(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (51) Int. Cl.: C12N 15/19 ( ) A61K 38/19 ( ) C12N 15/63 ( ) C07K 14/52 ( ) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/EP 03/ (30) Elsõbbségi adatok: EP (72) Feltalálók: EMING, Sabine, c/o Dermatologie Univ. zu Köln, Köln (DE); KRIEG, Thomas, c/o Dermatologie Univ. zu Köln, Köln (DE); SOLLBERG, Stephan HELIOS Kliniken Schwerin, Schwerin (DE); LAUER, Gereon, Radolfzell (DE) (73) Jogosult: Bayer Innovation GmbH, Düsseldorf (DE) (74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest (54) Proteolízisre rezisztens, aktív VEGF (57) Kivonat A találmány tárgyát képezi vaszkuláris endotél növekedési faktor (VEGF), amelyben a 111. aminosavhelyzetben lévõ alanin prolinra van cserélve, és a 110. aminosavhelyzetben lévõ arginin szubsztituálva lehet más aminosavval. Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti VEGF származékai, nukleinsavak, expressziós rendszerek, gyógyszerek, és a találmány szerinti VEGF-mutánsok alkalmazása krónikus sebek kezelésére. HU T2 A leírás terjedelme 18 oldal (ezen belül 5 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 1 HU T2 2 A találmány tárgyát képezi vaszkuláris endotél növekedési faktor (VEGF), amelyben a 111. aminosavhelyzetben lévõ alanin prolinra van cserélve. A 110. aminosavhelyzetben lévõ arginin szubsztituálva lehet más aminosavval. Szintén a találmány tárgyát képezik a találmány szerinti VEGF származékai, nukleinsavak, expressziós rendszerek, gyógyszerek, és a találmány szerinti VEGF-mutánsok alkalmazása krónikus sebek kezelésére. Bõrsebek gyógyulásának fontos szakasza a sarjszövet képzõdése. Ez utóbbival szorosan összefügg az újjáépülõ erek belépése (neoangiogenezis). Számos kísérletben és klinikai vizsgálatban kimutatták, hogy krónikus sebekre jellemzõ a rendellenes angiogenezis, és ezáltal kisebb mértékû sarjszövetképzõdés. Sok mediátor ismert, amely angiogenezist stimulál sebgyógyulás alatt. Ideszámítanak olyan faktorok, amelyek endotél sejtek stimulálása mellett mezenchimális és/vagy epidermális sejteket is aktiválnak (bfgf, afgf, TGF¹a, PDGF), és más, úgynevezett endotél sejtre specifikus faktorok, amelyek receptorai lényegében endotél sejtekre korlátozódnak (VEGF, angiopoietin). A vérkeringés közremûködésével nagyszámú fiziológiás és patológiás reakció összefügg VEGF és receptorainak megnövekedett mértékû expressziójával, így a VEGF központi szerepet játszik a bõr angiogenezisében. Az elsõ utalások alapján, amelyek szerint a VEGF-nek jelentõsége lehet a sebgyógyulás rendellenességeiben, olyan kísérleteket kezdtek végezni, amelyekben VEGF expresszióját vizsgálták diabéteszes egerekben (db/db-egerek) [Frank és munkatársai (1995)]. Ezekben a modellekben ki lehetett mutatni, hogy a sebgyógyulás rendellenessége összefüggésben van VEGF alacsony mértékû expressziójával. A VEGF sebgyógyulásban betöltött szerepét a közelmúltban alátámasztották egy további transzgenikus állatmodellben [Fukumura és munkatársai, (1998)], és úgy, hogy VEGF¹et kimutattak akut, humán sebváladékban [Nissen és munkatársai, (1998)]. Továbbá kimutatták, hogy VEGF-nek és receptorának megfelelõ mrns krónikus sebszövetben fokozottan expresszálódik [Lauer és munkatársai, (2000)]. SDS-PAGE vizsgálatokkal kimutatták, hogy a VEGFfehérjék mégis lebomlanak krónikus sebmiliõben, akut sebekkel ellentétben. Ez a lebomlás a biológiai aktivitás jelentõs mértékû veszteségéhez vezet, és ezáltal alapul szolgál arra, hogy VEGF-receptorok fokozott mértékû expressziója ellenére, a neoangiogenezis nem stimulálódik elégséges mértékben krónikus sebmiliõben. A fentebb leírtak szerint kimutatták, hogy a plazmin szerepet játszik VEGF hasításában krónikus sebmiliõben [Lauer és munkatársai, (2000)]. VEGF 165 hasítása plazminnal a karboxilterminális domén lehasításához vezet, amit a 7. exon kódol. Míg VEGF kötési sajátságait FIt¹1 és FIk-1/KDR jelû VEGFreceptorokhoz a 3. és 4. exon határozza meg, a 7. exonnak VEGF és neutrofilin¹1 közötti kölcsönhatásban vagy kritikus jelentõsége [Keyt és munkatársai, (1996)]. A neutrofilin¹1 egy 130 kda molekulatömegû, sejtfelszíni glikoprotein. Csak a közelmúltban írták le szerepét a VEGF endotél sejtekre kifejtett mitogén hatásainak potenciálásával kapcsolatban [Soker és munkatársai, (1998)]. Úgy tûnik, ebben neutrofil¹1 és FIk1/KDR közötti kölcsönhatásnak van jelentõsége, mert önmagában VEGF kötõdése neutrofilin-1-hez nem fejt ki jelgeneráló hatást. A plazmin a szerinproteázok osztályába tartozik. Ez az enzim alapvetõen peptidkötéseket hasít. A hasítást egy úgynevezett katalitikus triád végzi. A katalitikus centrumban különösen a névadó szerin játszik szerepet, de a hisztidinnek és az aszparaginsavnak is lényeges szerepe van, amin keresztül a peptid hasítása bekövetkezik [Stryer, 231. oldal (1987)]. Bár a kötés hasításának mechanizmusát minden szerinproteázra azonosították, szubsztrátspecifitásuk alapján egyértelmûen megkülönböztethetõk. Eszerint a plazmin, ugyanúgy, mint a tripszin, bázikus aminosavak, lizin és arginin után hasít. A plazmin szubsztrátspecifitása, amit a katalitikus centrum struktúráján keresztül határoztak meg, mégis olyan, hogy a plazmin nem képes az említett kötések mindegyikét hasítani. A peptidkötés hasításának katalízise csak akkor tud végbemenni, ha a megfelelõ fehérjeszakaszok olyan helyzetbe kerülnek az enzim katalitikus centrumával, hogy kölcsönhatásba tudjanak lépni [Power és munkatársai, (1993); Stryer (1987)]. Eddig nem vált ismertté egyetlen plazminhasítóhelyet kódoló, egyértelmû konszenzusszekvencia sem. A WO 97/08313 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak 30 VEGF mutánst/variánst, és ezek elõállítását és alkalmazását (például vaszkuláris trauma kezelésére). A közölt VEGF-variánsok többek között VEGF D109A, R110A, R112A és KKDR ( )AAA. A VEGF-variánsokat rekombinánsan (szignálszekvenciával rendelkezõ cdns-sel kódolva) 293-sejtekben expresszálták és tesztelték. A WO 97/08313 számú nemzetközi közzétételi iratban a VEGF és olyan fragmenseinek moduláris felépítését is leírják, amelyeket plazminnal végzett hasítással kaptak. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során feladatul tûztünk ki krónikus sebek gyógyítására szolgáló, javított módszert. Meglepõ módon azt találtuk, hogy ez a feladat a találmány szerinti, vaszkuláris endotél növekedési faktor (VEGF) variánsával oldható meg, amit az jellemez, hogy a natív vaszkuláris endotél növekedési faktor 111. aminosavhelyzetében az alanin prolinra van kicserélve. A találmány szerinti VEGF-variáns esetén, különösen a natív vaszkuláris endotél növekedési faktor 110. aminosavhelyzetében lévõ arginin és a natív vaszkuláris endotél növekedési faktor 111. aminosavhelyzetében lévõ alanin van prolinra kicserélve. A találmány szerinti VEGF-mutánsok elõnyösen VEGF 121, VEGF 145, VEGF 165, VEGF 183, VEGF 189 vagy VEGF 206 splicingvariánsként állnak rendelkezésre. A találmány szerinti VEGF-mutánsok nemcsak egyértelmûen fokozott stabilitást mutatnak plazminnal szemben, hanem a vad típusú VEGF-fel összehasonlítható mértékû aktivitással rendelkeznek. Meglepõ módon a találmány szerinti VEGF-variánsok egyértelmûen 2

3 1 HU T fokozott stabilitással rendelkeznek krónikus sebek váladékában. A mutációkat a VEGF-molekula biológiai aktivitása szempontjából kritikus helyeken végezzük. Ennek következtében attól tarthatunk, hogy a fehérje szerkezetének megváltoztatása ebben a tartományban negatívan befolyásolja az aktivitást. A prolin aminosavnál, melyet a találmány szerinti megoldásban a 111. helyzetbe vittünk be, egy ciklikus ¹iminosav képzõdik. A pirrolidincsoport ciklikus formája merev konformációval rendelkezik, ami az adott fehérje szerkezetére is kihat. Így a prolin például erõsebb ¹hélixtörõként funkcionál. Ezért különösen meglepõ, hogy éppen a 111. helyzetben lévõ alanin prolinra való cseréjével olyan mutáns jön létre, amely plazmin-proteázzal szemben stabil, krónikus seb váladékában stabil, és egyidejûleg vad típusú fehérjének megfelelõ aktivitással rendelkezik. A találmány tárgyát különösen az 1. vagy 2. azonosító számú szekvenciával rendelkezõ VEGF-variánsok képezik. A találmány tárgyát képezik a fentebb bemutatott VEGF-mutánsok olyan variánsai is, amelyekben az aminosavszekvencia módosítva van, vagy származéka van képezve, vagy mutációkat, inszerciókat vagy deléciókat tartalmaznak. A találmány tárgyát különösen olyan VEGF-variánsok képezik, amelyekben egyetlen további aminosav ki van cserélve, és olyanok, amelyekben glikozilálva, amidálva, acetilálva, szulfatálva vagy foszforilálva van. Az ilyen VEGF-variánsok elõnyösen a vad típusú VEGF-fel összehasonlítható mértékû vagy nagyobb aktivitással rendelkeznek. A találmány szerinti VEGF-variánsok szignálszekvenciát is tartalmazhatnak. A találmány tárgyát képezik nukleinsavak, amelyek a fentebb leírt VEGF-mutánsokat kódolják, és VEGF expresszálására szolgáló vektorok, amelyek ilyen nukleinsavakat tartalmaznak. A találmány tárgyát képezi gyógyszer is, amely a fentebb leírt VEGF-mutánsokat tartalmazza, valamint a VEGF-mutánsok alkalmazása különösen szövetelváltozások, például krónikus vénás elégtelenség (KVE), primer/szekunder limfödéma (nyirokpangás okozta vizenyõ), artériás elzáródási betegség, anyagcsere-betegségek, például cukorbetegség (diabetes mellitus), köszvény vagy felfekvés, krónikus gyulladásos betegségek, például pyoderma gangraenosum, vasculitis (érgyulladás), perforáló dermatosis (gyulladás nélküli bõrbetegség), mint például necrobiosis lipoidica diabeticorum és granuloma annulare, hematológiai alapbetegségek, mint például véralvadási rendellenességek, sarlósejtes anémia és polycythaemia vera (vörösvérsejtek abszolút számának növekedése), tumorok, mint például primer kután tumorok és fekélyesedõ metasztázisok okozta, krónikus sebek kezelésére, valamint plazmin gátlására, neoangiogenezis és/vagy mátrixlebomlás indukciójára szolgáló gyógyszer elõállítására. A növekedési faktorok helyi alkalmazása sebgyógyításban egy új terápiás koncepciót jelent. Krónikus sebek gyógyulásának javulását EGF, bfgf, PDWHF és PDGF alkalmazásával nagyszámú klinikai vizsgálatban megfigyelték [Scharffetter-Kochanek és munkatársai, (2000)]. Kritikus észrevételként megjegyezzük, hogy ilyen vizsgálatok eredményei mégis a várakozás alatt maradtak, azt tekintve, hogy ezek a mediátorok állatmodellben hatékonynak bizonyultak [Lawrence és munkatársai (1994)]. A növekedési faktorok ilyen korlátozott hatékonyságának valószínû magyarázata az, hogy krónikus sebek miliõjében minden bizonnyal fokozott proteolitikus aktivitás van, ami a helyileg felvitt faktorok lebomlásához vezet. Eszerint nyilvánvaló, hogy a helyi sebkezelés növekedési faktorok alkalmazásával új, sokféleképpen ígéretes terápiás stratégiát jelent. Mindazonáltal szükség van olyan új stratégiák kifejlesztésére, amelyek a proteolitikus aktivitást krónikus sebmiliõben kontrollálják. Krónikus sebmiliõben nagyfokú stabilitással rendelkezõ mestercitokinek elõállítása egy újfajta terápiás alkalmazást jelent. A találmány szerinti VEGF-mutánsok sebváladékban tapasztalt, nagyfokú stabilitása miatt különösen alkalmasak krónikus sebek helyi kezelésére. Példák Mutagenezis Négy mutánst célzott mutagenezis alkalmazásával állítottunk elõ, amelyben célzott aminosavcserét végeztünk Arg 110 -nél és Ala 111 -nél. Humán VEGF 165 ¹öt kódoló cdns¹t SV40 replikációs origóval rendelkezõ, pcdna 3.1 jelû expressziós vektorba (Invitrogen cég, De Schelp, NL) klónoztunk, a klónozóhelyen BamHIés EcoRI-hasítóhelyek alkalmazásával. A célzott in vitro mutagenezisben a Promega cég (Mannheim) által forgalmazott Gen Editor -rendszert alkalmaztuk. Ez olyan oligonukleotidok kiindulási szekvenciába történõ bevitelére alapul, amelyek a megfelelõ mutációkat hordozzák. VEGF 165 kiindulási szekvenciája a mutáció környékén az alábbi: GA CCA AAG AAA GAT AGA GCA AGA CAA G Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln A mutációk bevitelére láncindító oligonukleotidként az alábbi, párosodni nem képes oligonukleotidokat alkalmaztuk: 1. mutáció: Mut Ala : GA CCA AAG AAA GAT GCC GCA AGA CAA G Pro Lys Lys Asp Ala Ala Arg Gln 2. mutáció: Mut Gln : GA CCA AAG AAA GAT CAG GCA AGA CAA G Pro Lys Lys Asp Gln Ala Arg Gln 3. mutáció: Mut Pro : GA CCA AAG AAA GAT AGA CCA AGA CAA G Pro Lys Lys Asp Arg Pro Arg Gln 4. mutáció: Mut Lys-Pro : GA CCA AAG AAA GAT AAA CCA AGA CAA G Pro Lys Lys Asp Lys Pro Arg Gln Bemutatjuk a mutagenezisre alkalmazott láncindító oligonukleotidokat az általuk kapott, megváltoztatott 3

4 1 HU T2 2 aminosavszekvenciákkal. Dõlt nyomtatással jelöljük azokat a részeket, ahol a vad típusú szekvenciához viszonyítva megváltoztatott bázisok vagy aminosavak vannak. Az 1. mutánsban az arginin 110 ¹et egy apoláros alaninra cseréltük. A 2. mutánsban ugyanebbe a helyzetbe egy poláros, töltetlen glutamint vittünk be. A 3. mutánsban a nem bázikus arginin 110 ¹et, hanem a 111. helyzetben lévõ alanint egy prolinra cseréltük. A 4. mutánsban két aminosavat cseréltünk ki. Itt az arginin 110 és az alanin 111 helyett lizint és prolint vittünk be. A mutagenezis elvégzése után a mutációkat szekvenciaanalízissel igazoltuk. Az így kapott VEGF-mutánsok az alábbi szekvenciával rendelkeztek a aminosavaknál: VEGF 165 vad típus: -Asp 109 Arg 110 Ala 111 Arg 112 ¹ Mut Gln : -Asp 109 Gln 110 Ala 111 Arg 112 ¹ Mut Ala : -Asp 109 Ala 110 Ala 111 Arg 112 ¹ Mut Pro : -Asp 109 Arg 110 Pro 111 Arg 112 ¹ Mut Lys-Pro : -Asp 109 Lys 110 Pro 111 Arg 112 ¹ A Mut Pro és a Mut Lys-Pro mutánsok a találmány szerinti mutánsok, míg a Mut Gln és a Mut Ala mutánsokat összehasonlítási célból állítottuk elõ és vizsgáltuk. Az így kapott VEGF 165 expressziós vektort további kísérletekben alkalmaztuk Rekombináns VEGF 165 -fehérje elõállítása A VEGF 165 -fehérje expresszióját eukarióta COS-1- sejtekben végeztük. Az alkalmazott pcdna 3.1 jelû expressziós vektor egy SV¹40 replikációs origót tartalmazott. Ez vektorok olyan sejtekben történõ amplifikációjára szolgál, amelyekben az SV¹40-vírus nagy T¹antigénje expresszálódik. Az alkalmazott COS-1-sejtek egy megfelelõ, genomba integrálódott elemet tartalmaznak úgy, hogy a vektor episzomális replikációja megy végbe. Ezáltal elérhetõ a VEGF-célfehérjék expressziója több napig anélkül, hogy vektorok stabilan integrálódnának a sejt genomjába (transzformáció nélkül). A COS-1-sejtek így a mutagenezissel elõállított expressziós plazmidokkal lettek transzfektálva. Ehhez Superfect transzfekciós reagenst (QIAGEN, Hilden) alkalmaztunk, a gyártó által megadott használati útmutató alapján. Sok növekedési faktorhoz hasonlóan a VEGF 165 is heparinkötõhellyel rendelkezik, amely a bázikus C¹terminálisnál helyezkedik el. A heparinkötést felhasználhatjuk a fehérje tisztítására affinitáskromatográfiával [Mohanraj és munkatársai, (1995)]. A VEGF és a VEGF-variánsok izolálása az alábbi lépések szerint történt. Az expressziós plazmidokkal transzformált COS-1- sejteket 10% magzati borjúszérumot (FCS), 2 mm L¹glutamint, 10 U/ml penicillint és 10 g/ml sztreptomicint és ITS-kiegészítést ( ITS Supplement, Sigma, Deisenhofen) tartalmazó, szérummentes DMEM (Dulbecco-féle módosított Eagle-féle tápközeg) tápközegben tenyésztettük. A kondicionált tápközeget (200 ml) elkülönítettük 48 óra elteltével, és 5 ml Heparin-Sepharose-zal (Pharmacia, Freiburg) 4 óra hosszáig inkubáltuk. A Heparin-Sepharose¹t oszlopba töltöttük. Erre felvittük a tenyésztési tápközeget 25 ml/óra áramlási sebességgel. Az alábbi lépéseket hajtottuk végre: A: Affinitáskromatográfia Heparin-Sepharose-zal 1. mosás: 0,1 M NaCl; 20 mm Tris/pH=7,2 2. mosás: 0,3 M NaCl; 20 mm Tris/pH=7,2 3. mosás: 0,9 M NaCl; 20 mm Tris/pH=7,2 B: Az így kapott frakciók analízise Western-blot-analízisben C: A VEGF-tartalmú frakciók sómentesítése gélszûréssel Futtatásra használt puffer: 10 mm Tris/pH=7,2 D: Az oldat liofilizálása és koncentrációjának meghatározása ELISA-val Az így kapott VEGF¹et SDS-PAGE-val vizsgáltuk. COS-1-sejtekbõl kinyert VEGF-fehérje futási ideje SDS-PAGE-ban különbözik az alkalmazott, kereskedelmi forgalomban rendelkezésre álló VEGF 165 -fehérjétõl (R&D Systems cég forgalmazza). Továbbá a 42 kda-nál detektálandó jel (1. ábra, 6. sáv) mellett egy további, néhány kda-nal nagyobb molekulatömegû csík látható. A COS-1-sejtekben expresszált VEGF-fehérjékhez tartozó dupla csík oka a növekedési faktor megváltozott glikozilációja. COS-1-sejtekben történõ VEGF-expresszió esetén két, eltérõen glikozilálódott fehérje jelenik meg. Az egyik forma (42 kda) glikoziláltságában azonos az eddig alkalmazott rekombináns VEGF 165 -tel, amit rovarsejtekben, baculovírus expressziós rendszerrel állítottak elõ (R&D Systems, 1. ábra, 1. sáv). Kimutatták, hogy a 74. helyzetben lévõ aminosav, egy aszparagin N¹glikozilált [Gospodarowicz és munkatársai (1989); Keck és munkatársai (1989)]. A nagyobb molekulatömegnél megjelenõ (45 kda) második csík a fehérje egy másik glikozilálására utal. Az eltérõ glikoziláltság COS-sejtekben történõ expresszió esetén ismert jelenség, és nincsen hatással a növekedési faktor biológiai aktivitására (R&D Systems). A tisztított VEGF 165 -fehérje biokémiai és biológiai tulajdonságainak jellemzése I. VEGF 165 -fehérje és mutánsai stabilitásának analízise a) Inkubálás plazminban A négy tisztított, mutáns VEGF-fehérjét elõször stabilitásukra vizsgáltuk plazmin-proteázzal szemben. Azt vizsgáltuk, hogy az elõállított mutációk megváltozott lebomlási tulajdonságokhoz vezettek¹e a vad típusú VEGF-hez viszonyítva. Az 1. ábrán bemutatjuk vad típusú VEGF és a VEGF-mutánsok inkubálásának eredményeit plazminnal. A COS-1-sejtekben szintetizált, vad típusú VEGF (A, sáv) inkubálása már 15 perc elteltével a növekedési faktor lebomlását eredményezte. Ebben az esetben az alkotó fragmensek pontos nagyságának meghatározása SDS-PAGE-val nehéz, mert az eltérõen glikozilált fehérjéknek megfelelõ két csík átfedésben van. A lebomlási mintázat mindazonáltal azonos a kereskedelmi forgalomban elérhetõ VEGF 165 mintázatával (1A. ábra, 1 5. sáv). Így 45 perc után egy 38 kda molekulatömegû fragmenst lehetett detektálni. Ez meg- 4

5 1 HU T2 2 felel a kisebb mértékben glikozilált VEGF-variáns 110¹es dimerfragmensének. Ezek az eredmények egyértelmûen azt mutatják, hogy a COS-1-sejtekben expresszált VEGF-fehérjét is hasítja a plazmin a választott körülmények között. Az 1B. ábrán (1 17. sáv) mutáns fehérjék inkubálásának eredményei láthatók. Elõször azt a mutánst mutatjuk be, amelyben az arginin alaninra van cserélve (1 5. sávok). Az inkubálás nulla idõpontjában a vad típusú fehérjéhez hasonlóan, a VEGF-fehérje különféleképpen glikozilált variánsainak megfelelõ, mindkét csíkot lehetett detektálni. Ezeket persze az erõsebb jelintenzitás miatt nem lehetett egymástól olyan egyértelmûen megkülönböztetni, mint a vad típusú VEGF 165 esetén. A vad típusú VEGF-fel ellentétben, a mutáns fehérje futási tulajdonságai 240 perces inkubálás után kismértékben változtak meg. A leírt megfigyelés alapján kézenfekvõ, hogy a mutáció arginin 110 -rõl alanin 110 ¹re a plazminhasítóhely inaktiválásához vezetett. Továbbá az 1B. ábrán bemutatottak szerint a további három mutáns, Mut Pro, Mut Gln és Mut Lys-Pro esetén a 45 és 42 kda méretû jelek szintén összehasonlítható mértékben stabilnak bizonyultak plazminnal történt, 240 perces inkubálás után. Egy kontroll, amelyben vad típusú VEGF 165 ¹öt 4 óra hosszáig, 37 C¹on inkubáltunk plazminpufferrel, nem bomlott le (18. és 19. sáv). Összességében, ezekkel a kísérletekkel kimutattuk, hogy az elõállított és tisztított VEGF-mutánsok stabilak plazmin-proteázzal szemben b) Inkubálás akut és krónikus sebek váladékában A következõ lépésben a VEGF-mutánsok lebomlását analizáltuk akut és krónikus sebekkel rendelkezõ páciensektõl vett sebváladékban. A vad típusú VEGF 165 -fehérjét és valamennyi VEGF-mutánst 240 percig inkubáltuk akut sebbõl származó váladékban, ezután nem volt kimutatható lebomlás. A 2. ábrán bemutatjuk krónikus sebbõl származó váladék hatását VEGF-fehérje stabilitására. COS-1- sejtekben szintetizált vad típusú VEGF (2A. ábra, 1 4. sávok) 240 perces inkubálása után a növekedési faktor lebomlását figyeltük meg, egy körülbelül 38 kda tömegû fragmens megjelenésével. Ez megfelelt a kisebb mértékben glikozilált VEGF-variáns 110¹es dimerfragmensének. A vad típussal szemben a VEGF 165 -mutánsok más lebomlási tulajdonságokat mutatnak krónikus sebbõl származó váladékban történõ inkubálás esetén. Egyrészt a Mut Gln -mutánsokban (2B. ábra, sávok) és a Mut Ala -mutánsokban (5 8. sávok) olyan lebomlási folyamat figyelhetõ meg, ami a vad típussal összehasonlítható. Már 20 perc inkubálás után megjelennek a körülbelül 38 kda méretû fragmensek. Másrészt az analízis azt mutatta, hogy a Mut Pro - mutánsok (9 12. sávok) és Mut Lys-Pro -mutánsok (1 4., sávok) a vad típustól, a Mut Ala -mutánsoktól és a Mut Gln -mutánsoktól eltérõ lebomlási tulajdonságokkal rendelkeznek. 60 perces inkubálás után az SDS- PAGE-ban 42 és 45 kda méretnél stabil jelek láthatók. Ez a Mut Pro és Mut Lys-Pro mutáns fehérjék stabilizálására utal krónikus sebbõl származó váladékban. A semleges/apoláros aminosavakkal és prolinnal kialakított mutánsok lebomlási tulajdonságokban mutatkozó ilyen különbözõsége alapján nyilvánvaló, hogy krónikus sebmiliõben a plazmin mellett további proteázok is szerepet játszanak VEGF lebontásában. Krónikus sebbõl származó váladékban történt 240 perces inkubálás után minden mutáns fehérjénél lebomlást lehetett megfigyelni. Ebben az esetben nem keletkeznek egyértelmûen meghatározható méretû lebomlási fragmensek, sokszor 240 perces inkubálás után diffúz szignál látható 38 és 45 kda között. Valószínûleg a proteolízis az elsõ 20 aminosavat érintõ tartományban történik (az ellenanyag kötõhelye), mert a jelerõsség 240 perc után egyértelmûen csökken. Összefoglalva, az eredmények arra utalnak, hogy a 111. helyzetben prolint tartalmazó VEGF-mutánsok krónikus sebbõl származó váladékban eleinte stabilizálódtak, hosszabb távon azonban lebomlottak. Összehasonlítható eredményeket figyeltünk meg krónikus vénás elégtelenségben szenvedõ, három különbözõ pácienstõl vett sebváladékban. A különbözõ sebváladékok esetén a kísérletet legalább kétszer megismételtük (2B. ábra: X páciens 1 4. sávok; Y páciens: sávok). A molekulatömeg-standard viszonyítás céljára folyamatosan jelen volt. A 2C. ábrán vad típusú VEGF és Mut Lys-Pro lebomlásának denzitometriás kiértékelését mutatjuk be. A vizsgálat célja az volt, hogy mennyiségileg értékeljük VEGFmutánsok stabilizálását krónikus seb váladékában. Ebbõl a célból a jelerõsség (42 45 kda mérettartományban) idõfüggõ változását hasonlítottuk a nulla idõpontban meghatározott jelerõsséghez. A különbözõ idõpontokban mért, denzitometriás jelerõsséget ábrázoltuk a kiindulási jelek százalékos arányában. A denzitometriás vizsgálatból egyértelmû, hogy a mérés minden idõpontjában a VEGF-mutánsokra erõsebb jelet kaptunk a vad típusú VEGF-hez képest kda mérettartományban, és így intakt VEGF 165 -fehérjérõl van szó. A megfigyelés alapján kézenfekvõ az a feltételezés, hogy a mutáció VEGF-fehérje javított stabilitásához és biológiai aktivitásához vezet krónikus sebmiliõben. Már 20 perc inkubálás után a különbség a vad típus és a mutáns között statisztikailag szignifikáns. A mérésekhez három független kísérletet végeztünk, azonos sebváladékkal. II. Vad típusú VEGF 165 és a mutáns variánsok biológiai aktivitásának vizsgálata Azt vizsgáltuk, hogy vajon a mutációknak van¹e hatása a VEGF-molekula biológiai aktivitására. A biológiai aktivitást BrdU proliferációs vizsgálati eljárásokkal (Roche Diagnostics, Mannheim) határoztuk meg humán umbilicalis vénából származó endotél sejteken (HUVEsejteken) a gyártó által mellékelt használati útmutató alapján. Ebben HUVE-sejteket tenyésztettünk különbözõ VEGF-mutánsok hozzáadásával, azután 6 óra hosszáig inkubáltuk BrdU-oldattal és fixáltuk, majd ELISA¹t végeztünk BrdU-specifikus ellenanyag alkalmazásával. 1 ng/ml és 25 ng/ml közötti VEGF-koncentrációkat alkalmaztunk. Kereskedelmi forgalomban elérhetõ re- 5

6 1 HU T2 2 kombináns VEGF 165 -fehérje (R&D Systems) és COS- 1-sejtekben szintetizált, vad típusú VEGF 165 BrdU-beépülésre kifejtett stimulációja a maximum fele volt körülbelül 3 ng/ml-nél (3. ábra). A mutáns VEGF-fehérjékre az volt a jellemzõ, hogy a COS-1-sejtekben szintetizált, vad típusú VEGF-fel összehasonlítható mértékben stimuláltak endotél sejtproliferációt. Minden, COS- 1-sejtben szintetizált fehérjével elérhetõ, maximális stimuláció kisebb volt, mint a kereskedelmi forgalomban kapható, vad típusú VEGF 165 -tel. A görbék lefutása közötti különbségeket az egyes fehérjék esetén alkalmazott eltérõ expressziós rendszerek és tisztítási módszerek magyarázzák [Mohanraj és munkatársai, (1995)]. VEGF 165 biológiai aktivitását a létrehozott mutációk jelentõsen nem befolyásolták. A továbbiakban azt a kérdést vizsgáltuk, hogy vad típusú VEGF 165 és VEGF-mutánsok biológiai aktivitását milyen mértékben befolyásolja a plazminnal történõ inkubálás. Ebbõl a célból a VEGF-fehérjéket plazminnal inkubáltuk, és azután a biológiai aktivitást BrdU proliferációs vizsgálat alkalmazásával, HUVE-sejteken vizsgáltuk. Grafikusan ábrázoltuk (4. ábra) a BrdU-beépülést a kiindulási szignál (t=0 idõponthoz tartozó) százalékában. Vad típusú VEGF (COS-1-sejtekben szintetizált és R&D Systemstõl származó), valamint Mut Ala és Mut Lys-Pro VEGF-mutánsok inkubálása plazminpufferben, 37 C¹on nem csökkenti a fehérjék biológiai aktivitását (4A D. ábrák). Ezzel ellentétben vad típusú VEGF 165 inkubálása plazminban a biológiai aktivitás egyértelmû csökkenéséhez vezetett (4A., B. ábra). Már 20 perc inkubálás legalább 20%¹os aktivitásvesztéshez vezetett, ami azután a kiindulási aktivitás körülbelül 50%-ára tovább csökkent 240 perc elteltével. Mut Ala és Mut Lys-Pro mutánsok aktivitása nem csökkent szignifikánsan plazminnal történt inkubálás után (4C., D. ábra). Ezek az eredmények megerõsítik a Westernblotban bemutatott eredményeket a mutánsok plazminrezisztenciájára (1. ábra) vonatkozóan, és azt mutatják, hogy a mutáns fehérjék plazminnal történt inkubálás után stabilak. A bevitt mutációk VEGF plazmin általi hasításának gátlását is eredményezték. Az Ala 111 mutációja Pro 111 ¹re képes volt stabilizálni VEGF¹et, és ezáltal megnövelt biológiai aktivitást elõidézni krónikus sebmiliõben. 1. ábra: A VEGF 165 -mutánsok rezisztensek plazmin hasításával szemben. Az ábrán bemutatjuk VEGF 165 és a mutáns fehérjék inkubálását plazminoldatban (0,01 U/ml) vagy pufferoldatban (B, 18., 19. sáv) a megadott ideig. A lebomlási tulajdonságok analízisét Western-blottal és immunológiai detektálással végeztük. 2. ábra: Ala 111 mutációja Pro 111 ¹re megnöveli a VEGF stabilitását krónikus sebek váladékában. A) COS-1-sejtekben expresszált, vad típusú VEGF 165 ¹öt és B) VEGF-variánsokat inkubáltunk a megadott ideig krónikus sebek váladékában, és a lebomlási tulajdonságokat immunológiai detektálással mutattuk be. Két különbözõ pácienstõl vett sebváladékot vizsgáltunk: X páciens, sávok; Y páciens: sávok. C) A vad típusú VEGF és a Mut Lys-Pro krónikus seb váladékában vizsgált lebomlásának denzitometriás bemutatása. Három, egymástól függetlenül végzett Westernblot-analízisbõl származó, relatív jelerõsséget mutatunk be (középérték ± SD). 3. ábra: A VEGF-mutánsok biológiailag aktívak. Vad típusú VEGF 165 ¹öt és VEGF-mutánsokat inkubáltunk növekvõ koncentrációjú HUVE-sejtekkel. Bemutatjuk bázisanalógok beépülési arányát proliferáló sejtek DNS-ébe, melyet BrdU-ELISA-val határoztunk meg (középérték ± SD; n=3). 4. ábra: A plazmin nem változtatja meg a VEGF mutánsok biológiai aktivitását. Összehasonlítottuk a BrdU relatív beépülését HUVE-sejtekbe vad típusú VEGF 165 -tel (A, B), Mut Ala -val (C) és Mut Lys-Pro -val stimulálva (D), a megadott fehérjével való inkubálás után pufferben vagy plazminban (középérték ± SD; n=3). Referencialista Frank S, Hübner G, Breier G, et al., J Biol Chem 270: , Fukumura D, Xavier R, Sugiura T, et al., Cell 94: , Gospodarowicz D, Abraham J, Schilling J, Proc Natl Acad Sci 86: , Keck P, Hauser S, Krivi G, et al., Science 246: , Keyt B, Berleau L, Ngyen H, Chen H et al., J Biol Chem 271: , Lauer G, Sollberg S, Cole M, Flamme I, Stürzebecher J, Mann K, Krieg T, Eming S, J Invest Dermatol 115: 12 18, Lawrence W, Diegelann R, Clin Dermatol 12: , Mohanraj D, Olson T, Ramakrishnan S, et al., Growth Factors 12: 17 27, Nissen N, Polverini P, Koch A, et al., Am J Path 152: , Poers J, Odake S, Oleksyszyn J, Hori H et al., AAS 42: 3 18, Scharffetter-Kochanek, Meewes C, Eming S, et al., Z. Hautkrankheiten 74: , Soker S, Takashima S, Miao H, Neufeld G, Klagsbrun M et al., Cell 92: , Stryer T, in Biochemie. 4. Auflage 1987; Spektrum Akademischer Verlag. A szekvencialistában található kötetlen szövegek (<223> kód) magyar fordítása 1 2. azonosító számú szekvenciákhoz: A mesterséges szekvencia leírása: mutált humán VEGF 3. azonosító számú szekvenciához: A mesterséges szekvencia leírása: szignálpeptid 4 5. azonosító számú szekvenciákhoz: A mesterséges szekvencia leírása: a mutációban bejutatott VEGF165 végszekvencia 6 7. azonosító számú szekvenciákhoz: A mesterséges szekvencia leírása: Mutpro Missmatch oligonukleotid primerként mutagenezisre 6

7 1 HU T azonosító számú szekvenciákhoz: A mesterséges szekvencia leírása: MutGln Missmatch oligonukleotid primerként mutagenezisre azonosító számú szekvenciákhoz: A mesterséges szekvencia leírása: MutPro Missmatch oligonukleotid primerként mutagenezisre azonosító számú szekvenciákhoz: A mesterséges szekvencia leírása: MutLys-Pro Missmatch oligonukleotid primerként mutagenezisre 14. azonosító számú szekvenciához: A mesterséges szekvencia leírása: a vad típusú VEGF aminosavai azonosító számú szekvenciához: A mesterséges szekvencia leírása: MutGln mutáns VEGF aminosavai 16. azonosító számú szekvenciához: A mesterséges szekvencia leírása: MutAla mutáns VEGF aminosavai 17. azonosító számú szekvenciához: A mesterséges szekvencia leírása: MutPro mutáns VEGF aminosavai 18. azonosító számú szekvenciához: A mesterséges szekvencia leírása: Mutlys-Pro mutáns VEGF aminosavai <110> Eming, Sabine Szekvencialista <120> Proteolyseresistenter aktiver VEGF <130> wo ME/BM <140> PCT/EP03/02289 <141> ¹06 <160> 18 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 165 <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: mutierter humaner VEGF <400> 1 Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Pro Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe

8 HU T2 Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 165 <210> 2 <211> 165 <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: mutierter humaner VEGF <400> 2 Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Lys Pro Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg 165 <210> 3 <211> 26 <213> Homo sapiens <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Signalpeptid 8

9 HU T2 <400> 3 Met Asn Phe Leu Ser Trp Ser Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala <210> 4 <211> 27 <212> DNA <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Ausgangssequenz des VEGF165, in die Mutationen eingeführt werden <221> CDS <222> (3)..(26) <400> 4 ga cca aag aaa gat aga gca aga caa g 27 Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln <210> 5 <211> 8 <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Ausgangssequenz des VEGF165, in die Mutationen eingeführt werden <400> 5 Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln <210> 6 <211> 27 <212> DNA <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Missmatch Oligonukleotide Mutpro als Primer für Mutatgenese <221> CDS <222> (3)..(26) <400> 6 ga cca aag aaa gat gcc gca aga caa g 27 Pro Lys Lys Asp Ala Ala Arg Gln <210> 7 <211> 8 9

10 HU T2 <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Missmatch Oligonukleotide Mutpro als Primer für Mutatgenese <400> 7 Pro Lys Lys Asp Ala Ala Arg Gln <210> 8 <211> 27 <212> DNA <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Missmatch Oligonukleotid MutGln als Primer für Mutagenese <221> CDS <222> (3)..(26) <400> 8 ga cca aag aaa gat cag gca aga caa g 27 Pro Lys Lys Asp Gln Ala Arg Gln <210> 9 <211> 8 <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Missmatch Oligonukleotid MutGln als Primer für Mutagenese <400> 9 Pro Lys Lys Asp Gln Ala Arg Gln <210> 10 <211> 27 <212> DNA <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Missmatch Oligonukleotid MutPro als Primer für Mutagenese <221> CDS <222> (3)..(26) <400> 10 ga cca aag aaa gat agg cca aga caa g 27 Pro Lys Lys Asp Arg Pro Arg Gln 10

11 HU T2 <210> 11 <211> 8 <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Missmatch Oligonukleotid MutPro als Primer für Mutagenese <400> 11 Pro Lys Lys Asp Arg Pro Arg Gln <210> 12 <211> 27 <212> DNA <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Missmatch Oligonukleotid MutLys-Pro als Primer für Mutagenese <221> CDS <222> (3)..(26) <400> 12 ga cca aag aaa gat aag cca aga caa g 27 Pro Lys Lys Asp Lys Pro Arg Gln <210> 13 <211> 8 <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Missmatch Oligonukleotid MutLys-Pro als Primer für Mutagenese <400> 13 Pro Lys Lys Asp Lys Pro Arg Gln <210> 14 <211> 4 <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Aminosäuren des VEGF165 Wildtyps <400> 14 Asp Arg Ala Arg 1 <210> 15 <211> 4 11

12 1 HU T2 2 <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Aminosäuren der VEGF Mutante MutGln <400> 15 Asp Gln Ala Arg 1 <210> 16 <211> 4 <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Aminosäuren der VEGF Mutante MutAla <400> 16 Asp Ala Ala Arg 1 <210> 17 <211> 4 <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Aminosäuren des VEGF Mutante MutPro <400> 17 Asp Arg Pro Arg 1 <210> 18 <211> 4 <223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Aminosäuren der VEGF Mutante MutLys-Pro <400> 18 Asp Lys Pro Arg 1 SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Vaszkuláris endotél növekedési faktor (VEGF) variáns, azzal jellemezve, hogy a natív VEGF szekvenciájának 111. aminosavhelyzetében az alanin ki van cserélve prolinra. 2. Az 1. igénypont szerinti VEGF-variáns, azzal jellemezve, hogy ezenfelül a helyzeteinek bármelyikében legalább egy további aminosav is ki van cserélve Az 1. vagy 2. igénypont szerinti VEGF-variáns, ahol a VEGF-variáns a VEGF 121, VEGF 145, VEGF 165, VEGF 183, VEGF 189 és a VEGF 206 splicingvariánsok bármelyikének formájában van. 4. Az 1 3. igénypontok bármelyike szerinti VEGF 165 -variáns, azzal jellemezve, hogy az alábbiak közül az egyik aminosavszekvenciával rendelkezik: 12

13 1 HU T azonosító számú szekvencia: Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Pro Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg vagy 2. azonosító számú szekvencia: Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Lys Pro Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg Az 1 4. igénypontok bármelyike szerinti VEGFvariáns, azzal jellemezve, hogy az aminosavlánc szignálszekvenciát tartalmaz. 6. Nukleinsav, amely 1 5. igénypontok bármelyike szerinti VEGF-variánst kódol. 7. Vektor, amely 6. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmaz 1 5. igénypontok bármelyike szerinti VEGFvariáns expressziójára. 8. Gyógyszer, amely 1 5. igénypontok bármelyike szerinti VEGF-variánst, 6. igénypont szerinti nukleinsavat vagy 7. igénypont szerinti vektort tartalmaz. 9. Az 1 5. igénypontok bármelyike szerinti VEGF-variáns, a 6. igénypont szerinti nukleinsav vagy a 7. igénypont szerinti vektor alkalmazása krónikus sebek, különösen érsérülések, mint például krónikus vénás elégtelenség (CVI), primer/szekunder limfödéma (nyirokpangás okozta vizenyõ), artériás elzáródási betegség, anyagcsere-betegségek, mint például cukorbetegség (diabetes mellitus), köszvény vagy felfekvés, krónikus gyulladásos betegségek, mint például pyoderma gangraenosum, vasculitis (érgyulladás), perforáló dermatosis (gyulladás nélküli bõrbetegség), mint például necrobiosis lipoidica diabeticorum és granuloma annulare, primer hematológiai betegségek, mint például véralvadási rendellenességek, sarlósejtes anémia és polycythaemia vera (vörösvérsejtek abszolút számának növekedése), tumorok, mint például primer kután tumorok és fekélyesedõ metasztázisok okozta krónikus sebek kezelésére, valamint plazmin gátlására, neoangiogenezis indukálására és/vagy mátrixlebomlás gátlására szolgáló gyógyszer elõállítására. 13

14 HU T2 Int. Cl.: C12N 15/19 14

15 HU T2 Int. Cl.: C12N 15/19 15

16 HU T2 Int. Cl.: C12N 15/19 16

17 HU T2 Int. Cl.: C12N 15/19 17

18 HU T2 Int. Cl.: C12N 15/19 Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest