGTTGTTTGTTTTTGTTGTT ATATAAAACTCACCATCATCCT M06 CGTAGTTCGGTTTCGGTC ATATAAAACTCGCCGTCGTC NM06 TTTTGTAGTTTGGTTTTGGTT ATATAAAACTCACCATCATCCTC M07 GTTTTTTTAAGGGGTTCGC CTCAATACGCAAACGCTAAC NM07 GTGGTTTTTTTAAGGGGTTTGT CCTCAATACACAAACACTAACA *M: metilált-specifikus primerek; NM: nem metilált-specifikus primerek. # Az aláhúzott és félkövér citozinok (C) a forward primerek esetén, az aláhúzott és félkövér guaninok (G) a reverz primerek esetén jelentik azokat a citozinokat a promóter CpG szigetében, melyeket MSP-vel vizsgálni tudtunk. An. hőm: anellációs hőmérséklet. A primereket a transzkripciós start hely közelébe terveztük. A genomiális pozíció a forward primer 5 -végi nukleotidjának a helyzete a SMARCB1 gén transzkripciós start helyéhez viszonyítva. 11. Táblázat: A metiláció-specifikus PCR beállításai Folyamat Hőmérséklet Időtartam Ciklusszám Denaturáció 95 C 5 min C 15 sec. Anelláció C 30 sec. 35 Elongáció 72 C 15 sec. Végső elongáció 72 C 7 min. 1 38

39 Lézer mikrokimetszés (LCM- Laser Capture Microdissection) Hét epithelioid sarcoma mintából, RNS izolálás céljából, tumorsejteket és normál szöveti sejteket (endotélsejteket, limfocitákat) mikrodisszekáltunk PALM lézer mikrodisszekciós rendszer (PALM, Bernried, Németország) segítségével. Öt mintán pedig a tumorsejtek DNS-ének kinyerése céljából végeztünk el mikrokimetszést. A mikrodisszekciót a II. Belgyógyászati Klinika kutatólaboratóriumában volt lehetőségünk végrehajtani. A tumorminták paraffinos blokkjaiból speciális mikrodisszekcióra alkalmas tárgylemezre (Membrane Slide 1.0 PEN, Carl Zeiss, Jéna, Németország) 5 μm vastagságú metszeteket készítettünk. A paraffin metszetek leválásának elkerülése érdekében a membrános tárgylemezeket használat előtt 254 nmes UV fény alatt tartottuk 30 percig, ezáltal növelve a membrán adhezivitását. A SMARCB1 negatív tumorsejtek azonosításának érdekében a metszeteken SMARCB1 immunfestést végeztünk. Amennyiben az RNS kinyerése volt a cél, nagyfokú óvatossággal jártunk el az RN-áz mentes környezet megőrzése miatt a teljes munkafolyamat során. A minták deparaffinálása és az antigén feltárás az Immunhisztokémia fejezetben leírtaknak megfelelően történt, az immunfestést manuálisan a Novolink Max Polymer Detection System (Novocastra, Newcastle, Egyesült Királyság) kit használatával végeztük a gyártó leírása szerint. A mintákat 30 percen át hagytuk száradni a mikrodisszekciókat megelőzően. A lézer mikrokimetszések során átlagosan 3000 tumorsejtet gyűjtöttünk mintánként. Pozitív kontrollként ugyanennyi SMARCB1 immunreaktív endotélsejtet és/vagy limfocitát izoláltunk Reverz transzkripció (RT) Vizsgálataink során a reverz transzkripciót, azaz cdns szintézist kettő fajta kísérlethez kétféle kit használatával végeztük el. A normál génexpressziós vizsgálatokhoz a High-Capacity cdna Reverse Transcription Kit-et (Applied Biosystems, Foster City, USA) használtunk a gyártó ajánlása alapján ng RNS konverzióját hajtottuk végre 20 μl végtérfogatban. A reverz transzkripciós reakció 39

40 összetétele a 12. táblázatban található. A reakció a Veriti 96-Well Thermal Cycler PCR készülékben zajlott 10 perces 25 C-on történő inkubációt követően 120 percen keresztül 37 C-on, végül 5 perces inaktivációval zárult 85 C-on. 12. Táblázat: A reverz transzkripciós mix összetétele Komponens Bemérés RT puffer (10x) 2 μl dntp mix (100mM) 0,8 μl Random primer (10x) 2 μl Reverz transzkriptáz (50 U/μl) 1 μl RNS templát 0,5-1 μg Nukleáz mentes víz 20 μl-ig A mirns expressziós vizsgálatokhoz a cdns szintézist a TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) segítségével végeztük. Azonban nem random primerekkel dolgoztunk, hanem a TaqMan Small RNA Assay-k (Applied Biosystems) mirns specifikus primereivel. 10 ng RNS mintát írtunk át 15 μl végtérfogatban, mely 7 μl master mix-et és 3 μl RT primert tartalmazott az RNS mintán túlmenően. A master mix összetétele a 13. táblázatban található. Az összetevők vegyítését követően a mintát 5 percig jégen tartottuk, majd PCR készülékben 30 percen át 16 C-on, ismét 30 percen át 42 C-on és végül 5 percen keresztül 85 C-on inkubáltuk. A két módon készült cdns mintákat további felhasználásig -20 C-on tároltuk. 13. Táblázat: A mirns reverz transzkripciós master mix összetétele Komponens Bemérés RT puffer (10x) 1,5 μl dntp mix (100mM) 0,15 μl RNáz inhibítor (20 U/μl) 0,19 μl Reverz transzkriptáz (50 U/μl) 1 μl Nukleáz mentes víz 4,16 μl 40

41 In silico mirns target predikció A SMARCB1 gént (Gene ID: 6598) targetáló mirns-ek predikciójához in silico analízist használtunk. Számos online elérhető algoritmust lefuttattunk párhuzamosan, de csak a következő öt adott ki találatokat: MiRBase Target v5 ( [105], MirTarget2 ( [106], Targetscan 4.0 ( [107], RNAhybrid ( [108] és Pita ( [109]. A potenciális mirns-ek közül azokat részesítettük előnyben, amelyeket mind az öt program vagy legalább négy előre jelzett Sejtkultúra és mirns tranziens transzfekció Két humán tumor és egy normál, nem tumoros sejtvonalat tenyésztettünk a transzfekciós kísérletekhez, melyekről tudtuk, hogy kifejezik a SMARCB1 gént. A HT nevű humán fibrosarcoma sejtvonalat (ATCC szám: CCL-121) RPMI-1640 tápfolyadékban (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 10% fetal bovine serum (FBS) és penicillin-streptomycin antibiotikumok mellett (rendre 100U és 100 μg/ml koncentrációban) tenyésztettük. A Caco-2 nevű humán vastagbél adenocarcinoma sejtvonalat (ATCC szám: HTB-37) minimum essential mediumban (MEM) α-glutamin (Sigma-Aldrich) kiegészítéssel, 20% FBS, 1% nem esszenciális aminosav, valamint a fent említett antibiotikumok hozzáadása mellett növesztettük. A HDFα nevű humán bőr fibroblaszt sejtvonal (Invirogen, Carlsbad, USA) a speciális Medium 106 (Gibco ) tápfolyadékot igényelte Low Serum Growth Supplement (LSGS, Invitrogen) hozzáadásával. Mindhárom vonal esetén a sejteket 75 cm 2 es szövettenyésztő flaskában (Sarstedt, Newton, USA) tartottuk 5% CO 2 -nál 37 C-on. A médiumokat hetente kétszer cseréltük a sejteken. Az RNS interferencia funkcionális vizsgálatához a tranziens transzfekcióra alkalmas mirns-eket Pre-miR mirna Precursor molekulák formájában (Ambion) szereztünk be: hsa-mir-206 (assay ID PM10409), hsa-mir-381 (assay ID PM10242), 41

42 hsa-mir-671-5p (assay ID PM12599) és hsa-mir-765 (assay ID PM11892). Ezeket a kicsi, kémiailag módosított kettős szálú RNS molekulákat arra tervezték, hogy az endogén, érett mirns-ek biológiai hatását mimikálni legyenek képesek. A sejtekbe való bejutásukat követően az RNS-indukálta csendesítő komplexbe (RISC, RNA induced silencing complex) épülve specifikus mrns-ek repressziójában vagy azok hasításában vesznek részt. A géncsendesítéses kísérletekhez pozitív kontrollnak a PremiR hsa-mir-1 mirna Precursor-t (Ambion) választottuk, amely ismerten csendesíti a twinfilin-1 (más néven PTK9, protein tirozin kináz 9) gént. Negatív kontroll mirnsnek pedig Pre-miR Negative Control #1-et (Ambion) használtuk, mely random szekvenciájú molekulákból áll és nem rendelkezik validált mirns általi funkcionális hatásokkal. A sejtvonalakat elektroporációval transzfektáltuk a Neon transzfekciós rendszer 10 μl-es pipetta hegyének segítségével (Invitrogen) a gyártó leírását követve a 14. táblázatban olvasható paraméterek alkalmazásával. Egy elektroporációs reakcióhoz 3x10 5 darab sejtet és 30 nm végkoncentrációjú mirns-t szuszpendáltunk 10 μl Transfection Resuspension Buffer R oldatban. Majd az egész elegyet a Neon készülék pipetta hegyébe szívtuk fel és ebben zajlott le pillanatok alatt maga az elektroporáció is. A reakciót követően a transzfektáns sejteket 6-lyukú szövettenyésztő lemez egyetlen lyukába, 2 ml a sejteknek megfelelő, de antibiotikumtól mentes tápfolyadékba szélesztettük. A kísérleteket a sejtek transzfekcióját követő 24. órában végeztük. A HT transzfektáns sejteket 48 órát követően is vizsgáltuk. Ko-transzfekciós (azaz a mirns-ek együttes transzfekcióját jelentő) vizsgálatokhoz a HDFα sejtvonalat használtuk és a mirns-ek együttes végkoncentrációja ez esetben is 30 nm volt. 14. Táblázat: Az elektroporáció paraméterei a sejtvonalak esetén Sejtvonal Impulzus feszültsége Impulzus ideje Impulzusszám HT V 50 ms 1 Caco V 20 ms 2 HDFα 1400 V 20 ms 2 42

43 Valós-idejű kvantitatív PCR (q-rt-pcr) A SMARCB1 mrns expressziós szintjének analízisét valós-idejű kvantitatív PCR (real-time, q-rt-pcr) segítségével végeztük el. Valamint ugyanezt a módszert használtuk az epithelioid sarcoma mintáink mirns expressziójának meghatározásához. Az epithelioid sarcoma FFPE minták teljes szöveti blokkokból (n=16) és lézer mikrodisszekátumaiból (n=7) készült SMARCB1 q-rt-pcr-hez a következő primereket terveztük: SMARCB1-forward (5 -TCCGTATGTTCCGAGGTTC-3 ) és SMARCB1- reverse (5 -CTTCCACTTCCGAGGCTTT-3 ). A reakció 20 μl végtérfogatban 12,5 μl 2x-es AmpliTaq Gold 360 Master Mix (Applied Biosystems) és 1x-es LightCycler 480 Resolight Dye (Roche Applied Science, Indianapolis, USA) interkaláló festék keverékét, μm forward és reverz primert, 50 ng cdns templátot és kiegészítésként nukleáz mentes vizet tartalmazott. Belső kontrollként glycerinaldehid-3- foszfát dehidrogenáz (GAPDH) gént amplifikáltunk, kalibrátorként normál humán májszövetet használtunk. A LightCycler 480 II. (Roche Applied Science) típusú valósidejű PCR készülékben zajló reakció hőprofilja a 15. táblázatban található. 15. Táblázat: A q-rt-pcr hőprofilja Folyamat Hőmérséklet Időtartam Ciklusszám Denaturáció 95 C 5 min C 10 sec. Anelláció 59 C 10 sec. 45 Elongáció 72 C 20 sec. A tumorok mirns expressziós és a géncsendesítéseket követő génexpressziós q- RT-PCR vizsgálatokhoz TaqMan alapú (Applied Biosystems) expressziós rendszereket használtunk. A következő mirns-ek expressziós szintjét határoztuk meg: hsa-mir-1 (assay ID ), hsa-mir-206 (assay ID ), hsa-mir-381 (assay ID ), hsa-mir-502 (assay ID ), hsa-mir-548a (assay ID ), hsa-mir-619 (assay ID ), hsa-mir-671-5p (assay ID _mat), and hsa-mir-765 (assay ID ). Belső kontrollnak RNU6B-t (assay ID ), kalibrátornak normál humán 43

44 zsírszövetet alkalmaztunk. A PCR amplifikáció 40 cikluson keresztül 20 μl végtérfogatban zajlott. A reakcióelegy pontos összetétele a 16. táblázatban látható. A cdns templát a mirns specifikus reverz transzkripciókból származott. A LightCycler 480 II. (Roche Applied Science) típusú valós-idejű PCR készülékben zajló TaqMan reakció hőprofilja a 17. táblázatban található. Ez a hőprofil az ún. két-lépéses PCR-nek felel meg, ahol az anelláció és az elongáció egyazon hőmérsékleten megy végbe. 16. Táblázat: A reakcióelegy összetétele Komponens Bemérés TaqMan Master mix (2x) 10 μl TaqMan Small RNA Assay (20x) 1 μl cdns templát 1,33 μl Nukleáz mentes víz 7,67 μl 17. Táblázat: A TaqMan q-rt-pcr hőprofilja Folyamat Hőmérséklet Időtartam Ciklusszám Aktiváció 50 C 2 min C 10 min. 1 Denaturáció 95 C 15 sec. 40 Anelláció-Elongáció 60 C 60 sec. A géncsendesítéseket követő q-rt-pcr kísérletekhez SMARCB1 TaqMan assay-t (Hs _m1), pozitív kontrollnak PTK9 assay-t (Hs _s1), belső kontrollnak GAPDH assay-t használtunk. 50 ng cdns templátot mértünk be 20 μl végtérfogatú reakcióba. A PCR hőprofilja megegyezik a 17. táblázatban feltüntetettekkel. Valamennyi valós-idejű PCR esetében három párhuzamos reakciót futtattunk. Az eredményeket C p értékek formájában nyertük. A C p érték ( crossing point ; megfelel C T -nek is, ami a cycle threshold jelölése) azt a ciklusszámot jelöli, ahol a relatív fluoreszcencia szint elér egy beállított küszöbértéket, a reakció exponenciális fázisában. A relatív expressziós szintek számolása a ΔΔC p módszerrel történt [110]. 44

45 Immuncitokémia Immuncitokémiához 3x10 5 darab transzfektáns HDFα sejtet szélesztettünk 6- lyukú szövettenyésztő lemez egy lyukába tett 22 x 22 mm-es üveg fedőlemezre. A szélesztés után órával a sejteket metanollal fixáltuk (PBS-es mosás után 10 perc - 20 C-os metanol, szárítás és -20 C-on tárolás). Az így előkészített mintákat a fixálás után és az egyes lépések között is PBS-sel mostuk (3 x 5perc). A SMARCB1 immunfestést manuálisan a Novolink Max Polymer Detection System (Novocastra, Newcastle, Egyesült Királyság) kit használatával végeztük a gyártó leírása szerint. Az 5-5 perces peroxidáz és protein-blokkolások (mindkét reagens a kit része) után a mintákat nedves kamrában 1 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk az elsődleges anti- BAF47 (SMARCB1) ellenanyaggal (klón 25, hígítás 1:50). Ezt követően 30 perces Post Primary és 30 perces Polymer oldatos (mindkét reagens a kit része) inkubációk következtek. Az immunreakciót a H 2 O 2 /DAB szubsztrát/chromogén oldatok (szintén a kit részei) segítségével hívtuk elő, 5 perces inkubáció során. Záró lépésként a sejtmagokat hematoxilinnal festettük. A reakciókat a SMARCB1 festődés sejtmagi megléte vagy hiánya alapján értékeltük Statisztikai módszerek Az eredmények értékeléséhez Graphpad Prism 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, USA) statisztikai elemző programot használtunk. A mirns és génexpressziós q- RT-PCR vizsgálatok során a csoportok összehasonlításához one-way ANOVA-t és Tukey post-hoc tesztet alkalmaztunk. Azokat a különbségeket fogadtuk el szignifikánsnak, ahol a p érték kisebb volt 0,05-nél. 45

46 6. EREDMÉNYEK Szövettani és immunhisztokémiai vizsgálatok Az összegyűjtött 36 epithelioid sarcoma közül 20 (az esetek 56%-a) adódott disztális típusúnak, míg a fennmaradó 16 (az esetek 45%-a) proximális típusú volt. SMARCB1 immunhisztokémiával 31 tumorminta (az esetek 86%-a) esetén találtuk a sejtmagi reakció hiányát a daganatsejtekben, míg a tumort infiltráló limfociták, endotélsejtek és környező normál szöveti elemek egyértelműen SMARCB1 pozitívnak mutatkoztak. Az epithelioid sarcoma diagnózist a következő immunhisztokémiai reakciók segítségével állapítottuk meg: diffúz vimentin pozitivitás, legalább fokálisan erős keratin (AE1/AE3) és/vagy EMA pozitivitás, S100 negativitás és SMARCB1 negativitás (9. ábra). 9. Ábra: Disztális típusú epithelioid sarcoma (esetszám 29.) tipikus morfológiai képe és immunhisztokémiai fenotípusa. A tumorsejtek jelentős eozinofil citoplazmával és kis sejtmaggal rendelkeznek (a: H&E festés; 20x nagyítás). Karakterisztikus a vimentin (b; 20x nagyítás), a citokeratin (AE1/AE3) (c; 20x nagyítás) és az EMA (d; 20x nagyítás) együttes expressziója. SMARCB1 negatív 46

47 tumorsejtek, míg a normál stróma sejtjei, ill. a limfociták SMARCB1 pozitívak (e; 40x nagyítás). Mindössze öt epithelioid sarcoma (az esetek 14%-a) esetében mutatkoztak SMARCB1 pozitívnak a daganatos sejtmagok. A morfológiai jellegzetességeken túl a CD34 immunhisztokémiai festés pozitivitása erősítette meg az epithelioid sarcoma diagnózisokat (10. ábra). Ezen SMARCB1 pozitív daganatok közül két minta a mirns expressziós kísérletekben szerepel kontrollként, amúgy a genetikai és epigenetikai vizsgálatokhoz a SMARCB1 immunnegatív epithelioid sarcoma mintákat használtuk. 10. Ábra: Proximális típusú epithelioid sarcoma (esetszám 33.) jellegzetes morfológiai (a: H&E festés; 20x nagyítás ) és immunhisztokémiai képei. Karakterisztikus citokeratin (AE1/AE3) (b; 20x nagyítás) és CD34 (c; 20x nagyítás) pozitivitás, ellenben megtartott SMARCB1 fehérje expresszió (d; 20x nagyítás). 47

48 6. 2. SMARCB1 genetikai vizsgálatok Fluoreszcens In Situ Hibridizáció Ahogy korábban az fejezetben is feltüntettük, a BCR/ABL transzlokációs FISH próba használatával kimutatható BCR szignál vagy szignálok elvesztése a SMARCB1 kromoszóma régió kiesését is jelenti a tumorsejtekben. A 9-es kromoszómán elhelyezkedő ABL (9q34) gén pozitív kontrollként szerepelt. Ha mindkét SMARCB1 allél deléciót szenvedne el a tumorsejtekben, akkor ezzel magyarázható lenne a SMARCB1 fehérje nukleáris expressziójának hiánya. Azonban mindösszesen négy SMARCB1 negatív epithelioid sarcoma esetében találtunk ún. biallélikus vagyis mindkét BCR/SMARCB1 allélt érintő deléciót (11a. ábra). Ezekben a mintákban csak a kontroll narancsszínű ABL szignálok láthatók a daganatok sejtmagjaiban. Egyetlen BCR/SMARCB1 allél elvesztése, tehát egy zöld BCR szignál megléte 11 daganat esetében volt kimutatható (11b. ábra). A fennmaradó 16 epithelioid sarcomában kromoszómális eltérés FISH reakcióval nem volt detektálható (11c. ábra). Poliszómiát, vagyis a kromoszómák többszöröződését összesen öt epithelioid sarcomában találtunk, melyből egy eset triszómiásnak (11d. ábra), négy pedig tetraszómiásnak mutatkozott. A BCR/ABL transzlokációs próba használatával mindössze a 22-es és a 9-es kromoszómákat vizsgáltuk, így aneuploidiát erről a két kromoszómáról igazoltunk. Azonban irodalmi adatok szerint a szerkezeti és számbeli kromoszóma eltérések epithelioid sarcomában relatíve gyakorinak mondhatóak [111]. 48

49 11. Ábra: A FISH vizsgálat eredményei epithelioid sarcomában. A narancsszínű szignálok az ABL régiót (9q34), a zöld szignálok a BCR/SMARCB1 régiót (22q11.2) reprezentálják. Biallélikus BCR/SMARCB1 deléció (a), monoallélikus BCR/SMARCB1 deléció (b). Allélvesztéssel nem rendelkező tumorsejtek (c; d). Triszómiás epithelioid sarcoma sejt (d) A SMARCB1 gén szekvencia analízise Azoknak az epithelioid sarcomáknak végeztük el a SMARCB1 gén szekvencia analízisét, amelyekben FISH reakcióval nem volt kimutatható a 22q11.2 kromoszóma régió biallélikus deléciója. Tehát összesen 27 tumorminta SMARCB1 génjének 9 exonját PCR amplifikáltuk és direkt szekvenáltuk az esetleges mutációk felderítése céljából. 49

50 Mindössze két epithelioid sarcomában találtunk SMARCB1 mutációt, az egyik tumorban a gén 5-ös exonjában egy 10 bázispáros duplikációt (ATCCTAGCC) (12. ábra), míg a másik daganatban a gén 7-es exonjában egy pontmutációt (GGG>AGG) (13. ábra) mutattunk ki. A duplikáció a leolvasási keret eltolódását, míg a pontmutáció Glicin > Arginin aminosav cseréjét eredményezte. Mindkét szekvencia eltérés olyan tumorban volt, amelyekben FISH reakcióval monoallélikus deléciót találtunk. Így együttvéve a négy esettel, ami biallélikus deléciót mutatott FISH-sel, összességében hat epithelioid sarcomáról mondható el, hogy bennük a SMARCB1 biallélikus deléciója/mutációja tehető felelőssé a gén inaktiválódásáért. 12. Ábra: ATCCTAGCC duplikáció a SMARCB1 gén 5-ös exonban. Az elektroferogramon a nyíl pozíciójában látható a 10 bázispáros ismétlődés. 50

51 13. Ábra: G> A pontmutáció a SMARCB1 gén 7-es exonban. A nyíl jelzi a mutáns adenint, továbbá az elektroferogram alapján az is megállapítható, hogy a szekvenált minta többnyire daganat sejteket tartalmazott (a vad típusú guanint reprezentáló csúcs nem jelentkezett) A FISH eredmények validálása Az eddig tárgyalt FISH és szekvenálási eredményeink publikálását [112] követően jelent meg az irodalomban egy közlemény, mely szerint a SMARCB1 inaktivációjáért az epithelioid sarcomák döntő többségében mégis a gén biallélikus deléciója felelős [113]. Mivel az alkalmazott FISH próba nagyobb kromoszóma régiót fed át, mint egyetlen gén régiója, ezért előfordulhatott, hogy a kisebb delécióktól meglététől függetlenül a próba a DNS-hez hibridizálni képes. Annak érdekében, hogy ezeknek a kisebb delécióknak (pl. a gén egyes exonjainak teljes deléciói) a lehetőségét kizárjuk és kizárólag a tumorsejtek DNS-ét vizsgáljuk, határoztunk a lézer mikrokimetszést követő PCR amplifikáció elvégzése mellett. A validáláshoz három epithelioid sarcoma esetet választottunk, melyek monoallélikus delécióval bírtak (14. ábra), valamint kettő olyan daganatot, melyek FISH vizsgálata allélvesztést nem mutatott (15. ábra). Mindegyik mikrodisszekált és csak daganatsejteket tartalmazó minta esetében sikeresen sokszoroztuk PCR módszerrel a SMARCB1 gén 9 exonját. Az exonok meglétét a PCR termékekről készült elektroforetikus gélkép alapján azonosítottuk (14d-15d. ábrák), ezáltal a biallélikus deléciók előfordulását a tumorsejtekben kizártnak vehettük. 51

52 14. Ábra: FISH eredmények PCR validációja. Monoallelikusan deletált epithelioid sarcoma FISH eredménye (a). SMARCB1 immunhisztokémia lézer mikrodisszekciót megelőzően (b; 40x nagyítás). A SMARCB1 negatív tumorsejtek mikrodisszekciója, a reaktív szöveti elemek kivágását elkerültük (c; 40x nagyítás). A SMARCB1 exonok, mint PCR termékek azonosítása géleletroforézissel (d). 52

53 15. Ábra: FISH eredmények PCR validációja. Deléciót nem mutató, SMARCB1 vad típusú epithelioid sarcoma FISH eredménye (a). SMARCB1 immunhisztokémia lézer mikrodisszekciót megelőzően (b; 40x nagyítás). A SMARCB1 negatív tumorsejtek mikrodisszekciója, a reaktív szöveti elemek kivágását elkerültük (c; 40x nagyítás). A SMARCB1 exonok, mint PCR termékek azonosítása géleletroforézissel (d) A SMARCB1 mrns expressziós szintjének meghatározása A SMARCB1 mrns szintjének meghatározásához elsőként a teljes szöveti blokkokból izolált epithelioid sarcoma mintákat használtuk (n=16). A kvantitatív valósidejű PCR eredményeként a kontroll májszövethez képest több mint a felére lecsökkent SMARCB1 expressziót tudtunk kimutatni mind 16 mintában, amit a 16a. ábra diagramján tüntetünk fel. Kilenc tumor mintája az RNS-ük gyenge minősége miatt alkalmatlannak bizonyult ehhez a vizsgálathoz. Feltételeztük, hogy a stróma és más normál sejtek (limfociták, fibroblasztok, endotélsejtek, stb.) jelenléte kontaminációt 53

54 okozhat a génexpresszió mérése során. Az eltérő normál és tumor szövet arányok következtében kaptuk a különböző SMARCB1 mrns szinteket. Emiatt döntöttünk hét, legalább egy intakt SMARCB1 allélal bíró epithelioid sarcomából tumor és kontroll normál sejtek immunfestést követő mikrodisszekciója mellett (16b, c és d. ábra). A csupán daganatos sejtek mintáiban SMARCB1 mrns expressziót már nem detektáltunk q-rt-pcr módszerrel (16e. ábra). Azonban a kontroll sejtekben a SMARCB1 transzkriptum meglétét igazolni tudtuk (16e. ábra). 16. Ábra: A SMARCB1 génexpresszió meghatározásának eredményei. A SMARCB1 lecsökkent mrns mennyiségei a heterogén szöveti összetételű epithelioid sarcoma mintákban q-rt-pcr-rel meghatározva (a). SMARCB1 immunhisztokémia lézer mikrodisszekciót megelőzően (b; 40x nagyítás). Elkülönülten mikrodisszekált tumorsejtek (c; 40x nagyítás) és SMARCB1 pozitív limfociták (d; 40x nagyítás). q-rt-pcr amplifikációs görbék: kontroll GAPDH (kék-limfociták, narancs-tumorsejtek), SMARCB1 (barna-limfociták). A tumorsejtek mintáiból SMARCB1 mrns nem amplifikálódott (zöld alapvonal)(e). 54

55 6. 4. SMARCB1 epigenetikai vizsgálatok Összességében 25 SMARCB1 negatív epithelioid sarcoma esetén nem találtunk biallélikus genetikai eltérést a SMARCB1 gént illetően. Ezért az epigenetikai szabályozó folyamatok közül elsőként a SMARCB1 promóterének metilációját és majd az EZH2 fehérje expressziót és az EZH2 mediálta H3K27 trimetilációt vizsgáltuk meg SMARCB1 promóter metiláció Elsőként a technikai kontrollnak kapott DNS mintákon teszteltük a metilációspecifikus PCR-hez tervezett primereinket. A teljesen metilálatlan, negatív kontroll DNS templátról csak a nem metiláció specifikus primerek amplifikáltak PCR termékeket, ahogy ezt a 17a. ábra gélelektroforézis képe is mutatja. Az in vitro metiltranszferázzal metilált, pozitív kontroll DNS templát PCR amplifikációja során a metiláció és a nem metiláció specifikus primerek egyaránt felsokszorozták a specifikus nukleinsav szakaszokat, amint ez a 17b. ábrán látható. Ez a metilációs heterogenitás arra utal, hogy a kontroll DNS in vitro metilációja nem működhetett 100%-os hatásfokkal, maradtak metilálatlan allélek is a mintában. Ennek ellenére, a kontrollok használatával megbizonyosodhattunk a módszer és primereink megbízható működésében. A 25 biszulfit konvertált epithelioid sarcoma DNS-ének MSP vizsgálatával azt találtuk, hogy a SMARCB1 gén promóterében nincsenek metilált citozinok, mivel a PCR-ek során minden tumor esetében kizárólag a nem metiláció specifikus termékek amplifikálódtak. A 17c. ábra egy reprezentatív epithelioid sarcoma MSP módszert követő gélelektroforézis eredményét mutatja. 55

56 17. Ábra: A SMARCB1 promóter metiláció-specifikus PCR (MSP) termékeinek azonosítása gélelektroforézissel. Negatív kontroll DNS minta MSP amplifikációja (a). Pozitív kontroll DNS minta MSP amplifikációja (b). Epithelioid sarcoma biszulfit módosított DNS-ének MSP amplifikációja (c) EZH2 mediálta H3K27 trimetiláció Az epithelioid sarcomák hiszton metilációs kísérleteit az EZH2 metiltranszferáz fehérje expresszió immunhisztokémiai kimutatásával kezdtük. Majd a hiszton H3 lizin27 oldalláncának trimetilációját (H3K27me3), mint az EZH2 mediálta metiláció funkcionális bizonyítékát, szintúgy immunfestésekkel vizsgáltuk. Az EZH2 fehérje expressziót mind a 36 epithelioid sarcoma esetében az fejezetben leírt pontozási rendszer alapján értékeltük. Az epithelioid sarcomák összesített átlagos pontértéke 2,97±1,55 (átlagérték±szórás), tehát megállapítottuk, hogy az EZH2 overexpresszió nem jellemző az epithelioid sarcomára. Hármas vagy annál kevesebb pontértéket 25 daganat (69%) kapott, így ezeket EZH2 negatívnak (2,2±1,14) tartottuk (18a. ábra). A fennmaradó 11 epithelioid sarcoma (31%; kilenc proximális és két disztális típus) EZH2 pozitívnak (4,73±0,9) bizonyult. A legmagasabb hatos értéket három proximális típusú epithelioid sarcoma (8%) esetében kaptuk (18b. ábra). Irodalmi adatok szerint az EZH2 overexpresszió a malignus rhabdoid tumorokra jellemző [114], amit a malignus 56

57 rhabdoid tumor mintánkon is igazoltunk (18d. ábra). A H3K27me3 antitest, ami a kizárólag a háromszorosan metilált lizin27 oldalláncot ismeri fel a H3-as hisztonon szintén negatív immunhisztokémiai reakciót mutatott az összes vizsgált epithelioid sarcoma minta tumorsejtjeiben (18c. ábra). 18. Ábra: EZH2 és H3K27me3 immunhisztokémia eredmények. EZH2 negatív epithelioid sarcoma (a; 40x nagyítás). EZH2 pozitív proximális típusú epithelioid sarcoma (b; 20x nagyítás). H3K27me3 reakció epithelioid sarcomában, a tumorsejtek negatívak, míg a kép jobb szélén látható limfoid csoport sejtjei pozitívak (c; 20x nagyítás). EZH2 erős pozitivitás malignus rhabdoid tumorban (d; 20x nagyítás) A SMARCB1 mrns-t célzó mirns-ek azonosítása In silico target predikció 57

58 Az öt target predikciós algoritmussal (lásd Módszerek 5.13 fejezet) összesen 80 mirns-t azonosítottunk, amelyek a SMARCB1 3 -UTR régióját lehetségesen célozzák. Ezek közül egyetlen mirns-t, a mir-206-ot mindegyik algoritmus jelezte. Érdekesség, hogy a mir-206-ot a SMARCB1-hez társítja egy online mrns adatbázis is, melyet egy sarcomákat vizsgáló kutatócsoport hozott létre [115]. Hét további mirns-t (mir-1, mir-381, mir-502, mir-548a, mir-619, mir-671-5p, mir-765) legalább négy program azonosított, míg a maradék 72 mirns-t már csak három vagy kevesebb algoritmus jelezte. A fent konkrétan megnevezett nyolc mirns-t választottuk ki további kísérleteink végrehajtásához. A mirns-ek expresszióját kvantitatív valós-idejű PCR módszerrel 30 epithelioid sarcoma (25 legalább egy intakt SMARCB1 allélal rendelkező tumor, három biallélikusan deletált daganat és két SMARCB1 pozitív epithelioid sarcoma) és két malignus rhabdoid tumor mintában vizsgáltuk Target predikciós programokkal kiválasztott mirns-ek expressziója epithelioid sarcomában Négy mirns mutatott szignifikánsan magasabb expressziót (p<0,001; 19. ábra) a 25 epithelioid sarcoma mintában (melyek legalább egy genetikailag intakt SMARCB1 alléllal rendelkeztek) összehasonlítva a három kontroll csoport mintáival (két malignus rhabdoid tumor, két SMARCB1 pozitív epithelioid sarcoma és három SMARCB1 biallélikusan deletált epithelioid sarcoma) és a normál zsírszövettel. A mir-206 5,7- szeres, a mir-381 8,17-szeres, a mir-671-5p 6,55-szörös és a mir ,12-szeres átlagos emelkedését találtuk. A mir-1 és a mir-502 expressziós szintje megegyező vagy lecsökkent értékeket mutatott az összes csoportot tekintve. Ugyanakkor a mir- 548a és a mir-619 nem voltak detektálhatóak egyik fent említett szövettípusban sem. 58

59 19. Ábra: A mirns-ek expressziójának meghatározása q-rt-pcr módszerrel. (***p<0,001) A mirns-ek hatásának funkcionális vizsgálata sejttenyészetekben A mir-206, mir-381, mir-671-5p és mir-765 géncsendesítés hatása a SMARCB1 génexpresszióra Annak igazolására, hogy az epithelioid sarcomában emelkedett expressziót mutató mirns-ek funkcionálisan képesek szabályozni a SMARCB1 génátiratok mennyiségét, vagyis csendesíteni tudják ezt a tumorszupresszort, HT-1080, Caco-2 és HDFα sejtvonalakat transzfektáltunk. A kísérleteket megelőzően mindhárom sejtvonal esetében q-rt-pcr módszerrel megbizonyosodtunk arról, hogy sejtjeik kifejezik a SMARCB1 gént. A mir-206, mir-381, mir-671-5p, mir-765 és a negatív kontroll mirns-ekkel való transzfekciókat követő 24, illetve a HT-1080 sejtekkel 48 óra után is megmértük a SMARCB1 mrns expressziót kvantitatív valós-idejű PCR módszerrel. A HT-1080 sejtekben a mir-206, mir-381 és mir-671-5p által közvetített csendesítés rendre 34,27%-ra, 74,23%-ra és 72,45%-ra csökkentette le szignifikánsan a 59

60 SMARCB1 mrns szintjét 24 óra elteltével (20. ábra; p<0,001). 48 órát követően a mir-206 és a mir-671-5p szignifikánsan csendesítették 54,15%-ra és 74,74%-ra az mrns szintet, a mir-381-nek nem volt szignifikáns hatása. Tehát 24 órával a mirns transzfekciót követően rendszerünkben intenzívebb a géncsendesítés hatása, összehasonlítva azt a 48 órás kísérlettel. A mir-206, mir-381 és mir-671-5p transzfekció a Caco-2 sejtekben 43,53%- ra, 79%-ra és 72,45%-ra, a HDFα sejtekben 31,2%-ra, 56,7%-ra és 56,8%-ra redukálta szignifikánsan a SMARCB1 mrns szintjét (20. ábra; p<0,001 és p<0,01). Meglepetésünkre, a mir-765-nek nem találtuk funkcionális hatását a sejtekben, pedig ez a mirns mutatta a legmagasabb szintű expressziót az epithelioid sarcomákban. A leghatékonyabb géncsendesítő mirns molekulának a mir-206 bizonyult. 20. Ábra: A SMARCB1 génexpressziójának változásai a mir-206, mir-381, mir-671-5p, mir- 765 és a negatív kontroll mirns transzfektáns sejtekben q-rt-pcr-rel mérve. (***p<0,001 és **p<0,01) Annak kiderítésére, hogy a mir-206, mir-381 és mir-671-5p által közvetített géncsendesítő folyamatok szinergisztikusan működnek-e, együttesen transzfektáltuk (ún. ko-transzfekcióval) a HDFα sejteket a fent említett három mirns molekula kombinációival és 24 óra elteltével határoztuk meg a SMARCB1 mrns szinteket (21. ábra). A mir-206/381 és a mir-206/671-5p kombinációk ugyan szignifikánsan 60

61 csökkentették (p<0,001) 44,59%-ra és 35,47%-ra a SMARCB1 génexpressziót, de a mir-206 általi csendesítés önmagában hatékonyabbnak bizonyult a HDFα sejtvonalban. Vagyis a mirns-ek szinergizmusra utaló funkcióját kísérleti rendszerünkben bizonyítani nem tudtuk. A mir-381/671-5p kombinációnak már nem detektáltunk szignifikáns géncsendesítő hatását a SMARCB1 mrns-re. Érdekesnek tartottuk, hogy a hármas mirns kombináció transzfekciója nem befolyásolta a SMARCB1 expressziót. Mindez egy küszöbhatás folyamatát sejteti, konkrétan azt, hogy a hármas kombinációban az egyes mirns koncentrációk nem érték el a csendesítéshez szükséges szintet. 21. Ábra: A SMARCB1 génexpressziójának változásai a mir-206, mir-381, mir-671-5p kombinációk és a negatív kontroll mirns transzfektáns HDFα sejtekben q-rt-pcr-rel mérve. (***p<0,001) A mir-206, mir-381 és mir-671-5p géncsendesítés hatása a SMARCB1 fehérje expressziójára Az mrns szinten leghatékonyabb SMARCB1 géncsendesítést kiváltó három mirns (a mir-206, mir-381 és mir-671-5p) SMARCB1 fehérjére gyakorolt hatását HDFα sejtek transzfektálásával, majd 24 és 48 óra után a sejteken végzett immuncitokémiával vizsgáltuk. SMARCB1 intranukleáris negativitással rendelkező 61

62 sejteket a mir-206 transzfektánsok (22c. ábra), illetve a mir-206/671-5p és a mir- 206/381 ko-transzfektánsok (23c és d. ábra) 48 órás kísérletei esetén figyelhettünk meg. A transzfektánsok között 20-60%-os arányban maradtak SMARCB1 fehérje expressziójukat megőrző sejtek, amit a tranziens transzfekciós hatékonyság körülbelül 85 %-os arányának és a fehérje megújulásának ( turnover -ének) tulajdonítottunk. A SMARCB1 protein becsült in vitro féléletideje körülbelül 30 órára tehető a Protparam algoritmus ( fehérje analízise szerint. A nem transzfektált és a negatív kontroll mirns-sel transzfektált sejtek 100 %-a SMARCB1 pozitív immunfestéssel bírt (22a, b. és 23a, b. ábrák). 22. Ábra: SMARCB1 immuncitokémiai festés a kontroll nem transzfektált (a; 40x nagyítás), a negatív kontroll mirns-sel (b; 40x nagyítás), valamint a mir-206-tal (c; 40x nagyítás) transzfektált HDFα sejteken. 62

63 23. Ábra: SMARCB1 immuncitokémiai festés a kontroll nem transzfektált (a; 20x nagyítás), a negatív kontroll mirns-sel transzfektált (b; 20x nagyítás), valamint a mir-206/671-5p-vel (c; 20x nagyítás) és a mir-206/381-gyel (d; 20x nagyítás) ko-transzfektált HDFα sejteken. 63