LEPTIN, LEPTINRECEPTOR ÉS EGYÉB ADIPOKINEK VIZSGÁLATA HISZTIDIN- DEKARBOXILÁZ GÉNKIÜTÖTT EGÉRBEN. Hegyi Krisztina. Doktori (PhD) értekezés tézisei

Átírás

1 LEPTIN, LEPTINRECEPTOR ÉS EGYÉB ADIPOKINEK VIZSGÁLATA HISZTIDIN- DEKARBOXILÁZ GÉNKIÜTÖTT EGÉRBEN Hegyi Krisztina Doktori (PhD) értekezés tézisei Készült a Semmelweis Egyetem Molekuláris orvostudományok Tudományági Doktori Iskola A humán genetika és géndiagnosztika alapjai c. Ph.D. program keretében Program- és témavezeto: Dr. Falus András egyetemi tanár Budapest, 2004.

2 BEVEZETÉS Az elmúlt évtizedekben elsosorban a fejlett ipari társadalmakban gyors ütemben nott a túlsúlyosak száma, gyakoribb lett a cukorbetegség, és népbetegséggé vált a csontritkulás. A Egyesült Államok felnott lakosságának 59 százaléka túlsúlyos, kövér vagy extrém módon elhízott, a cukorbetegek 79 százalékának nagyobb a testtömegindexe a normálisnál. A cukorbetegek száma 1980 és 2002 között megkétszerezodött (5,8-tól 13,3 millióra nott). Az oszteoporózisra visszavezetheto csonttörések miatti kiadások meghaladták a 17 milliárd dollárt. A leptin az energiahomeosztázis egyik legfontosabb szabályozója, olyan központi elem, amely kapcsolatot teremt a zsírszövet mint energiaraktár és a metabolikus folyamatok között. A testtömeg indikátora, rendellenes muködése, hiánya súlyos zavart okoz a táplálékfelvételben, az energiaraktározásban és felhasználásban. A leptin hatásait endokrin, parakrin módon fejti ki, számos szabályozó folyamatot köt össze a zsírszövettel. A leptin érintett mind az elhízás, mind a diabétesz, mind pedig a csontritkulás kórtanában, így hatásmechanizmusának, szabályozó folyamatainak pontos felderítése alapveto. 2

3 A leptin hatásainak egyik közvetítoje a hisztamin, elsosorban a táplálékfelvételre gyakorolt hatása révén. A leptin a hipotalamikus neurotranszmitter hisztamin segítségével csökkenti a táplálékfelvételt és fokozza az energia-leadást. Dolgozatom tárgya a leptin és a hisztamin kapcsolatának jellemzése hisztaminhiányos, hisztidindekarboxiláz génkiütött egérmodell tanulmányozásával. A krónikus, egész élettartamot átfogó hisztaminhiány pontosabb képet adhat a hisztamin leptinre gyakorolt hatásairól. Munkámban részint a hisztaminhiányos egerek leptin fenotípusát jellemeztem az életkor és a nem szempontjából, másrészt vizsgáltam a megfigyelt módosulások lehetséges molekuláris magyarázatát és annak következményeit a testtömeg és a jelátvitel szintjén. Emellett vizsgáltam, hogy a hisztamin hiányának van-e befolyása egyéb adipokinek termelodésére, továbbá egy mások által eddig még nem kutatott területet, a hisztamin és a zsírsejt-differenciálódás lehetséges kapcsolatát is tanulmányoztam. 3

4 CÉLKITUZÉSEK A HDC KO egér leptinszintjének jellemzése: Szérum leptinszint Korfüggés, nemi különbségek Táplálék: normál, hisztaminmentes hatása Genetikai háttér Fehér zsírszövet leptinszintje Testtömeg, zsírtartalom Van-e különbség a két genotípus testtömegében? Eltér-e a két genotípus zsírtartalma? A leptinszint módosulásának molekuláris szintu magyarázata Leptin promóter reszponzív elemeihez kapcsolódó transzkripciós faktorok vizsgálata A leptinszint módosulásának következményei A testtömegre nézve Leptin érzékenység/rezisztencia: leptinreceptorexpresszió, jelátviteli molekulák mennyisége és aktivitása 4

5 Az aktív, hozzáférheto leptin mennyiségét befolyásoló tényezo: szolubilis leptinreceptor mérése Egyéb adipokinek vizsgálata TNF-? Szérumkoncentráció Szolubilis TNFRI és TNFRII szérumszintje Acrp30 A TNF-? és az adiponektin kölcsönösen gátolják egymást termelodését, ellentétes hatásúak: az acrp30 inzulinra érzékenyíto. Szérumszint A zsírdifferenciálódás vizsgálata Primer fibroblaszt eredetu preadipociták zsírsejtdifferenciálódási hajlamának összehasonlítása vad típusú és KO egérben 5

6 MÓDSZEREK Modellek: Hisztidin -dekarboxiláz génkiütött egér: BALB/c és CD-1 genetikai hátteru egértörzseket használtunk. Az állatok szabadon hozzáfértek a táplálékhoz és vízhez, a tartási körülmények megfeleltek az eloírásoknak. Az állatokat normál (19,5% fehérje, 4,6% zsír, 5,0% rost) vagy hisztaminmentes tápon tartottuk (hisztamin <0,6 nmol, 16,8% fehérje, 4,9% zsír, 4,1% rost). A mintavétel elott egy éjszakán át éheztek, a mintavétel reggel 9-10 óra között történt. Adipogenezis sejtmodell Az adipogenezis tanulmányozása primer fibroblaszt sejttenyészeteken történt, amelyek napos embriókból származtak. A sejtek magas glükóztartalmú DMEM + 10% FCS + Penicillin/Streptomicin összetételu tápfolyadékon tenyésztek. ELISA A leptin, TNFa, szolubilis TNF RI, RII koncentrációkat ELISÁ-val határoztuk meg a gyártó útmutatásait követve. Acrp30 mérése 6

7 Western blottal történt, 1? l szérumból. A hígítások: antiacrp30 1:2000, anti-nyúl-hrp 1: Szolubilis leptinreceptor mérése Affinitástisztítást követoen Western blottal történt, leptin- CNBr Sepharose 4B gyantával. Az aspsecifikus jelek kiszurésére BSA-Sepharose-t alkalmaztunk. EMSA A Promega cég útmutatásai alapján vizsgáltunk CREB, SP-1, GR, C/EBPa oligonukleotidokat. A magfrakció mintákból 5-10?g összfehérje mennyiséget adtunk egy reakcióhoz. RT-PCR Trizol reagenssel teljes RNS-t izoláltunk, az OBR primerek az alábbiak voltak: gat gtt cca aac ccc aag aa (elülso) cat agc tgc tgg gac cat ct (reverz) and for OBRshort atc tgc cgg tgt gag ttt tc (elülso) and cca gtc tct tgc tcc tca cc (reverz). Western blot 15 mg összfehérje tartalmú mintákat választottunk el SDS- PAGE-sel, majd PVDF membránra blottoltunk. A detektálás során blokkolás 5% tejpor-pbs-ben történt, a ellenanyagokat az alábbiak szerint hígítottuk: : CREB (Upstate Biotech) 7

8 1:1,000, STAT3 (Santa Cruz) 1:500, P-Tyr (Sigma) 1:1,500, OBR (R&D Systems) 1:1,000. Zsírdifferenciáltatás Primer fibroblaszt eredetu preadipocitákat használtunk (p2) a konfluencia elérése után. A differenciálódás indukálására az alábbi koktélt használtuk: (0,5 mm izobuthilmetilxantine (IBMX), 100 nm inzulin, 1?M dexametazon) 2 napig, majd 100 nm inzulin 2 napig, végül DMEM újabb 2 napig. EREDMÉNYEK Hisztamin hiányában megemelkedik a szérum leptinszintje A hisztaminhiányos, génkiütött egerek leptin szintje a szérumban jelentosen, akár közel négyszeresre nott. A hatás mind nostényeken, mind hímeken, fiatalabb és idosebb korban egyaránt megfigyelheto volt. A táplálék hisztamin tartalma képes volt ezt a hatást kompenzálni, hisztamintartalmú tápon a KO egerek leptin szintje alig, nem szignifikáns mértékben haladta csak meg a vadban mértet. A vad típusú egerekben nem okozott változást a hisztaminszegény diéta. A zsírszövet leptintartalma magasabb, de nem jár együtt zsírfelhalmozódással A megnövekedett leptin szint nem járt együtt zsírfelhalmozódással, de a zsír leptin tartalma magasabb volt a 8

9 KO-ban. Így a magasabb leptin koncentráció egyik lehetséges oka a fokozott szintézis, amelynek molekuláris magyarázata a KO preadipocitákban mért konstitutív CREB expresszió lehet, amely a leptin promóter egyik reszponzív elemének transzkripciós faktora. Valószínuleg ennek köszönheto a KO preadipociták nagyobb hajlama a zsírsejtdifferenciálódásra is. A testtömeg nem változott hisztamin hiányában Hisztamin hiányában a leptin nem tudja kifejteni testsúlycsökkento hatását, amennyiben ez az egyetlen szabályozókör, amin keresztül a testtömegre hat. Mivel a hisztaminhiányos, HDC KO egerek testtömege nem változott, ezért feltehetoen a hisztamin nem egyedüli közvetítoje a leptin szignálnak. A szérum szolubilis leptinreceptor szintje nott, a leptinérzékenység nem változott A hiperleptinémia gyakori következménye az érzékenység csökkenése, amely jelátviteli szinten valósul meg. A HDC KO egerekben nem változott a receptor hosszú, szignalizációs izoformájának expressziója, sem a legfobb út fo eleme, a STAT3 mennyisége és alapaktivitása. Megnott ugyanakkor a szolubilis leptinreceptor mennyisége a szérumban, ami feltehetoen a leptin vérben töltött idejének 9

10 növelésével hozzájárul a hiperleptinémia kialakulásához, másrészt a leptin kötésével normalizálja a biológiailag aktív leptin mennyiségét. A hisztamin hiánya nem befolyásolta egyéb adipokinek szérumszintjét A hisztamin egyéb adipokinek, a TNF-? és az acrp30 szintjét nem befolyásolta jelentos mértékben. A genetikai háttér számít, befolyásolja a hisztaminhiány okozta hatások erosségét A CD-1 kültenyésztett egértörzsben a leptinszint emelkedése jóval nagyobb mértéku volt, mint a BALB/c beltenyésztett törzsben. Az CD-1 állatok idoskorban elhíztak, csökkent a glükóztoleranciájuk. Molekuláris szinten a receptor expressziójának csökkenését figyeltük meg, ami leptin rezisztencia kialakulására utal. A CD-1 egerekben a TNFa szint megemelkedett, az acrp30 lecsökkent, szemben a másik törzsben tapasztalttal. Egy ~27 és egy ~50 kda fehérje tirozin-foszforilációja lecsökkent Vizsgálataink érdekes hozadéka volt két ismeretlen, a plazmában és a magban egyaránt megtalálható fehérje tirozinfoszforilációs mintázatának megváltozása. Mindkét fehérje 10

11 konstitutív foszforilációjának csökkenését észleltük a KO egerek májában, amely diétával, illetve LPS-sel indukálhatónak bizonyult. Így elképzelheto, hogy ezek a fehérjék részt vesznek az akutfázis reakcióban. Zsírdifferenciáltatás Alacsony potenciájú indukciós koktélt alkalmazva, szuboptimális körülmények között a KO egerekbol származó preadipociták nagyobb mértékben alakultak át zsírsejtekké, mint a vad típusú sejtek. KÖVETKEZTETÉSEK A hisztamin-hiánya a leptin szérumban mért szintjének a megemelkedéséhez vezet mind hím, mind nostény egerekben fiatal és idosebb korban egyaránt. A nemi és életkorbeli különbségek csak kismértékben módosítják ezt a hatást. A hisztamin-hiány okozta leptin koncentrációnövekedés diétafüggo, a táplálékkal bevitt hisztaminnal a hatás visszafordítható. A hisztaminszegény táp a vad típusú állatok vérének leptin tartalmát nem befolyásolja jelentosen. 11

12 A magas leptinszint magyarázata részben a zsírszövet fokozott leptintermelése, részben a vérben keringo leptin hosszabb életideje lehet. A fokozott leptin szintézisre molekuláris magyarázatot adhat a preadipocitákban megfigyelt konstitutív CREB aktivitás. A hisztamin-hiány nem okoz elhízást BALB/c HDC KO egerekben, a testtömeg nem különbözik jelentosen a vad típushoz képest. A leptin valószínuleg nemcsak hisztaminon keresztül képes a normális testtömeg értéket fenntartani. A magas leptinszint megnövekedett szolubilis leptinreceptor koncentrációval párosul, így a biológiailag elérheto leptin mennyisége valószínuleg nem módosul. A krónikus hiperleptinémia a jelátviteli molekulák expresszióját, mennyiségét és alapaktivitását nem módosította, így a sejtek feltehetoen megorizték leptin érzékenységüket. A genetikai háttér befolyásolja a hisztamin-hiány hatását: CD-1, kültenyésztett hátteru egerek idoskori enyhe elhízásban, viszcerális zsírosodásban és csökkent glükóz toleranciában szenvednek, acrp30 szintjük lecsökkent. A tirozin-foszforilációs mintázat eltér a vad típusú és a HDC KO egérben: két, egyelore ismeretlen fehérje konstitutív 12

13 foszforilációja lecsökkent a KO egerek májszövetében. A fehérjék mind a citoplazmában, mind a magfrakcióban jelen voltak, foszforilációjukat a táplálék hisztamin-hiánya és egy órás LPS indukció csökkentette. PUBLIKÁCIÓK 1. Hegyi K, Fulop KA, Kovacs KJ, Falus A, Toth S. High leptin level is accompanied with decreased long leptin receptor transcript in histamine deficient transgenic mice. Immunol Lett Mar 29;92(1-2): Hegyi K, Fulop K, Kovacs K, Toth S, Falus A. Leptininduced signal transduction pathways. Cell Biol Int. 2004;28(3): Hegyi K, Fulop AK, Toth S, Buzas E, Watanabe T, Ohtsu H, Ichikawa A, Nagy A, Falus A. Histamine deficiency suppresses murine haptoglobin production and modifies hepatic protein tyrosine phosphorylation. Cell Mol Life Sci May;58(5-6): Fulop AK, Foldes A, Buzas E, Hegyi K, Miklos IH, Romics L, Kleiber M, Nagy A, Falus A, Kovacs KJ. Hyperleptinemia, visceral adiposity, and decreased glucose tolerance in mice with a targeted disruption of the histidine decarboxylase gene. Endocrinology Oct;144(10): Tamasi V, Fulop AK, Hegyi K, Monostory K, Falus A. Upregulation of CYP2e1 and CYP3a activities in histamine-deficient histidine decarboxylase gene targeted mice. Cell Biol Int. 2003;27(12): Prufer K, Schroder C, Hegyi K, Barsony J. Degradation of RXRs influences sensitivity of rat osteosarcoma cells to the antiproliferative effects of calcitriol. Mol Endocrinol May;16(5):

14 Poszterek, eloadások 1. Hegyi, K, Toth, S, Kovacs, KJ, Foldes, A, Fulop, AK, and Falus, A. Studying Serum Leptin, Leptin Receptor and CREB Expression In Histidine-Decarboxylase Gene Targeted Mice. Keystone Symposia: Molecular Control of Adipogenesis and Obesity. Fairmont Banff Springs Banff, Alberta, Canada. March 4-10, poszter 2. Hegyi K., Tóth S., Fülöp A. K., Falus A. Szérum leptin és leptin receptor expresszió vizsgálata hisztidindekarboxiláz génkiütött egerekben. A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztálya 8. Munkaértekezlete, Tihany, május poszter 3. K. Hegyi, A.K. Fulop, S. Toth and A. Falus. Increased leptin (OB) levels in serum and white adipose tissue and modified expression of OBR in histidine-decarboxylase knockout mice. XXXIIth Meeting of the European Histamine Research Society, Noordwijkerhout, the Netherlands, May 7th - 11th, eloadás 4. Hegyi K, Fülöp AK, Tóth S, Buzás E, Watanabe T, Ohtsu H, Ichikawa A, Nagy A and Falus A. Histamine deficiency in histidine decarboxylase gene targeted mice modifies tyrosine phosphorylation of two hepatic protein EMBO Lecture Course on Cellular Signalling in Development and Disease, Split, Horvátország, September 21 th -27 th, poszter 5. Tóth S., Hegyi K., Falus A. Módosult CREB aktivitás HDC-/- fibroblaszt sejteken A Magyar Biokémiai Egyesület Molekuláris Biológiai Szakosztálya 8. Munkaértekezlete, Tihany május eloadás 6. Falus A., Hegyi K., Fülöp AK., Kovács KJ., Tóth S. High leptin level is accompanied with decreased long 14

15 leptin receptor transcript in histamine deficient transgenic mice. Symposium on Signals and Signal Processing in the Immune System, Sopron, Hungary. Sept 3rd-7th eloadás 7. Falus A., Fülöp AK., Hegyi K., Pap E., Kovács KJ., Wiener Z., László V., Jelinek I., Pós Z., Hegyesi H., Buzás E.. Unexpected findings in the physiology of HDC knckout mice: a postgenomic view. XXXII th Meeting of the European Histamine Research Society, Noordwijkerhout, the Netherlands, May 7 th - 11 th, eloadás 8. Fülöp A.K, Kovács KJ., Hegyi K., Földes A., Lannert Á., Szomor V., Falus A. Energy homeostasis related alterations in a histamine free mouse model.xxxii th Meeting of the European Histamine Research Society, Noordwijkerhout, the Netherlands, May 7 th - 11 th, poster 9. Hegyi K. Proteomika, avagy túl a genomikán? BMGE Szervetlen és Analitikai Tanszék Tudományos értekezlete február 15. meghívott eloadó 10. K. Hegyi. Proteomics or beyond genomics? Meeting of International Pharmacology Students, Budapest, Hungary meghívott eloadó 11. Barsony J, Prufer K, Hegyi K. Proteasomal degradation of retinoid X receptors blocks the anticancer effect of calcitriol in rat osteosarcoma cells. 40th Annual Meeting of the American Society for Cell Biology, San Francisco, USA. 9-13th Dec, poszter 15