Ajánlás Molekuláris diagnosztika Hajósné Dr. Novák, Márta

Átírás

1 Ajánlás Molekuláris diagnosztika Hajósné Dr. Novák, Márta

2 Genetikai variabilitás a növénynemesítésben: Molekuláris diagnosztika Hajósné Dr. Novák, Márta Ez a kiadvány az Oktatási Minisztérium támogatásával, a Felsőoktatási Pályázatok Irodája által lebonyolított felsőoktatási tankönyv-támogatási program keretében jelent meg. Szerzői jog 1999 Hajósné Dr. Novák Márta Minden jog fenntartva. Bármilyen másolás, sokszorosítás, illetve adatfeldolgozó rendszerben való tárolás a kiadó előzetes írásbeli hozzájárulásához van kötve.

3 Tartalom 1. Ajánlás Előszó Bevezetés A genetikai variabilitás fogalma, genetikai alapjai, növelésének lehetőségei A genetikai markerek fogalma és jellemzői A genetikai variabilitás vizsgálata tartalékfehérjékkel A tartalékfehérjék általános jellemzése, osztályozása A búza tartalékfehérjéi A búzagliadinok és -gluteninek genetikája A kukorica tartalékfehérjéje, a zein A zeinek osztályozása és genetikai szerveződése Polimorfizmus és heterogenitás a zeinmintázatban A genetikai variabilitás vizsgálata izoenzimekkel Az izoenzimek fogalma, keletkezése, genetikája Az izoenzim analízisek alkalmazásának lehetőségei A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel A restrikciós fragmentumhossz polimorfizmus, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) elve és lépései Az RFLP-technika előnyei, hátrányai és alkalmazási területei A PCR-technikán alapuló módszerek A polimeráz láncreakció (PCR) elve Véletlen primerek használatán alapuló módszerek: MAAP A miniszatellit polimorfizmus módszere: VNTR A mikroszatellit polimorfizmus módszerei Az amplifikált fragmentumhossz polimorfizmus: AFLP Az AFLP elve Az AFLP lépései Az AFLP alkalmazási területei A különböző DNS-technikák összehasonlítása Molekuláris markerezési eljárások a kertészeti növényeknél Molekuláris markerek alkalmazása az erdészeti növények nemesítésében Az izoenzim-analízis erdészeti alkalmazásai és eredményei DNS-vizsgálatok erdei fafajokon Az adaptív genetikai mintázatok azonosításának korlátai A DNS-vizsgálatok alkalmazási lehetőségei a rendszertanban és a származásazonosításban A különböző markerekkel kapott mintázatok kiértékelése A tartalékfehérje-mintázatok kiértékelése Az izoenzim-mintázatok kiértékelése Az RFLP-mintázatok kiértékelése A RAPD-mintázatok kiértékelése A PCR-reakció optimalizálása A reakcióelegy komponenseinek optimalizálása A PCR-reakció körülményeinek optimalizálása A biokémiai és genetikai analízisek automatizálása; RAPD- és DAF-reakcióelegyek és PCRkörülmények Elválasztástechnika iii

4 Ajánlás Az elektroforézis elve Az izoenzimek elválasztása gélelektroforézissel A tartalékfehérjék elválasztása gélelektroforézissel A PhastSystem elektroforézis rendszer alkalmazása DNS-szintű polimorfizmus azonosítására Egy illusztráció a PhastSystem alkalmazására entomopatogén (rovarpatogén) nematódafajok molekuláris taxonómiai elemzéséből merítve DNS-fragmentumok elválasztása RFLP-analízishez PhastSystemmel Nagynyomású vagy nagy teljesítményű folyadékkromatográfia A nagynyomású folyadékkromatográfiás rendszer elemei A HPLC-technika előnyei és hátrányai Néhány alkalmazás A kapilláris elektroforézis (CE) elve, alkalmazása A kapilláris elektroforézis elválasztási módjai A kapilláris elektroforetikus rendszer felépítése A molekuláris markerekkel kapcsolatos számítások A populáció allélszerkezetének vizsgálata Az alléles összetétel meghatározása Allélgyakoriság becslése kodomináns autoszómás gének esetében Allélgyakoriság becslése egy domináns és egy recesszív allél esetében Allélgyakoriság becslése polialléles gének (multiplex allélek) esetében Populáción belüli változatosság mérése Polimorfizmus (a polimorf lókuszok %-os aránya) Heterozigótaság Egyéb módszerek a genetikai változatosság mérésére A populációk közötti változatosság mérése Nei-féle genetikai azonosságot kifejező értékszám (I) A genetikai távolság (D és d0 ) A PCR-technikán alapuló módszerekkel kapott eredmények matematikai kiértékelése Irodalom iv

5 Az ábrák listája 1. Beltenyésztett kukorica vonalak és hibridjeik zein mintázata az anya vonal mintázata, az apa vonal mintázata (drzewiecki, 1996) Kukoricavonalak és -hibridek zein HPLC mintázata A nemegyenlő crossing over eredménye (a génkópiák számának növekedése), a 1; a 2, a 3, a 4 homológ szekvenciák a. Alegységes szerkezetű enzimek molekuláris polimorfizmusa A) a lehetséges alegységkombinációk, B) az elektroforetikus kép b. Alegységes szerkezetű enzimek molekuláris polimorfizmusa Az autotetraploid kukorica alkohol dehidrogenáz-1 (ADH1) enzimjének izoenzim mintázata (Hajós- Novák M. - H. Nagy A. Vida G., 1986) Nicotiana fajhibridek levélészterázai (Szilágyi és H. Nagy, 1978) Almasav dehidrogenáz (MDH) és aszpartát-aminotranszferáz (AAT) enzimek szerepe a mitokondriális és citoszól anyagcsereutakban Napraforgó levél peroxidázok mintázata szülő (a, b) és az F x hibridben (c) (H. Nagy és mtsai, nem közölt adatok) Crossing over kimutatása tetraploid kukoricaszem scutellumának ADH1 izoenzim mintázata alapján. A nyíllal jelzett SSSS genotípus triplex genotípusa egyed öntermékenyítése után csak crossing over eredményeként jöhetett létre. (Hajós-Novák és mtsai, 1994/a) Deléció (B), inszerció (D), valamint a restrikciós hasítóhelyen (C) bekövetkezett bázisváltozás kimutatása RFLP-vel (Pérez, 1993) DNS átvitele (blottolása) agaróz gélről membránra A polimeráz láncreakció sémája (Stansfield, 1997) A GCGAAGCGCC minihajtű primer háromdimenziós szerkezete (Hirao és mtsai, nyomán) SSR hossz polimorfizmus keletkezése (Cregan és mtsai, 1994) A nádképű csenkesz (Festuca arundinacea L.) 18 szomaklónjának (Scj.jg) SSR-PCR módszerrrel végzett genetikai elemzése A nyilak az alkalmazott (GACA) 4 primerrel felismert és felszaporított, polimorfizmust mutató DNS-fragmentumokat jelzik. (Gyulai és mtsai, 1995) MP-PCR szemi-speifikus primőrrel (Weising és mtsai, 1997) Az Inter-SSR-PCR sematikus rajza (Zietkjewicz és mtsai, 1994) Csicseriborsó-fajták AMP-PCR mintázata (Weising és mtsai, 1997) RAMP szemi-specifikus és random primerrel (Weising és mtsai, 1997) RAMPO random primőrrel (Weising és mtsai, 1997) Árpa izogén vonalak (AlgR = rezisztens, AlgS = fogékony) RAPD mintázata fluoreszcens festékkel jelölt primerek és Géné Scanner ABI362 automata készülékkel történő elválasztás alkalmazásakor A nyíllal jelölt helyeken eltérés látható a rezisztens és a fogékony vonalak között. (Walsh és mtsai, 1997) Az AFLP-technika sematikus ábrázolása (Vos és mtsai, 1995) E-CAG/M-AGG primer párral létrehozott AFLP-polimorfizmus A nyilak az AFLP-markerként felhasználható polimorf PCR-fragmentumokat jelzik, amelyek bp hosszúak. Az 1-19 minták termesztett szója (G. max.) fajták, a jelűek pedig vad szójafajok (G. sója). (Maughan és mtsai, 1996) Közép- és nyugateurópai bükkpopulációk allozimatikus változatossága, 12 enzimlókusz elemzése alapján. A csoportok szétválasztása diszkriminancia-analízis segítségével történt. A populációk differenciáltsága a nagy földrajzi távolságok ellenére is csekély. (Comps és mtsai, 1998) A relatív mobilitás meghatározása referenciasáv figyelembevételével Lolium rigidum (a), Lolium multiflorum (b) és egy ismeretlen Lolium faj (c) tartalékfehérje mintázatai kapilláris elektroforézis (CE) után (Dinelli és Bonetti, 1992) A sávok intenzitásának alakulása Adhl-FFFS triplex heterozigóta tetraploid kukorica pajzsocskájában (Hajós-Novák és H. Nagy, 1994) Fenyőfűi erdeifenyő (Pinus sylvestris) populáció leucin-aminopeptidáz (LAP) mintázata. A LAP izoenzimnek két génje (A, B) két-két alléllel aktív a tűlevelekben (Földvári, 1989) A GS-értékeken alapuló UPGMA cluster analízis eredményeinek dendrogramon történő ábrázolása A Hindin-UMC46 enzim-klón kombináció digitalizált RFLP-mintázata Wl 17 (4N) S 18 alvonalakban (Hajós-Novák M., Dallmann G., Orosz L., nem közölt adatok) v

6 Ajánlás 31. W117 S 22 autotetraploidkukorica-alvonalak RAPD-mintázata az OPO12 (5' CAGTGCTGTG3') 10 mérés random primerrel (Hajós-Novák és Dallmann, 1997) W117 4x S 22 kukorica-alvonalak RAPD adatokból (27 random primer, 269 fragmentum) UPGMA cluster analízissel számított genetikai távolsága (Hajós-Novák és Dallmann, 1997) A kapcsolódási hőmérséklet hatása a DNS amplifíkációs ujjlenyomatra pentamer (AGCTG) primer használatakor a Smith 92 E. coli törzsnél Az A ábrán a PGE ujjlenyomat, a B ábrarészen pedig az IMAGE programmal történt kiértékelés eredménye látható. A rövid primerek a vártnál kevesebb amplifíkációs terméket hoznak létre és alacsony molekulatömegűek egyáltalán nem keletkeznek. (Caetano-Anollés és mtsai, 1992; Caetano-Anollés, 1994) A vertikális elektroforézis-készülék rajza A dehidrogenázok kimutatásának elve Két entomopatogén nematóda faj RFLP mintázata Egyetlen Heterorhabditis (1-4) és Steinernema (5-8) nematóda példány genomiális DNS (rrns gén 18S és 26S exonok közötti intron régió) PCR amplifikált régiójának elektroforetikus képe különböző restrikciós enzimekkel (1,5 Alu I; 2,6 Dde I; 3,7 Hinf I és 4,8 Rsa I) történő emésztés után A nagynyomású kromatográfiás rendszer felépítése El és E2: eluensek, Pl és P2: szivattyúk, K: keverő, M: mintaadagoló, O: oszlop, D: detektor Két búzafajta gliadin frakciójának kromatográfiás képe Eagle (a) és Condor (b) búzafajták gliadin frakciójának elválasztása a gyenge anioncserélő MonoQ HR5/5 oszlopon. Eluens 10 mmol/1 CAPS, ph 10,4-10 mmol/1 CAPS + 0,4 mol/1 nátrium acetát. Gradiens 0%-100% B, 20 perc alatt. (Kick és mtsai, 1992) Élesztőben szintetizált a-gliadin kimutatása nagynyomású folyadékkromatográfiával Az élesztőből izolált és Sephadex LH-20 oszlopon előzetesen tisztított fehérjefrakciót fordítottfázisú kromatográfiával, Vydac C-4 oszlopon kromatografálták. Gradienshez használt A-oldat: 0,1% TFA vízben, B-oldat: acetonitril-propanol 3:1, TFAO,1%. Elució 5 ml A-, majd 65%-ig lineárisan emelkedőén B-oldattal (5 perc-85 perc). (Blechl és mtsai, 1992) A micelláris elektrokinetikus kromatográfía sematikus rajza (Boèek és mtsai, 1988) A kapilláris elektroforetikus készülék sematikus rajza A laktóz (1), a galaktóz (2) és a glükóz (3) elektroferogramja. Elektrolit: 5,3 mm szorbinsav oldat ph = 12,1 (0,1 N NaOH-val beállítva) (indirekt UV detektálás: λ = 256 nm), alkalmazott feszültség: V, kapilláris: kvarc, hossza: 60 cm, hasznos hossza: l = 36 cm, belső átmérője: K) = 50 λm, mintamennyiség: 5 nl, hőmérséklet: 20 C vi

7 A táblázatok listája 1. Enzimek alegységes szerkezete Izoenzím lókuszokkal kapcsoltan öröklődő tulajdonságok Háromvonalas (TC) kukoricahibridek lehetséges alkohol dehidrogenáz-1 (Adhl) mintázatai a szülők genotípusától függően (LELKES és HAJÓS-NOVÁK nem közölt adatok) A MAAP-technikák összehasonlítása Kertészeti növényeknél alkalmazott molekuláris markerezési eljárások és eredmények Néhány európai és északázsiai fafaj allozirnatikus genetikai változatosságának becsült értékei Az adatok általában időskorú állományokból vett mintákra vonatkoznak. Embriók és csemeték adatsorát "juv." megjelölés jelzi. (MÜLLER-STARCK, 1991 nyomán, kiegészítve) Az erdeifenyő (Pinus silvestris), a lúdfű (Arabidopsis thaliana) és az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) sejtmagi DNS-tartalmának, valamint a szekvenált repetitív DNS-szakaszok számának összehasonlítása DNS adatokra számított genetikai diverzitás (He), Shannon-Weaver diverzitás index (H), közös tenyészkerti kísérletben mért fenotípusos variancia (Vp), valamint a populációk közötti variancia százalékos aránya (Vbetw) egy dél-finnországi (Helsinki) és egy lappföldi (Ylläs) erdeifenyő (Pinus silvestris) populációra (SAVOLAINEN, 1997) A Quercus petraea és Qu. robur fajkomplex allozimatikus és kloroplasztisz-dns diverzitásának komponensei (KREMER és mtsai, 1991) Ismert és ismeretlen Lolium fajok RSI (%) értékei (DINELLI és BONETTI, 1992) A lehetséges LAP-izoenzim genotípusok száma és tényleges gyakorisága erdeifenyő (Pinus sylvestris) populációban két gén és lókuszonként két-két alléi esetében (FÖLDVÁRI, 1989) W117 S18 tetraploid kukorica alvonalak RFLP-mintázatának (Hind HI-UMC46 enzim-klón kombináció) bináris kódolása Wl 17 4x S22 kukorica-alvonalak OPO12 primerrel (5' CAGTGCTGTG 3') létrehozott RAPDmintázata bináris mátrix formájában (HAJÓS-NOVÁK és DALLMAN, 1997) A DAF-reakcióelegy négy legfontosabb komponensének optimális intervalluma és ajánlott mennyisége (CAETANO-ANOLLÉS, 1996) PCR ciklusok száma a templát DNS-molekulák számától függően (CAETANO-ANOLLÉS, 1996) Néhány jellegzetes HPLC-média vii

8

9 1. fejezet - Ajánlás A növénynemesítőnek minden időben újabb kihívásoknak kell megfelelnie. A termesztők és a piac mindig újat követelnek. Emellett különösen a nagyüzemi termesztés bevezetése óta egyre több eddig ismeretlen kártevő okoz növekvő gondot, amire a kemizálás mellett vagy inkább helyett, a rezisztens vonalak előállítása tűnik ígéretes, környezetbarát megoldásnak. Feladatokban tehát nincs hiány, s szerencsére, miként ez a könyv is bizonyítja, módszerekben sincs. A biokémia és a molekuláris genetika fegyvertára látványosan kibővült az utóbbi évtizedekben. A módszertani fejlődés bámulatosan gyors. Aki néhány évig nem követi a szakirodalmat, az értetlenül áll a rengeteg új elnevezés vagy rövidítés hallatán. Ezek jelentős részét e könyv bemutatja, s az új módszerek elsajátítására is ad útmutatást. A gyors siker reményétől azonban két okból is óvom a túlzottam optimista olvasót! Az első a módszertani alkalmazás, a második a várható gyakorlati eredmény. Az elméleti biológiai kutatások, így a molekuláris biológiaiak is, nem véletlenül használnak gyakorlati szempontból sokszor haszontalan, jelentéktelen baktérium-, gomba-, növény- vagy állatfajokat. Ezek az úgynevezett modell élőlények (pl. kólibaktérium, élesztő, Arabidopsis, muslica, egér stb.) a kísérletező kutató számára előnyös tulajdonsággal rendelkeznek. A velük szerzett eredményeket kell azután átültetni a gyakorlat számára fontos fajokba. Ez sokszor igen nehéz, olykor szinte megoldhatatlannak látszó feladat. A második probléma az eredményekkel kapcsolatos fokozott elvárás. Idősebb nemesítők tanúsíthatják, hogy hány biológiai felfedezés okozott eleinte túlzott reményeket, majd csalódást, míg végül a megfelelő helyére került. Gondoljunk csak a poliploidiára, az indukált mutációra, az antérakultúrára, a protoplasztfúzióra stb. A legjelentősebb nemesítési eredmények azonban a variáció-szelekció hagyományos módszerével születtek. Ez a könyv jelentős részben pont ezt célozza meg. A nemesítő számára oly fontos genetikai variabilitás megbízható diagnosztizálását ígéri. S valóban, a fehérjére s különösen a DNS-re alapozó jellemzés megbízhatóság vonatkozásában minden más marker felett áll. Kiválóan alkalmas fajták, vonalak azonosítására, azok genetikai heterogenitásának jellemzésére. Ne feledjük azonban el azt a lényeges körülményt, hogy a legtöbb gazdaságilag fontos tulajdonság genetikai meghatározottsága sok-sok génben kódolt, melyek többnyire nem azonosak molekuláris markereinkkel! Az 1992-es riói csúcs (UNCED = United Nations Conference on Environment and Development) óta az élővilág változatossága, a biodiverzitás fontos kifejezéssé vált. A fajon belüli változatosság a genetikai diverzitásból fakad. Erre alapul a természetes szelekció evolúciós változáshoz vezetve, s ezt végzi a nemesítő is az újabb növényfajták előállítása során. Molekuláris módszerekkel mindez még pontosabban és gyorsabban végezhető el. A molekuláris genetika legújabb eredményeivel pedig a genetikai diverzitás felhasználhatósága az egész élővilágra terjeszthető ki. A genetikai információ ma már tetszőlegesen kombinálható a legkülönbözőbb fajok között. A tárgyalt módszerek az így létrehozott transzgénikus fajták azonosítására is alkalmazhatók. A genetikai diverzitás molekuláris módszerekkel történő pontos elemzése egyre nélkülözhetetlenebb része lesz a növénynemesítő, sőt a növénytermesztő munkájának. Ez az elemzés nem könnyű, de a hozzávalók birtokában a módszerek kellő akarattal, pontossággal és megfelelő genetikai ismeretekkel a növénynemesítés eredményessége és hatékonysága jelentősen növelhető. Sok sikert! Vida Gábor 1

10 2. fejezet - Előszó Családomnak A könyv azoknak a kezdő vagy már tapasztalatokkal rendelkező szakembereknek szól, akik a növénynemesítésben, fajtafenntartásban, fajtavédelemben, a vetőmagtermesztésben vagy más kapcsolódó tudományterületen dolgoznak. Részletesen tárgyalja azokat a biokémiai-genetikai markereket (tartalékfehérjék, izoenzimek, RFLP-k, PCR-alapuló markerek), amelyek segíthetnek a nemesítőknek a nemesítési alapanyagokban meglévő örökletes variációk megtalálásában, a kívánt genotípusok kiválasztásában, a rokonsági viszonyok tisztázásában és a fajtavédelemben. Konkrét példákon keresztül mutatja be a különböző markerekkel kapott mintázatok kiértékelését, és útmutatót ad a PCR-reakció optimalizálásához is. A módszertani részben néhány elválasztástechnikai módszer (gélelektroforézis, RP-HPLC, kapilláris gélelektroforézis) elvét, előnyeit, hátrányait és a munka elkezdéséhez szükséges protokollokat lehet megismerni. A könyv utolsó fejezetében pedig a molekuláris markerekkel kapcsolatos számításokat találhatjuk meg. Reméljük, hogy a tankönyv áttanulmányozása után mindenki ki tudja választani a kutatási céljának és a lehetőségeinek legmegfelelőbb markert, és a kapott eredményt értelmezni is tudja. Ezen molekuláris módszerek megértése és alkalmazása azon túl, hogy lehetőséget ad a nemesítőnek arra, hogy bepillantson a genomba, egyben hidat is jelent a klasszikus és a molekuláris nemesítés között, hiszen ezeket a módszereket a transzgénikus növények nemesítése során is alkalmazhatjuk. Köszönöm szerzőtársaimnak, hogy résztvettek a könyv megírásában. Köszönöm Ócsai Sándorné, Bachoffer Klára és Kuti Gáborné technikai segítségét a könyvben szereplő kutatásokban. Köszönöm férjem, dr. Hajós László tanácsait és segítségét a korrektúra javításában Hajósné dr. Novák Márta szerkesztő 2

11 3. fejezet - 1. Bevezetés A genetikai variabilitás fogalma, genetikai alapjai, növelésének lehetőségei A fajtaelőállítás sikerét a növénynemesítés kezdeti, Mendel előtti és mai korszakában is a kiindulási alapanyagban meglévő genetikai variabilitás határozta, illetve határozza meg. Kezdetben a nemesítők az evolúció során kialakult természetes genetikai variabilitást használták új fajták előállítására. Ez azonban véges, és nem minden tulajdonságra terjed ki. Ezt már a korai nemesítők is felismertek. A genetikai variabilitás mesterséges, irányított növelését célzó törekvések ezért már a 18. században elkezdődtek. A keresztezést, mint a variabilitás növelésének első módszerét, a növények szexualitásának felfedezése után Koelreuter 1765-ben alkalmazta először, és előállította az első dohányhibridet. E század elején Mendel törvényeinek újrafelfedezése áttörést jelentett a növénynemesítésben is, mert a nemesítők rájöttek arra, hogy a genetikai variabilitás fő forrásai a génmutációk és a rekombinációk, és azok mesterségesen is kiválthatók. Az evolúció során kialakult genetikai variabilitás spontán kereszteződések, gén- és kromoszómamutációk (spontán megkettőződés), valamint természetes szelekció eredményeként jött létre. Ezt ma a nemesítő tudatosan, saját célkitűzéseinek megfelelően irányítja. Amikor változatosságot, polimorfizmust vizsgálunk egy faj egyedei vagy fajtái között, akkor különbséget keresünk tulajdonságaikban. A különbség jelentkezhet tenyészidőben, növénymagasságban, szemszínben, endospermiumszínben, növényi pigmentek jelenlétében vagy hiányában, minőségben, betegségrezisztenciában, hideg- vagy szárazságtűrésben és egyéb gazdaságilag fontos tulajdonságokban. Ezeket a különbségeket vizuálisan vagy mennyiségi mérésekkel lehet megállapítani. Egy fajon belül kétféle variáció jöhet létre: környezeti és öröklődő. A növényegyedek között környezeti tényezők hatására bekövetkező környezeti variációk általában méretben, alakban, színben, beltartalomban vagy fejlettségi állapotban jelentkeznek. Ezek nem öröklődnek és így szelekcióval nem izolálhatók. Ha pl. ugyanabból a búzafajtából nagyobb és kisebb szemeket vetünk el, akkor a kikelt csíranövények között méretbeli különbség lehet annak ellenére, hogy genetikailag azonosak voltak. A különbség abból adódik, hogy a kisebb szemek endospermiumában kevesebb tápanyag volt a csíranövények kezdeti fejlődéséhez, mint a nagyobb szemekében. Az öröklődő variációkat genetikai jelenségek hozzák létre. Ilyen variációk jelentkezhetnek könnyen megfigyelhető tulajdonságokban mint pl. szemszín, endospermiumtípus, toklász jelenléte vagy hiánya és/vagy komplex jellegekben, pl. bokrosodási képesség, növénymagasság, érés, betegségrezisztencia. Ezek a variációk a különböző növények utódjai között is megfigyelhetők tehát öröklődnek, de kifejeződésük mértéke a környezettől függően változhat. Ha pl. búza törzskeveréket szárrozsda fertőzésre alkalmas körülmények között termesztünk és azt tapasztaljuk, hogy egy kivételével mindegyik növény rozsdával fertőzött lesz, akkor feltételezzük, hogy az egészséges növény azért különbözik a megbetegedettektől, mert örökletesen rezisztens vagy immunis a szárrozsdával szemben. Ezután a fogékony növények és a rezisztens növény öntermékenyítéséből származó utódait rozsdafertőzésre alkalmas környezetben termesztjük. Ha ilyen körülmények között nem csak a fogékony növények, hanem az egészséges növény utódjai is megbetegszenek, akkor feltehetően a szülő növény csak azért nem betegedett meg, mert elkerülte a fertőzést. A környezeti és az örökletes variációkat kiváltó tényezők legtöbbször együttesen hatnak a növényre. Például a rozsdarezisztens búzafajta sem terem többet egy rozsdafertőzésre fogékony fajtánál olyan évjáratban, amely nem kedvez a rozsdafertőzésnek. A növénynemesítők az öröklődő variációkat keresik a nemesítési alapanyagokban. Ezeket azonosítják, kiemelik és új fajtákat állítanak elő belőlük. Egy fajban meglévő genetikai variabilitás mértékét jelentős mértékben meghatározza a szaporodási rendszer. Öntermékenyülő növényfajokban pl. búza, szója, paradicsom, árpa, amelyek majdnem 100%-ban homozigóta egyedekből állnak, kevesebb a természetes genetikai variáció, mint az idegentermékenyülők esetében (pl. kukorica, napraforgó, rozs, lucerna, burgonya). Kivételek mindig vannak. Ilyen pl. az uborka, 3

12 1. Bevezetés amely annak ellenére, hogy idegentermékenyülő, a természetes genetikai variációk kevés számát tekintve az öntermékenyülőkre hasonlít. Egészen másképp értékeli a nemesítő az öröklődő variációkat a fajtafenntartás során. Ekkor ugyanis a fajta genotípusos összetételének stabilizálására törekszik, és a spontán megváltozás vagy a mechanikai keveredés következtében megjelenő új genotípust eltávolítja. A nemesítési alapanyagokban a genetikai variációkat növelhetjük hagyományos és új módszerekkel. A genetikai variációk növelésének hagyományos módszerei: ivaros keresztezés, indukált mutáció, poliploidia, kromoszóma-átvitel. A genetikai variációk növelésének új módszerei: ivartalan keresztezés protoplaszt fúzió (szomatikus hibridizáció), in vitro mutáció szomaklonális variabilitás, génátvitel rekombináns DNS-módszerrel vertikális rekombináció. Nem elegendő azonban a genetikai variabilitás létrehozása, a megfelelő variációt meg is kell találni. Ez kezdetben kizárólag a morfológiai bélyegek alapján történt. Később a biokémia és a műszeres analitika fejlődésével a természetes és az indukált genetikai variációk detektálásának módszerei gyorsan fejlődtek. A gélelektroforézis technika kifejlesztése a 60-as években lehetővé tette a fehérje és az izoenzim polimorfizmus vizsgálatokat. A 70-es évek végén, a 80-as évek elején a Southern blot (Southern, 1975) és az RFLP-eljárások (Grodzicker és mtsai, 1974) kidolgozásával lehetőség nyílt az öröklődő variációk DNS-szintű analízisére is. A polimeráz láncreakció (PCR), illetve az ezen alapuló egyszerű, gyors és automatizálható módszerek pedig a molekuláris diagnosztika kialakulásához vezetett, lehetővé téve a nemesítő számára gén és genotípus közvetlen azonosítását bármely növényi szövetből, bármely fejlődési állapotban A genetikai markerek fogalma és jellemzői A nemesítési alapanyagokban meglévő genetikai variációkat a nemesítők genetikai markerek segítségével találják meg, illetve különböztetik meg a a környezeti variációktól. A genetikai markerek tulajdonságokat meghatározó allélek, amelyeknek sajátosságait fenotípusos, fehérje- vagy DNS-szinten vizsgáljuk. Segítségükkel polimorfizmust, változatosságot keresünk és jellemzünk. Polimorfizmusról akkor beszélünk, ha kettő vagy több eltérő genetikai jelleg egy populációban nagyobb gyakorisággal jelenik meg, mint amelyre az ismétlődő mutáció esetén számíthatunk. Egy lókusz általában akkor polimorf, ha a leggyakoribb allél előfordulása kisebb, mint 0,99. Elvileg egy genomnak valamennyi allélját lehet markerként használni. A gyakorlatban azonban főleg azok használhatók, amelyek könnyen kimutathatók és követhetők, a genom több pontján előfordulnak, nincs káros fenotípusos hatásuk, a fejlődés korai fázisában tanulmányozhatók, nem befolyásolják a növények fejlődését és szaporodását, egyszerűen öröklődnek, kodominánsan expresszálódnak, függetlenek a környezeti hatásoktól és polimorfok. A nemesítők a 60-as évek végéig elsősorban a morfológiai, élettani és agronómiai tulajdonságokat meghatározó alléleket használták genetikai markerként. Ezeknek azonban számos, az analízis szempontjából kedvezőtlen tulajdonsága van, mint pl. domináns recesszív öröklődés, késői expresszió, pleiotrópia, episztázis, környezeti függés, ritka polimorfizmus. A keményítő gélelektroforézis technika felfedezésével a genetikai markereknek egy újabb csoportja, a biokémiai markerek váltak hozzáférhetővé és használhatóvá. A biokémiai markerek jellemzői: 4

13 1. Bevezetés a környezet hatásától jórészt függetlenek, nem episztatikusak, egyszerűen öröklődnek, kodominánsan fejeződnek ki, a növény fejlődését nem befolyásolják, nincsenek hatással a növény szaporodására, könnyen, gyorsan és olcsón vizsgálhatók. A biokémiai markerek három csoportra oszthatók: alacsony molekulatömegű markerek fenol származékok, alkaloidok, nem fehérje-alkotó aminosavak, fehérjék izoenzimek és tartalékfehérjék, DNS-markerek. Tanksley (1983) molekuláris markereknek nevezte el azokat a biokémiai markereket, amelyek fehérje és/vagy DNS-szinten azonosítják polimorfizmust. A DNS-szintű markerek alkalmazását a már említett Southern blot technika (Southern, 1975), az ezen alapuló RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism = restrikciós fragmentumhossz polimorfizmus) módszer, majd a polimeráz láncreakció (PCR) felfedezése tette lehetővé. Az ideális DNS-markerek jellemzői: nagyfokú polimorfizmus, kodomináns öröklődés, az allélek egyértelmű jelölése, gyakori előfordulás a genomban, egyenletes megoszlás az egész genomban, pleiotróp hatás hiánya, könnyű hozzáférhetőség (nem kell klónozni), reprodukálhatóság, viszonylag olcsó kifejleszthetőség, az adatok könnyű kicserélhetősége a laboratóriumok között. 5

14 4. fejezet - 2. A genetikai variabilitás vizsgálata tartalékfehérjékkel A tartalékfehérjék általános jellemzése, osztályozása A tartalék- vagy raktározott fehérjék a gabonafélék magvainak endospermiumában találhatók, és az összes fehérjének kb. a felét teszik ki. A magfehérjék nem csak az élelmiszer- és a takarmányipar, hanem az alapkutatás számára is értékes biológiai anyagot képviselnek, mert génjeik a növény életciklusának csak pontosan meghatározott szakaszában működnek. A növényi tartalékfehérjék közül a búzasikért (glutént) elsőként Beccari már 1745-ben tanulmányozta. A növényi fehérjéknek a mai napig érvényben lévő osztályozása Osborne (1924) nevéhez fűződik, aki szerint megkülönböztethetők: vízben oldódó fehérjék albuminok, sóoldható fehérjék globulinok, alkoholban oldódó fehérjék prolaminok, savban oldódó fehérjék gluteninek. A prolaminok a Gramineae család fajaiban fordulnak elő. Gabonafélékben a szem fehérjetartalmának kb. a felét a sok prolint és glutamint tartalmazó prolaminok alkotják. A kukoricában a zein, a búzában a gliadin, a rozsban a secalin, a zabban az avenin, az árpában a hordein nevű prolamin fordul elő. A prolaminok polimorfok; polipeptidjeik relatív molekulatömege fajon belül és fajok között kd között változik A búza tartalékfehérjéi A búzában a sikérnek két fő összetevője van, a gliadinok (prolaminok) és a gluteninek, amelyek közül feltehetően könnyebb kivonhatóságuk miatt a gliadinok a jobban tanulmányozottak és ismertek. A búzaprolaminok Na-dodecilszulfátos poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS/PAGE) meghatározott molekulatömege kd. Aminosav-összetételük és -sorrendjük alapján három csoportba sorolhatók: kénben gazdag, kénben szegény és nagy molekulatömegű (High Molecular Weight = HMW) prolaminok. A kénben gazdag és a nagy molekulatömegű prolaminoknak domén szerkezete van. A kénben gazdag gliadinok lehetnek hődenaturációnak ellenálló polimerek (fehérjeláncok közötti diszulfid hidakkal) és monomerek (fehérjeláncon belüli S-S kötésekkel). Ide tartoznak a búza elektroforetikus vándorlási sebesség alapján α és γ jelölésű, valamint kis molekulatömegű (Low Molecular Weight = LMW) gliadinjai. N-terminális doménjük ismétlődő, C-terminális doménjük nem ismétlődő szekvenciájú. A kénben szegény gliadinok (lassú elektroforetikus mobilitású ω-gliadinok) cisztein hiányosak és nem poli-mer szerkezetűek. A HMW-gliadinok N-terminálisán nemismétlődő domének vannak, a C-terminálishoz pedig egy központi ismétlődő domén kapcsolódik. A búza kénben szegény prolaminjainak molekulatömege kd. Az A és a D genomok által kódolt gliadinok glutamát+glutamin tartalma kb. 40 mol%, prolintartalma pedig kb. 30 mol%. Az 1B kromoszóma által kódolt gliadinok több glutamátot és glutamint (50 mol%) és kevesebb prolint (20 mol%) tartalmaznak. Ez különböző ismétlődő szerkezetre utal. Az 1B kromoszómától függő gliadinok N-terminális aminosav szekvenciájában is találtak kismértékű variációt A búzagliadinok és -gluteninek genetikája 6

15 2. A genetikai variabilitás vizsgálata tartalékfehérjékkel A búza tartalékfehérjéit kódoló gének a genom 9 különböző lókuszában találhatók. Közülük az 1A, 1B és 1D kromoszómák rövid karjain található Gli-A1, Gli-B1 és Gli-D1 az ω-, valamint a γ-gliadinokat, a Gli-A2, Gli-B2 és Gli-D2 pedig az α- és β-gliadinok lókuszait kódolja, amelyek a 6A, 6B, 6D kromoszóma rövid karján térképezhetők. Mindegyik lókusz több génből álló génkötegnek tekinthető. A gliadinok öröklésmenetét tanulmányozva Mecham és mtsai (1978) különböző típusok keresztezése után az F 1 nemzedékben az egydimenziós (1D) elektroferogramokon a szülői mintázatok additív képét találták, az F2 nemzedékben pedig kodomináns öröklődésre utaló polipeptid-szegregációt kaptak. Egydimenziós gélelektroforézissel azonban nem lehetett recesszív jelleget vagy allél dózisból adódó változatokat kimutatni. A nagyobb felbontású kétdimenziós (2D) gélelektroforézissel az α -gliadin csoportban a génkomplex izolókuszai és az allélikus viszonyban lévő változatok is megkülönböztethetők. A gliadin gének génduplikációval keletkeztek. A kettőzött lókuszok sorozatos mutációkkal önálló evolúciós úton elkülönültek, és kialakult a mai polimorfizmus. Ezzel magyarázható pl. a 6D kromoszómán kódolt komponensek azonos molekulatömege, alumínium-laktátos gélben az eltérő elektroforetikus mobilitása. Hasonló módon származtatják az 1B kromoszómán kódolt két 41 kd molekulatömegű, eltérő töltésű polipeptidet is. Ezek a különbségek pontmutációk eredményei lehetnek. A búzasikérnek két fizikai sajátossága van: a rugalmasság, ami a polimer gluteninekkel van kapcsolatban, és a terülékenység, ami a monomer gliadinoktól függ. Sok európai búzafajta lisztjéből készült kenyér gyenge minőségét a sikér fokozott terülékenysége okozza A gluteninek molekulatömege többszázezer kd, esetleg millió is lehet. Inter- és intramolekuláris S-S kötéseket tartalmaznak. A HMW-gluteninek közül a 3+10-es és a 2-es alegységek jó kenyérminőséget kondicionálnak. A gluteninek szintéziséért az 1B és az 1D kromoszómán 2-2, az 1A kromoszómán pedig 1 lókusz felelős. Ezek a hosszú karokon helyezkednek el. A 3+10 alegységeket az 1D, a 2-es alegységet az 1A kromoszóma kódolja. Különböző, nagy molekulatömegű glutenin alegységű búzafajták keresztezése után 21 allélikus variánst találtak a Glu-A1, a Glu-B1 és a Glu-D1 lókuszok tanulmányozása során. A glutenin alegységek kodominánsan öröklődnek; géndózistól függetlenül nyilvánulnak meg az endospermiumban. A gliadinok jelentős heterogenitást mutatnak, és gélelektroforézissel komponensre választhatók szét. A különböző fajták ezeket a komponenseket különböző kombinációban tartalmazzák. A gliadinösszetétel tehát fajtára jellemző, és így búzafajták azonosítására, továbbá a fajták tisztaságának vizsgálatára alkalmas. A glutenin alegységek is jelentős különbséget mutatnak az egyes fajták között. Búzában eddig 20 HMW alegységet írtak le. Közülük egy fajtában általában 4 5 található meg. A glutenin alegységekben meglévő alléles variációkat alegységek polimorfizmusában megnyilvánuló fajtaazonosításra lehet felhasználni. Nagy molekulatömegük és gyenge oldhatóságuk miatt azonban elektroforézissel (SDS-PAGE vagy IEF+SDS-PAGE) nehezen választhatók el. Így elsősorban hasonló gliadinösszetételű fajták megkülönböztetésére használjuk őket. Speciális glutenin sávok jelenlétéből vagy hiányából a sütőipari értékre is lehet következtetni. Így a glutenin mintázat búza törzsek minőségre történő szelekciójához is hasznos információt adhat A kukorica tartalékfehérjéje, a zein A kukorica tartalékfehérjéje, amelyet Osborne (1987) zeinnek nevezett, glutaminsavban, prolinban, leucinban és albuminban gazdag, de az esszenciális aminosavak közül lizinből és triptofánból kevés található benne. A zein az endospermiumban szintetizálódik a megtermékenyülés utáni kb. 15 naptól, és a riboszómák szintetizálják a durva endoplazmás reticulumban (RER). A szintézist egy 1 2 kd molekulatömegű szignál peptid indítja. Ez átjuttatja a szintetizálódott molekulákat a membránon, majd kivágódik, a molekulák pedig a membrán belsejében elhelyezkedve létrehozzák a RER-hez kötött fehérjetestet A zeinek osztályozása és genetikai szerveződése A zeinek SDS-PAGE elválasztása után 27 kd és 10 kd molekulatömegű polipeptideket kapunk. Szokatlan szerkezetű fehérjék, és a gélelektroforézis során a molekulatömegük alapján várhatónál gyorsabban vagy lassabban vándorolnak. Másrészt alkoholos oldószerekben az oldószer természetétől függően számtalan zein frakcióra bomlanak, ezért többféleképpen osztályozzák őket: az SDS-PAGE után relatív mobilitás alapján (Wilson 1991), az oldhatóság alapján (Esen, 1987), 7

16 2. A genetikai variabilitás vizsgálata tartalékfehérjékkel a fehérjék szerkezete alapján (Larkins és mtsai, 1989). A fehérjék szerkezete alapján α-, β-, γ- és δ-zeineket különböztetünk meg. Az α-zeinek alkotják az összes zein kb. 70%-át. 19 kd és 22 kd molekulatömegű fehérjék, amelyek aminosavból állnak, 25% glutamint, 20% leucint, 15% alanint és 11% prolint tartalmaznak. Lizin egyik α- zeinben sem található. A többi zein frakciótól legjobban azzal különböztethetők meg, hogy a fehérje központi részében 20 aminosavból álló, tandem ismétlődésű peptidek vannak. A 22 kd és a 19 kd molekulatömegű sávot izoelektromos fókuszálással (IEF) vagy alacsony ph-jú elektroforézissel számos alkotórészre lehet bontani. A β-zeinek 14 kd molekulatömegűek, 160 aminosavból állnak és az összes zeinnek csak 10%-át alkotják. Az α- zeineknél kevesebb glutamint (16%), leucint (10%) és prolint (9%) tartalmaznak. Jelentősen nagyobb viszont a metionin (7%) és a cisztein (4%) tartalmuk. IEF-fel sok egyedi polipeptidre bonthatók. A γ-zeinek csoportjába 27 kd és 16 kd molekulatömegű fehérjék tartoznak. Az előbbiek az összes zeinfrakció 20%-át, az utóbbiak pedig kevesebb mint 5%-át alkotják, és aminosav komponensük van. A 27 kd -zeinek ciszteinben gazdagok (7%), és kivételesen sok prolint (25%) tartalmaznak. A nagy prolintartalmat az NH2 láncvégen lévő hexapeptid ismétlődések (PPPVHL) okozzák. Ebből a tandem ismétlődésből 8 kópia található a 27 kd molekulatömegű és 3 kópia a 16 kd γ-zeinekben. Valószínűleg részben ez okozza a molekulatömegbeli különbséget. A δ-zeinek kisméretű fehérjék, csak 130 aminosavból állnak. Molekulatömegük 10 kd. Az összes zeinnek kevesebb, mint 5%-át alkotják. Sok kéntartalmú aminosavból állnak (7% metionin, 4% cisztein), és így fontos kénforrást jelentenek a csíra számára. Egyes szerzők az α-zeineket kódoló gének számát száznál többre becsülik, és néhányról azt feltételezik, hogy pszeudogén. Zein géneket ezideig a 4., a 7. és a 10. kromoszómán térképeztek; a 4. és a 7. kromoszómán lévők struktúrgének, a 10. kromoszómán pedig egy regulátorgén van. A Zp1, a Zp2 és a Zp3 gének csak együtt expresszálódnak vagy nem expresszálódnak. Az α-zeinek öröklődését tanulmányozva azt találták, hogy a hibridekben valamennyi szülői zein mintázat jelen van, de új zeinek nincsenek. Southern hibridizációval kimutatták, hogy a 19 és a 22 kd molekulatömegű fehérjéket kis multigén családok kódolják. Rubenstein és Geraghty (1986) a zein multigén családot négy alcsaládra bontják. A négy alcsaládban (SF1, SF2, SF3, SF4) a zeinek teljes aminosav-szekvenciáját 4 régióra lehet osztani. Más szerzők szerint (Thompson és mtsai, 1992, Pedersen és mtsai, 1986) a 22 kd α-zeineket 25, a 19 kd molekulatömegűeket pedig 50 gén határozza meg. Ezeken kívül olyan mutáns géneket (opaque és floury) is térképeztek, amelyek recesszív alléljai gátolják a zein szintézisét, ezért a szemben növekszik a lizintartalom. Mindkét mutáns gén alléljeinek hatására a kukorica endospermiuma lágy, lisztes konzisztenciájú lesz. Az o 1, o 2, o 5, o 6 és o 7 opaque gének térképhelye a 4., a 7. és a 10. kromoszómán, a floury géneké (fl 1, fl 2 és fl 3) pedig a 2., a 4. és a 8. kromoszómán van. Az o 9, o 10, o 11, o 12 és az o 13 gének lokalizációja még nem ismert, és nem mindegyik opaque és floury génnek ismert a genetikai kölcsönhatása sem. Általában additíven hatnak vagy episztatikusak. Pl. az o 2 additív az o 6-tal és az o 7-tel, és elnyomja (episztatikus) az fl 2-t. A mutáns gének közül csak az o 2 zeinszintézisre gyakorolt hatása ismert. Motto és mtsai (1988), Schmidt és mtsai (1990) valamint Lohmer és mtsai (1991) az o 2 gént transzpozonnal jelölték, majd klónozták. Megállapították, hogy az o2 gén egy leucin cipzár-típusú transzkripciós regulátorfehérjét kódol, amely kapcsolódik a 22 kd α-zein gének promotereihez, és így azok átíródnak. Az α-zeineket kódoló gének közül néhányat már klónoztak és szekvenáltak. A haploid genomban az α-zein géneknek 100 kópiája van jelen. A triploid endospermium sejtekben tehát 300-ra becsülhető az α-zein gének száma. A β-, γ- és δ-zeineket valószínűleg olyan gének kódolják, amelyek genomonként csak egy vagy két kópiában vannak jelen Polimorfizmus és heterogenitás a zeinmintázatban A zeinmintázatban polimorfizmust először Turner és mtsai mutattak ki 1965-ben. Ez a polimorfizmus adódhat egyrészt a homozigóta egyedek magvaiból nyert prolamin frakció különböző összetételéből, másrészt származhat abból, hogy az elválasztható komponensek száma függ az alkalmazott módszertől és a hibridtől is. A prolamin komponensek eltérő elektroforetikus sajátosságaik miatt szülői genotípustól függően hibridenként változhatnak. A zein-polimorfizmus többségét poszttranszlációs modifikáció okozza. Righetti és mtsai (1977) a megfigyelt zein-heterogenitást részben in vivo deaminációból származtatják. Különböző zein IEF-mintázatú 8

17 2. A genetikai variabilitás vizsgálata tartalékfehérjékkel kukoricavonalak reciprok keresztezésének eredményeiből arra lehet következtetni, hogy az IEF-sávok additív módon működő struktúrgén rendszernek felelnek meg. Mivel a zeinmintázatot a környezeti tényezők nem befolyásolják, a zein-polimorfizmussal beltenyésztett kukoricavonalak és -hibridek genetikai azonosságát vagy különbözőségét lehet kimutatni (1. ábra). Viszont azt a teljes genetikai különbözőséget, amely alapján az agronómiai teljesítmény (pl. heterózis) pontosan előrejelezhető, ezzel a módszerrel sem lehet feltárni. 1. ábra - Beltenyésztett kukorica vonalak és hibridjeik zein mintázata az anya vonal mintázata, az apa vonal mintázata (drzewiecki, 1996) Wilson (1987) az alábbi módszereket tartja alkalmasnak a zein-polimorfizmus kimutatására: SDS-PAGE (molekulatömeg alapján), IEF (a sáv helyzete alapján), savas PAGE karbamid jelenlétében, RP-HPLC (fordított fázisú, nagy felbontóképességű folyadék-kromatográfia), kapilláris gélelektroforézis, aminosav komponensek alapján történő molekulatömeg-meghatározás, zeint befolyásoló regulátorgének (pl. o 2), zein struktúrgének térképezése, zein cdns klónozása. Bietz (1983) módszere, az RP-HPLC, a fehérjéket és így a zeint is a felszíni hidrofób csoportok alapján bontja részeire. Ezzel a technikával a heterogén zeint több frakcióra lehet bontani, mint bármely más kromatográfiás vagy elektroforetikus módszerrel. Utóbbi két módszert úgy kombinálják, hogy először a zeint HPLC-vel, majd IEF-fel frakcionálják. A 2. ábrán egy zein HPLC-mintázatot láthatunk. 2. ábra - Kukoricavonalak és -hibridek zein HPLC mintázata 9

18 2. A genetikai variabilitás vizsgálata tartalékfehérjékkel 10

19 5. fejezet - 3. A genetikai variabilitás vizsgálata izoenzimekkel Az izoenzimek fogalma, keletkezése, genetikája Az élő sejtekben azonos funkciók ellátására szolgáló fehérjemolekulák szerkezetében (összetételében) genetikailag meghatározott, biokémiai módszerekkel kimutatható eltérések vannak. A szerkezeti fehérjék és az enzimek egyaránt lehetnek polimorfok. Utóbbiak nem csak a fehérje molekuláris sajátsága, hanem katalitikus jellemzőik alapján is csoportosíthatók és analizálhatók genetikailag. Annak felismerése, hogy katalitikus rendszerek nem csak a szervetlen anyagok körében léteznek, Berzelius nevéhez fűződik. Az 1837-ben megjelent könyvében már utal arra is, hogy egyes enzimek katalitikus hatásukat széles, mások szűk szubsztrátspecifitással fejtik ki. Ezt követően az enzimológiai kutatások elsősorban a katalitikus működést befolyásoló tényezőkre irányultak. Az enzimek eredetére, összehasonlító elemzésére akkor még nem terjedt ki a kutatók figyelme. Fischer ben publikált munkájában is inkább még arra hívta fel a figyelmet, hogy különböző eredetű enzimek azonos működésűek. Azonos faj nagyon különböző szöveteiben közel azonos sajátságú pl. az alkohol dehidrogenáz vagy a savas foszfatáz. Az 1950 előtti évekből sem faj-, sem szövetspecifikus enzimformákról nincs részletes leírás. A biokémiai módszerek fejlődésével kialakult a nagy felbontású elválasztási technikák által kimutatott multiplex molekuláris enzimformákat a klasszikus enzimológia hívei olyan műtermékeknek tekintették, amelyek a sejtből történő izolálás során, pl. aggregálódás útján jöttek létre. A hasonló, de nem azonos összetételű és szerkezetű fehérjék elválasztását biztosító kromatográfiás eljárások (ioncserés, cellulózoszlopos stb.) és az elektroforézis (pl. zónaelektroforézis keményítőgélen) alkalmazása a multiplex enzimformák létezésének igazolásához jelentősen hozzájárult. Az izoenzim elnevezést Markert és Moller 1959-ben vezette be óta egy faj olyan multiplex molekuláris enzimformáit, amelyeknek a genomban több mint egy enzim struktúrgén felel meg, izoenzimeknek nevezzük. Ezek több lókuszt jelölhetnek, vagy egy lókusz több allélformáját képviselhetik. Multiplex enzimformának, izoenzimnek fogadható el az a csoport is, amely ugyan stabil, szignifikánsan különböző formák meglétével jellemezhető, de ismeretlen genetikai eredetű. Ugyancsak 1977-ben vezették be az izoenzim mellett a különböző struktúrgének termékeként létrejövő alegységek asszociációjából származó formákra az alloenzim vagy allozim elnevezést is. A Nemzetközi Biokémiai Egyesület az elemek periódusos rendszeréhez hasonló elvet a katalizált reakció természetén alapuló rendszert javasolta az izoenzimek besorolására. A kritériumokból napjainkig fennmaradt két alapkövetelmény: a különböző genetikai eredet és a hasonló funkció. Még így is adódtak besorolási problémák pl. a tripszin és a kimotripszin esetében, amelyek proteolitikus, tehát hasonló funkciójú enzimek, és bár genetikai eredetük különböző, mégsem izoenzimekként, hanem a tágabb kategóriának tekintett multiplex molekulaformaként tartjuk őket számon. Hasonló kivételes esetnek tekinthetők a nemspecifikus lúgos és savas foszfatázok. Szubsztrátspecificitásuk alapján számos közös jellemzőjük van, mégis két csoportot alkotnak minden rendszerben, azaz nem izoenzimek. A besorolás az enzimkatalógusok megújulásával változhat is. Példa erre az idegrendszerben működő acetilkolinészteráz ( valódi kolinészteráz) és a szérum-kolinészteráz ( pszeudo kolinészteráz) izoenzimként történő nyilvántartása. A két enzimnek van közös és van megkülönböztető szubsztrátja. Közös szubsztrátjaik elsősorban a szintetikus (mesterséges) anyagok körében találhatók. Genetikai hátterük eltérő és elég jól ismert. A példák azt igazolják, hogy az azonos helyett a hasonló katalitikus hatás szükséges és elégséges kritérium az izoenzim jelleg alátámasztására. Különös problémát jelentenek a széles szubsztrátspecifikusságú enzimcsoportok, amelyeknek többsége szintetikus szubsztráttal is működik. Egyik legjellemzőbb csoportjuk a 11

20 3. A genetikai variabilitás vizsgálata izoenzimekkel számos faj számos szövetében működő nemspecifikus észterázok. Vannak közöttük szorosan kapcsolt struktúrgének által kódoltak. Ezek minden bizonnyal azonos evolúciós eredetűek, génduplikációval keletkeztek, tehát tipikus izoenzimek. A meghatározás körüli viták és az azok kapcsán elvégzett vizsgálatok pozitívuma, hogy felhívták a figyelmet az enzimstruktúrák és -funkciók evolúciós eredetére, továbbá az egyedfejlődés, a szöveti differenciáció genetikai szabályozására A multiplex enzimformák eredete és szerkezete Ha izoenzimeknek a különböző struktúrgénekhez rendelhető molekulákat tekintjük, akkor ez a meghatározás azt is jelzi, hogy az aminosav-összetételük, azaz elsődleges szerkezetük több-kevesebb ponton eltérő lehet. Az aminosav-sorrend különbségei az enzimfehérje másodlagos és harmadlagos szerkezetében is eltéréseket okoznak. Legtöbb esetben azonban a multiplex enzimformákról még nem rendelkezünk ilyen mélységű ismeretekkel. Az elektroforetikus vizsgálatok igazolják az elkülöníthetőséget, a genetikai analízisek pedig valószínűsítik a genetikai hátteret. A multiplex formák genetikai háttere háromféle lehet: 1. Hasonló (azonos) működést végző enzimet kódolhat több különböző gén (lókusz). 2. Mutáció eredményeként azonos lókusz több allélikus formája jöhet létre a genomban. 3. Az egyedfejlődés során egy-egy sejtvonalban szomatikus mutáció eredményeként is keletkezhetnek fehérjeszerkezeti változások, amelyek egyedi eltérést eredményeznek, és ivaros úton nem adódnak tovább. A génkifejeződés során az enzim-struktúrgének között általában gén- és allélkölcsönhatásokat nem feltételeznek. A fenotípus additív képpel jellemezhető, az allélikus viszonyban levőkre a kodomináns öröklésmenet a tipikus. Allopoliploid növényekben saját vizsgálataink során ez alól kivételt tapasztaltunk. A többlókuszos enzimformák az evolúció során legvalószínűbben génduplikációval alakultak ki. A génduplikáció gének többszöröződése a genomban pl. nemegyenlő crossing over útján jöhet létre. Vázlatos mechanizmusát a 3. ábra szemlélteti. Meiózis során, ha a homológ kromoszómákon ismétlődő komplementer szekvenciák vannak, párosodásuk nem csak egyféle módon valósulhat meg. A 3. ábrán B-vel jelölt crossing over eredménye: két, nem egyenértékű kromoszóma a homológok szétválásakor. A duplikációt és deléciót tartalmazó termékek sorsa a meiózist követően eltérő lehet. Az azonos szekvenciákat az eredetinél több kópiában tartalmazó duplikálódott kromoszóma az utódoknak továbbadódva génmutációk bekövetkezésének nagyobb esélyét hordozza magában. Az így megtöbbszöröződött lókuszoknak mutációval allélikus formái jöhetnek létre, ezért a genetikai analízisekben meg kell különböztetni az azonos lókusz allélikus változatát és a különböző lókuszokhoz rendelhető izoformákat. Pl. az amiláz enzim kódolására két gén szolgál a kukoricában: Amy-1 és Amy-2. Közülük az Amy-1-nek két allélikus formája ismert. 3. ábra - A nemegyenlő crossing over eredménye (a génkópiák számának növekedése), a 1; a 2, a 3, a 4 homológ szekvenciák 12

21 3. A genetikai variabilitás vizsgálata izoenzimekkel A különféle enzim-struktúrgének mutációs gyakorisága eltérő lehet, aminek következtében egyes enzimek csak ritkán fordulnak elő eltérő allélikus változatban, míg más izoformájúaknak a populációban több allélja létezik. Ez a különbség az önálló lókusz bizonyítékaként is elfogadható. A többlókuszos izoformák kialakulására egy másik evolúciós út is elképzelhető. Lehetséges, hogy az eredetileg eltérő enzimek struktúrgénjeinek változásai hasonló katalitikus funkciók kialakulását eredményezték. A proteáz enzimek egy része az aktív centrumba épült szerin miatt válhatott izoformává (aktív -SH és fémfüggő proteázok). Azonos lókuszokon a populációkban bekövetkező mutációk eredményeképpen különböző allélformák alakulhatnak ki. A multiplex allélek izoenzimei az allozimek. Diploid szinten ha az egyed heterozigóta a különböző allélformáknak megfelelő enzimmolekulák fenotípusosan kimutathatók (kodomináns öröklésmenet). Az allélikus variációk száma feltehetőleg nagyobb, mint amit a genetikai analízisek leírnak, mert elektroforézissel a molekuláris változatoknak csak egy részét lehet kimutatni. Ha multiplex gén- és allélformák alegységes szerkezetű enzimek alegységeit kódolják, akkor az eltérő sajátságú molekularészekből kialakuló aktív enzimek polimorfizmusa számottevően megnő. Jól szemlélteti ezt a 4a és 4b ábra. Kétféle alegységből dimer enzim esetében három, tetramernél már öt izoforma alakulhat ki, ha az alegységek kombinációja véletlenszerű. Mivel az enzimeknek több mint a fele dimer vagy tetramer szerkezetű, könnyen belátható, hogy ez önmagában erősen megnöveli a molekuláris polimorfizmust. 4a. ábra - Alegységes szerkezetű enzimek molekuláris polimorfizmusa A) a lehetséges alegységkombinációk, B) az elektroforetikus kép 13

22 3. A genetikai variabilitás vizsgálata izoenzimekkel 4b. ábra - Alegységes szerkezetű enzimek molekuláris polimorfizmusa Az 1. táblázat hat fő enzimcsoportra jellemző alegységek számát mutatja be, amelyből a véletlen alegységkombinációkból csoportonként adódó lehetséges izoformák nagy száma becsülhető. 1. táblázat - Enzimek alegységes szerkezete sorsz Enzimcsoportok elnevezés Monomer Dimer Trimer Tetramer Oktamer 14

23 3. A genetikai variabilitás vizsgálata izoenzimekkel ám 1. Oxidoreduktázo k Transzferázok Hidrolázok Liázok Izomerázok Ligázok 1 Összesen: A homomer és heteromer formák arányából, ha az eltér a véletlen kombinációból adódótól (pl. 1:2:1 és 1:4:6:4:1 arányoktól), következtetni lehet az alegységek struktúrgénjeinek expresszió-szabályozására (pl. tejsavdehidrogenáz izoformák a szívben, májban stb.). Poliploid növényekben, ha azok heterozigóták az enzimalegységeket kódoló allélformákra, az elektroforetikus képből meghatározható az allélösszetétel. Az 5. ábra tetraploid kukorica alkoholdehidrogenáz-1 (ADH-1) mintázatát mutatja (Hajós Novák és mtsai, 1986). Ha egy diploid heterozigóta kukoricában a lassú (s) és a gyors (f) elektroforetikus mobilitású alegység azonos mennyiségben szintetizálódik, az ss; sf; ff dimerek 1:2:1 arányban lesznek jelen. Tetraploidban háromféle heterozigóta lehet: a) sssf; b) ssff; c) sfff Adh-1 allél viszonyokkal. Ha az alegységek véletlen kombinációja érvényesül az aktív enzim képződésében, akkor az a) esetben a 9:6:1, a b) esetben 1:2:1 és a c) esetben 1:6:9 lesz a két homodimer és a heterodimer enzim aránya. Ez a gélen jól látható és denzitometriásan mérhető. 5. ábra - Az autotetraploid kukorica alkohol dehidrogenáz-1 (ADH1) enzimjének izoenzim mintázata (Hajós-Novák M. - H. Nagy A. Vida G., 1986) A génműködés szabályozása az egyedfejlődés különböző szakaszaiban is változó enzimformákat eredményez, ezért az egyes enzim izoformák a fejlődési stádiumok jelzőiként alkalmazhatók és a fejlődésgenetika sajátos kutatási területét jelentik. 15

24 3. A genetikai variabilitás vizsgálata izoenzimekkel Mint említettük, az enzim izoformák általában kodominánsan öröklődnek, emiatt a genetikai analízisekben additív mintázatot várunk. A génműködés bonyolult szabályozása, a génkölcsönhatások sokfélesége azonban megenged kivételeket. A Nicotiana genus számos faja alloploid eredetű. A Nicotiana tabacum a N. sylvestris és a N. tomentosiformis allotetraploid fajhibridje. A N. tabacum és N. glauca mesterséges hibridek saját vizsgálata során a levél észterázainak elektroforetikus analízisét végeztük el. A N. tabacum enzimformái közül egy N. sylvestris forma hiányzott, az additív kép nem érvényesült. Ugyanakkor a N. tabacum N.glauca hibridben ez a hiányzó N. sylvestris típusú enzim a 6. ábrán láthatóan megjelent. Génje tehát jelen van a hibrid genomban, de a különböző genomok kombinációja valószínűleg szupresszív hatás miatt működését akadályozza (Szilágyi és H. Nagy, 1978). 6. ábra - Nicotiana fajhibridek levélészterázai (Szilágyi és H. Nagy, 1978) Az enzim izoformák elsődleges szerkezeti különbségei akkor váltak ismertté, amikor lehetővé vált az aminosavsorrend meghatározása. Bár ez nyújtja a legtöbb ismeretet, mégis kevés enzim esetében ismert pontosan. Az izoformák közötti szerkezeti különbségek a felépítő aminosavak számának és kémiai természetének eltéréseire vezethetők vissza. Például a citoplazmás és a mitokondriális aszpartát-aminotranszferáz izoenzimek közül az előbbi 412, az utóbbi 401 aminosavból épül fel. Könnyen belátható továbbá, hogy megváltozik a fehérje szerkezete és feltehetőleg a funkciója is, ha neutrális aminosav helyett lizin, arginin (amino csoport többlet), aszparaginsav, glutaminsav (karboxil csoport többlet), szerin, threonin (hidroxil csoport többlet), metionin, cisztein (-SH csoport), hisztidin (imidazol gyűrű) épül be a fehérjeláncba, vagy ha ezek egymást helyettesítik. Ilyen természetű változások pontmutációval is bekövetkeznek. Ilyenkor a fehérje molekulatömege nem módosul, de töltése igen, ami elektroforézissel kimutatható. Ha ilyen változások az enzim aktív centrumát érintik, a funkcióját is módosítják. Az aminosav-összetétellel a további szerkezeti formák (másodlagos, harmadlagos, negyedleges) alakulása is összefügg. A koenzimek, fémionok, alegységek kapcsolódása ezeknek kialakításában döntő szerepet játszik. Az elsődleges szerkezet, az aminosav-sorrend egyértelműen genetikailag meghatározott. A transzláció során képződött polipeptid lánc azonban további kémiai módosulásokon ( érésen ) megy át a sejtben, míg funkcionáló formává alakul. Ez is többféle végterméket adhat. Mivel azonban a változások az elsődleges szerkezet genetikai meghatározottságát nem érintik, a multiplex molekulaformákat sokan nem tekintik izoenzimeknek. Bármely álláspontot fogadjuk is el, azt figyelembe kell venni, hogy a poszttranszlációs módosulások természete, mértéke és ideje a sejtben genetikailag meghatározott, szabályozott folyamat. A molekuláris sokféleség az enzimek működési sajátságaiban is tükröződik. Az izoenzim definícióban csak az a kritérium szerepel, hogy a katalizált reakció azonos legyen. Ennek érvényesülése mellett az izoformák több katalitikus sajátságukban eltérőek lehetnek: különbözhet a szubsztrát specifikusságuk, jelentős eltérések lehetnek a specifikus aktivitásukban, megkülönböztető, szelektív gátlóik lehetnek és 16

25 3. A genetikai variabilitás vizsgálata izoenzimekkel hőstabilitásuk is eltérhet. A katalitikus hatásban bekövetkező változás sokszor olyan mértékű, hogy egyes alloenzimek inaktívvá válnak, pl. amikor mutáció érinti az aktív centrumot. Ezeket az irodalom nullallélként tartja számon. Azonban a nullallél, azaz az enzimnek a leírt körülmények közötti inaktivitása, mindig fenntartással fogadható, mert bizonyos feltételek között aktivitása újból megnyilvánulhat. Az eltérő katalitikus jelleg gyakori példái találhatók a sejtorganellumok és a citoszól enzimeinek izoformái körében. Számos mitokondriális enzim nem azonos a megfelelő citoszól enzimekkel. Független genetikai eredetük (önálló struktúrgén) az organellumok prokarióta evolúciós eredetével is kapcsolatban állhat. Más anyagcsereútban vesznek részt, és így katalitikus szerepük is eltérő. Az említett mitokondrium, citoszól reakciókban az almasav dehidrogenáz (MDH) és aszpartát-aminotranszferáz (AST) funkciókülönbségeit mutatja a 7. ábra. Az eltérés oka, hogy oxálacetátra a mitokondriális membrán nem átjárható, így az MDH és az AST ellentétes irányú reakciókat katalizálnak a mitokondriumban és a citoszólban. 7. ábra - Almasav dehidrogenáz (MDH) és aszpartát-aminotranszferáz (AAT) enzimek szerepe a mitokondriális és citoszól anyagcsereutakban A multiplex enzimformák katalitikus sajátságai A nemzetközi Enzim Bizottság (Enzyme Comission = EC) az izoenzimeket az általuk kataliziált specifikus kémiai reakció alapján az alábbi hat főcsoportba osztotta: 1. Oxidoreduktázok Alkohol dehidrogenáz (ADH) Diaforáz (DIA) Glutamát dehidrogenáz (GDH) Peroxidáz (PX) Sikimisav dehidrogenáz (SAD) 17

26 3. A genetikai variabilitás vizsgálata izoenzimekkel Kataláz (CAT) Glükóz-6-foszfát-dehidrogenáz (6-PGDH) Almasav dehidrogenáz (MDH) 2. Transzferázok Foszfo-glükomutáz (PGM) 3. Hidrolázok Savas foszfatáz (ACP) Aminopeptidáz (α-amp) α-amiláz (α-amy) β-amiláz (β-amy) β-glükozidáz (β-glu) Észteráz (EST) 4. Liázok Aldoláz (ALD) Fumaráz (FUM) 5. Izomerázok Trióz-foszfát izomeráz (TPI) Glükoz-foszfát izomeráz (GPI) 6. Ligázok Glutamin-szintetáz (GS) Minden enzim az Enzim Bizottság rövidítéséből (EC = Enzyme Comission) és négy számból álló kódot kapott. Mind az EC betűk, mind pedig a négy szám után pontot teszünk. A négy szám közül az első azt jelöli, hogy az enzim a hat fő csoport vagy osztály közül melyikbe tartozik; a második az alcsoportot vagy alosztályt jelzi; a harmadik az al-al csoportot vagy al-al osztályt adja meg; a negyedik pedig az enzim az al-al csoporton vagy alal osztályon belüli sorozatszámát határozza meg. Ennek megfelelően az alkohol dehidrogenáz enzim jelölése: Alkohol: NAD + oxidoreduktáz ( E.C ) Az izoenzimeket angol nevük első kezdőbetűjével és még egy vagy két jellemző betűjével jelöljük, és a rövidítés valamennyi betűjét ha az enzimről van szó nagybetűvel írjuk. Pl. a peroxidáz izoenzim rövidítése angol neve (peroxidase) után PX. Ha az izoenzimet kódoló gént vagy az allél(eke)t említjük, akkor csak az első betű nagy, a többi kicsi (pl. Px). Az alléleket a betűk után található, egytől kezdődő számok jelentik (pl. a Px 4 a peroxidáz enzimrendszeren belül a 4-es számú allélt jelenti) Az izoenzim analízisek alkalmazásának lehetőségei Az izoenzim analíziseket számos célra alkalmazhatjuk: taxonómiai besorolásra, a génexpresszió tanulmányozására, a különböző eredetű genomokat hordozó fajok genomösszetételének jellemzésére, egy populáció molekuláris polimorfizmusának meghatározására, a nemesítési alapanyagok genetikai azonosságának vagy különbözőségének megállapítására, az elit beltenyésztett vonalak közötti rokonsági viszonyok tisztázására, a kívánt genotípusok kiválasztására a szelekció során, az ön- vagy idegentermékenyülés mértékének 18

27 3. A genetikai variabilitás vizsgálata izoenzimekkel meghatározására, az izoenzimeket kódoló génekkel azonos kromoszómán elhelyezkedő rezisztenciagének kimutatására, a haploidok előzetes detektálására, a szomaklonális és gametoklonális variabilitás kimutatására, a hagyományos vagy új módszerrel bejuttatott idegen gének kimutatására, a fajtatisztaság vizsgálatára, a fajtaazonosításra és a fajtavédelemre. A felsorolt alkalmazási terület mindegyike fontos. Ezek közül szeretnénk kiemelni a biokémiai géntérképek készítését különböző növényfajoknál, amelyeket genetikai eredetű polimorfizmus felmérése és jellemezése után állítottak össze. A genetikai analízisek tanúsága szerint az enzim struktúrgének legalább harmada polimorfizmust mutat, és ez még alulbecsült értéknek tekinthető, mert a kimutatási módszerek korlátai nem teszik lehetővé az enzimek teljes körű elemzését. Kodomináns öröklődésük és a génkölcsönhatások módosító szerepének hiánya miatt rendkívül alkalmasak kapcsoltsági géntérképek összeállítására. Azokban a fajokban, amelyekben sok morfológiai bélyeg már ismert térképhelyű, a klasszikus hárompontos térképezési eljárással az enzim izoformák génjei is meghatározhatók. Így állították össze a kukorica és a paradicsom biokémiai géntérképét is. Az enzimeket kódoló lókuszok térképezését a növények körében gyakori aneuploid formák is segítik. A hexaploid búza (Triticum aestivum) nulli-mono-triszóm stb., sőt diteloszóm vonalai számos enzim struktúrgénjének elhelyezését tették lehetővé nemcsak a kromoszóma, hanem a kar megjelölésével is. A kapcsoltsági térképek ismeretében közvetve tudunk szelektálni valamilyen gazdaságilag fontos tulajdonságra. Mintegy 300 féle növényi izoenzimet ismerünk, azonban csak mintegy 50-nek határozták meg a térképhelyét. Izoenzim-kapcsoltságot pedig elsősorban a kvalitatív tulajdonságok, pl. betegségellenállóság, hímsterilitás között sikerült ezideig kimutatni (2. táblázat). 2. táblázat - Izoenzím lókuszokkal kapcsoltan öröklődő tulajdonságok Jelleg Növényfaj Izoenzim gén Fonálféreg rezisztencia (Mi) paradicsom Aps-1 Bab sárga mozaikvírus rezisztencia (Mo) borsó Pgm-p Hímsterilitás (ms-10) paradicsom Prx-2 Inkompatibilitás (S) alma Got-1 Sárga mozaikvírus rezisztencia (Ym) árpa Est-1, Est-2, Est-4 Rozsdarezisztencia (Rph-11) árpa Acp-3 Az izoenzimeknek a gyakorlat szempontjából szintén fontos alkalmazási területe a fajtatisztaság ellenőrzése. Erről a területről két példát mutatunk be. Olajnövényünk, a napraforgó egyike a legnagyobb területen termesztett szántóföldi növényfajoknak. Ma már kizárólag hímsteril alapon előállított két- vagy háromvonalas hibrideket termesztünk. A nem szakszerűen végzett vetőmag-előállítás következtében az F1 nemzedékben a hibridek mellett megjelennek az öntermékenyülésből vagy vonalon belüli megporzásból származók is. Ez heterogén állományt és terméscsökkenést okoz. Az ön- és a vonalon belüli megporzás mértékét hagyományosan minden vetőmagtételből egy bizonyos mennyiségű magot elvetve a morfológiai tulajdonságok alapján a nem hibrid egyedek százalékos arányából állapítják meg. Ez az ún. kitermeltetési módszer azonban hosszadalmas és földterületet is igényel. Az idegen egyedek arányát sokkal rövidebb idő alatt meg tudjuk határozni a csíranövények izoenzim mintázata alapján. Ehhez azonban olyan izoenzim lókuszokra van szükség, amelyek a szülőkben eltérő allélesek. H. Nagy és mtsai különböző napraforgó hibridek fajtatisztaságágát vizsgálták izoenzim elemzés segítségével (nem közölt adatok). Olyan izoenzimrendszernek, amely a szülővonalakban és a hibridekben eltérő mintázatot (polimorfizmust) mutat, a vizsgált izoenzim rendszerek közül a négyhetes csíranövények legidősebb leveléből 19

28 3. A genetikai variabilitás vizsgálata izoenzimekkel izolált peroxidáz bizonyult. Megállapították, hogy a vizsgált vonalakban és hibridekben a kimutatható peroxidázokat 2 lókusz 2 allélja határozza meg. Az egyes lókuszoknak megfelelő allélikus enzimek két mobilitási zónában helyezkedtek el, mindkét zónában allozimekkel együtt. A tiszta vonalú szülői forma kétsávos, mindkét zónában egy-egy aktív sávval (8a ábra). A kiváló vonalakból származó F1 hibridet a 8c ábrán látható négysávos additív kép jellemezte. A szülői vonalak heterogenitásából (8b ábra) adódóan a különböző hibridek változatos képet mutattak, variabilitásuk az enzimmintázat alapján számszerűsíthető volt. A peroxidáz izoenzim analízis eredményeinek és a kitermeltetés adatainak (növénymagasság, virágzási idő stb.), összehasonlításából kitűnt, hogy a peroxidáz enzimrendszer alkalmas az F 1 hibridek genetikai tisztaságának jellemzésére. A levélben képződő peroxidázok szintézisét szabályzó két lókusz allélformái a napraforgó izoenzimek genetikájában újdonságot képviselnek. 8. ábra - Napraforgó levél peroxidázok mintázata szülő (a, b) és az F x hibridben (c) (H. Nagy és mtsai, nem közölt adatok) A kukoricának két-, három- és négyvonalas hibridjeit termesztjük. A vetőmag-előállítás kézi vagy gépi címerezéssel történik. A szakszerűtlen idegenelés, a pontatlan címerezés, a fattyak visszahagyása, az izolációs távolság be nem tartása öntermékenyülést, vonalon belüli megporzást, illetve más fajtával történő beporzást okoz. Ennek mértékét hagyományos módon kitermeltetéssel állapítjuk meg, de itt is lehetséges az izoenzimanalízis alkalmazása. A helyzet egyszerű, ha kétvonalas (SC) hibridről van szó, mert ha a szülők különböző allélra voltak homozigóták, akkor az F1 nemzedékben attól függően, hogy az enzim monomer vagy dimer szerkezetű minden egyednek a heterozigótákra jellemző két- vagy háromsávos mintázatot kell adnia. A vetőmag-előállítási hibát az anyai homozigóta mintázat vagy elégtelen izolációs távolság esetén az idegen apa eltérő mintázatának megjelenése mutatja. Mint említettük, a kukorica ADH1 izoenzimjének gyors- (Adh1-F) és lassú (Adh1-S) elektroforetikus mobilitású alegységét egy lókusz két allélja kódolja. Mivel az enzim dimer szerkezetű, a két különböző allélra homozigóta egyed keresztezéséből származó utódban háromsávos mintázatot kapunk (4b ábra). Ennek alapján az idegen egyedek százalékos arányának megállapításához a gél lapokon csak azt kell megszámolni, hogy az összes szemből hánynak volt egysávos, homozigóta mintázata. A három- vagy négyvonalas hibridek esetében ennek pontos arányát nem lehet megállapítani, mert itt a hasadás miatt számíthatunk homozigóta egyedek megjelenésére. Ha nem kapjuk meg a szülői vonalakat mint ahogy az 20

29 3. A genetikai variabilitás vizsgálata izoenzimekkel leggyakrabban előfordul -, akkor végig kell gondolni, hogy a hasadás miatt mennyi és milyen mintázat várható. Ugyanis akkor vetőmag-előállítási hibára valamelyik homozigóta forma vártnál nagyobb gyakoriságából következtethetünk. A 3. táblázatból látható, hogy TC hibrid előállításakor az ADH1 izoenzim vonatkozásában nyolc féle variáció lehetséges a szülők genotípusától függően. Ha a keresztezésben résztvevő mindhárom szülő ugyanarra az allélre homozigóta, akkor az F2 nemzedék egyedei is ugyanarra az allélre homozigóták (1. és 2. eset). Legkönnyebb a vetőmag-előállítási hiba kimutatása a 3. és a 4. esetben, amikor az egyszeres mindkét szülővonala azonos allélre homozigóta, így az F1 is homozigóta. Ha erre az SC anyára egy másik allélre homozigóta apával keresztezünk, akkor a végtermék 100%-ban heterozigóta lesz. Az 5 8. esetekben, amikor az anyai egyszeres Adh1-FS heterozigóta, bármelyik homozigóta apával végezzük a keresztezést, az utódnemzedékben a hasadás miatt akkor is megjelenik a homozigóta mintázat, ha nem történt címerezési hiba. 3. táblázat - Háromvonalas (TC) kukoricahibridek lehetséges alkohol dehidrogenáz-1 (Adhl) mintázatai a szülők genotípusától függően (LELKES és HAJÓS-NOVÁK nem közölt adatok) Sorszá m Anyai egyszeres (SC) anya vonal genotípusa apa vonal genotípusa F 1 hibrid genotípusa Apa vonal genotípusa TC hibrid (F 2) genotípusa 1 FF FF FF FF Mind FF 2 SS SS SS SS Mind SS 3 FF FF FF SS Mind FS 4 SS SS SS FF MindFS 5 FF SS FS SS 6 SS FF FS SS 7 FF SS FS FF 8 SS FF FS FF 50% FS + 50% SS 50% FS + 50% SS 50% FS + 50% FF 50% FS + 50% FF FF = gyors allélra homozigóta, SS = lassú allélra homozigóta, FS = heterozigóta A 9. ábrán a kukorica Adh1 gén és a centromeron közötti crossing over eredménye látható. Egy scutellumban Adh1-FFFS triplex heterozigóta mintázatot mutató tetraploid kukorica növényt öntermékenyítettünk, és a csövön valamennyi szem pajzsocskájában megnéztük az ADH1 izoenzimmintázatot. Autotetraploid szinten az említett genotípusú növény öntermékenyítése után háromféle feno-/genotípus várható (FFFF, FFFS, FFSS) 1:2:1 arányban. A gél lapokon látható negyedik, lassú allélra homozigóta (SSSS) mintázatot csak crossing over és kettős redukció hozhatta létre (Hajós-Novák és mtsai, 1994/a). 9. ábra - Crossing over kimutatása tetraploid kukoricaszem scutellumának ADH1 izoenzim mintázata alapján. A nyíllal jelzett SSSS genotípus triplex genotípusa egyed öntermékenyítése után csak crossing over eredményeként jöhetett létre. (Hajós-Novák és mtsai, 1994/a) 21

30 3. A genetikai variabilitás vizsgálata izoenzimekkel Az izoenzim markerek előnyei összefoglalva az alábbiak: kodomináns allélexpresszió, nincs episztatikus kölcsönhatás, környezeti tényezők hatására ritkán változnak meg, a különböző lókuszok alléljai jól megkülönböztethetők, az allélikus különbségek elektroforetikus mobilitásbeli különbségként detektálhatók, egyszerűen, gyorsan és olcsón vizsgálhatók. Az izoenzim markerek hátrányai: kevés a térképezett izoenzim lókusz, a szűk genetikai bázisú elit beltenyésztett anyagokban kevés a polimorf lókusz, nem minden DNS szinten bekövetkező változás detektálható fehérje szinten is. 22

31 6. fejezet - 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel A restrikciós fragmentumhossz polimorfizmus, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) elve és lépései 1974-ben Grodzicker és mtsai adenovírus DNS-t restrikciós endonukleázokkal emésztettek, és a DNSfragmentumok hosszában meglévő különbségeket használták hőre érzékeny mutáns izolátumok jellemzésére. Kan és Dozy (1978), valamint Botstein és mtsai (1980) imerték fel, hogy ezeket az úgynevezett hasítási fragmentumhossz polimorfizmusokat (RFLP-k) markerként lehet felhasználni teljes genetikai kapcsoltsági térképek szerkesztéséhez. Az RFLP-technikával nem csak a restrikciós endonukleázokkal végzett emésztés után kapott DNSfragmentumok hosszának különbségeit lehet kimutatni, hanem az inszerciót, a deléciót és a bázisváltozást is. A deléció és az inszerció megváltoztatja az érintett fragmentumok elektroforetikus mobilitását. A fragmentumok számának változása és új fragmentumok megjelenése pedig azt jelzi, hogy bázis szubsztitució, inszerció vagy deléció miatt egy enzim hasítási helye megszűnt, illetve egy új hely jött létre. A 10. ábrán egy DNSszegmentben (A) deléció (B) és inszerció (D), illetve a restrikciós hasítóhelyen bekövetkezett bázisváltozás (C) miatt kialakult relatív mobilitás (b, d) és fragmentumszám-változás (c) látható. 10. ábra - Deléció (B), inszerció (D), valamint a restrikciós hasítóhelyen (C) bekövetkezett bázisváltozás kimutatása RFLP-vel (Pérez, 1993) Az RFLP-k véletlenül oszlanak el a genomban és nagyon gyakoriak. Restrikciós endonukleázokkal szinte korlátlan mennyiségű polimorfizmust lehet létrehozni pl. a növénynemesítési alapanyagokban. Ennek oka az, hogy a DNS-ben bekövetkező kis változások is RFLP-k létrejöttét eredményezik, másrészt pedig nem csak az exonokban, de az intronokban is keletkezhetnek RFLP-k. Ezeket IFLP-nek (Intron Fragment Length Polymorphism) nevezzük. Az RFLP volt az első olyan markeres módszer, amellyel a növénynemesítő DNSszinten tudta meghatározni egy növényegyed genotípusát. Az RFLP-technika lépései: Kromoszomális (sejtmagi) DNS-t izolálunk extrakcióval és tisztítással bármely, lehetőleg osztódó növényi szövetből, legtöbbször kéthetes csíranövények (3 5 db) friss leveleiből. A kromoszomális DNS-t II. típusú restrikciós endonukleázokkal emésztjük. Ezek speciális nukleotid szekvenciáknál hasítják a DNS-t. Pl. az Eco RI a GAATTC szekvenciákat ismeri fel, és azokat a GA között hasítja. Az emésztést általában többféle endonukleázzal végezzük, mert nem lehet előre tudni, hogy melyikkel kapunk értékelhető mintázatot. Kb. 5 egységnyi (Unit = U) enzim kell 1 g kromoszomális DNS megfelelő emésztéséhez, amit 37 C-on végzünk olyan pufferban, amelynek összetétele enzimenként változó. Az 23

32 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel emésztés után több százezernyi DNS-fragmentumot kapunk, amelyek általában néhány száz és húszezer közötti bázispárt tartalmaznak. A fragmentumokat agaróz gélen elektroforézissel választjuk el egymástól. Az elektroforézis után a DNS-fragmentumokat denaturáljuk, depurináljuk, majd a gélről nitrocellulóz vagy nejlon membránra visszük át (Southern blot). A transzfer sóoldatot (2OX SSC ph = 7), amely magával viszi a DNS-t a gélről a fölötte lévő membránra, a legfelül lévő száraz papírtörölközők elszívják a tálból a gélen keresztül. A DNS a membránhoz tapad és nem megy át rajta. A DNS-nek a gélről a membránra történő átvitele minimum 2 óráig, maximum fél napig tart (11. ábra). A membránon a denaturált, egyfonalas DNS-fragmentumok hibridizálnak egy jelölt, egyfonalas DNSpróbával. Az alacsony kópiaszámú DNS-szekvenciákat radioaktív 32P izotóppal vagy biotinnal jelölik. Van nem radioaktív, antigén/antitest reakción alapuló jelölés is [DIG-11-dUTP = digoxigenin (Boehringer)]. Próbaként használhatunk kódoló szekvenciákból álló cdns-t vagy gdns-t. Ez utóbbit úgy készítjük, hogy a kódoló és nem kódoló régióból álló összes, kromoszomális DNS-t restrikciós enzimmel emésztjük és a kapott fragmentumokat vektorba klónozzuk. Ha radioaktív próbát használunk, akkor autoradiográfia után a próbával komplementer fragmentumokat sávok formájában látjuk a röntgen filmen. Ha két egyed olyan restrikciós fragmentumban különbözik, amely homológ a próbával, akkor a megfelelő sávok különböző helyen lesznek az autoradiogramon vagy a fluorigramon, vagyis polimorfizmust tapasztalunk. Ha viszont a próbával homológ restrikciós fragmentumban nincs különbség két egyed között, akkor a sávok azonos helyen lesznek, monomorf mintázatot kapunk. 11. ábra - DNS átvitele (blottolása) agaróz gélről membránra Az RFLP-vel kapott eredményeket a rendelkezésre álló próbák és a használt restrikciós enzimek száma befolyásolja. Minden próba különböző cdns- vagy gdns-fragmentumokkal hibridizál, és minden enzim különböző pontokon vág ki szegmentet a kromoszomális DNS-ből. Kukoricánál az Eco RI, az Eco RV, a Hind III és a Bgl II restrikciós endonukleázokat használják a leggyakrabban, próbaként pedig olyan cdns-klónokat alkalmaznak, amelyeknek a térképhelye is ismert. Ilyen cdns-klón készleteket (pl. UMC2A, UMC4, UMC5, UMC168 stb.) a Missouri Egyetemről (Columbia, USA) lehet beszerezni. A felhasznált próbák számát és típusát mindig a vizsgálatok célja határozza meg. Ha pl. rokonsági viszonyok megállapítása vagy fajtaazonosítás a cél, akkor általában a DNS-t egy- vagy kétféle restrikciós endonukleázzal emésztjük, és a hibridizációt sok cdns klónnal végezzük. A kiértékeléshez kb. 140 polimorfizmust mutató klón enzim kombináció szükséges. Ez természetesen 140 RFLP vizsgálatnál többet jelent, mert előre nem tudhatjuk, hogy melyik klón enzim kombináció ad polimorf mintázatot. A kukoricánál eddig több mint 1000 RFLP-markert térképeztek. Több laboratóriumban dolgoznak olyan nagy felbontóképességű genetikai térkép elkészítésén kukoricánál és más növényfajoknál, amelyeken a markerek 1 cm távolságra vannak Az RFLP-technika előnyei, hátrányai és alkalmazási területei Az RFLP-technika előnyei a következők: 24

33 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel a kimutatott polimorfizmusok kodominánsan öröklődnek, függetlenek a génexpressziótól, a DNS-szekvenciában meglévő különbségeket közvetlenül tükrözik, az egész genomról vagy annak bármelyik komponenséről információt adnak, a variációt nem csak a kódoló régióban mutatják ki, elvben valamennyi mutációs eseményt is jelzik, korai fejlődési fázisban és majdnem minden szövetben detektálhatók, függetlenek a környezettől. Hátrányai: idő-, pénz- és munkaigényes módszer, izotópos jelöléskor az óvórendszabályok be nem tartása esetén veszélyes lehet. Az RFLP-technika alkalmazási területei: DNS-ujjlenyomat (fingerprint) fajtaazonosítás, fajtavédelem, rokonság megállapítása: pedigre analízis, kombinálódóképesség-vizsgálat, rekurrens szülő megtalálása, genetikai tisztaságvizsgálat Tulajdonságok térképezése Monogénes tulajdonságok térképezése közel izogén vonalak (NILs = Near Isogenic Lines) felhasználásával vagy bulk szegregációs analízissel. Kvantitatív tulajdonságok térképezése (QTL) Markereken alapuló szelekció (Marker Assisted Selection = MAS) gyors vonalátalakítás, génfelhalmozás (betegségrezisztencia, beltartalom). A hibridkukorica-nemesítésben az RFLP-k használata az alábbi területeken növelheti a nemesítési programok hatékonyságát: csíraplazmák felbontása heterotikus csoportokra, szülők kiválasztása a keresztezésen alapuló vonalelőállítás során, a kívánt genotípus megtalálása a backcross programban, heterózis előrejelzése az RFLP lókuszokra vonatkoztatott genetikai különbözőség és a szemtermés közötti kapcsolat alapján. 25

34 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel A PCR-technikán alapuló módszerek A polimeráz láncreakció (PCR) elve A polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction), amelyet K. B. Mullis talált fel 1985-ben, in vitro módszer, amellyel kromoszomális vagy klónozott DNS (cdns) célszekvenciákat sokszorozhatunk meg (amplifikálunk) enzimatikus úton, hőstabil DNS-polimeráz enzim (Taq polimeráz) segítségével, lánckezdő oligonukleotidok (primerek) jelenlétében, a hőmérsékletet gyorsan és pontosan változtató készülékben (thermocycler). A DNS-fragmentumok enzimatikus felszaporítása egy vagy két olyan oligonukleotid primer felhasználásával történik, amely(ek) a célszekvenciák mindkét fonalának 5 végével komplementerek. Az egyszálú templátról a DNS polimeráz a primertől kiindulva 5 3 irányban komplementer szálat szintetizál. A primer kapcsolódási pontja specifikus, így eltérő kromoszómális szekvenciasorrend esetén eltérő nagyságú DNS-fragmentumok képződnek, amelyek agarózgélen elektroforézissel elválaszthatók. A PCR-reakció ciklusokból áll, egy cikluson belül pedig három fő lépés van: A szaporítandó kettős DNS-szálat 95 C körüli hőmérsékleten két egyszálú fonallá denaturáljuk. A hőmérséklet 37 C-ra csökkentésével a rövid, általában 8 20 nukleotidból álló szintetikus oligonukleotid molekulák, a primerek kapcsolódnak a komplementer célszekvenciákhoz (annealing) C-on a hőstabil DNS Taq polimeráz az egyszálú templát DNS-hez kapcsolódó primerek 3 végeit meghosszabbítja (elongáció), és ezzel egyidőben megtörténik a templát DNS-sel komplementer szál szintézise (extension) is 5 3 irányban. Ezzel az első ciklus befejeződik, és olyan kettős fonalú DNS-molekulát kapunk, amely a primert is tartalmazza. A molekulák újbóli denaturálásával kezdődik a második cilkus (12. ábra). 12. ábra - A polimeráz láncreakció sémája (Stansfield, 1997) Egyetlen DNS-molekulából egy ciklus után kettő lesz, a második után négy, a harmincadik után pedig elméletileg 2 30, azaz kb A ciklusok számát az határozza meg, hogy mennyi cél DNS-t kívánunk kapni ciklus alatt a szubsztrátban lévő pikogrammnyi DNS-ből néhány óra alatt mikrogrammnyi mennyiséget lehet előállítani. Mivel a ciklusok ismétlődése során a Taq polimeráz az újonnan elkészített DNS-szálakat is templátként használja, ezért a primer kötőhelyek közötti DNS-szakaszok mennyisége exponenciálisan nő. Az amplifikációs reakciót a primer kapcsolódási és a lánchosszabbítási hőmérséklet változtatásával módosíthatjuk. A hőmérséklet növelésével minimumra csökkentjük a célszekvenciák versenyét az enzimért és a primerekért. A hőmérséklet csökkentése pedig a célszekvenciákkal rokon szekvenciák amplifikációját eredményezi. A láncreakció első néhány ciklusában különböző hosszúságú DNS-fragmenteket kapunk, vagyis a célszekvenciánál hosszabb szálak is keletkeznek. A ciklusszám növekedésével azonban a célszekvenciával azonos DNS-fragmentek lesznek többségben. Polimeráz láncreakcióval 50 bp 3 kb méretű kromoszomális DNS-fragmenteket lehet felszaporítani, de lehet RNS-t is amplifikálni. 26

35 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel A PCR-technikát széles körben alkalmazzák az evolúció-, a fejlődés- és a molekuláris biológiában, továbbá a diagnosztikában és a populációgenetikában is Véletlen primerek használatán alapuló módszerek: MAAP A láncreakció felfedezése óta számos PCR-en alapuló technika vált ismertté. Közülük ebben a fejezetben csak azokat tárgyaljuk, amelyek ismert szekvenciájú, de véletlen nukleotidokból álló primert vagy primereket használnak. Így a genomnak azokat a régióit tudjuk felszaporítani, ahová a primer vagy a primerek elég közel kapcsolódnak az ellenkező fonalon, lehetővé téve a közbeeső, ismeretlen szekvenciájú DNS-szakasz felszaporítását. Ezek a DNS-fragmentumok megfelelő primer(ek) alkalmazásakor tehát egyedenként vagy vonalanként eltérő mintázatot, polimorfizmust mutatnak. A véletlen primerekkel történő DNS-amplifikáció magyarázatára Caetano-Anollés és mtsai (1992) modellt dolgoztak ki. A modell szerint az első néhány hőmérsékleti ciklusban a templát elemző (screening) fázisban rokon amplikonok (felszaporítandó DNS-szakaszok) egy csoportja szelektálódik ki az amplifikációhoz. Ezt a folyamatot a primer templát enzim kölcsönhatások irányítják, amelyek téves primer templát párosodást okozhatnak. Az első kör amplifikációs termékei kezdetben egyszálúak, de palindrom végük van, és így belőlük primer templát és templát templát dimerek, vagy hajtű hurkok jöhetnek létre. A primernek fel kell ismernie és ki kell szorítani ezeket a szerkezeteket, mert csak így válik lehetővé az enzim rögzítése és a primer meghosszabbodása. A következő ciklusokban kialakul az egyensúly. A ritka primer templát dimerek enzimatikus úton a felaszaporodó amplifikációs termékké alakulnak. A véletlen primereket használó PCR-technikákat Caetano-Anollés és mtsai (1992) MAAP-nak (Multiple Arbitrary Amplification Profiling = többszörös tetszés szerinti amplifikációs profil) nevezték el. Ide tartoznak a RAPD és a rokon módszerek (AP-PCR, DAF és RAPD-DGGE). Közös jellemzőjük az, hogy a felszaporított kromoszomális DNS-fragmentumokat gélen elválasztjuk, láthatóvá tesszük, lefényképezzük, majd a kapott mintázatot kiértékeljük. Különbség közöttük az alkalmazott primerek hosszában, az amplifikáció körülményeiben, az elválasztás módjában és a felszaporított kromoszomális DNS-fragmentumok láthatóvá tételében van. Közülük először a RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) technikát írták le Williams és mtsai (1990), valamint Welsh és mtsai (1990) olyan eljárásként, amellyel az RFLP-nél használt klónozott DNS-próbák nélkül lehet polimorfizmust találni. A RAPD módszerrel tehát a genom ismeretlen DNS szekvenciáit lehet felszaporítani 1 vagy 2 önkényesen választott, 10 nukleotidból álló (10 mer) primerrel (pl. GGTGACGCAG). Az amplifikáció kiindulását képező primer(ek) a genomon véletlenszerűen hibridizál(nak) a komplementer szekvenciával. Ha az amplifikációhoz egy primert használunk, akkor a DNS mindkét szálának felszaporításához a primerrel komplementer szekvenciáknak mindkettőn néhány kbp-nyi távolságon belül kell lenniük. PCR-rel általában maximum 2 kbp DNS-fragmentumot lehet felszaporítani. Azok a DNS-régiók, amelyek nem tartalmazzák egymástól kb. 2 kbp-re a primer szekvencia két kópiáját fordított orientációban, PCR-rel csak akkor amplifikálhatók, ha két primert használunk. Az amplifikációs termékeket a PCR-reakció után 1,5%-os agarózgélen futtatjuk, és etídium-bromiddal tesszük láthatóvá. UV fényben azonnal fényképezzük vagy számítógépbe visszük. Megfelelő primer vagy primerek alkalmazásakor a gélen primerenként változó számú (maximum 10) és méretű (néhány 100 bp 2000 bp) fragmentumokat látunk. A fragmentumok méretét a mintákkal együtt futtatott DNS-markerek segítségével állapítjuk meg. Véletlen primerek használatakor az egyedek vagy a vonalak közötti polimorfizmust egyrészt a primer kötőhelyi DNS-szekvenciakülönbség, másrészt pedig az amplifikált régióban vagy a primer kapcsolódási helyén deléció, inszerció vagy inverzió okozhatja. Ha az amplifikációt két tetszőleges primerrel végezzük, akkor olyan reprodukálható mintázatokat kapunk, amelyek különböznek bármelyik egyetlen primerrel létrehozott mintázattól. Primerpárok használatakor a termékeknek több mint 50%-a különbözik a bármelyik egyedüli primer által létrehozottól. A primerpárok használata növeli a RAPD analitikai feloldóképességét. Egyetlen primer használatakor a véletlen kiválasztás során arra kell vigyázni, hogy a G + C tartalom 40 60% között legyen, és palindrom szekvenciák ne forduljanak elő. Két primer együttes használatakor pedig arra kell ügyelni, hogy ne legyen közöttük komplementaritás. 27

36 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel A RAPD-okkal kimutatott genetikai polimorfizmus lókuszonként 1 allélt fed fel, ami megfelel a látható amplifikációs terméknek. A RAPD-ok domináns öröklődésűek, ezért a heterozigóta genotípusok kimutatására nem alkalmasak. A RAPD-mintázatok reprodukálhatósága körül sok vita van. A reprodukálhatóságot főleg a templát DNS minősége és mennyisége határozza meg, ezért a DNS bomlását kizáró izolálási módszert kell választani. A RAPD-mintázatokban lévő variabilitást leginkább a DNS etanollal kicsapható szennyeződései okozzák. A templát DNS minőségét hígítási sor készítésével lehet ellenőrizni. Ha jó minőségű a templát DNS, akkor minden koncentrációnál azonos mintázatot kapunk. A nagyon magas vagy nagyon alacsony templát DNS-koncentráció szintén megbízhatatlan mintázathoz vezet. Ha egy adott templát DNS-re az optimális koncentrációt megállapítottuk, akkor a további RAPD-analíziseknél is ezt kell használni. Néhány primer-templát kombináció nem ad reprodukálható mintázatot standard amplifikációs körülmények között. Ekkor a reakció paramétereit (pl. magnéziumkoncentráció) is optimalizálni kell. A legjobb azonban nagyszámú primert vizsgálni, és ezek közül a további vizsgálatokhoz azokat kiválasztani, amelyek a kérdéses templát DNS-sel ismételhető mintázatot adnak. Mivel az agaróz gélen a fragmentumokat csak hosszuk alapján lehet elválasztani, ezért az alacsony feloldóképességű RAPD-technikával csak a túlsúlyban lévő termékeket lehet kimutatni. A RAPD-markeres polimorfizmus alkalmazási területei: genetikai különbözőség és/vagy rokonság megállapítása, tulajdonságok térképezése, DNS-ujjlenyomat készítése, beltenyésztett vonalak homozigótaságának megállapítása, fajták homogenitás vizsgálata, F 1 hibrid vetőmagok uniformitásának megállapítása. Morell és mtsai (1995) hagyma-, árpa-, repce-, brokkoli-, karfiol-, zeller-, zab- és kakaófajták azonosítására használták a RAPD-technikát, és még olyan közeli rokon fajtákat is meg tudtak különböztetni, amelyeknek genomja 94% hasonlóságot mutatott. A RAPD-analízissel feltárt rokonságot az alloenzim és a tartalékfehérje markerekkel kapott eredmények is igazolták. Fajtaazonosítás esetében nagyon fontos, de nehezen megválaszolható kérdés az, hogy hány RAPD primert kell használni, és hogy a fajtákat hány sáv alapján lehet megkülönböztetni. Repcefajták megkülönböztetéséhez pl. elég lehet egy jól kiválasztott primer és/vagy 5 25 véletlenül kiválasztott fragmentum. Az AP-PCR (Arbitrary Primed PCR = PCR tetszés szerinti primerrel) elve ugyanaz, mint a RAPD-é, csak itt a primerek 20 nukleotidból állnak, a PCR-reakció pedig több ciklusos, mint a RAPD esetében. DNS amplifikációs ujjlenyomat, DAF (DNA Amplification Fingerprinting) (Caetano-Anollés és mtsai 1991). A DAF-reakcióban általában egyetlen, 8 12 nukleotidból (pl. GCCCGCCC) (nt) álló primert használunk kromoszomális szekvenciák amplifikálására. De egyetlen, 5 nt primer is hozhat létre jellegzetes, nagyon informatív mintázatot. A különböző primer templát kombinációk különböző hosszúságú, rövid DNSfragmentumokat eredményeznek. Az amplifikációs termékek spektruma primer templát kombinációnkét változó és az adott kombinációra jellemző. A fragmentumokat általában poliakrilamid gélen választjuk el és ezüstfestéssel tesszük láthatóvá, de használhatunk agaróz gélelektroforézist, denaturáló grádiens gélelelktroforézist (DGGE), kapilláris gélelektroforézist vagy DNS-szekvenálót is. Primer párokkal is lehet DAF-mintázatot létrehozni. Így nem csupán az egyes primerekkel külön-külön kapott mintázatok összegződnek, hanem egyes sávok eltűnnek, és újak is keletkeznek. Ha külön-külön használjuk az egyes primereket, akkor azok a genomnak egy diszkrét, meghatározott részét amplifikálják, és jellegzetes fragmentumokat alakítanak ki. 28

37 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel A primer szekvencia és így a G + C tartalom változtatásával szabályozni tudjuk, hogy egyszerű, kevés sávból álló vagy komplex, több információt adó, soksávos mintázatot kapjunk. A 10 nukleotidból álló, nagy G + C tartalmú (60 70%) véletlen primerek használatával a genommérettől függően több fragmentumot lehet kapni, mint a 40 60%-osakkal; embernél pl. 0 19, szójánál pedig 2 49 fragmentumot. A kevés sávból álló mintázatokat a genetikai térképezésnél, a komplex mintázatot pedig DNS-ujjlenyomat készítésére használjuk. Egyszerű mintázatot jobb rövidebb primerrel és magasabb kapcsolódási hőmérséklettel előállítani, mint kisebb primer- vagy magnézium-koncentrációval. A sávok számát és a polimorfizmust növelni lehet az amplifikáció előtt a DNS restrikciós endonukleázos emésztésével (tecmaap = Template Endonuclease Cleavage MAAP) is. Ezzel a módszerrel nagyon közeli rokon fajtákat, valamint kontroll és EMS mutáns vonalakat is meg tudunk különböztetni. A DAF-technika alkalmazási területei: azonosság tesztelése, populáció- és pedigreanalízis, közel izogén vonalak molekuláris jellemzése, nagy felbontású genetikai térképek készítése. Ha bármelyik véletlen primerrel létrehozott amplifikációs terméket egy vagy két primerrel, vagy ha a DAFmintázatot mini hajtű -nek nevezett primerekkel (13. ábra) vagy standard véletlen primerekkel ismét amplifikáljuk, akkor ezt ASAP (Arbitrary Signatures from Amplification Profiles) analízisnek nevezzük (Caetano-Anollés és Gresshoff, 1996). A módszerrel lehetővé válik az elsődleges szekvencia további vizsgálata. Ha az egyik vagy mindkét PCR-reakció során két primert használunk, akkor 104 vagy 1016 különböző reakció lehetséges. Bár az első amplifikáció során létrejött DAF-fragmentumok között kapcsolódás (priming) is létre jöhet. 13. ábra - A GCGAAGCGCC minihajtű primer háromdimenziós szerkezete (Hirao és mtsai, nyomán) Az ismertetett MAAP-technikák jellemzőit a 4. táblázat foglalja össze. 29

38 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel 4. táblázat - A MAAP-technikák összehasonlítása Jellemzők RAPD AP-PCR DAF Feloldóképesség alacsony közepes magas Termékek Elválasztás agaróz PAGE PAGE Detektálás EtBr radioaktív ezüstfestés Primer hosszúság (nt) Primer (mm) koncentráció 0, Kapcsolódási hőmérséklet alacsony magas és alacsony alacsony vagy magas A miniszatellit polimorfizmus módszere: VNTR Az eukarióta genom nem kódoló régiójában, a heterokromatikus részekben előforduló szatellit DNS is felhasználható molekuláris markerként. A szatellit DNS egyszerű, tandem ismétlődő oligonukleotid központi (core), di- AT n, tri-atc n, tetra-agtc n és pentamer AGTCT n szekvenciából áll. Méretük alapján három csoportba sorolhatók: midi-, mini- és mikroszatellitek. Közülük a 0,5 30 kb hosszú,változó számú tandem ismétlődő szekvenciákat Jeffreys és mtsai (1985) VNTR-nek (Variable Number of Tandem Repeats = változó számú tandemismétlődések) vagy miniszatelliteknek nevezték el. A miniszatellitek nukleotidból álló szekvencia csoportok (cluster-ek). Pl. a GGAAGGGAAGGGAAAGGGAAAG alap szekvenciában a GGAAG szekvencia négyszer ismétlődik tandem módon. Az ilyen szekvenciacsoportok az emberi genomban nagyon gyakoriak. Az ismétlődések száma egy adott lókuszra vonatkozóan különböző, ezért mindegyik variáció egy VNTR-allélt képvisel. A VNTR-szekvenciák restrikciós endonukleázokkal történő emésztése és Southern blottolása után kapott DNS ujjlenyomat az egyedre jellemző, és független attól, hogy melyik szervből vagy szövetből izoláltuk a DNS-t. A VNTR módszer az RFLP-hez hasonlít azzal a különbséggel, hogy itt olyan próbákat használunk, amelyek három vagy két nukleotidból álló ismétlődő szekvenciákkal hibridizálnak. A miniszatellitek állatoknál 0,1 20 kb. hosszúak, és az ismétlődő régiót konzervatív endonukleáz hasító helyek határolják. Ha tehát a PCR-reakció során olyan primer(eke)t használunk, amely(ek) ezekhez a konzervatív régiókhoz kapcsolódik(nak), akkor egy adott VNTR lókuszt amplifikálni tudunk. A kapott PCR-termék vagy fragmentum hossza pedig aszerint változik, hogy az amplifikált VNTR-allélen vagy alléleken belül hány ismétlődő DNS-egység van. Azok a fragmentumok, amelyeken belül a központi szekvencia többször ismétlődik, hosszabbak, mint a kevesebbszer ismétlődő, rövidebb szekvenciák. A VNTR-ek méretük miatt nehezen amplifikálhatók. Növényeknél a miniszatellitek kevésbé tanulmányozottak. A legmegfelelőbb DNS-ujjlenyomatot olyan oligonukleotid primerek felhasználásával készítették, amelyek a (GATA) n szekvenciát tartalmazták (n = 2 5). Ezzel a módszerrel fajra jellemző ujjlenyomatot készítettek a Triticum, a Secale, a Hordeum, a Beta, a Brassica és a Nicotiana nemzetségekben (Beyermann és mtsai, 1992). A többlókuszos VNTR-mintázatot oligonukleotid ujjlenyomatnak is nevezzük. Ez könnyen reprodukálható és nagyon érzékeny. Segítségével egyes fajokban egyedspecifikus mintázatok is kimutathatók. Hátránya viszont, hogy a laboratóriumi protokoll elég bonyolult, mikrogramnyi mennyiségű DNS kell hozzá és a többlókuszos mintázat nem ad elég információt az allélekről. Mitotikus stabilitása miatt az oligonukleotid ujjlenyomat segítségével a fajtaazonosság és/vagy -különbözőség egyértelműen megállapítható. A VNTR-ek felhasználhatók tulajdonságok térképezésére is. Itt azonban problémát jelent, hogy a miniszatellitek esetében elég gyakori a mutáció (emberi miniszatelliteknél 0,5 1% gamétánként és nemzedékenként), amely új, eltérő hosszúságú allélek kialakulását okozhatja. Így jelentős mennyiségű nem szülői mintázat is megfigyelhető. Ez a jelenség növényeknél és gombáknál is megtalálható. 30

39 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel A mikroszatellit polimorfizmus módszerei Ha a tandem ismétlődő régiók két nukleotidból állnak, akkor VNDR-nek (Variable Number of Dinucleotide Repeats = változó számú dinukleotid ismétlődések, Nakamura és mtsai 1987), STR-nek (Short Tandem Repeat = rövid tandem ismétlődés, Edwards és mtsai, 1991) mikroszatellitnek (Litt és Luty, 1989) vagy SSR-nak (Simple Sequence Repeat = egyszerű szekvencia ismétlődés, Jacob és mtsai, 1991) nevezzük. A mikroszatellitek egyes szerzők szerint bp, mások szerint bp hosszú, könnyen amplifikálható, nagy polimorfizmust mutató DNS-szakaszok, amelyek egyenletesebben oszlanak el a genomban, mint a miniszatellitek. Egy 20 bp-nál hosszabb ismétlődés (SSR) átlagosan 30 kbp-ként fordul elő a növényi genomban; Brassica fajokban pl. 19 kbp-ként (Lagercrantz és mtsai, 1993). Az emberi genomban 6 kbp-ként találhatók 20 bp-nál hosszabb mikroszatellitek. Az SSR-k különböző típusainak gyakorisága növényfajonként eltérő. A növényi genom legelterjedtebb dinukleotid ismétlődése az AA/TT motívum. Ennél kevesebbszer fordulnak elő az AT/TA és a CT/GA motívumok. Ez a három dinukleotid SSR átlag 1 6-szor ismétlődik egymás után, és az összes növényi mikroszatellit 75%-át teszik ki (Lagercrantz és mtsai, 1993) A mikroszatellitek tehát nagy polimorfizmust mutató DNS-szakaszok, amelyek 2 5 bp hosszúságúak. A trinukleotidok közül a rizsnél a GGC n mikroszatellit fordul elő a leggyakrabban, n = 13 tandemszámmal, kukoricánál pedig a (TTG) n és a (TTC) n ismétlődések a leggyakoribbak (Taramino és Tingey, 1996). A három és négy nukleotidból álló ismétlődések előnye a két nukleotidból állókkal szemben az, hogy a kis méretbeli különbséget mutató allélvariánsok vizsgálatát is lehetővé teszik. Azok a heterozigóta egyedek, amelyek alléljei 4 bp-ban különböznek, jól elkülöníthetők, viszont 2 bp-nyi különbség az allélek között már nem mutatható ki. A mikroszatelliteket (SSR-okat) határoló DNS-szekvenciák ugyanazon faj egyedein belül általában konzervatívak. A konzervatív DNS-szekvenciák ellentétes szálaival azonos primerekkel a közbeeső mikroszatelliteket PCR-rel amplifikálni tudjuk egy adott faj valamennyi genotípusában. A fragmentumokat agaróz gélen választjuk el és etídium-bromiddal tesszük láthatóvá. Ezt a speciális, mikroszatellit primerekkel történő amplifikációt szekvenciával jelölt PCR-nek vagy STS-PCR-nek (Sequence-Tagged-Site) nevezzük. A módszerrel a nukleotid ismétlődések számában ( n ) meglévő különbséget tudjuk kimutatni a fragmentumok eltérő hosszúsága alapján. A 14. ábra két homzigóta genotípus (A és B) SSR hossz különbségét mutatja. Az A genotípus egy bizonyos SSR lókusznak (AT)/(TA)18 alléljét hordozza, a B genotípusú egyed pedig az (AT)/(TA)22 allélt. Mindkét genotípus egyetlen PCR-terméket, fragmentumot hoz létre. A B egyedtől származó fragmentum azonban nagyobb, mert több (AT)/(TA) ismétlődő egység-ből áll. 14. ábra - SSR hossz polimorfizmus keletkezése (Cregan és mtsai, 1994) 31

40 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel Az (AT) n és a (TAT) n mikroszatellitek szójánál nagy polimorfizmust mutatnak, szomatikusan stabilak és kodominánsan öröklődnek. SSR-markereket ezideig szójára, szőlőre, rizsre és árpára fejlesztettek ki. A mikroszatellit hossz polimorfizmust populációs tanulmányokra, kapcsoltsági és fizikai térképek készítésére, valamint fajtaazonosításra lehet használni. Az SSR-technikát a nádképű csenkesz (Festuca arundinacea) szomaklónok közötti genetikai variabilitásának kimutatására használták Gyulai és mtsai (1995) (15. ábra). 15. ábra - A nádképű csenkesz (Festuca arundinacea L.) 18 szomaklónjának (Scj.jg) SSR-PCR módszerrrel végzett genetikai elemzése A nyilak az alkalmazott (GACA) 4 primerrel felismert és felszaporított, polimorfizmust mutató DNS-fragmentumokat jelzik. (Gyulai és mtsai, 1995) 32

41 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel A 90-es évek elejétől az alábbi, PCR-en alapuló mikroszatellit markermódszereket dolgozták ki: MP-PCR, AMP-PCR, RAMP, RAMPO, STMS. Ezek főleg az amplifikációhoz használt primer(ek) pozíciójában és típusában különböznek. MP-PCR (Microsatellite-Primed PCR = PCR mikroszatellit primerrel; Meyer és mtsai, 1993) Az MP-PCR az Alu-PCR (Nelson és Laskey, 1990), az STMS és a RAPD néhány elemét kombinálja. Ennél a módszernél a mikroszatellittel komplementer oligonukleotidokat nem hibridizációs próbaként használjuk, mint a VNTR-nél, hanem primerként. Ha a genomban fordítottan ismétlődő mikroszatellitek vannak egymástól amplifikálható távolságra, akkor az ismétlődés közötti szekvenciák amplifikálódnak (16. ábra). A PCRtermékeket agaróz gélen választjuk el és etídium-bromiddal festjük. 16. ábra - MP-PCR szemi-speifikus primőrrel (Weising és mtsai, 1997) Az MP-PCR azon változatát, amikor egy primert használunk az amplifikációs reakciókban, SPAR-nak (Single Primer Amplification Reaction = egy primerrel végzett amplifikációs reakció) nevezzük (Gupta és mtsai, 1996). A módszer során ismeretlen szekvenciájú cél DNS-szakaszokat szaporítunk fel egy vagy két nem végálló mikroszatellit primerrel [pl. (CCG)5 vagy (CGA)5] olyan körülmények között, amelyek biztosítják a pontos primerkapcsolódást. Ha a PCR-t radioaktív jelöléssel végezzük (a primerek 5 végét 32P izotóppal jelöljük), és a kapott termékeket nem agaróz gélen, hanem denaturáló poliakrilamidgélen választjuk el, akkor még a nagyon kis méretű (300 bp) fragmentumok is jól láthatók. Polimorfizmus létrehozására a tetranukleotid primerek a legalkalmasabbak. Az MP-PCR-módszerrel primer templát kombinációnként 1 20, az adott fajra specifikus sávot lehet a géleken megfigyelni, amelyek 0,3 2 kb méretűek. Ha primerként dinukleotid vagy AT-ben gazdag trinukleotid ismétlődéseket használunk, akkor a sávok kevésbé élesek, elkenődnek, mert az ilyen típusú mikroszatellitek nagy kópiaszámban fordulnak elő a növényi DNS-ben. Az MP-PCR reprodukálhatósága azonos a RAPD-éval, mert a sávok között sok téves primerkapcsolódás eredményeként jön létre. AMP-PCR (Anchored Microsatellite-Primed PCR = végálló mikroszatellit primerekkel végzett PCR; Zietkiewicz és mtsai, 1994) Egyik változata a 17. ábrán bemutatott Inter-SSR-PCR. 17. ábra - Az Inter-SSR-PCR sematikus rajza (Zietkjewicz és mtsai, 1994) 33

42 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel Az AMP-PCR egy másik változatával ismeretlen kromoszomális DNS-szekvenciákat amplifikálunk egyetlen, az 5 vagy a 3, illetve mindkét végen álló di- vagy trinukleotid mikroszatellit primerekkel [pl. VDV (CT) 8 vagy BDB (AC) 7A, ahol B = C, D = A, G vagy T, V = A, C vagy G] (18. ábra). A fragmentumokat poliakrilamid gélen választjuk el és autoradiográfiával tesszük láthatóvá. Leginformatívabb mintázatot a végálló GA és GT dinukleotid motívumokkal lehet létrehozni. A mintázat sávból áll. A sávok domináns markerként viselkednek. AMP-PCR-rel főleg fajspecifikus különbségeket, esetenként a fajok közötti polimorfizmust lehet kimutatni. A módszert krizantém- és olajrepcefajták azonosítására, továbbá beltenyésztett pattogatni való kukoricavonalak közötti genetikai különbözőség kimutatására használták. 18. ábra - Csicseriborsó-fajták AMP-PCR mintázata (Weising és mtsai, 1997) RAMP (Random Amplified Polymorphic Microsatellites = véletlen amplifikálódott polimorf mikroszatellitek; Wu és mtsai, 1994) A módszer alkalmazásakor az amplifikációhoz 5 végálló mikroszatellit primerek és dekameres RAPD-primerek kombinációját használjuk (19. ábra). A mikroszatellit komplementer primert 33P-dATP izotóppal jelöljük. A PCR-reakció úgy van beállítva, hogy magas és alacsony kapcsolódási hőmérsékletek között vált át, és ezáltal elsősorban a mikroszatellit lókuszok amplifikálódnak. A PCR-termékeket denaturáló poliakrilamid gélen választjuk el. Az autoradiogramon csak az izotóppal jelölt mikroszatellit eredetű sávok láthatók. Ha az izotópos jelölés helyett ezüstfestést alkalmazunk, akkor a RAPD-sávok is láthatók. Arabidopsis ökotípusok RAMPvizsgálata során primerenként polimorf sávot és 2 7 allélt kaptak. Hasadó populációban a 104 RAMPfragmentumból 67 kodomináns markerként viselkedett. 19. ábra - RAMP szemi-specifikus és random primerrel (Weising és mtsai, 1997) Ha a szokásos 10 meres random primereknél hosszabbat használunk (16 vagy 20 mer), akkor a két primer részére közel azonos kapcsolódási hőmérsékletet tudunk biztosítani. Ezzel elkerüljük a hőmérséklet szempontjából aszimmetrikus PCR-körülmények kialakítását. Ha a kapott PCR-terméket restrikciós endonukleázokkal emésztjük (pl. MseI), akkor további polimorfizmust, dramp-okat kapunk. A RAMPtechnikát Sanchez de la Hoz és mtsai (1996) geneteikai rokonság megállapítására és térképezésre használták árpánál. RAMPO (Random Amplified Microsatellite Polymorphisms = véletlen amplifikált mikroszatellit polimorfizmus; Richardson és mtsai, 1995), RAHM (Random Amplified Hybridization Microsatellites = véletlen amplifikált hibridizációs mikroszatellitek; Cifarelli és mtsai, 1995), RAMS (Randomly Amplified Microsatellites = véletlen amplifikált mikroszatellitek; Ender és mtsai, 1996) A technika kombinálja a véletlen (20. ábra) vagy a mikroszatellit primerekkel végzett PCR-t és a mikroszatellit hibridizációt. A módszer alkalmazása során első lépésként kromoszomális DNS-t amplifikálunk a RAPDanalíziseknél használt 10 meres véletlen primerrel vagy egy mikroszatellittel komplementer 15 vagy 16 meres primerrel. A PCR-termékeket elektroforetizáljuk, etídium-bromiddal láthatóvá tesszük, fényképezzük, blottoljuk és 32P izotóppal vagy digoxigeninnel (DIG) jelölt próbákkal [pl. (A)16, (GA)8, (CAA)5 vagy (GATA)4] 34

43 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel hibridizáljuk. Az autoradiográfia után reprodukálható, próbától függő mintázatot kapunk, amely különbözik az etídium-bromidos festés után kapott mintázattól, és alkalmas a fajok közötti polimorfizmus kimutatására. 20. ábra - RAMPO random primőrrel (Weising és mtsai, 1997) A véletlen, 10 meres primerrel történő PCR-reakció után az etídium-bromidos festés csak a nagy mennyiségben keletkezett fragmentumokat teszi láthatóvá. A mikroszatellit próbával történő hibridizáció után viszont a kis amplifikációs termékek is detektálhatók. Egy bizonyos mikroszatellit motívumot tartalmazó fragmentumok jelintenzitását mind a motívum hossza, mind pedig a fragmentum mennyisége befolyásolja. A hibridizáló sávokat lehet klónozni, szekvenálni, majd próbaként használni RAPD- vagy RFLP-géleken. Klónozott RAMPO-fragmentumokkal fajon belüli és fajok közötti polimorfizmust is ki lehet mutatni. A RAMPOtechnikával eddig yam-, olajbogyó-, cukorrépa- és napraforgófajokat vizsgáltak, de valószínűleg sikeresen használható valamennyi növényfaj esetében. Nagy előnye ennek a módszernek, hogy PCR-reakcióval indul, ezért akkor is alkalmazható, ha nanogram mennyiségű DNS áll rendelkezésre. A mikroszatelliteken alapuló markertechnikák kevés kivétellel, pl RAMP, domináns típusú markereket hoznak létre. Tehát ezekkel a homo- és a heterozigóta állapotot nagyon nehéz vagy lehetetlen megállapítani. Mivel többlókuszos markerek, ezért az egyedi lókuszokat is nehéz velük elkülöníteni. STMS (Sequence Tagged Microsatellite Sites = szekvenciával jelölt mikroszatellit helyek; Beckmann és Soller, 1990) A lókusz-specifikus mikroszatellit analízis (STMS) kiküszöböli a mikroszatelliteken alapuló markermódszerek előzőekben ismertetett hátrányait, mert lókusz-specifikus kodomináns markereket és jól azonosítható alléleket eredményez. Az STMS-módszer lépései: 1. mikroszatellit ismétlődések keresése genomkönyvtárban, 2. a megfelelő klónok szekvenálása, 3. az ismétlődésekhez kapcsolódó primerek tervezése, 4. kromoszomális DNS amplifikálása az elkészített specifikus primerekkel, 5. a PCR-termékek radioaktív jelölése és elválasztása denaturáló gélen, 6. detektálás autoradiográfiával. Azokat a fragmentumokat, amelyek között 4 bp-nál nagyobb a különbség, 2%-os agaróz gélen is el lehet választani és etídium-bromiddal láthatóvá lehet tenni. Szintén jó feloldóképességet ad a nem denaturáló poliakrialmid gélen történő elválasztás ezüst- vagy etídium-bromidos festéssel kombinálva. Ezáltal elkerülhető a radioaktív jelölés. A legújabb STMS-technika alkalmazásakor az 5 és a 3 végen fluoreszcens festékkel jelölt primereket és félautomata szekvenálót használnak. Így a fluoreszcens PCR-termékek az elektroforézis alatt lézerszkenneléssel kimutathatók (21. ábra). A kiértékelés GENESCAN szoftver programmal végezhető. A technikával egyetlen zsebben futtatott 24 különböző mikroszatellit lókuszt is lehet sávonként analizálni. A Gene Scanner ABI 362 készülék azonban nagyon drága. 21. ábra - Árpa izogén vonalak (AlgR = rezisztens, AlgS = fogékony) RAPD mintázata fluoreszcens festékkel jelölt primerek és Géné Scanner ABI362 automata készülékkel történő elválasztás alkalmazásakor A nyíllal jelölt helyeken eltérés látható a rezisztens és a fogékony vonalak között. (Walsh és mtsai, 1997) 35

44 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel Az STMS-mintázatnál a dinukleotid ismétlődések enzimatikus amplifikációja miatt külön sávok helyett homályos csíkok csoportját látjuk, amelyek 2 bp-nyi intervallumonként különülnek el egymástól. A további csíkok nagy valószínűséggel a Taq polimerázos replikáció alatti elcsúszás miatt jönnek létre. Ezek a műtermékek gyakran nehezítik az allélek pontos méretének a meghatározását, különösen akkor, ha a két allél csak 2 bázispárban különbözik. Tri- és tetranukleotid ismétlődések amplifikálása esetén az elcsúszás kisebb, a sávok pedig élesebbek. Az STMS-markereket főleg térképezésre és genotípus azonosításra használják. Fajtaazonosításra megbízhatóbb, mint a RAPD, az MP-PCR vagy az oligonukleotid ujjlenyomat, mert az alléleket és a genotípusokat a kodomináns öröklődés miatt egyértelműen meg lehet határozni. Genotípus meghatározására főleg szójánál alkalmazták, és megállapították, hogy 10 vagy 15 lókusz elegendő szoros rokonságban lévő genotípusok megkülönböztetésére. Szőlőre olyan fajtaazonosító rendszert dolgoztak ki, amelynek során az STMS-lókuszokat fluoreszcens primerekkel vizsgálják, az eredményeket pedig GENESCAN szoftver programmal értékelik ki. Az STMS-markereket tulajdonságok térképezésére rizsnél, Arabidopsisnál, szójánál, árpánál, kukoricánál és paradicsomnál alkalmazták. A jelenleg rendelkezésre álló mikroszatellit markerek közül az STMS-markerek egyesítik az ideális markerekre jellemző tulajdonságokból a legtöbbet. Ezek az alábbiak: 1. nagyon polimorfak és informatívak, 2. kodominánsan öröklődnek, és így a homo- és heterozigóta genotípusokat jól megkülönböztetik, 3. a PCR-rel felszaporított mikroszatellitek szekvenáló gélen történő elválasztásával lehetővé teszik az allélek pontos meghatározását és az allélgyakoriságok kiszámítását, 4. az eukariota genomban mikroszatellitek mindenütt bőségesen jelen vannak, 5. valószínűleg semlegesek, mert csak kevés mikroszatellit íródik át, 6. megfelelő primerek esetében az egyes genotípusok meghatározása PCR-rel gyors, könnyű, csak nanogramnyi templát DNS kell hozzá és automatizálható, 7. az eredmények nagymértékben reprodukálhatók, ha szigorú (sztringens) PCR körülményeket alkalmazunk, 36

45 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel 8. a primer szekvenciákkal kapcsolatos információk könnyen cserélhetők az egyes laboratóriumok között. A STMS-technika széleskörű alkalmazására azonban a klónozás és a szekvenálás nagy pénz- és munkaigénye, valamint a genotípusok fárasztó azonosítása és a sávok elcsúszása ( dadogása ) miatt csak a legfontosabb növényfajoknál számíthatunk Az amplifikált fragmentumhossz polimorfizmus: AFLP Az AFLP elve Az AFLP-módszert (Amplified Fragment Lenght Polymorphism = amplifikált fragmentumhossz polimorfizmus), az egyik legújabb DNS-technikát, Zabeau és Vos (Key Gene, Hollandia) 1993-ban szabadalmaztatta és 1995-ben publikálta. Lényege: ismeretlen szekvenciájú kromoszomális restrikciós fragmentumokat amplifikálunk PCR-rel. Az amplifkáció előtt a genomiális DNS-t két restrikciós endonukleázzal hasítjuk, és a DNS-fragmentumok végeire helyspecifikus ds (double stranded = kettős fonalú) adaptereket ligálunk. Így az adapterek szekvenciája és a csatlakozó hasított vég lesz a restrikciós fragmentumok primerkötő helye az amplifikáció alatt. A PCR-primerek 3 végeihez szelektív nukleotidokat adunk, amelyek a hasítási helyek csak egy csoportját tudják azonosítani. Így csak azok a restrikciós fragmentumok amplifikálódnak, amelyekben a hasítási helyhez kapcsolódó nukleotidok összeillenek a szelektív nukleotidokkal (22. ábra). 22. ábra - Az AFLP-technika sematikus ábrázolása (Vos és mtsai, 1995) A fragmentumokat létrehozó két restrikciós enzim közül az egyik ritkán, a másik pedig gyakran vág. Ezért az AFLP-módszer elsősorban olyan restrikciós fragmentumok amplifikációját eredményezi, amelyeknek egyik végén ritkán vágott, a másik végén pedig gyakran vágott szekvenciák vannak. A kétféle restrikciós enzim használatának az alábbi okai vannak: 1. A gyakran vágó restrikciós enzim kis DNS-fragmentumokat hoz létre, amelyek jól amplifikálódnak és optimális méretűek a denaturáló gélen történő elválasztáshoz. 2. A ritkán vágó restrikciós enzimek az amplifikálódott fragmentumok számát csökkentik. Ez limitálja az AFLP-reakcióhoz szükséges szelektív nukleotidok számát. 3. Két restrikciós enzim használata lehetővé teszi, hogy a kettős szálú PCR-termékek közül csak az egyik legyen jelölve. Ez megelőzi a gélen az amplifikálódott fragmentumok két szálának különböző mobilitása miatt kialakuló másolatok (doublets) jelenlétét Az AFLP lépései 37

46 Az AFLP-módszer három fő lépésből áll: templátkészítés, fragmentum amplifikáció, gélanalízis. 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel Alapvető a DNS minősége. Nagyon fontos, hogy a DNS teljesen hasítódjon. Ha ugyanis két olyan DNS-t hasonlítunk össze, amelyek a nem teljes hasítás miatt különböznek, akkor nagy valószínűséggel nem igazi DNSpolimorfizmust mutató sávok jelennek meg. A templátkészítés első lépése a DNS hasítása a ritkán és a gyakran vágó restrikciós enzimekkel. Ritkán vágó enzimként általában az EcoRI-t (GAATTC), gyakran vágó enzimként pedig az MseI-t (TTAA) használják. Jó minőségű AFLP ujjlenyomathoz 500 bp fragmentumokra van szükség. Az MseI-gyel (TTAA) történő hasítás a legtöbb növényfajnál kis DNS-fragmentumokat eredményez, mert a legtöbb növény genomja A-T-ben gazdag. Az egyszikűeknél azonban az MseI nem hasít elég kis fragmentumokat, és a másik 4 bázispárnál vágó enzim is hasonló eredményt ad. Az AFLP-adapterek egy központi és egy hasító enzimspecifikus szekvenciából állnak. Ezek szerkezete az alábbi: EcoRI: 5-biotin-CTCGTAGACTGCGTACC CATCTGACGCATGGTTAA-5 MseI: 5-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5 Az adapterek úgy kapcsolódnak, hogy a hasítási helyek ligálás után nem alakulnak vissza. A ligálási reakcióban a restrikciós enzimek működése miatt a fragmentumok egymással nem ligálódnak. Az adapterek pedig azért nem tudnak egymással kapcsolódni, mert nem foszforiláltak. A ligálás után háromféle fragmentumot kapunk: MseI-MseI, EcoRI-MseI és EcoRI-EcoRI. Mivel az EcoRI-primert biotinnal jelöltük, ezért csak azokat a DNS-fragmentumokat tudjuk detektálni, amelyeknek EcoRI végük van. A biotinnal jelölt fragmentumokat a biotinnal nem jelölt MseI-MseI fragmentumoktól sztreptavidinhez való kötődés alapján lehet elkülöníteni. Ha az MseI primer végét 32P-vel -33P]ATP-vel jelölik, akkor az EcoRI-MseI és az MseI-MseI fragmentumokat is ki lehet mutatni. A 33P izotóppal végzett jelölés drága, de éles sávokat ad. Az izotópos jelölés helyett ezüstfestést is lehet alkalmazni az AFLP-vizsgálatoknál. Az ezüstfestés feloldóképessége azonos a 33P izotópéval, de több munkát és gyakorlatot igényel, mint az utóbbi. A sikeres PCR-amplifikáció feltétele a megfelelő primer konstrukció. Az AFLP-primerek három részből állnak: 1. az 5 régió, a központi rész, 2. a középső rész, az enzimspecifikus szekvencia (ENZ), 3. a 3 vég, ahol 1 vagy 3 szelektív nukleotid található (jelölésük: + 1 vagy + 3, illetve N vagy NNN). 38

47 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel Tehát az EcoRI- és az MseI-primerek szerkezete az alábbiak szerint alakul: Központi rész ENZ Szelektív nukleotidok EcoRI 5-GACTGCGTACC AATC NNN-3 MseI 5-GATGAGTCCTGA G TAA NNN-3 Az AFLP-primerek szerkezetét elsősorban a restrikciós fragmentumokhoz ligálódott adapterek szerkezete határozza meg. Különböző szerkezetű adapterekhez más és más PCR körülmények tartoznak. Ezért először a specifikus konstrukciójú adaptert választjuk ki, és ehhez optimalizáljuk a PCR-reakciót. Általában nukleotidból álló AFLP-primereket használnak. Az AFLP-analíziseknél a két restrikciós enzimmel pontosan be lehet állítani az amplifikálandó fragmentumok számát. Specifikus AFPL-primer készlet alkalmazásakor a várható fragmentumok számát a 2R/4 n képlettel lehet becsülni, ahol R = a ritka hasítási helyek (szekvenciák), n = a szelektív nukleotidok összes száma. Ezzel a képlettel azért lehet csak becsülni a fragmentumok számát, mert az amplifikált fragmentumok száma a szelektív nukleotidok természetétől is függ. Az A-T-ben gazdag szervezetekben az A-T-ben gazdag szakaszok meghosszabbodásakor több amplifikált fragmentum jön létre, mint a G-C-ben gazdagokban. Az AFLP-módszer, amely kromoszomális eredetű restrikciós fragmentumok detektálására alkalmas, hasonlít az RFLP-re. Közöttük a legfontosabb különbség az, hogy a restrikciós fragmentumok detektálása az RFLP-nél Southern hibridizációval, az AFLP-nél pedig PCR amplifikációval történik. Az RFLP-technika a restrikciós fragmentumhossz különbségeit mutatja, míg az AFLP a restrikciós fragmentumok meglétét vagy hiányát jelzi Az AFLP alkalmazási területei Az AFLP nagy feloldóképességű technika. Komplex genomok esetében ezzel a módszerrel korlátlan számú restrikciós fragmentumot lehet kapni. Egyetlen, pl. egy specifikus hat- és négybázisú restrikciós enzimkombinációval az egyedi AFLP-fragmentumok százezereit lehet létrehozni. Ezzel a módszerrel független lókuszok ezreinek gyors szűrését lehet elvégezni. AFLP-vel tízszer több (20 100) lókuszt lehet detektálni, mint RAPD-dal. Az AFLP-markerek viszont domináns, mendeli öröklődést mutatnak, így a homo- és a heterozigótákat nem lehet a mintázat alapján megkülönböztetni. Alkalmazási területek: géntérképezés (a genetikai és a fizikai térképek közötti különbséget is áthidalhatja), bulk szegregációs analízis, nemesítési alapanyagok genetikai különbözőségének a vizsgálata (23. ábra), fajtavédelem. 23. ábra - E-CAG/M-AGG primer párral létrehozott AFLP-polimorfizmus A nyilak az AFLP-markerként felhasználható polimorf PCR-fragmentumokat jelzik, amelyek bp hosszúak. Az 1-19 minták termesztett szója (G. max.) fajták, a jelűek pedig vad szójafajok (G. sója). (Maughan és mtsai, 1996) 39

48 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel Maughan és mtsai (1996) genetikailag nagyon eltérő vad és termesztett szója nemesítési alapanyagok diverzitását tanulmányozták 15 AFLP-primer párral, és 274 polimorf fragmentumot találta. Az RFLP-próbákkal és a mikroszatellitekkel egy, a RAPD-okkal pedig primerenként mindössze 0,5 polimorf lókuszt mutattak ki. Smith és mtsai (1994) kimutatták, hogy 20 AFLP-primer párral végzett analízis eredményei 35 beltenyésztett kukoricavonal esetében szoros korrelációban volt az F1 szemterméssel, a heterózis hatással, a pedigrével és az RFLP-adatokkal A különböző DNS-technikák összehasonlítása Mindig a vizsgálat célja határozza meg, hogy az előzőekben ismertetett DNS-technikák közül melyiket használjuk. A legmegfelelőbb az, amelyik olcsó, megbízható és egyértelmű, megismételhető eredményt ad. RFLP és PCR A genetikai variabilitás detektálására használt PCR-alapú DNS-technikák előnyei az RFLP-vel szemben: 1. kevesebb DNS-t igényelnek, 2. kevesebb lépésből állnak, 3. optimalizálás után a a PCR-alapú módszerek egyszerűbbek, 4. nem kell radioaktivitást alkalmazni, 5. a PCR-alapú módszerek a DNS-izolálástól az adatgyűjtésig és a kiértékelésigkönnyen automatizálhatók, 6. szinte korlátlan számú primer szekvenciát lehet használni. Kis számú minta esetében a RAPD olcsóbb, mint az RFLP. Nagy mintaszám vizsgálatakor viszont az RFLP a gazdaságosabb. A költségek kiszámításánál figyelembe kell venni a próba, illetve a specifikus primerek kifejlesztésének költségét és a vizsgálandó minták számát is RAPD és STS A RAPD-módszer alábbi hiányosságait kell figyelembe venni: 1. az alacsony sztringens körülmények között végbemenő amplifkáció során a primer és a templát DNS között gyenge komplex keletkezik, amely bizonyos primerek és sávok esetében rossz reprodukálhatóságot okoz, 2. a mintázatban kis gyakorisággal nem öröklődő sávok is előfordulnak, amelyek PCR-műtermékeknek tekinthetők, 3. a különböző laboratóriumok által azonos körülmények között végzett RAPD-analízisek eredményei feltehetően csak azonos PCR-készülék használatakor egyeznek, 40

49 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel 4. a RAPD-sávok domináns öröklődést mutatnak, vagyis a heterozigótákat csak ritkán detektálnak. Így a polimorfizmust csak a sávok megléte vagy hiánya jelzi. Ennek következtében a RAPD és más multilókuszos profilok kevesebb genetikai információt adnak, mint az egy lókuszos kodomináns markerek, pl. az STS. RAMP és ISA Mindkét módszer hátránya a RAPD-dal szemben az, hogy radioaktív jelöléssel lehet a mintázatot láthatóvá tenni. A mikroszatellitekhez hasonlítva a polimorfizmus gene-tikai magyarázata sokkal komplexebb lehet, mint az egy lókuszos STS-markerekkel. A RAMP- és az ISA-módszerekkel több lókuszos DNS profilt lehet létrehozni. STS és RAPD Az STS-markerek kiküszöbölik a RAPD hátrányait, mert egy lókuszos, kodomináns markerek, továbbá, mert reprodukálható és informatív mintázatot mutatnak. Az STS-módszer hátránya az, hogy a specifikus primerek más fajok vagy nemzetségek vizsgálatához nem használhatók és létrehozásuk idő- és pénzigényes Molekuláris markerezési eljárások a kertészeti növényeknél A kertészeti növények a paradicsom kivételével korábban csak valamilyen speciális szempont alapján mint pl. jó in vitro tenyészthetőség és regenerációs képesség (sárgarépa, dohány, petúnia) transzpozonok tanulmányozása (Antirrhinum) kerültek a molekuláris vizsgálatok porondjára és esetenként kapcsolatba a molekuláris markerezéssel. A 90-es évek közepére viszont már minden növénycsaládban, a gazdaságilag vagy genetikailag érdekes fajokkal számos kutató- és nemesítő helyen egyidejűleg megindult a markerezés. A párhuzamos izoenzim-, RAPD-, illetve AFLP-, SSR- stb. vizsgálatok kiegészítik egymást, mert sokszor más a növényanyag (eltérő fajták, más nemesítési alapanyagok) és sokszor mások a kitűzött célok is (fajtaösszehasonlítás, genomanalízis, molekuláris markerre alapozott szelekció [ Marker Assisted Selection, MAS] vagy genetikai térkép készítése). A néhány felsorolt példa és az 5. táblázat a teljesség igénye nélkül kíván képet adni a kertészeti növényeknél alkalmazott molekuláris módszerekről és eredményekről. 5. táblázat - Kertészeti növényeknél alkalmazott molekuláris markerezési eljárások és eredmények Magyar Latin Molekuláris markerezési eljárások eredmények név GT FR Zöldségfélék Bab Phaseolussp ,3,4 Vignasp. + + Borsó Pisum sp ,4 Schneider mtsai, 1997 és Csicseriborsó Cicer arietimim Lencse Lens culinaris Káposztafélék Brassica sp Osborn és mtsai, 41

50 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel 1997 Sárgarépa Daucus carota ,4 Schulz és mtsai, 1994 Paprika Capsicum annuum ,3,4, Lefebvre és mtsai, 1995 Paradicsom Görögdinnye Lycopersicon sp. Citrulhis lanatus ,3,4,5,6 Yoder, Sárgadinnye Cucumis méh ,4 Katzir és mtsai, 1996 Uborka Cucumis sativus ,3,4,6 Serquen és mtsai, 1997 Vöröshagyma Allhim cepa Bark és mtsai, 1994 Csemegekuko rica Zeamays ,4,5, Gyümölcsfélék Alma Malus domestica ,4 Conner és mtsai, 1997 Körte Pyrus communis Cseresznye Prunus aviwn + + Stockinoer mtsai, 1996 és Meggy Prunus cerasus + + Őszibarack Prunus perska Warburton mtsai, 1996 és Sárgabarack Prunus armeniaca + + Dió Juglans regia + + Szamóca Fragaria sp. + Davis és Yu, 1997 Avokádó Avocado sp ,4,6 Szőlő Vitissp ,5 Vignani és mtsai,

51 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel Gyógy- és fűszernövények Cickafark Achilleasp. + + Gyűszűvirág Digitális sp. + Útifű Plantago sp. + Zsálya Salvia sp. + Libatop Chenopodium sp. + Menta Mentha sp. + Mustár Brassica juncea Cheuno és mtsai, 1997 Dísznövények Szegfű Dianthus caryophyllus Tzuri és mtsai, 1991 Rózsa Rosa sp. + + Gerbera Gerbera sp. + + Jelmagyarázat: l - Fehérjeprofll, 2 - Izoenzim, 3 - RAPD, 4 - RFsLP, 5 - AFLP, 6 - VNTR, 7 - NIL, 8 - RIL, 9 - BSA, 10 - MAS, 11 - QTL, GT - Géntérkép, FR - Föreferencia A könyvben tárgyalt módszereket fel lehet használni a genetikai polimorfizmus vizsgálatára, a markeres szelekcióra, a genetikai térképezésre, a genomanalízisre, az evolúció során történt génáramlás tanulmányozására, az extrakromoszómális tulajdonságok vizsgálatára, a géndetektálásra transzgénikus növényekben, valamint a kórokozók kimutatására és jellemzésére. A genetikai polimorfizmus vizsgálata szinte minden faj esetében megindult. Időrendileg az izoenzim-vizsgálat (pl. alma, kajszi- és őszibarack), majd a RAPD-módszer került széleskörű alkalmazásra. A nagy- vagy kielégítő mértékű genetikai variabilitással rendelkező növényeknél már az izoenzim- és RAPD-módszer (szőlő, kajszi, zeller) is igen eredményes lehet, de klónok, közel rokon fajták közötti különbségtételre az AFLP, az SSR, az ISTR vagy a SCAR javasolt. Eddig számos esetben (pl. Cicer, Cucumis, Citrullus, Galium fajoknál) adott jó eredményt az ismétlődő szekvenciákon (VNTR) alapuló különbségtétel főleg a mikroszatellitek (SSR) alkalmazása. A minőségbiztosítás, a fajtatisztaság és a fajtavédelem területén az izoenzim-vizsgálatokat már rutinszerűen alkalmazzák kukoricánál, babnál és paprikánál (pl. hibriditás ellenőrzésére). De terjed a genommarkerek használata is, amelyek a jogi védelemben egyre fontosabb szerepet játszanak (pl. dinnyék esetében az AFLP). A hibridek vizsgálata a távoli keresztezések esetén kutatási céllal folyik. A hibridjelleg kimutatására Cucumis, Daucus, Prunus, Vitis fajhibrideknél az izoenzimeket, Allium fajhibrideknél az allotetraploid eredet tisztázására pedig az RFLP-vel kombinált citogenetikai módszert és RAPD-technikát alkalmazták sikerrel. A burgonya és a paradicsom szomatikus keresztezésével nyert nemzetséghibrideket mind izoenzim-technikával, mind pedig RFLP-vel és RAPD-dal is vizsgálták. Markeres szelekciót (MAS) használtak beltenyésztett vonalak azonosítására babnál és borsónál (RAPD); monogénes rezisztencia paradicsomnál nematódarezisztencia (izoenzim, RFLP, RAPD, SCAR), paprikánál dohány mozaikvírus-rezisztencia (RFLP), borsónál lisztharmat-, fuzárium- és vírusrezisztencia követésére. Gyümölcsfáknál, dísznövényeknél, arborétumi anyagoknál (nyárfa) a korai, differenciáló morfológiai bélyegek hiánya miatt, a magoncok kiválogatására (fenyőfélék) használták (RAPD). Mennyiségi tulajdonságok, illetve az 43

52 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel ezekért felelős lókuszok követése történt pl. a nem meghatározása (uborka), a hajtáshossz, a koraiság, a gyümölcssúly (uborka, dinnye, paradicsom), a virágzási idő (káposztafélék), a paradicsom sárga levélsodróvírus- és rovarrezisztencia (paradicsom RAPD), a részleges uborka mozaikvírus-rezisztencia (paprika RAPD), a gyümölcshússzín (őszibarack RAPD), a faminőség (Eucaliptus RAPD) vizsgálatának esetében. Babnál MAS segítségével folyik a mono- és a poligénes jellegek összeépítése, és már sikerült halmozott baktérium- (Pseudomonas-, Xanthomonas-), vírus-, gomba-, nematóda-rezisztenciát és kedvező QTLeket összeépíteni. A genetikai térképezés legtöbb eredményt a paradicsom esetében hozott. Mind hagyományos, mind molekuláris markerekkel készültek kapcsoltsági térképek, és jelenleg az egyik legtelítettebb komplex kapcsoltsági géntérkép áll rendelkezésre. Különböző kiterjedésű, teljes és részleges térképek készültek pl. bab (izoenzim, RFLP, RAPD), mandula (izoenzim+rflp-394cm), káposzta (RFLP-921cM, AFLP-615cM), Brassica napus (RFLP-1016cM), B. campestris, uborka (RAPD-600cM), hagyma (RAPD), spárga stb. vonatkozásában. A gyengén polimorf sárgadinnyénél az AFLP-markerek hatékonyabbak voltak a mikroszatellit (SSR) és RAPD-markereknél. A térképek lehetővé teszik a térképezésen alapuló génizolálást. De eredményes a fordított eljárás is: génkönyvtárból történő génizolálás (káposzta, paradicsom) pl. homológ (Arabidopsis) szekvenciák alapján, majd a megismert gén helyének azonosítása a géntérképen. A genomanalízisek hasznos információkat adhatnak a nemzetségek rokonsági fokáról. Bab és szója esetében egy adott lókusz szekvenciájának változása, továbbá RFLP- vagy ctdns-analízis alapján meg lehetett állapítani közöttük a rokonsági fokot. Fűféléknél az evolúciós leszármazást tárták fel, a burgonya, a paradicsom és a paprika esetében pedig genom homológiát és kromoszómaszerkezet, illetve génsorrend azonosságokat és különbségeket mutattak ki (RAPD, RFLP, kromoszóma in situ hibridizáció). A részleges és teljes géntérképeken alapuló összehasonlító genomanalízisre még csak kevés kertészeti faj esetében (pl. Lycopersicon, Solanum, Capsicum, Brassica, Allium nemzetségekben) van lehetőség. Extrakromoszomális tulajdonságok vizsgálatánál az organellumok jellemzésére is használják a DNS-markereket (RAPD, RFLP). Így pl. a cikória és a napraforgó cibridek tanulmányozásánál alkalmazták. Káposztaféléknél és hagymánál a hímsterilitást, uborkánál az apai mitokondriális öröklődést vizsgálták mtdns markerekkel. A szelekció során gyakran szükséges a növényekben az idegen gének jelenlétének kimutatása. Ezeket a géneket a Southern hibridizáción alapuló eljárásnál gyorsabb PCR-technikával detektálják a pl. a tojásgyümölcs, a sárgadinnye, a szilva, a kajszi és a paradicsom esetében. A kórokozók kimutatása és jellemzése a hagyományos módszerek mellett, amelyekkel pl. a kórokozókra jellemző fehérjék (pl. vírus köpenyfehérjék) kimutatására van lehetőség, újabban nukleinsav detektálási módszerekkel is folyik. Itt a kórokozók pl. vírusok, mikoplazmák, gombák genomjának kimutatására és jellemzésére van lehetőség. Ezt a technikát már eredményesen alkalmazták pl. alma, csonthéjasok, szőlő, dísznövények kórokozói esetében és vetőmagvak fertőzöttségének kimutatására. A molekuláris módszerekkel kapott hazai eredmények a kertészeti növények esetében szerényebbek, mint a gabonafélékkel elértek (MTA Mezőgazdasági Kutató Intézete Martonvásár, GK KHT Szeged), vagy amelyekkel a lucerna géntérképezésében az MTA Szegedi Biológiai Központ munkatársai nemzetközileg is kiemelkedtek. A kertészeti növényekkel végzett hazai markerezési eredmények közül elsősorban a gödöllői Mezőgazdasági Biotechnológiai Központban a paprika polimorfizmusát feltáró és a MAS-t segítő AFLP, mikroszatellit és RAPD-markerekkel végzett munkát kell kiemelni. Ennek során fajtaazonosítási, fajtavédelmi problémák megoldásán túl TMV-, Xanthomonas- és fonálféreg-rezisztencia kimutatását oldották meg. Az OMMI laboratóriumában a rutinszerű fajta- és hibridvizsgálatokhoz használt izoenzimes módszereket a kertészeti növényeknél is alkalmazni kezdték (paprika, bab). A gazdaságilag fontos és a nemzetközileg is jelentős hazai szőlő génanyag feldolgozása genommarkerekkel (RAPD) nemzetközi kooperációban az egri kutatóintézetben indult el. Taxonómiai, populációgenetikai vizsgálatok folytak (izoenzim markerekkel) termesztett és vad paprika fajokkal hagymás növényekkel (izoenzim markerekkel), újabban pedig fás növényekkel (RAPD) az ELTE Genetikai Tanszékén. A GATE Genetika és Növénynemesítés Tanszékén is színvonalas izoenzimes munka folyik, esetenként kertészeti növényekkel. A paprikanemesítésben Keszthelyen a Pannon Agrártudományi Egyetemen megkezdték a RAPD-markerek használatát. A paradicsom esetében a fonálféreg-rezisztencia izoenzimes markerezését éveken át rutinszerűen végezték a Kertészeti Kutató Intézet Kecskeméti Telepén, mely munka a Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetemen folytatódott. Az utóbbi egyetem Genetika és Növénynemesítési Tanszékén izoenzimes és RAPD-vizsgálatok folynak nemesítési és taxonómiai céllal bab, kajszi, szőlő, görög- és sárgadinnye vonatkozásában, és új biokémiai markerezési eljárások metilezéssel összefüggő rezisztenciafaktorok OPTLC-s kimutatásának fejlesztése is folyik. A NIR-technika egyik hazai bázisát a Központi Élelmiszeripari Kutató Intézetben hozták létre, ahol szójafajták elkülönítő 44

53 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel jellemzésére indultak meg a vizsgálatok, a Kertészeti és Élelmiszeripari Egyetemen pedig számos kertészeti növény esetében a minőségellenőrzésében (meggy, cseresznye, alma stb.) és genetikai vizsgálatokban (dinnye, bab) alkalmazzák Molekuláris markerek alkalmazása az erdészeti növények nemesítésében Biokémiai markereket mintegy 30 éve alkalmaznak az erdészeti kutatásban; legkorábban a fenyők kiemelkedő gazdasági jelentősége miatt a fenyőgyanta terpén komponenseit használták fel genetikai elemzésekhez (Squillace, 1976; Squillace és Fisher, 1966). Jelenleg a DNS-, illetve az izoenzimmarkerekkel támogatott genetikai elemzések az erdészeti kutatás legdinamikusabban fejlődő, az alkalmazás szempontjából is egyre bővülő területe. Az erdőgazdálkodás sok tekintetben nagyon eltér a mezőgazdasági és a kertészeti termesztéstől, genetikai szempontból a legfontosabb különbség az, hogy az erdőművelő döntő mértékben vad populációkkal dolgozik, és ebben természetvédelmi és egyéb megfontolásokból a távolabbi jövőben sem lesz lényeges változás. Ez határozza meg az erdészeti genetika feladatait és ezen belül a biokémiai markerek alkalmazásának indítékait. Gyakorlati szempontból elsősorban az erdészeti szaporítóanyag-felhasználás szabályozása igényel markereket. Az erdei fafajok termőhelyi alkalmazkodottságának, illetve alkalmazkodóképességének fenntartása a hosszú termelési ciklus miatt elsőrendű fontosságú. Ehhez elengedhetetlen a természetes genetikai változatosság fajon belüli mértékének, földrajzi mintázatának, továbbá a fajon belüli és a rokon fajok közötti evolúciós viszonyoknak (migrációs útvonalak, introgresszió, speciáció előrehaladottsága stb.) minél alaposabb feltárása. A génmegőrzés, a genetikai diverzitás fenntartása is hasonló feladatokat jelöl ki. A genetikai összefüggések statikus elemzése mellett fontos szerep jut a markereknek a populációkon belüli dinamizmus feltárásában. A párosodási viszonyok, a génáramlás, a természetes és antropogén szelektív tényezők (pl. légszennyezés okozta mortalitás, erdőművelési beavatkozások) génkészletre gyakorolt hatásai olyan kérdések, amelyek ismerete nélkül tudományosan megalapozott termesztési és konzervációs stratégiák nem képzelhetők el. Az egyes fajcsoportokban (pl. nemes nyárak) számottevő előrehaladást elért erdészeti nemesítés számára a markerek alkalmazása különösen előnyös, mert segítségükkel a hosszú évtizedes tesztelési munkák egy része megtakarítható. Jelentős kutatási tevékenység folyik a mennyiségi tulajdonságokat meghatározó génhelyek (QTL) és a rezisztenciamarkerek azonosítására is. Az említettek miatt a genetikai markereket az erdészetben nem csak az alapkutatás és a nemesítő munka során, hanem a szaporítóanyag-ellenőrzésben, a magtermesztő ültetvények tervezésében, a génmegőrzést szolgáló rezervátumok kiválasztásában, általában a hosszútávú gazdasági és természetvédelmi stratégiák kidolgozásában is széleskörűen alkalmazzák. A felhasználással kapcsolatos igények előrevetítik a biokémiai markerekkel kapcsolatos nehézségeket is. Az erdőgazdálkodásban elsődleges jelentőségűek az adaptív tulajdonságok. A jelenleg ismert markerek azonban semlegesnek vagy közel semlegesnek bizonyultak még adaptív összefüggéseket jelező mintázatok esetében is, mert ezek kauzális (oksági) volta nem egyértelmű (ennek ellenőrzése az utódnemzedékekben sokkal időigényesebb és körülményesebb, mint az egynyári növényeknél). Emiatt a biokémiai markeres eredmények csak a párhuzamosan végzett tenyészkerti és ökológiai vizsgálatok eredményeivel együtt hasznosíthatók Az izoenzim-analízis erdészeti alkalmazásai és eredményei Az allozimatikus változatosságot tekintve az erdei fák értékei a lágyszárú növény- és állatfajokéhoz képest kiemelkedően magasak: a lókuszonkénti átlagos allélszám 2 és 3 közötti, a heterozigóta lókuszok aránya pedig általában meghaladja a 20 %-ot (Mitton, 1983; Ledig, 1986; 6. táblázat). Ez az allélváltozatosság azonban legnagyobbrészt a populációkon belül nyilvánul meg. A 6. táblázatban közölt összefoglaló adatokból látható, hogy a populációk közötti differenciálódás mértéke (GSG %) az összefüggő áreával rendelkező fafajok esetében csekély, pl. a kocsánytalan tölgy (Quercus petraea) esetében mindössze 2%, és általában nem haladja meg az 5%-ot. Magas populációk közötti varianciát mutatnak a jellegzetesen széttagolt áreával rendelkező fajok, mint pl. a cirbolyafenyő (Pinus cembra), illetve a feketefenyő (Pinus nigra). 45

54 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel 6. táblázat - Néhány európai és északázsiai fafaj allozirnatikus genetikai változatosságának becsült értékei Az adatok általában időskorú állományokból vett mintákra vonatkoznak. Embriók és csemeték adatsorát "juv." megjelölés jelzi. (MÜLLER-STARCK, 1991 nyomán, kiegészítve) Fafaj Vizsgált génhelyek átlagos száma (db)* Lókuszonkénti átlagos allélszám (db) Heterozigóta lókuszok aránya (%) Populációk közötti differenciálódá s (GSG%) Fenyők Abies álba 6,6 2,1 49,0 Larix decidua 17,6 1,9 16,3 2,6 Picea abies 10,5 2,1 12,8 4,7 Pinus cembrá 8,7 1,8 12,8 32,0 sibiríca 14,0 1,6 16,3 1,6 nigra 3,8 2,5 27,2 10,8 silvestris 6,5 3,4 34,8 3,5 juv. 11,1 3,1 26,8 1,5 Lombfák Castanea sativa 14,6 1,9 25,9 12,2 Fagus sylvatica 5,6 2,3 28,2 5,4 juv. 6,6 3,1 23,1 Quercus juv. petraeá 14,7 3,2 21,9 2,0 roburjuv. 13,0 3,2 21,3 1,8 Összehasonlításul Kétszikű lágyszárúak** Egyszikű lágyszárúak** 1,4 11,3 1,4 16,5 *A táblázat nagyszámú irodalmi forrás felhasználásával készült. A mintázott populációk és egyedek, valamint a vizsgált enzimrendszerek száma is eltérő, ezért az adatsorok csak korlátozottan vethetők egybe. Az adatok forrásai Müller-Starck (1991) tanulmányában találhatók. **A kétszikűek adatai 338 faj, az egyszikűek 80 faj átlagai, forrásuk: Hamrick és Godt (1989). 46

55 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel Az allélgyakoriságot tekintve az erdei fafajok allozimatikus változatossága négy alaptípusra vezethető vissza, amelyek eltérő hatások nyomán jöhetnek létre: a. hiányzó ritka allélek: valószínűleg csak nagyon csekély számú mutáns allél funkcióképes, a többiek letálisak (ez a típus elégtelen mintavétel miatt is előállhat); b. gyakori és ritka allélek vegyes előfordulása a mintában: mutáns, de hátrányos hatású allélek folyamatos képződése vagy adaptívan kedvezőtlen allél bevándorlása; c. változatosság hiánya (monomorfizmus), illetve csekély polimorfizmus: irányított szelekciós hatás révén jön létre, de kis populációméret esetén genetikai drift következménye is lehet, organellumban működő enzimeknél gyakoribb; d. di-, illetve polimorfizmus (jellemzően két ritkán három nagy gyakoriságú allél jelenléte): valószínűleg heterozigóta fölény tartja fenn, amelynek oka lehet a környezeti tényezők időbeli vagy térbeli fluktuációja, de dimorfizmushoz vezethet a kódolt élettani funkció kontrolljának az egyedfejlődés során előálló változása, differenciálódása is. A dimorfizmus csak a citoplazmában működő enzimeknél figyelhető meg (Gregorius és Bergman, 1995). Különös érdeklődésre tarthat számot az izoenzim-változatosságnak a populációk között kimutatható esete. Gyakran egyetlen vizsgált lókuszon sem mutatkozik számottevő különbség, ami a populációk közötti akadálytalan a génáramlásra utal. Ha fragmentálódtak, akkor a fragmentálódás evolúciósan rövid időszakra vezethető vissza. A bükk (Fagus sylvatica) hazai előfordulásait elemezve például Comps és mtsai (1998) megállapították, hogy az izolálódás hatása a hazai bükkösök jelentős mértékű fragmentálódása ellenére sem mutatható ki. A drift és a szelektíven semleges hatások érvényesülése véletlen eltéréseket is generálhat, amelyek azonban nem képeznek ökológiailag értelmezhető mintázatokat. A nagy gyakoriságú allélok földrajzi mintázata összefüggő área esetén adaptív divergenciára utal, míg a csak ritka alléleknél megfigyelhető eltérések egyedi mutációk fellépését jelzik. A gyakori alléleknél megfigyelhető földrajzi mintázat ritka jelenség. A populációk között igen nagy földrajzi távolságon belül is általában elhanyagolhatók a géngyakorisági eltérések. Ez arra utal, hogy a helyi ökológiai szelekciós tényezőknek csekély szerepük van az izoenzim-változatosság kialakításában. Paule (1995) a bükk esetében 23 összehasonlító kísérletben vizsgált 17 enzimrendszere közül 3 esetben talált földrajzi elkülönülést jelző mintázatot (GOT-2, MDH-3, SKDH lókuszokon). Ez a mintázat is elsősorban a két európai faj (F. sylvatica és orientalis) elkülönülése és introgressziója révén jött létre. Comps és mtsai (1998) Dél-franciaországtól a Zemplénig terjedő mintegy 1800 km hosszú transzektben vizsgálták a bükk genetikai differenciálódását. Diszkriminancia-analízis segítségével a nagy földrajzi távolságot és jelentős tengerszint feletti magasságkülönbséget képviselő populációmintákban 12 enzimlókusz allélgyakorisága alapján mindössze 4 szignifikánsan eltérő bükk körzetet sikerült azonosítani (24. ábra). 24. ábra - Közép- és nyugateurópai bükkpopulációk allozimatikus változatossága, 12 enzimlókusz elemzése alapján. A csoportok szétválasztása diszkriminancia-analízis segítségével történt. A populációk differenciáltsága a nagy földrajzi távolságok ellenére is csekély. (Comps és mtsai, 1998) 47

56 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel A kapott eredmények értékelése Az értékeléskor figyelembe kell venni, hogy az enzimeket kódoló gének a genom expresszált részének is csak töredékét képviselik, és a kapott diverzitásadatok nem általánosíthatók a teljes genomra. Különösen nagy a hibaforrás, ha egy-két enzimrendszer vizsgálata alapján általános következtetéseket vonnak le, pl. a géndiverzitás mértékéről, mert egyes enzimek polimorfok, mások változatossága pedig csekély vagy teljesen hiányzik. Fás növényeknél pl. az almasav dehidrogenáz (MDH) sokszor csak egyetlen változatban fordul elő. Emiatt minél több enzimrendszer elemzésére van szükség. Az elektroforézissel kimutatható allozimatikus változatosság emellett nem tükrözi teljes mértékben az enzimet kódoló DNS-szakasz változásait sem. A genetikai kódszótár degenerált jellegéből adódóan a bázissorrend-változás nem jár feltétlen aminosavváltozással: pl. a leucinnak hatféle kódja lehet. Az allozimek eltérései csak 30%-ban jelentenek standard labormódszerekkel kimutatható töltésváltozást (Bergmann, 1991). Eltérő enzimvariánsok egymást is fedhetik, emiatt a változatosság mértékét alábecsüljük. Azt is figyelembe kell venni, hogy a kivonás, a feldolgozás és az elektroforézis során az enzimek fehérjeszerkezete megváltozhat, esetleg részlegesen felbomolhat. Mindezek miatt az elektroforézissel előállított izoenzim mintázatok genetikai értelmezése csak akkor igazán valósághű, ha ellenőrzött keresztezések segítségével előzetesen az öröklésmenetet is megvizsgáljuk. Az izoenzimanalízissel kapott eredmények általánosításának legfőbb akadálya: nincs egyetértés abban, hogy a kimutatott genetikai változatosság semleges vagy adaptív jellegű-e. Ennek ellenére sikerült pl. a jegenyefenyő esetében (Bergmann és mtsai, 1990) közvetlen kapcsolatot találni a természetes szelekció működése és az allozimek gyakorisági mintázata között. A földrajzi mintázatok létezése önmagában nem perdöntő, mert a földrajzi mintázatot migrációs és driftjelenségek is létrehozhatják. Bergmann és mtsai (1990) szerint az enzimek működésében már csekély módosulások is jelentős változást (romlást vagy javulást) okozhatnak. Ezért feltételezik, hogy a populációban számottevő gyakorisággal képviselt allozimek a fenotípus fenntartása szempontjából nem lehetnek szelekciósan semlegesek. Mai ismereteink szerint úgy tűnik, hogy az erdei fák izoenzim-változatosság mintázata néhány kivételtől eltekintve a helyi környezeti tényezőktől aránylag függetlenül alakul ki. Ez azt jelenti, hogy az enzimeket kódoló lókuszok szintjén szélsőségesen eltérő környezetekben (gyakorisági) eltérés csak akkor mutatható ki, ha a homozigóta típusok alkalmazkodottsága számottevő környezeti eltérést mutat, ami pedig ritkán fordul elő. Következésképpen az izoenzimek ökológiaigenetikai vizsgálatokra alig használhatók. Ezt jól illusztrálják a 6. táblázat adatai is. 48

57 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel DNS-vizsgálatok erdei fafajokon A fafajok DNS-vizsgálata nehéz feladat, mert pl. a fenyők haploid genomjának DNS-tartalma egy, sőt két nagyságrenddel nagyobb, mint bármely más növényfajé ( bp Ohri és Khoshoo, 1986). Számos vizsgálat igazolja, hogy DNS-állományuk mintegy 3/4 része repetitív szakaszokból áll (Neale és Williams, 1991). Az erdeifenyőre Savolainen (szóbeli közlés, 1995) a genetika modellszervezeteivel összehasonlítva a 7. táblázat adatait adja meg. 7. táblázat - Az erdeifenyő (Pinus silvestris), a lúdfű (Arabidopsis thaliana) és az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) sejtmagi DNS-tartalmának, valamint a szekvenált repetitív DNS-szakaszok számának összehasonlítása Tényezők Pinus silvestris Arabidopsis Drosophila Generációk hossza, minimum 25 év 5 hét 12 nap A sejtmag DNS-tartalma (pg) 28 0,1 0,2 Szekvenált száma Géntérképezéssel kutatók száma DNS-szakaszok foglalkozó A lassúbb előrehaladás tehát nem csak a hosszú generációs időből és a kutatók viszonylag kis számából, hanem a fafajok genomjának nagyságából is adódik. A számos DNS-marker közül erdészeti szempontból azoknak van elsősorban gyakorlati jelentősége, amelyek egyrészt lehetőséget adnak a fajon belüli adaptív változatosság feltárására és a származási körzetek minél fínomabb megkülönböztetésére, másrészt pedig kvantitatív tulajdonságok jelzésére Az adaptív genetikai mintázatok azonosításának korlátai Az adaptáció DNS-változatosságban megmutatkozó hatását Savolainen (1997) adataival illusztráljuk, aki egy Helsinki környéki és egy lappföldi (Ylläs-i) erdeifenyő-populáció elemzését végezte el. Előbbi helyen a januári középhőmérséklet 6,9 C, a vegetációs idő hossza 174 nap, a nyár közepén a napszakhossz 16 óra, ugyanez Lappföldön 13,9 C, illetve 121 nap és 24 óra. A számított genetikai diverzitás-adatokat a 8. táblázat tartalmazza. 8. táblázat - DNS adatokra számított genetikai diverzitás (He), Shannon-Weaver diverzitás index (H), közös tenyészkerti kísérletben mért fenotípusos variancia (Vp), valamint a populációk közötti variancia százalékos aránya (Vbetw) egy dél-finnországi (Helsinki) és egy lappföldi (Ylläs) erdeifenyő (Pinus silvestris) populációra (SAVOLAINEN, 1997) Jellemző Mértékegys ég* Helsinki Yllás V betw RFLP H e 0,44 0,54 2 Mikroszatellit ek H e 0,74 0,

58 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel rdns H 1,40 1,38 14 Összehasonlításul 12 enzimlókusz H e 0,35 0,35 2 Rügyfakadás V P *A táblázat 3. és 4. oszlopára vonatkozik Jól látható, hogy az extrém környezeti különbségek ellenére az RFLP és a mikroszatellit markerek változatossága nem mutat jelentős eltérést. Az rdns-nek a populációk közötti aránylag nagyobb varianciája is inkább véletlen drifttel magyarázható. Ugyanakkor a rügyfakadásra megállapított fenotípusos varianciaértékek populációk közötti aránya jól jelzi az adaptációban mutatkozó tényleges eltéréseket. Az izoenzim-változatosság értékei is indifferensek. Bár a DNS-markerekkel a génkészlet monitorozása aránylag gyorsan és pontosan elvégezhető, ezek a fontos adaptív tulajdonságok közvetlen elemzését egyelőre nem helyettesíthetik. Kevés kivétellel ez mind a fenyőkre, mind a zárvatermő lombos fafajokra érvényes A DNS-vizsgálatok alkalmazási lehetőségei a rendszertanban és a származásazonosításban A nukleáris DNS-hez képest egyszerűbb vizsgálhatóság és a génáramlásban betöltött különleges szerep miatt az organellum-dns felhasználása az erdészetben elég széles körű az infraspecifikus genetikai mintázatok elemzésére. Az organellum-dns vizsgálatok jelentőségét az erdészeti genetika számára az adja, hogy az erdei fák nagy része (az akác kivételével szinte valamennyi fontos mérsékeltövi termesztett faj) allogám és hatékony szélporzó. A pollen migrációs távolsága közismerten nagy, ugyanakkor a mag terjedőképessége viszonylag korlátozott. Különösen nagy az eltérés a nagy magvakkal rendelkező klimaxfajoknál, így pl. a tölgyek esetében, ahol a pollenre, illetve a zigótára érvényes effektív migrációs távolságok eltérése legalább 3 nagyságrendet tesz ki. A sejtmag DNS-ében kódolt allélok igen hatékony génáramlásával szemben tehát az anyai organelláris öröklés helyi mintázatok fennmaradását teszi lehetővé. Ezáltal az organellum-dns markerek azon kevés genetikai markerek közé tartoznak, amelyek potenciálisan lehetővé teszik kisebb térségek populációinak azonosítását, azaz a szaporítóanyag származásának ellenőrzését. A DNS-t tartalmazó sejtorganellumokat, a mitokondriumot és a kloroplasztiszt az eukarióta szervezetek fogságába került baktériumszerű endoszimbiontákból eredeztetik (előzők a jelenlegi Cyanobacteriumokkal, utóbbiak a fotoszintetizáló lila baktériumokkal rokoníthatók, Gray, 1989). Markerként való alkalmazásukhoz ki kell emelni, hogy az organellumgenom haploid, csak az egyik szülő által örökíthető át és nem rekombinálódik. A kloroplasztisz-dns (cpdns) a kétszikűekben, ahová valamennyi zárvatermő (lombos) fafajunk tartozik, kizárólagosan anyai öröklődést mutat, a pollenből hiányzik. Ugyanakkor a nyitvatermőkhöz tartozó fenyőknél néhány kivételes esettől eltekintve a cpdns-örökítése apai ágon, azaz a pollen révén történik. A legtöbb növény- és állatfaj mitokondriális DNS-e (mtdns) anyai öröklődésű. Kivételt képeznek a fenyők között a Cupressaceae család fajai (pl. Sequoia, Calocedrus sp.; Hipkins és mtsai, 1994). Alkalmazási példaként az ökológiailag eltérő igényű kocsányos és kocsánytalan tölgyfajokkal végzett kutatások néhány eredményét mutatjuk be. A két faj genetikai távolsága, hibridizálásuk lehetősége, illetőleg az esetleges introgresszió (fajok közötti hibridizálódás) mértéke sem morfológiai alapon, sem izoenzim-vizsgálatok alapján nem dönthető el egyértelműen. Más fafajokhoz hasonlóan, a fajon belüli allozimatikus genetikai diverzitásnak mindössze 3 4 százalékát lehet a populációk közötti szintre visszavezetni (9. táblázat). A cpdns-vizsgálatok ugyanakkor ennek gyökeresen ellentmondó eredményeket szogáltattak: a kloroplasztisz DNS-ből meghatározott diverzitásnak mindössze 9%-a korlátozódik a populáción belüli különbségekre, 88% pedig a populációk közötti különbségekben mutatkozik meg (9. táblázat). Ez az organellumok anyai öröklődésével függ össze. A cpdns-elemzés alapján kirajzolódó, aránylag kis területű haplotípus-körzetek ökológiailag nem értelmezhetők, de regionális azonosításra alkalmasak lehetnek (Petit és mtsai, 1993). 50

59 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel 9. táblázat - A Quercus petraea és Qu. robur fajkomplex allozimatikus és kloroplasztisz- DNS diverzitásának komponensei (KREMER és mtsai, 1991) Lókusz Teljes géndiverzitás A diverzitás komponensei (%) G 8 G GT G SG H ES egyedek fajok közötti populációk Allozimatikus diverzitás Savas foszfatáz (ACP) 0,487 94,7 4,8 0,5 Diaforáz (DIA) 0,567 93,6 4,7 1,7 Foszfoglüko-izomeráz (PGI) Foszfoglükomutáz (PGM) 0,241 92,6 2,7 4,7 0,323 84,3 7,9 7,8 Átlag 0,404 91,3 5,0 3,7 cp DNS-diverzitás (restrikciós enzim génhelyek) Aval 0,489 7,5 4,2 88,3 Cfol 0,489 7,5 4,2 88,3 Hind Hl 0,461 11,5 0,05 88,5 Átlag 0,480 8,8 2,8 88,4 Megjegyzés: a diverzitás értékeket a két faj összevont adataiból számították. H ES = a lókuszon talált allélgyakoriságokból számított teljes diverzitás mértéke, G S = a populáción belül, egyedek között mért diverzitás aránya (%), G GT = a fajok közötti különbség okozta diverzitás aránya (%), G SG = a fajon belül, populációk közötti különbségek okozta diverzitás aránya (%). Ugyanakkor a két faj elkülönülése sem allozimatikus, sem kloroplaszt-dns differenciálódás alapján nem látszik nagymértékűnek. A 9. táblázat adatai alapján a differenciálódás fajok közötti komponensére a vizsgált 4 enzim átlagában 5 %, a három kloroplasztisz restrikciós enzimre pedig 3 % esik. Eddig nem találtak olyan nukleáris DNS-markert, amely a tölgyfajok azonosítását egyértelműen lehetővé tenné, bár ilyen utalások az irodalomban előfordulnak (pl. Kreike és mtsai, 1991; Dumoulin-Lapégue és mtsai, 1997). Alapvető probléma, hogy a fajokra általánosan érvényes megállapításokat csak a teljes áreát kellően reprezentáló mintázással lehet tenni, ennek kivitelezése azonban óriási feladat. Magyarországon Burg és Bordács (1997, publikálatlan adatok) kísérelték meg a két faj, valamint az erdészeti alkalmazás szempontjából kiemelkedően fontos szlavóniai kocsányos tölgy származási régiójának azonosítását sejtmag DNS-markerek segítségével. A vizsgálathoz az ország különböző pontjain 13 kijelölt állományból gyűjtöttek anyagot. A RAPDmódszerrel végzett elemzések során négy olyan tesztelhető DNS-szakaszt (primert) találtak, amely alkalmas lehet a fajok elkülönítésére. A kocsányos tölgy alapfajtól élesen elkülönültek a szlavon származású példányok a markerszakaszok gyakorisága, illetve hiánya alapján. Ugyanakkor jól elválaszthatóan elkülönültek a 51

60 4. A genetikai variabilitás vizsgálata DNS-markerekkel kocsánytalan tölgy fajú egyedek is. Meglepő volt, hogy a vizsgált szlavon kocsányos tölgyek genomja az egyik primer esetében (OPERON G9 jelű, 680 bp) a kocsánytalan tölgyekkel azonos gyakorisággal fordult elő, bár kis számban hasonló típusú kocsányos tölgyeket is találtak. A vizsgált egyedek viszonylag kis száma és a mintavétel regionális jellege miatt azonban ezek az eredmények nem általánosíthatók. A jelenségre két magyarázat adható: evolúciósan fiatal, viszonylag frissen szétvált fajokról van szó, vagy pedig a fajok között folyamatos és erőteljes génáramlás van. Gyors speciáció esetén valószínűsíthető, hogy az adaptáció szempontjából kisebb jelentőségű életfunkciókat meghatározó génekben, illetőleg nem kódoló DNSszekvenciákban a differenciálódása alacsony szinten marad. Mennyiségi bélyegeket kódoló génhely (QTL) alkalmazása az erdészeti nemesítésben. A genetikai markerekkel támogatott szelekció lehetőségei az erdészeti nemesítés specifikumai miatt (hosszú generációs idők, nagy egyedszámú tesztek hely- és költségigénye) ma még nincsenek kellő mértékben kiaknázva. A potenciál azonban nagy, mivel az erdészeti fafajok szelekciója jellegzetesen komplex, mérsékelt heritabilitású tulajdonságokra irányul (pl. produkció, általános ellenállóképesség, termőhelyállóság). Becslések szerint a markeres szelekció a pusztán fenotípusra épített szelekcióval szemben akkor nyújt előnyt, ha a markerekkel magyarázható additív genetikai variancia aránya 50%-nál nagyobb és a heritabilitás értéke 0,5 alatt van (Bradshaw és Grattapaglia, 1994). Amennyiben a kvantitatív tulajdonságokat meghatározó lókuszok száma kicsi, a markerek azonosítása lehetséges lesz. Ha számos, hasonló hatású lókusz felelős a mennyiségi tulajdonságért, akkor a populációk szintjén hasznosítható markerek azonosítása nem kecsegtet gyors sikerrel. Újabb kutatási eredményekből arra lehet következtetni, hogy egyes fontos kvantitatív tulajdonságok öröklődését a korábban feltételezettnél kevesebb, nagyhatású gén határozza meg. A QTL-markerek felderítésére csak akkor van lehetőség, ha megfelelő, ellenőrzött leszármazású családok állnak rendelkezésre. A magról szaporított fafajok egy részénél főleg a fenyők esetében kiterjedt utódvizsgálatokat végeztek, amelyeket a megfelelő markerek azonosítására fel lehet használni. RAPD- és RFLP-típusú markerek kutatása előrehaladott pl. a Pinus, Eucalyptus és Populus nemzetségekben. Az USA délkeleti államaiban termesztett Pinus taeda esetében három generáció ellenőrzött beporzású utódnemzedékét használták fel RFLPmarkerek kimutatására (Neale és mtsai, 1994). A markerek azonosítását segítheti, hogy rendszertanilag távoli családok között szekvencia hasonlóságok mutathatók ki egyes bélyegek genetikai kontrollja és működése tekintetében, így pl. a patogénekkel és herbivórokkal szembeni reakciók esetében. Az alkalmazható módszerekről Davis és Lawrence (1994) ad áttekintést. 52

61 7. fejezet - 5. A különböző markerekkel kapott mintázatok kiértékelése A tartalékfehérje-mintázatok kiértékelése A gélelektroforézis után kapott mintázatok kiértékelését végezhetjük közvetlenül a gélről vagy fotójáról. Először megállapítjuk, hogy a gélnek melyek azok a részei, amelyek egyértelműen kiértékelhetők. Ezután ezekben a régiókban meghatározzuk a fehérjesávok relatív mobilitását és intenzitását is. A relatív mobilitás meghatározásához egy olyan referencia sávot választunk, amely általában a gél közepén található. Ennek a starttól mért távolságát tekintjük 50-nek, és ehhez viszonyítva számítjuk ki a többi sáv relatív mobilitását. A 25. ábrán bemutatott példán a referenciasáv migrációs távolsága a géllap tetejétől 150,0 mm. A gél tetejétől 222,0 mm-re lévő sáv relatív mobilitása (R m) tehát 25. ábra - A relatív mobilitás meghatározása referenciasáv figyelembevételével A sávok intenzitását denzitométerrel állapíthatjuk meg. Az egyes sávok görbe formájában jelennek meg a denzitogramon. Minél nagyobb intenzitású a sáv, annál nagyobb a görbe alatti terület. Vannak olyan szoftverprogramok, amelyek a denzitogram alapján összehasonlítják a vizsgált fajta kódolt tartalékfehérjemintázatát a világon fellelhető legjelentősebb fajtákéval és kiírják az azonosságot és/vagy a különbözőséget. Ha a tartalékfehérjék elválasztására kapilláris gélelektroforézist (CE) használtunk, akkor az elektroforegramokon a retenciós időnek megfelelően elváló csúcsokat sorrend szerint megszámozzuk, a legkisebb retenciós idejű csúcs kapja az 1. számot (26. ábra.). Ha azononosság és/vagy különbözőség megállapítása a célunk, akkor a meglévő és a hiányzó számozott csúcsok alapján a mintákat páronként összehasonlítjuk. A közös pontok összes száma adja az abszolút hasonlósági indexet (ASI), amelyből a relatív hasonlósági index (RSI) az alábbi képlettel számítható: ahol N=az összes detektált pont. 26. ábra - Lolium rigidum (a), Lolium multiflorum (b) és egy ismeretlen Lolium faj (c) tartalékfehérje mintázatai kapilláris elektroforézis (CE) után (Dinelli és Bonetti, 1992) 53

62 5. A különböző markerekkel kapott mintázatok kiértékelése Az RSI értéke között változik, és megadja, hogy két elektroforegram hasonlóságáért a fehérje alkotórészek hány százalékban felelősek. A 26. ábrán bemutatott Lolium rigidum, Lolium multiflorum és egy ismeretlen Lolium faj CE mintázata alapján számított RSI értékeket a 10. táblázat tartalmazza. 10. táblázat - Ismert és ismeretlen Lolium fajok RSI (%) értékei (DINELLI és BONETTI, 1992) Lolium rigidum Lolium multiflorum Lolium rigidum Lolium multiflorum 54,5 Ismeretlen Lolium faj 45,4 90,9 Az ismeretlen Lolium faj és a Lolium multiflorum összehasonlításából származó RSI-értékből (90,9%) arra lehet következtetni, hogy az ismeretlen minta valószínűleg a L. multiflorum fajhoz tartozik, de másik fajta vagy populáció Az izoenzim-mintázatok kiértékelése A géllapokon megfigyelhető izoenzim-mintázat lehet szimmetrikus és aszimmetrikus. Amennyiben a gyors és a lassú elektroforetikus mobilitású formákat kódoló allélek (F és S) egyenlő hányadban járulnak hozzá az enzimaktivitáshoz és az alegység-kombináció véletlen, akkor szimmetrikus a mintázat. Ez a heterozigótamintázat sávjainak az intenzitásából állapítható meg; monomer heterozigótáknál a sávok intenzitása 1:1, a dimereké 1:2:1, a trimereké 1:3:3:1, a tetramereké pedig 1:4:6:4:1 (4b ábra). Aszimmetrikus mintázat akkor látható a géllapokon, ha az egyik allél által kódolt polipeptid a teljes aktivitáshoz kevésbé járul hozzá, mint a másik. Ezt okozhatja eltérő szintézisráta, kevésbé stabil alegység vagy eltérő katalitikus tulajdonságok. Az eltérő szintézisráta szervspecifikus reguláció következménye is lehet. Az alkohol dehidrogenáz-1 gén alléljainak (Adh1-F és Adh1-S) kvantitatív és szervspecifikus szabályozása figyelhető meg kukoricában. Az elsődleges gyökérben és a mezokotilban az Adh1-F allél expressziója mintegy 54

63 5. A különböző markerekkel kapott mintázatok kiértékelése kétszerese az Adh1-S allélének. A scutellumban (pajzsocska) egyforma a két allélforma aktivitása. Tehát a kukorica elsődleges gyökerében és a mezokotilban az F- és az S-allélek által kódolt polipeptidek (alegységek) 2:1 arányban, a pajzsocskában pedig 1:1 arányban képződnek. Így a heterozigótákban a dimer enzim aktivitása 4:4:1, illetve 1:2:1. Aszimmetrikus mintázat esetén feltétlenül szükség van a heterozigóta sávmintázatok denzitometrálására és annak megállapítására, hogy a kapott sávintenzitások megegyeznek vagy megbízhatóan eltérnek az elméletileg várt arányoktól. Ezt κ 2 próbával ellenőrizzük. A 27. ábrán Adh1-FFFS triplex genotípusú heterozigóták sávintenzitásának denzitogramját mutatjuk be tetraploid kukorica scutellumában. Az Adh1-FFFS triplex heterozigótákra jellemző 9:6:1 sávintenzitás helyett 4:3:1, illetve 3:4:1 arányokat kaptunk, amely megbízhatóan eltért az elméletileg várttól (Hajós-Novák és mtsaii, 1994). Ezt feltehetően az okozta, hogy az egyik allélt kódoló polipeptid kevésbé járult hozzá az enzim teljes aktivitásához. 27. ábra - A sávok intenzitásának alakulása Adhl-FFFS triplex heterozigóta tetraploid kukorica pajzsocskájában (Hajós-Novák és H. Nagy, 1994) Mivel az izoenzim-mintázat nem csak sejt-, szövet- és szervspecifikus, hanem fejlődési állapottól is függ, ezért csak azonos fejlettségi állapotú egyedekről származó minták izoenzim mintázatát lehet összehasonlítani. Az izoenzim-aktivitásra festett géleken minden egyes horizontális zóna egy lókuszt képvisel. Ezek a lókuszok vagy polimorfok, vagy nem. Az egy lókuszon belüli alléleket az eltérő elektroforetikus mobilitású sávok jelzik, amelyek közül anód irányú vándorlás esetén a szeparálógél tetejéhez legközelebbi sáv a lassú (Slow=S), a legtávolabbi pedig a gyors (Fast=F) elektroforetikus mobilitású forma. Ez figyelhető meg az egy lókuszos kétalléles izoenzimek esetében. Ha három vagy négy allél van jelen egy zónán (lókuszon) belül, akkor azokat relatív mobilitásuk alapján 1-től kezdődően számozzuk (a leggyorsabb elektroforetikus mobilitású kapja az 1-es számot). A lókuszokat az ABC betűivel jelöljük. A 28. ábrán látható, hogy a Fenyőfű melletti erdeifenyő (Pinus sylvestris) populációban a leucin-aminopeptidáz (LAP) enzimnek két génje (A és B) két-két alléllel (A 1 és A 2, illetve B 1 és B 2) volt aktív a tűlevelekben. 28. ábra - Fenyőfűi erdeifenyő (Pinus sylvestris) populáció leucin-aminopeptidáz (LAP) mintázata. A LAP izoenzimnek két génje (A, B) két-két alléllel aktív a tűlevelekben (Földvári, 1989) 55

64 5. A különböző markerekkel kapott mintázatok kiértékelése A vizsgált 48 erdeifenyő közül 2 db A 1A 1 B 1B 1, 1 db. A 1A 2 B 1B 2 és 45 db A 2A 2 B 2B 2 genotípusú volt (11. táblázat). Polimorfizmus vizsgálatok során ezen adatokból a különböző LAP-allélek gyakorisága az alábbi módon számítható ki: A 1 allél gyakorisága: A 2 allél gyakorisága: p (A2) = 1 p (A1) = 1 0,052 = 0,948 B 1 allél gyakorisága: B 2 allél gyakorisága: P (B2) = 1 0,052 = 0, táblázat - A lehetséges LAP-izoenzim genotípusok száma és tényleges gyakorisága erdeifenyő (Pinus sylvestris) populációban két gén és lókuszonként két-két alléi esetében (FÖLDVÁRI, 1989) Lehetséges genotípusok B-lókusz

65 5. A különböző markerekkel kapott mintázatok kiértékelése A-lókusz ---- AiAiBiBi AiAiB 2B 2 AiAiBiB 2 Gyakoriság (db) B-lókusz A-lókusz AiA 2BiBi AiA 2B 2B 2 AiA 2BiB 2 Gyakoriság (db) B-lókusz A-lókusz A 2A 2BiBi A 2A 2B 2B 2 A 2A 2BiB 2 Gyakoriság (db) Az eredményekből tehát az állapítható meg, hogy a vizsgált Pinus sylvestris populáció a LAP-gén vonatkozásában nem nagy polimorfizmust mutat, mert a lehetséges 9 genotípus közül csak három jelent meg. A tanulmányozott egyedek 94%-a a négy allél közül az A 2-t és a B 2-t hordozza legnagyobb gyakorisággal. A sávok helyzetét a gélen az előzőekben ismertetett kódolás után mobilitásuk szerint kétféleképpen is jellemezhetjük: a. az ismeretlen sávnak a szeparáló gél tetejétől mért távolságát osztjuk a gél hosszával, vagy b. az ismeretlen sáv szeparáló gél tetejétől mért távolságát osztjuk a gél közepén lévő sáv szeparáló gél tetejétől mért távolságával és szorozzuk 50-nel (a gél közepén lévő sáv relatív mobilitásával). A távolságokat mm-ben adjuk meg. Ez különösen ajánlatos akkor, ha egy izoenzim génnek kettőnél több allélje van. De így tudjuk kimutatni és jellemezni a töltésváltozás következtében fellépő eltérő mobilitású, új elektroforetikus variánsokat is. Néha két vagy több enzimlókusz termékei elfedik egymást vagy együtt vándorolnak. Ha ez a citoplazmában, a kloroplasztiszban és a mitokondriumban is működő enzimeknél fordul elő, akkor vagy megváltoztatjuk az elválasztási körülményeket, vagy egyetlen sejtfrakcióból izoláljuk az enzimet. Ha az izoenzimek nem válnak jól szét a gélen, akkor a heterozigóta mintázat egyetlen széles sáv lesz a várt két vagy három külön sáv helyett. Nulla allél esetében a monomer és a dimer enzimek a homo- és a heterozigótákat nem különböztetik meg; trimerek és tetramerek esetében heterozigótáknak a vártnál kevesebb, de legalább kétsávos a mintázata Az RFLP-mintázatok kiértékelése Az autoradiogramokat vagy nem izotópos jelölés esetén a luminogramokat próba-enzim kombinációnként értékeljük. Egy sáv pár képviselheti egy lókusz két alternatív allélját, egyetlen allél redundáns komponenseit 57

66 5. A különböző markerekkel kapott mintázatok kiértékelése vagy két különböző (kapcsolt vagy nem kapcsolt) lókusz alléljait. A mintázatot számítógépbe visszük, digitalizáljuk, majd a sávokat binárisan kódoljuk; 1=meglévő sáv, 0=hiányzó sáv. Külön kódot adunk a hiányzó értékeknek. Sok lókusz és sok egyed vizsgálatakor számos hiba adódhat amikor a nyers autoradiogramokat vagy luminogramokat átfordítjuk elemzésre alkalmas számítógépes fájlokká. Ezt úgy lehet elkerülni, hogy ugyanazt a gélt ketten értékelik. A félreérthető fenotípusokat legjobb hiányzó értékként kódolni próbaenzim kombináció adataiból főkomponens analízist végzünk pl. a PROC PRINCOMP szoftverprogram (SAS) felhasználásával. A főkomponens analízist elvégezhetjük próba-enzim kombinációnként meghatározott genetikai hasonlóság (GS) értékekkel is. A genetikai hasonlóság kiszámítását Dice (1945) írta le, majd Nei (1972) alkalmazta először két beltenyésztett vonal közötti genetikai hasonlóság megállapítására. A genetikai hasonlóság kiszámítására az alábbi képletet használjuk: ahol i és j beltenyésztett vonalak, N ij = azonos sávok száma két vonal között. A GS-érték 0 és 1 között változhat. GS=0: a két vonalnak nincs közös RFLP-sávja, GS=1: a két vonal RFLPmintázata azonos. A GS-érték standard hibáját jackknife módszerrel lehet megállapítani. Az NT SYS-pc (Rohlf, 1992) szoftverprogram GS-értékek alapján végzi a főkomponens analízist. A vonalak, klónok, fajták, hibridek közötti genetikai távolság becslése GS-értékeken alapuló UPGMA cluster analízissel is elvégezhető és dendrogramon ábrázolható (29. ábra). 29. ábra - A GS-értékeken alapuló UPGMA cluster analízis eredményeinek dendrogramon történő ábrázolása 58

67 5. A különböző markerekkel kapott mintázatok kiértékelése Ezenkívül táblázat formájában általában megadjuk a monomorf és polimorf mintázatot eredményező enzim-klón kombinációkat, valamint az RFLP-mintázatok átlagos számát klón-enzim-kombinációnként. A következőkben egy RFLP-mintázat kiértékelését mutatjuk be saját kísérleteink alapján. Hat W117 S 18 tetraploid kukorica alvonal azonosságát és/vagy különbözőségét vizsgáltuk. A Hind III-UMC46 enzim-klón kombinációval kapott mintázatot számítógépbe vittük, majd a sávokat digitalizáltuk. Mivel relatív mobilitásukat nem határoztuk meg, ezért a sávokat 1-től kezdődően beszámoztuk, majd binárisan kódoltuk (30. ábra és 12. táblázat). 30. ábra - A Hindin-UMC46 enzim-klón kombináció digitalizált RFLP-mintázata Wl 17 (4N) S 18 alvonalakban (Hajós-Novák M., Dallmann G., Orosz L., nem közölt adatok) 12. táblázat - W117 S18 tetraploid kukorica alvonalak RFLP-mintázatának (Hind HI- UMC46 enzim-klón kombináció) bináris kódolása Alvonalak

68 5. A különböző markerekkel kapott mintázatok kiértékelése Sávok Összes sáv (db) Ezt követően az alvonalakat a közös sávok száma alapján páronként összehasonlítottuk, és az előbbiekben ismertetett képlet szerint minden vonalpár között genetikai hasonlósági értéket számítottunk. A 30. ábrán látható, hogy ezen enzim klón kombináció esetében az 1. és a 2. (GS = 0,66), valamint a 2. és a 3. alvonalak hasonlítanak legjobban egymásra (GS = 0,50). A többiek RFLP-mintázata pedig teljesen különbözik egymástól A RAPD-mintázatok kiértékelése A mintázat kiértékelésénél vegyük figyelembe, hogy csak azokat a fő sávokat érde-mes analizálni, amelyekben különbség van az egyedek között. Ha egy populáció genetikai összetételét tanulmányozzuk, akkor azok a RAPD-termékek adják a legtöbb információt, amelyek egynél több egyedben találhatók meg, de nem mindegyikben. Az egyedi sávok kevés információt adnak a genetikai rokonságra vonatkozóan, de a génintrogresszió indikátorai lehetnek. A kiértékelésben primerenként meghatározzuk a kapott fragmentumok hosszúságát. A 31. ábrán hét tetraploid kukorica-alvonal OPO12 primerrel (OPERON) létrehozott RAPDmintázatának a kiértékelését mutat-juk be. Célunk az alvonalak közötti azonosság és/vagy különbözőség megállapítása. A futtatás után kapott DNS-mintázatot képanalizálóba történő bevitel után automatikusan vagy vizuálisan a gélről készült fotóról értékeljük. Az értékelés alapja mind a két esetben az R f értékek meghatározása, amelyet primerenként végzünk. Vizuális értékelésnél először minden sáv közepére húzunk egy egyenest, majd az egyenes mentén megmérjük a DNS-marker első és utolsó jól látható sávja közötti távolságot (D of) mm-ben. Ezután pedig egyenként valamennyi sáv távolságát megmérjük az első jól látható marker sávétól (D od). Az Rf-értékeket a D od / D of-hányadosok adják. Ezeket binárisan kódoljuk (13. táblázat). 31. ábra - W117 S 22 autotetraploidkukorica-alvonalak RAPD-mintázata az OPO12 (5' CAGTGCTGTG3') 10 mérés random primerrel (Hajós-Novák és Dallmann, 1997) 60

69 5. A különböző markerekkel kapott mintázatok kiértékelése 13. táblázat - Wl 17 4x S22 kukorica-alvonalak OPO12 primerrel (5' CAGTGCTGTG 3') létrehozott RAPD-mintázata bináris mátrix formájában (HAJÓS-NOVÁK és DALLMAN, 1997) Alvonalak Rf (mm) Sáv (db.) A kiértékelés végén beltenyésztett vonalanként (egy oszlop=egy beltenyésztett vonal) a vizsgált primerekkel kapott bináris matrixokat függőleges oszlopban, üres sor kihagyása nélkül visszük be számítógépbe Microsoft Excel munkafüzetbe, és az adatokat csak szöveg fájlban mentjük el. Az így bevitt adatok lemezről a további kiértékeléshez számítógépbe beolvashatók. Ha genetikai azonosságot vagy különbözőséget vizsgálunk beltenyésztett vonalak vagy hibridek között, akkor ezeket az adatokat statisztikai algoritmusokkal értékeljük ki (UPGMA, Clark és Lanigan, 1993; PAUP, Swofford, 1995). Ezek speciálisan RAPD-adatok kiértékelésére kidolgozott statisztikai szoftvercsomagok, amelyek megrajzolják a dendrogramot is. Az általunk TREECON programmal elkészített dendrogram (32. ábra), amely 27 OPERON primerrel kapott 269 fragmentum alapján végezte el a kiértékelést, a hét tetraploid kukorica-alvonalat két alcsoportba sorolta. Az egyik alcsoportba a 21, a 22 és a 24 jelű alvonalak, a másikba pedig a 25, a 26 és a 27 jelű alvonalak tartoznak. Az alcsoportokon belül a 21 és a 22, illetve a 25 és a 27 alvonalak között legkisebb a genetikai távolság. A 28-as számmal jelzett alvonal pedig valamennyitől különbözik. 32. ábra - W117 4x S 22 kukorica-alvonalak RAPD adatokból (27 random primer, 269 fragmentum) UPGMA cluster analízissel számított genetikai távolsága (Hajós-Novák és Dallmann, 1997) 61

70 5. A különböző markerekkel kapott mintázatok kiértékelése 62

71 8. fejezet - 6. A PCR-reakció optimalizálása A DNS-amplifikációt három paraméterrel lehet jellemezni: specifikusság, hatékonyság és hűség. Ezeket a paramétereket a reakcióelegy egyes komponenseinek koncentrációja, egymáshoz való aránya, a reakció körülményei (a ciklusok hőmérséklete, ideje és száma) és a PCR-készülék megbízhatósága határozzák meg. A megfelelő mennyiségű és minőségű termék, valamint a reprodukálhatóság érdekében az amplifikációs paramétereket előkísérletben állapítjuk meg. Ha ezt nem tesszük meg, akkor a következők lehetségesek: nincs termék, kevés a termék, erős, nem specifikus a háttér, mutáció léphet fel a termékben A reakcióelegy komponenseinek optimalizálása Egy PCR-reakcióelegy több komponensből áll: MgCl2, dezoxi-nukleotid-trifoszfátok (dntp-k), primer(ek), DNS-Taq-polimeráz, templát-dns, 10-szeres koncentrációjú reakciópuffer, esetenként nem ionos detergens (pl. Tween 20 vagy Triton X-100) és ásványi olaj vagy paraffin. Ezek közül előkísérletben a templát, a primer, a dntp-k és a MgCl2 -koncentrációit kell megállapítani. A magnéziumkoncentráció befolyásolhatja a primer kapcsolódását, a primer dimerek keletkezését, a DNS-Taq-polimeráz aktivitását és a másolás pontosságát. A Taq-polimeráz működéséhez szabad magnéziumion jelenléte szükséges. A magnéziumionok aktivitását a primer, a templát-dns és a dntp-koncentráció is szabályozza. Ha ezek közül bármelyik feleslegben van jelen, akkor a magnéziumkationok hozzáférhetősége csökken és ez gátolhatja az amplifikációt. Növényi és állati DNS esetében csak viszonylag alacsony magnéziumkoncentráció (1,5 4 mm) mellett lehet megfelelő ujjlenyomatot kapni. Az 1,5 mm Mg-koncentráció általában megfelelő. A dezoxinukleotid-trifoszfátokat (dntp-k datp, dgtp, dttp, dctp) azonos koncentrációban adjuk. Optimális koncentrációt (0,02 0,2 mm) alkalmazva megfelelő a másolás pontossága, csökken a téves kapcsolódás és a téves lánchosszabbítás lehetősége. A primer összetétele, mérete és a cél DNS-sel való homológiája minden más tényezőnél jobban meghatározza a PCR-reakció sikerét vagy sikertelenségét. Ezen kívül a primer(ek) hossza és szekvenciája meghatározza a reakcióban kapott egyszerű vagy komplex mintázat jellegét is. A primerek általában nukleotid hosszúak, a random primerek 10 nukleotidból (10 nt vagy 10 mer) állnak. Fontos, hogy a primer(ek) G + C tartalma 50 60% legyen, és a primeren belül ne legyen palindrom szekvencia. A primer hosszát 5 nt-ig lehet csökkenteni (DAF), ekkor azonban számolni kell azzal, hogy az első ciklus után az amplifikációs termékeknek palindrom vége van, amely hajtű hurkot tud létrehozni, és ezzel gátolja bizonyos termékek amplifikációját. A primerhossz növelésével viszont több lesz a téves párosodás és így a nem várt amplifikációs termék is. Általában 8 nt hosszúságú primerek használatakor legmegfelelőbb a hatékonyság és a specificitás. A reakcióelegy optimális primerkoncentrációja 0,1 0,5 mm. Random primerek készletben vehetők meg pl. az OPERON-tól (USA). Allélspecifikus PCR (AS-PCR) vagy a PCR-termékek klónozása esetén az előzőekben ismertetett szempontok figyelembevételével, céljainknak megfelelően tervezzük a primerpárokat. Ekkor azonban a primerek olvadási hőmérsékletéről (Tm = melting temperature) sem szabad megfeledkezni. Ez primerhossztól függően 55 C vagy 63

72 6. A PCR-reakció optimalizálása ennél magasabb, és mindkét primer esetében közel azonos értékű. Az olvadási hőmérsékletet az alábbi képlettel határozzuk meg: Tm = 4 n (G + C) + 2 n (A + T) ahol az aktuális n = a G + C és az A + T nukleotidok számával. Primerek tervezésére ismertek számítógépes programok is, pl. OLIGO (National BioSciences), Primer Select (DNASTAR, Inc.). Ezek segítségével könnyebben meghatározható a primerek helyes Tm értéke, és elkerülhető a saját magukkal vagy másik primerrel kapcsolódó, illetve hurkot képező primerek tervezése. A DNS-Taq-polimeráz ajánlott koncentrációja 0,5 2 U (Unit = egység). Ha az optimálisnál magasabb az enzimkoncentráció, akkor az agaróz gélen erős a háttér, tehát nem specifikus az amplifikáció. Ha az optimálisnál alacsonyabb az enzimkoncentráció, akkor pedig kevés a termék, ezért a csíkok halványak. Mivel a Taq-polimeráznak nincs 3 5 irányú exonukleáz aktivitása, ezért a tévesen beépített bázisokat nem tudja lehasítani. A báziscsere-gyakoriság 1:9000, a kereteltolódási (frameshift) hiba pedig 1: A PCR-reakcióban templátként használhatunk kettősszálú DNS-t, RNS-t vagy cdns-t. Az izolált DNS-nek viszonylag tisztának kell lennie. Fontos, hogy EDTA-t, detergenst vagy fenolt még nyomokban sem tartalmazzon, mert ezek gátolják a DNS-polimeráz működését. Az egyéb komponensek közül a KCl elősegíti a primerkapcsolódást, de 50 mm-nál több gátolja az enzimaktivitást. A zselatin és a nem ionos detergensek (pl Tween 20) stabilizálják a polimeráz enzimet. Ásványiolajat vagy paraffinolajat egyrészt a párolgás megakadályozása céljából, másrészt pedig azért adunk a reakcióelegyhez, mert a legfontosabb komponenseket (primerek, DNS-polimeráz) közvetlenül a PCR-készülék bekapcsolása előtt pipettázzuk az olaj tetejére. Ezek csak a legelső lépésben, 94 C-on ( forró start ) keverednek össze a többi komponenssel. Így csökkenteni lehet a nemspecifikus termékek mennyiségét. A reakcióelegy összeállításakor egyes laboratóriumokban a primereket és a DNS Taq polimerázt, másokban pedig a puffert, a templátot és az enzimet mérik be utoljára. Az optimalizálás során a primer, a templát, az MgCl2 és a dntp-k koncentrációját egymástól független kísérletekben kellene vizsgálni. Mind a négy komponenst három szinten tanulmányozva ez 34 = 81 reakciót jelentene. Taguchi és Wu (1980) modelljével kilenc reakció elegendő az optimalizáláshoz. A reakcióelegy optimalizálása során az egyik legfontosabb változó a primer és a templát DNSkoncentrációjának az aránya. A DAF-módszer pl. tízszer több primert használ, mint a RAPD, és a primer - templát tömegarány is nagy, A DAF-reakcióelegy optimalizálásához a 14. táblázat ad segítséget. 14. táblázat - A DAF-reakcióelegy négy legfontosabb komponensének optimális intervalluma és ajánlott mennyisége (CAETANO-ANOLLÉS, 1996) Komponens Optimális intervallum Ajánlott koncentráció Primer 2-10 μm 3-6 μm MgCl mm 1,5 mm dntp-k μm 200 μm Polimeráz enzim 0,2-0,8 U/μl 0,3 U/μl A PCR-reakció körülményeinek optimalizálása A PCR-reakció körülményeinek optimalizálása során figyelembe kell venni: a templát DNS denaturációs hőmérsékletét, 64

73 6. A PCR-reakció optimalizálása a primerkapcsolódás hőmérsékletét, a ciklusszámot, a hőmérséklet hatását az enzimre és a nukleinsavakra, a kapcsolódás, a denaturálás és a lánchosszabbítás idejét. A templát DNS denaturálása általában C-on 5 másodperc alatt történik. A denaturációs idő csökkentése feltehetően azért növeli az amplifikált termékek mennyiségét, mert növeli a Taq-polimeráz felezési idejét. Túl magas hőmérsékleten vagy 5 másodpercnél hosszabb denaturációs idő esetén csökken az enzim aktivitása. A primerkapcsolódási hőmérséklet az amplifikált termék mennyiségét, számát és megoszlását befolyásolja. Kiszámítása az alábbi képlettel történik: T a OPT = 0,3T m primer + 0,7T m termék 14,9 ahol T a OPT = az optimális kapcsolódási hőmérséklet, ahol T m primer = a primer olvadási hőmérséklete, T m termék = a termék olvadási hőmérséklete. Az OLIGO (National BioSciences) program ezt az értéket a tervezendő primerre automatikusan kiszámítja. A kapcsolódási hőmérséklet az alkalmazott módszertől függően C. A hőmérséklet növelésével kevesebb lesz a téves lánchosszabbítás (misextension) a primer 3 végén és jobb lesz a specificitás is. Az alacsony kapcsolódási hőmérséklet ugyanakkor magas dntp-koncentrációval párosulva téves primerkapcsolódást (mispriming) és téves lánchosszabbítást okoz. Oktamer primerek esetében a kapcsolódási hőmérséklet 65 C is lehet. Caetano-Anollés és mtsaii (1992), valamint Caetano-Anollés (1994) különböző kapcsolódási hőmérsékletek (15, 45, 55, 60 és 65 C) hatását tanulmányozták a DNS amplifikációs mintázat alakulására pentamer primer (AGCTG) használatakor Escherichia coli Smith 92 törzsnél. Kísérletükben az amplifikációs termékek száma és mennyisége 55 C kapcsolódási hőmérsékletnél volt a maximális (33. ábra). 33. ábra - A kapcsolódási hőmérséklet hatása a DNS amplifíkációs ujjlenyomatra pentamer (AGCTG) primer használatakor a Smith 92 E. coli törzsnél Az A ábrán a PGE ujjlenyomat, a B ábrarészen pedig az IMAGE programmal történt kiértékelés eredménye látható. A rövid primerek a vártnál kevesebb amplifíkációs terméket hoznak létre és alacsony molekulatömegűek egyáltalán nem keletkeznek. (Caetano-Anollés és mtsai, 1992; Caetano-Anollés, 1994) A láncszintézis hőmérséklete hagyományosan 72 C. Ezen a hőmérsékleten a láncszintézis sebessége bázis/sec puffertől, ph-tól, sókoncentrációtól és DNS-templáttól függően. Egy 2 kb hosszú szál szintéziséhez 2 perces ciklusidő szükséges. 65

74 6. A PCR-reakció optimalizálása A ciklusszámot optimális körülmények között főleg a templát kezdő koncentrációja befolyásolja. A kettő összefüggését a 15. táblázat tartalmazza. 40 fölötti ciklusszám esetén erősen megnő a nemspecifikus termékek mennyisége. 15. táblázat - PCR ciklusok száma a templát DNS-molekulák számától függően (CAETANO-ANOLLÉS, 1996) Templát DNS-molekulák száma Ciklusok száma 3 l , I l A biokémiai és genetikai analízisek automatizálása; RAPD- és DAF-reakcióelegyek és PCR-körülmények Valamennyi PCR-alapú genetikai marker analíziséhez a templát DNS-t (genomiális DNS) kéthetes csíranövények friss vagy liofilizált leveleiből izoláljuk pl. Dellaporta (1983) módszere szerint az alábbi módon: Dörzscsészében, folyékony nitrogénben lefagyasztunk 2 g friss levelet és porfinomságúvá szétdörzsöljük. Áttesszük 50 ml-es centrifugacsőbe és rápipettázunk 15 ml extraháló puffert. Összerázzuk. 1 ml 20%-os SDS hozzáadása után összekeverjük és 10 percig 65 C-on inkubáljuk. Időnként összerázzuk. Rápipettázzunk 5 ml 5 M kálium-acetátot, összekeverjük és percre jégre tesszük. Ezután a mintákat 20 percig 4 C-on g fordulaton centrifugáljuk. A felülúszót gézen átszűrjük egy tiszta 50 ml-es centrifugacsőbe. Hozzáadunk 10 ml 2-propanolt, óvatosan billegtetve összekeverjük és 40 percre 20 C-ra tesszük. Ezután a mintákat g fordulatszám mellett 20 percig centrifugáljuk, a felülúszót leöntjük és 5 percig szárítjuk. A DNS-csapadékot 100 μl TE pufferben feloldjuk és 4 C-on tároljuk. Kapható olyan DNS-izoláló műszer, amely óránként 60 mintából izolál automatikusan DNS-t mintánként 5g mennyiségben. Ez több száz RAPD-analízishez elég. A PCR-reakcióelegyek összemérése is történhet manuálisan vagy robottal. A PCR-reakció végén a RAPDfragmentumokat 2%-os agaróz gélen választjuk szét 1xTBE tartálypufferben. Minden mintához 4 μl felvivő puffert adunk, a szélső és a középső zsebekbe pedig feltesszük a megfelelő molekulasúly markert (λhind III/EcoRI vagy ϕx). A gélt addig futtatjuk, amíg a brómfenolkék el nem éri a gél végét (150 V, 3 óra cm gél esetén). Utána percre 1g/1 ml etídium-bromidba tesszük, majd 10 percig desztillált vízben mossuk. UV-lámpa alatt megnézzük és lefényképezzük, számítógépbe visszük a további kiértékeléshez. A DNS-amplifikációs termékek méret szerinti szétválasztásának automatizálása problémát jelent. A gélen történő elválasztást kiküszöbölő DNS-szekvenáló készülékek és a CE nem tudják a kívánt eredményt elérni. A genetikai diagnosztika tehát automatizálható, és így évente analízist lehet elvégezni attól függően, hogy az egyednek hány lókuszát kell vizsgálni. Amikor DNS-amplifikáción alapuló genetikai markereket használunk beltenyész-tett vonalak, hibridek vagy fajták genetikai távolságának meghatározására, fajtaazonosításra vagy fajtatisztaság megállapítására, akkor az alábbi szempontokat vehetjük figyelembe: a DNS-t genotípusonként általában 10 g levélből izoláljuk, polimorf genomú fajok RAPD-analízise során kb. 100 db 10 meres random primert használunk, homogén genomúaknál at, de pl. 4 primerrel is meg lehetett különböztetni 14 brokkoli- és 12 karfiolfajtát, 66

75 6. A PCR-reakció optimalizálása SSR-módszernél 10 12, mikroszatellit régióhoz csatlakozó primerpár is elegendő a genetikai diverzitás megállapításához, AFLP-technika alkalmazásakor általában 15 primerpárt használnak a genetikai távolság becslésére, STMS-markerek használatakor elvileg lókusz is elegendő a közeli rokon genotípusok megkülönböztetésére, az STMS-markerek jobbak, mint a RAPD, az MP-PCR és az oligonukleotid ujjlenyomat, mert az allélek és a genotípusok egyértelműen meghatározhatók, markerként mindig olyan sávokat kell választani, amelyek ismételt futtatás esetén is könnyen detektálhatók, és elég intenzívek ahhoz, hogy meg lehessen állapítani jelenlétüket vagy hiányukat. A továbbiakban RAPD- és DAF-analízisekhez szükséges reakcióelegyeket és PCR-körülményeket adunk meg. RAPD-reakcióelegy (20 μl) desztillált víz 10x puffer 10x dntp-k Primer (20 m) 14,75 μl, 2,00 μl, 2,00 μl, 0,20 μl, Taq polimeráz 0,05 μl (0,25 U), DNS ( ng) 1,00 μl. A reakcióelegyet jégen mérjük össze! Háromkomponenses PCR-program: a) 1 ciklus 94 C 4 perc 36 C 1 perc 72 C 1,5 perc b) 45 ciklus 94 C 1 perc 36 C 1 perc 72 C 1,5 perc c) 72 C 5 perc 4 C-on tartjuk a futtatásig DAF-reakcióelegy (20 Φl) kétszer desztillált víz 10,2 μl, 67

76 6. A PCR-reakció optimalizálása dntp (2 mm mindegyik) magnézium (25 vagy 100 mm Mg Cl 2-ből) STF reakciópuffer DNS polimeráz enzim (10 U/μl AmpliTaq Stoffel fragment) templát DNS (1 10 ng/μl) 2 μl, 1,2 μl, 2 μl, 0,6 μl, 2 μl. PCR-körülmények: Ciklusszám = C 30 sec, 30 vagy 50 C 30 sec, 72 C 30 sec. Elektroforézis előtt a mintákat 5 10-szeresére hígítjuk. A minták térfogatának csak 3 6%-át használjuk fel az elektroforézishez, a többit 4 C-on tároljuk. A fragmentumokat kapilláris elektroforézissel is elválaszthatjuk. 68

77 9. fejezet - 7. Elválasztástechnika Az elektroforézis elve Egy oldatban lévő különböző molekulatömegű és töltésű (ionizált) részecskék elektródák (anód: +, katód: ) közötti elektromos erőtér hatására ellentétes töltésük szerint vándorolnak. Ezt elektroforézisnek nevezzük Ma széles körben alkalmazzák, elsősorban peptidek, fehérjék (izoenzimek és nem enzim jellegű fehérjék) és nukleinsavak elválasztására. Az elektroforetikus szétválasztás történhet szűrőpapíron, membránokon, valamint különböző géleken (pl. keményítő, poliakrilamid, agaróz). A keményítő és a poliakrilamid géleknél az elektroforézis során a töltés szerinti elválasztás mellett molekulaszűrő hatás is fellép. Az a gélszerkezet, amelynek átlagos pórusnagysága közel esik az elválasztandó ionok méretéhez, az ionokkal szemben szűrőként viselkedik. Az átlagos pórusnagyságot jelentősen meghaladó ionok nem vagy csak lassan, a kisebb ionok gyorsabban hatolnak át a gél pórusain Az izoenzimek elválasztása gélelektroforézissel Mivel az izoenzimek fehérjék, ezért elektroforézissel elválaszthatók és enzimspecifikus festéssel láthatóvá tehetők. Az UPOV a fajtaazonosság és/vagy -különbözőség vizsgálatát az izoenzimek felhasználásával egységes rendszer szerint keményítő gélen végzi. A keményítő gélnek az az előnye, hogy nem mérgező és egy vastag gél kiöntése után, annak több lapra vágásával egyszerre többféle izoenzimet lehet tanulmányozni. Nagyobb feloldóképessége miatt azonban egyre inkább a polakrialmid gélt használjuk, amelynek porózus szerkezete akrilamid (CH 2 = CH-CO-NH 2) polimerizációjával jön létre a keresztkötést biztosító N,N -metilén-biszakrilamid (CH 2 = CH-CO-NH-CH 2-NH-CO-CH = = CH 2) jelenlétében. A polimerizáció eredményeként színtelen, átlátszó, rugalmas, szilárd, forralásnak és fagyasztásnak ellenálló gél keletkezik. A gél sűrűségét, viszkozitását és pórusméretét az akrilamid és a bisz-akrilamid koncentráció határozza meg. A polimerizációhoz szabad gyökök képződése szükséges, amely termo- vagy fotokatalitikusan indítható meg. A poliakrilamid lapgél két részből áll: tömörítő gélből és elválasztó gélből. A tömörítő gél 3% akrilamidot tartalmaz, nagy pórusú, feladata a mintafehérjék koncentrálása. Molekulaszűrő hatást nem fejt ki, csak a minták diffúzióját korlátozza. Az elválasztó gél az elválasztandó izoenzim molekulatömegétől függően 4 20% akrilamidot tartalmaz, kis pórusú, itt történik a fehérjeminták szétválasztása. A poliakrilamid gél lehet homogén, azonos pórusméretű vagy pórus grádiens (PoroPAGE), amikor a gél koncentrációja a fehérjék vándorlásának irányába nő. Grádiens gélen a sávok élesebbek. A gél koncentrációját növényfajonként és izoenzimenként előkísérletben állapítjuk meg. Az izoenzimek elválasztásakor leggyakrabban lúgos diszkontinuus pufferrendszert alkalmazunk (Orstein, 1964 és Davies, 1964), amelyben az elektródpuffer TRIS-glicin (ph = 8,3), a tömörítő és a szeparáló gél pedig eltérő ph-jú Tris-HCl-puffert tartalmaz (ph = 6,7, illetve 8,9). Ebben a rendszerben a részecskék vándorlása a negatív pólustól a pozitív felé történik, vagyis anód irányú. Vannak azonban katód felé vándorló izoenzimek is, pl. a kukorica-észteráz-1 (EST-1), amelyek ebben a rendszerben nem vizsgálhatók. Növényi izoenzimeket friss, ritkán 80 C-ra lefagyasztott növényi sejtekből, szövetekből, szervekből (pl. kallusz, scutellum, endospermium, gyökér, sziklevél, csíranövény, levél, szár, bibe, portok, pollen stb.) lehet izolálni. Liofilizált anyagból nem lehet aktív izoenzimeket kivonni. Mivel az enzimaktivitást mind az izolálás, mind pedig az elektroforézis alatt is fenn kell tartani, ezért az extrakciót előhűtött dörzsmozsarakban, 4 C-os izoláló oldattal kell végezni. Az izolátumokat az izolálás befejezéséig jégen tartjuk, majd 4 C-on centrifugáljuk. A leggyakrabban használt izoláló 50 mm Tris-HCl-t (ph = 8,3), 5 mm dithiotreitolt és 20% (w/v) cukrot tartalmaz. A lecentrifugált izolátumok felülúszó részét az üveglapok közé kiöntött gélre, a tömörítő gélben kialakított mintahelyekre visszük fel. Az elektroforézist gyárilag vagy házilag készített készülékekben végezzük (34. ábra), amelyek a géllapok helyzetétől függően horizontálisak vagy vertikálisak. A futtatás 4 C hőmérsékleten történik. 34. ábra - A vertikális elektroforézis-készülék rajza 69

78 7. Elválasztástechnika Az izoenzimeket elektroforézis után in situ enzimspecifikus festéssel tesszük láthatóvá. A dehidrogenázokat a gélek tetrazolium sóban történő inkubálása után tudjuk lokalizálni. Inkubálás után a tetrazolium só terminális elektronakceptorként működik, redukálódik és csapadékot ad. Az NBT és az MTT fényérzékeny tetrazolium sók, ezért az inkubálást PMS jelenlétében, sötétben végezzük. A reakció eredményeképpen kék színű csapadék, formazán képződik (35. ábra). 35. ábra - A dehidrogenázok kimutatásának elve A hidrolázok színes fluoreszcens terméket adó homogén vagy fluorogén szubsztrátokkal azonosítók. A transzferázokat és izoemrázokat ezzel a módszerrel nem tudjuk tanulmányozni. Ezeknél a hívóoldatban segédenzimeket is alkalmazunk, amelyek az enzimterméket egy olyan termékké alakítják át, amellyel a hívóoldatban lévő dehidrogenázok reakcióba léphetnek. A segédenzimek alkalmazásakor színes termék csak a gél felszínén képződik. A foszfatázok és észterázok hidrolizálják az α- és β-naftil-származékokat, és ezáltal α- és β-naftolt szabadítanak fel. Ezen termékek azo festékkel történő egyesítése után színes csapadék keletkezik. A gélek festőoldatba helyezése után a sávok előhívása legtöbbször szobahőmérsékleten (25 30 C) vagy termosztátban 37 C-on, nagyon ritkán ennél magasabb hőmérsékleten történik. Az enzimspecifikus festéseket jobb sötétben végezni, mert pl. a tetrazolium sók fény hatására redukálódnak, a háttér sötét lesz, és így a sávok kevésbé láthatók. A Fast Blue BB diazonium só már kevés fény hatására is inaktiválódik. Ha a sávok elég élesek, akkor a reakciót általában 7%-os ecetsavban állítjuk le, peroxidáznál desztillált vízben, a 6-PGDH esetében pedig 50%-os ethanolban. A továbbiakban a 6%-os natív poliakrilamid gél készítéséhez szükséges oldatokat és néhány reakcióelegy összetételét adjuk meg. A szeparáló gél készítéséhez szükséges oldatok: 70

79 7. Elválasztástechnika Gélpuffer: 48 ml 1n HCl-ben felodunk 18,3 g Tris-HCl-t, majd desztillált vízzel 100 ml-re kiegészítjük. Akrilamid törzsoldat: 30 g akrilamidot és 0,8 g N,N-metilén-bis-akrilamidot 100 ml desztillált vízben feloldunk. Tarálypuffer: 6 g Tris-HCl-t és 28,8 g glikokollt 1000 ml desztillált vízben feloldunk (ph = 8,3). A tömörítő gél oldatai: 4. oldat: 48 ml 1n HCl-ben feloldunk 5,98 g Trisz-HCl-t, majd 100 ml-re kiegészítjük desztillált vízzel (ph = 6,7). 5. oldat: 10 g akrilamidot és 2,5 g N, N-metilén-bis-akrilamidot feloldunk 100 ml desztillált vízben. 6. oldat: 4 mg riboflavint 100 ml desztillált vízben oldunk fel (1 hétig áll el). 7. oldat: 10 g szacharózt feloldunk 25 ml desztillált vízben. Gélkészítés: A felhasználásig hűtve tárolt oldatokat gélöntés előtt perccel kivesszük a hűtőszekrényből. Először a szeparáló gélt készítjük el. Egy 8 cm 8 cm 0,2 cm-es laphoz 3,75 ml gélpuffert, 3 ml akrilamid törzsoldatot és 8,125 ml desztillált vizet mérünk össze. Ezután az oldatot vízsugár vákuumszivattyúval légtelenítjük, és adunk hozzá 270 μl 10%-os ammónium perszulfátot és 15 μl koncentrált TEMED-et. A géloldatot pipettával az összeragasztott lapok közé mérjük, és desztillált vizet rétegezünk a tetejére. Kb perc múlva, amikor gél megdermedt, leöntjük a tetejéről a desztillált vizet, és rápipettázzuk az alábbi összetételű tömörítő gélt: 1ml 4-es + 2 ml 5-ös + 1 ml 6-os + 4 ml 7-es oldat. A tömörítő gélbe belehelyezzük a fésűt (mintahelyek), majd UV lámpa alá tesszük, hogy a polimerizáció végbemenjen. Amikor opálos fényű a gél, akkor kivesszük a lámpa alól, és ha másnap használjuk fel, akkor hűtőszekrénybe tesszük. Felhasználás előtt a zsebekből kivesszük a fésűt és desztillált vízzel feltöltjük. Ezután a lapokat a készülékre erősítjük. A mintákból μl-t teszünk pipettával a zsebekbe. Minden mintához új pipettahegyet használunk. A futtatást 200 V feszültségnél és laponként 15 ma áramerősségnél végezzük. A futtatási idő 4 5 óra. Amikor a minták elérték a gél alját, a tápegységet kikapcsoljuk, a gélt kivesszük az üveglapok közül, majd az alábbi hívóoldatok valamelyikébe tesszük. 1) ALKOHOL DEHIDROGENÁZ (ADH) Alkohol: NAD + oxidoreduktáz (E.C ) Reakció: Alkohol + NAD + Aldehid vagy keton + NADH Festés: Tetrazolium rendszer Festőoldat: 0,1 M Tris- HCl 100 ml ph = 7,5 NAD + MTT PMS Ethanol 30 mg 20 mg 4 mg 6 ml Festés: enzimaktivitástól függően percig sötétben. Reakció leállítása 7%-os ecetsavban. 2) GLÜKÓZ-6-FOSZFÁT-DEHIDROGENÁZ (6-PGDH) D-glükóz-6- -oxidoreduktáz (E.C ) Reakció: D-Glükóz-6-P +NADP+ 6 PG + NADPH 71

80 7. Elválasztástechnika NADPH + MTT + PMS formazán (szín) + NADP Inkubálás sötétben 37 C-on 1 órát. Öblítés desztillált vízben, a reakció leállítása 50%-os etanolban. 3) GLUTAMÁT DEHIDROGENÁZ (GDH) Glükóz + NAD glükoniksav + NADH NADH + MTT + PMS Formazán (színes csapadék) + NAD Festőoldat: 0,1 M Tris- HCl 10 mm CaCl 2 0,2 ml 100 ml ph = 7,5 Nátriumglutamát NAD + NBT PMS 800 mg 30 mg 20 mg 4 mg Inkubálás sötétben 30 C-on 30 perctől 2 óráig. Öblítés desztillált vízben, fixálás 50%-os etanolban. 4) IZOCITRÁT DEHIDROGENÁZ (IDH) (E.C ) Threo-D s-izocitrát + NADP + 2-Oxoglutarát + CO 2 + NADPH Reakcióelegy: 0,1 M Tris-HCl 100 ml ph = 7,5 1 M MnCl 2 1 ml DL-Izocitrát (Na 3) NADP + MTT PMS 100 mg 15 mg 20 mg 4 mg Inkubálás sötétben 37 C-on 30 perctől 1 óráig. Öblítés desztillált vízben, majd fixálás 50%-os ethanolban. 5) almasav DEHIDROGENÁZ (MDH) L-Malát : NAD+ oxidoreduktáz (E.C ) l-malát + NAD Oxálacetát + NADH NADH + MTT + PMS NAD + Formazán (színes csapadék) 72

81 7. Elválasztástechnika Reakcióelegy: 0,1 M Tris-HCl 100 ml ph = 7,5 1M DL-Malát 1 ml ph = 7,5 NAD + MTT PMS 30 mg 20 mg 4 mg Festés sötétben 37 C-on, amíg a kék sávok meg nem jelennek. Öblítés desztillált vízben, fixálás 50%-os ethanolban. 6) SIKIMISAV DEHIDROGENÁZ (SKDH vagy SAD) (E.C ) Reakcióelegy: -Dehidrosikimát + NADPH 0,1 M Tris-HCl 100 ml ph = 7,5 Sikimisav NADP + MTT PMS 100 mg 15 mg 20 mg 4 mg A gélt 30 perctől 1 óráig festjük sötétben 37 C-on. Öblítés desztillált vízben majd fixálás 50%-os ethanolban. 7) ASZPARTÁT-AMINO TRANSZFERÁZ (GLUTAMÁT-OXÁLACETÁT TRANSZAMINÁZ = GOT) (E.C ) L-Aszpartát + 2-Oxoglutarát Oxálacetát + L-Glutamát Reakcióelegy: A) 0,1 M Tris-HCl 100 ml ph = 8,5 α-ketoglutarát Aszpartátsav B) Piridoxál-5- foszfát Fast Blue BB 100 mg 200 mg 10 mg 150 mg Az A oldatot legalább 15 perccel a felhasználás előtt elkészítjük, mert a savak nehezen oldódnak. Közvetlenül felhasználás előtt beleöntjük a B reagenseket tartalmazó lombikba. Az oldatnak sárga színűnek kell lenni. Ha sokáig tartjuk fényen, akkor a diazonium só inaktiválódik és az oldat barna színű lesz. Ekkor újat kell készíteni. 73

82 7. Elválasztástechnika A géleket sötétben, szobahőmérsékleten 1 2 óráig inkubáljuk, majd desztillált vízzel leöblítjük és 50%-os etanolban fixáljuk. 8) SAVAS FOSZFATÁZ (ACP) (E.C ) α-naftilfoszfát foszfát + α-naftol α-naftol + Fast garnet GB színes festék 50 mm Na-acetát 100 ml ph = 5,5 1 M Mg Cl 2 6H 2O 1 ml Fast Garnet GB só 1% β-naftilsav-foszfát (50% acetonban) 100 mg 3 ml A pufferben először a diazonium sót oldjuk fel, majd hozzáadjuk a naftilfoszfátot. Ekkor az oldatban apró részecskék jelennek meg. Ezeket úgy lehet eltüntetni, hogy közvetlenül a gélre történő öntés előtt mágneses keverőre tesszük az oldatot. Az inkubálás sötétben, 30 C-on 1 5 órát tart, amíg a lila vagy piros sávok meg nem jelennek. Ekkor leöntjük az oldatot, a gélt desztillált vízzel leöblítjük, majd 50%-os etanolban fixáljuk. Néhány perc múlva fényképezzük és/vagy számítógépbe visszük A tartalékfehérjék elválasztása gélelektroforézissel A tartalékfehérjéket SDS-PAGE vagy savas PAGE-módszerrel választjuk el. Az SDS gélelektroforézis alkalmazásakor az izolálóban, a gélrendszerben és a tartálypufferben is van ionos detergens (sodium-dodecylszulfát = SDS). A fehérje-sds-komplex az anód felé vándorol. Az SDS-poliakrilamid gél tömörítő és elválasztó gélből áll. A tömörítő gél nagypórusú mintahelyeire tesszük fel a denaturált fehérje-mintákat (általában 10 μl-t). Az elválasztó gél lehet átlagos pórusméretű vagy grádiens gél. Az elektroforézis után a sávokat hisztokémiai festéssel (Coomassie Blue R-250) vagy az ennél százszor érzékenyebb ezüstfestéssel tesszük láthatóvá. A tartalékfehérjék savas közegben (savas PAGE) történő elválasztásakor mind a gél, mind pedig a pufferek savas kémhatásúak. A futtatás pedig a pozitív pólustól a negatív irányába történik. A savas PAGE-t búzagliadinok elválasztására az alábbiak szerint végezzük: A búzaszemet dörzsmozsárban eldörzsöljük, majd kisméretű szitán átszitáljuk. A nyers lisztet eppendorfba tesszük és 200 μl 70%-os etanolt töltünk rá. Alaposan összekeverjük és egy éjszakán át állni hagyjuk. Felkeverés után centrifugáljuk (3500 ford/perc). A felülúszót új eppendorfba tesszük, majd 1:1 arányban jelzőfestéket tartalmazó oldatot teszünk hozzá. Mintafelvivő oldat: 75 μl tartálypuffer, 25 μl glicerin, 0,15 mg brómfenolkék. A jelzőfestéket is tartalmazó oldatból 20 μt-t viszünk fel a zsebekbe. Savas PAGE-géloldatok. Akrilamid törzsoldat: 15 g akrilamidot, 0,75 g N,N-metilén-bis-akrilamidot és 0,2 g aszkorbinsavat 70 ml desztillált vízben feloldunk, majd 5 ml 0,1%-os FeSO 4 oldatot adunk hozzá, és desztillált vízzel 100 ml-re kiegészítjük. Gélpuffer: 2,56 ml ecetsavat desztillált vízzel 90 ml-re higítunk, majd az oldat ph-értékét 3,1-re állítjuk be glikokollal, és végül 100 ml-re egészítjük ki desztillált vízzel. Katalizátor oldat: 1,4 g ammónium-perszulfátot kb. 60 ml desztillált vízben feloldunk, ph-értékét glikokollal 3,1-re állítjuk be, majd a térfogatát 100 ml-re egészítjük ki. 74

83 7. Elválasztástechnika Tartálypuffer: 2500 ml desztillált vízben feloldunk 30 g glikokollt, majd ecetsavval az oldat ph értékét 3,1-re állítjuk be. Végül desztillált vízzel 3000 ml-re egészítjük ki. Coomassie Brillant Blue G-250 színezőoldat: Szilárd Coomassie Blue G-250 színezékből desztillált vízben oldva 1%-os oldatot készítünk. Ebből 1 részt 19 rész 12,5%-os triklórecetsav oldattal keverve kapjuk a színezőoldatot. Ha Coomassie Blue R-250-et használunk, akkor a színezéket etanolban oldva készítjük el az 1%-os oldatot. Az elegyítési arány pedig 1:25. Szükség esetén a színező oldatot elkészítése után 20 perccel szűrni kell. Gélkészítés. A felhasználásig hűtve tárolt akrilamid törzsoldatból és a gél-pufferoldatból 1:1 arányban elegyítjük a szükséges mennyiséget. Ezután az oldatot vízsugár vákuumszivattyúval légmentesítjük, majd 1,7 ml katalizátoroldatot adunk hozzá (120 ml géloldat esetén). A folyadékot a lapok közé öntjük és éjszakára a hűtőszekrénybe tesszük polimerizálni. A minták futtatása. A polimerizálódott gélt a készülékbe helyezzük, figyelembe véve, hogy savas rendszerben a vándorlás a negatív pólus (katód) felé történik. A minta felvitele előtt a géllapot 30 percig 100 V egyenfeszültséggel előfuttatjuk. A feszültségmentesítés után minden mintából 20 μl-t viszünk fel a mintatartó helyekre, majd 20 percre 6 ma egyenáramot kapcsolunk a készülékre. Ezután 400 V feszültség alá helyezzük a rendszert (40 50 ma). A futási idő 400 V-on 5 6 óra. A gélek festése elektroforézis után. Az elektroforézis befejezése után a gélt néhány percre 12,5%-os triklórecetsav oldatba tesszük. Ennek leöntése után pedig a géleket órára Coomassie Blue G festőoldatba, majd 2 3 órára desztillált vízbe helyezzük. Végül magát a gélt vagy fotóját beszkenneljük és számítógéppel kiértékeljük A PhastSystem elektroforézis rendszer alkalmazása DNS-szintű polimorfizmus azonosítására A PhastSystem (Pharmacia) rendszer egy olyan gélelektroforetikus készülék, amelyben a mintafelvitel, az elválasztás és a festés is automatikusan, egy készülékben történik. A készülék két részből áll: az egyik az elválasztó és szabályozó egység, amelyben i. beépített, programozható tápegység, ii. a Peltier elemmel termosztált horizontális elválasztó lap két gél futtatására, iii. az elektródok, valamint iv. a mintafelvivő található. A másik az előhívó egység, amely fűthető zárt kamra, ahol a festés és a háttér színtelenítése történik. A készülék egyaránt felhasználható fehérjék és DNS elválasztására, DNS-markerek vizsgálatára. Attól függően, hogy milyen területen használjuk ezt a módszert, ki kell választanunk a megfelelő elválasztó rendszert. Ez a gélösszetétel, az alkalmazott pufferrendszer és az elektroforetikus futtatás körülményeinek optimalizálását jelenti. A gélek mérete mindössze 5x4 cm, vastagságuk 0,5 mm, és azok laboratóriumban elkészíthetők. Egyes típusok gyári kiszerelésben a kereskedelmi forgalomban is beszerezhetők. Egy-egy gélre 6 12 minta vihető fel. A PhastSystem rendszert DNS-analízisre eddig az alábbi területeken használták: pontmutáció kimutatására PCR-SSCP-analízissel, mikroszatellita-analízisre, RFLP-vel történő molekuláris taxonómiára. A PhastSystem rendszer előnyei: 75

84 7. Elválasztástechnika radioaktív izotópok helyett ezüstfestéssel oldja meg a DNS (vagy fehérje) kimutatását, rendkívül érzékeny és éles elválasztást tesz lehetővé, van olyan pufferrendszerünk, amelyikben már egyetlen bázispárnyi hosszkülönbséget is ki tudunk mutatni, 200 bp körüli hossztartományban, anyagigénye hallatlanul kicsi (pl. egyetlen nematodából, egyetlen pihetollból kifogástalan RFLP-mintázat nyerhető), kezelése egyszerű, gyorsasága rendkívül nagyszámú minta elemzését teszi lehetővé (az elektroforézis csak mintegy 20 percet igényel) Egy illusztráció a PhastSystem alkalmazására entomopatogén (rovarpatogén) nematódafajok molekuláris taxonómiai elemzéséből merítve Az entomopatogén nematódák, különösen az Heterorhabditis és a Steinernema fajhoz tartozók, fontos szerepet játszanak a mezőgazdaságban. Ezek a fajok rovarok parazitái. Dauer lárváik a rovarok testébe jutva, ott elszaporodnak és felfalják a gazdarovart. Genetikai rendszerük laboratóriumi modellje a Caenorhabditis elegans fonalféreg. A rovarpatogén nematódák a környezetbarát biológiai növényvédelem fontos eszközeivé válhatnak. A nematóda rokonsági kör ugyanakkor a speciáció, a faj kialakulása, az evolúció jobb megértéséhez is hozzájárulhat. A DNS-molekulákban kimutatott molekuláris változások lenyomatai a múlt történéseinek. Az ilyen típusú vizsgálatokhoz a genom előnyös terepe a riboszóma RNS-gén (rrns-gén). Az előny két körülmény szerencsés összejátszásából adódik. Egyrészt az rrns-gén 18S és 26S RNS darabját kódoló exonok rendkívül konzervatívak, szekvenciájuk megőrződött az evolúció során. Ennél fogva a PCR amplifikáláshoz szükséges oligonukleotid-primerek a legkülönbözőbb fajok DNS-én használhatók. Másrészt a 18S és 26S exonok egy intront fognak közre, amelyre nem nehezedik szelekciós nyomás. Többé-kevésbé káros következmények nélkül léphetnek fel és őrződhetnek meg mutációk ebben a szekvenciában. Az intron régió tehát teret ad a DNS-polimorfizmusok keletkezésének és fennmaradásának. A PhastSystem rendszer óriási előnye más gélelektroforetikus technikákkal szemben ebben a kísérletsorozatban is jól látható. Az RFLP-analízishez szükséges nanogramm mennyiségű DNS lehetővé teszi, hogy egyedi nematódákból származó genomiális DNS PCR-rel amplifikált régióját használjuk fel különböző restrikciós enzimes emésztéshez, és az így kapott mintázatokat hasonlíthatjuk össze. A 36. ábra két entomopatogén nematódafaj RFLP-mintázatát mutatja be. 36. ábra - Két entomopatogén nematóda faj RFLP mintázata Egyetlen Heterorhabditis (1-4) és Steinernema (5-8) nematóda példány genomiális DNS (rrns gén 18S és 26S exonok közötti intron régió) PCR amplifikált régiójának elektroforetikus képe különböző restrikciós enzimekkel (1,5 Alu I; 2,6 Dde I; 3,7 Hinf I és 4,8 Rsa I) történő emésztés után. 76

85 7. Elválasztástechnika DNS-fragmentumok elválasztása RFLP-analízishez PhastSystemmel A gél, a katolit és az anolit összetétele: Gélösszetétel: 7,5%T5% C(Bis) elválasztó gél, 5%T3% C(Bis) stacking gél, a puffer mindkét gélben 0,112M Tris/0,112M acetát, ph= 6,4. Katolit anolit: és 0,2M Tris, 0,2M tricin, 0,55% SDS, 2,8% Isogel (FMC Cat. No.50202) agaróz Gélkészítés PhastSystem RFLP-analízishez A gélt GelBond-PAG (FMC Cat. No ) lapra öntjük, UltraMould (Pharmacia Cat. No ) gélöntő készülékben a következő módon: 77

86 7. Elválasztástechnika 5 ml elválasztó gél készítése: 40% T 5% C (Bis) törzsoldat 0,94 ml 10 Tris/acetát puffer 0,50 ml desztillált víz légtelenítés után: 10% ammónium-perszulfát TEMED 3,56 ml 25 μl 3 μl 5 ml stacking gél készítése: 40% T 3% C (Bis) törzsoldat 0,62 ml 10 Tris/acetát puffer 0,50 ml desztillált víz légtelenítés után: 10% ammónium-perszulfát TEMED 3,88 ml 25 μl 3 μl 5 ml elválasztó gél oldatot pipettázunk a kazettába, szobahőmérsékleten polimerizáljuk levegő kizárásával legalább két órán keresztül, majd 5 ml stacking gél oldatot polimerizálunk hasonló körülmények között, végül ismét 5 ml elválasztó gélt öntünk a kazettába és az egész rendszert egy éjszakán át hagyjuk gélesedni. Másnap az üveglapok eltávolítása után felvágjuk a gélt a stacking gél közepén hosszában, utána pedig mindegyik részt tovább vágjuk 5 részre. Így 10 db ,5 mm méretű gélt kapunk. Az elektroforézist 400 V állandó feszültség mellett végezzük 45 Vh-n (volt óra) keresztül. Ennek ideje kb. 20 perc 0,3 μl megfelelő restrikciós enzimmel emésztett minta esetében. A DNS-fragmenteket a gélben ezüstfestéssel tesszük láthatóvá (kb. 40 min). Összehasonlításként standard DNS-létrát használunk (Molecular Weight Marker V, Boehringer, Cat.No ) Nagynyomású vagy nagy teljesítményű folyadékkromatográfia Mind analitikai, mind pedig preparatív célokra egyre elterjedtebben alkalmazzák az oszlopkromatográfiának a kromatográfiás hordozó szemcse méretének és alakjának célszerű beállításával, az oldószerrendszert továbbító szivattyúk nyomásteljesítményének és a detektálás érzékenységének növelésével kifejlesztett nagynyomású vagy nagy teljesítményű kromatográfiának (HPLC, azaz High Pressure vagy Performance Liquid Chromatography) nevezett változatát. Bár a HPLC-technikát elsősorban kis molekulatömegű komponensek elválasztására, azonosítására, illetve preparálására dolgozták ki, ma már elterjedten alkalmazzák makromolekulák analízisére, izolálására, pl. fehérje és DNS vizsgálatára, jellemzésére is. 78

87 7. Elválasztástechnika A nagynyomású kromatográfia módszerében jelentős fejlődést hozott az ún. fordított fázisú kromatográfia. Ennél a megoldásnál a poláros adszorbensből (pl. szilikagél) készített szemcse felületét meghatározott hosszúságú (legalább 5 szénatomos, legfeljebb általában 18 szénatomnyi), apoláros oldallánc erdővel ültetik be. Az adszorbens felülete így módosul, a szilikagél eredeti, poláros karaktere már nem érvényesül, helyette az oldalláncok apoláros tulajdonságai dominálnak. A fordított fázisú kromatográfiánál a leggyakrabban használt eluens általában az acetonitril, trifluor-ecetsav, metanol és víz különféle arányú elegye. A nagynyomású rendszerek sikerrel alkalmazhatók a különféle komponensek méretfüggő elválasztására is: a szabályozott belső pórusátmérőjű, kis szemcseméretű szférikus gélekre alapozott nagynyomású gélkromatográfia ma már a fehérjék elválasztásának általános módszere. Néhány jellegzetes HPLC-hordozó felsorolását az 16. táblázat tartalmazza. 16. táblázat - Néhány jellegzetes HPLC-média Kromatográfia típusa Fordított fázisú kromatográfia Gélkromatográfia Ioncserélő kromatográfia Kereskedelmi név NucleosilCIS LiChrospher C8 Ultrasphere C8 SynChropak RP-P Vydac Superose 12 TSKSW2000 Fractogel TSK Mono Q Mono S DEAE Si500 CM Si300 Oldallánc, funkciós csoport, illetve alapmátrix n-oktadecil n-oktil n-oktil n-oktadecil n-tetril agaróz szilika vinil polimer kvaterner ammónium bázis szulfoetil dietil-aminoetil karboxi-metil A nagynyomású folyadékkromatográfiás rendszer elemei A nagynyomású folyadékkromatográfiás rendszer felépítése megfelel a hagyományos kromatográfiás rendszernek. Lényeges különbség az, hogy az egyes moduláris elemeknek a magas nyomás és a gyors elúció miatt különleges követelményeknek kell megfelelniük. Az elúció módja többféle lehet. A legegyszerűbb megoldás az izokratikus elúció, melynél a teljes kromatográfiás elválasztás során ugyanazt az oldószert használják. Komplex rendszerek elválasztására, ioncserélő kromatográfiánál már egyetlen oldószer rendszerint nem elegendő: legalább két eluenst (37. ábra, E1 79

88 7. Elválasztástechnika és E2) kell alkalmaznunk úgy, hogy az elúció során a két komponens arányát az elválasztás céljának megfelelően, a P1 és P2 pumpák számítógépes vezérlésével meghatározott program szerint változtatjuk (gradiens elúció). Változtatható pl. az oszlopra kerülő oldószer ionerőssége, ph-ja vagy polaritása. Az oldószer aktuális paramétereit két vagy esetleg több oldószer keverésével állítják be. 37. ábra - A nagynyomású kromatográfiás rendszer felépítése El és E2: eluensek, Pl és P2: szivattyúk, K: keverő, M: mintaadagoló, O: oszlop, D: detektor. A K keverő funkciója az, hogy a viszonylag nagy sebességgel beáramló két fizikai tulajdonságában sokszor eltérő tulajdonságú, pl. más fajsúlyú eluenst homogenizálja és az oszlopra már homogén oldószer kerüljön. Az M mintaadagoló változtatható térfogatú, μliter nagyságrendű minták adagolását oldja meg. Az O oszlop a nyomásnak és oldószereknek megfelelően ellenálló rozsdamentes acél, üveg vagy műanyag alapú. A kromatográfiás rendszer fontos eleme a detektor (D). A vizsgált jel az esetek zömében optikai, sok esetben a törésmutatót vagy az igen érzékeny fluoreszcenciát méri. Az átfolyó küvetta térfogata μliter nagyságrendű, így a frakcionálás során elkülönülő komponensek keveredése minimális. Az optikai úthossz általában 10 mm. A fényelnyelést mérő detektorok kiválasztásánál döntő szempont a hullámhossz. Amennyiben fehérje vagy nukleinsavak elválasztása a feladat, a szűrővel működő, 280 nm, illetve 254 nm hullámhosszúságú fényt érzékelő detektorokra van szükség. De nagyobb érzékenység érhető el, ha a detektálást 210 nm körüli tartományban végezzük, mert ennél a hullámhossznál a kémiai kötések jelentős része erős optikai elnyelést mutat. Mivel azonban 210 nm körül az oldószerek fényelnyelése is gyorsan növekszik, ezért fontos a hullámhossz megválasztása előtt az oldószer spektrumát megvizsgálni. A korszerű pásztázó (scanning) detektorok hasonlóan az ún. diódasoros detektorokhoz a küvettán átfolyó eluens spektrumát is meghatározzák. A kromatográfiás értékelésnél fontos a jelfeldolgozás, amit a korszerű készülékekben számítógép vezérel. A megjelenített jellemzők számát, pontosságát és a származtatott adatok számát a gyártó által szállított szoftver határolja be. 80

89 7. Elválasztástechnika A nagynyomású preparatív folyadékkromatográfiában különös jelentősége van a frakciók gyűjtésének. A hagyományos kromatográfiában alkalmazottaktól a preparatív HPLC-s frakciószedők abban térnek el, hogy a gyűjtendő frakció kis térfogata miatt ( μl) mikrokémcsöveket használnak, a gyors elúció miatt pedig a beépített automatika az oszlopot elzárja arra az időre, míg új kémcső kerül a kifolyóvég alá A HPLC-technika előnyei és hátrányai Előnyök Az elválasztás a klasszikus oszlopkromatográfiához képest rendkívül gyors. Míg pl. a klasszikus ioncserélő kromatográfiánál az elúciós sebesség 6 20 ml/óra, a nagynyomású rendszereknél ez 1 2 ml/perc, ami az analízis idejét legalább tizedére csökkenti. Egy fehérjekeverék ioncserés elválasztása HPLC-vel átlag perc alatt elvégezhető. A HPLC-technikának igen jó a felbontóképessége. Ez elsősorban a finom szemcseméret miatt megnövekedett fajlagos felületnek köszönhető. A korszerű fehérje-biokémia vizsgálati objektumai egyre inkább az élő szervezetben igen kis koncentrációban jelenlevő fehérjék és enzimek. Ezek előállítása a hagyományos fehérjepreparálási módszerek alkalmazásával kilátástalan volt. A HPLC-technika nagy érzékenységével és hatékonyságával ezen a fronton is áttörést hozott, lehetővé téve az alacsony koncentrációban előforduló fehérjék, illetve fragmentumai preparálását és analízisét. Hátrányok A HPLC-rendszerek mint általában minden magas fokra fejlesztett technika a környezeti hatásokra fokozottan érzékenyek és a hibák zömének kijavítása specialistát igényel. A finom szemcseméret miatt nagy nyomást és emiatt nagyteljesítményű, precízen vezérelt, állandó teljesítményű, pulzálásmentes szivattyúkat kell alkalmazni. Az alkalmazott oszlopokba speciális berendezésekkel lehet az álló fázist betölteni, ezért a klasszikus kromatográfia töltsd magad költségkímélő gyakorlatával nem vagy csak speciális feltételek mellett lehet élni. A felhasználó így a kereskedelemben kapható, költséges oszlopokra van utalva, amelyek mindamellett csak korlátozott ideig (kb alkalommal) használhatók. A HPLC további gondja, hogy az oldószernek igen jó minőségűnek kell lennie, mivel egyrészt az oszloptöltetek érzékenyek a szennyeződésre, másrészt a szennyeződés az oldószer spektrális tulajdonságait ronthatja. A nagynyomású rendszernél gyakrabban kerülünk szembe az oszlopeltömődés problémájával, mivel az elválasztandó keverék egyes komponenseinek instabilitása kicsapódáshoz vezethet, az oszlopon keletkező csapadék pedig sokkal nehezebben távolítható el, mint a hagyományos kromatográfia alkalmazásánál. Utóbbi problémák azonban ún. előtét (guard) oszlopokkal megelőzhetők és ezáltal a kromatografáló oszlopok élettartamát is meg lehet hosszabbítani. Az előnytelenségek természetesen viszonylagosak, elsősorban a megemelkedő alkalmazási költségekben jelentkeznek, ezért a HPLC betűszóban a P betűt sok szakember price -nak értelmezi (Kalász, 1998) Néhány alkalmazás A HPLC-technikát, annak különböző megoldásait (adszorpciós kromatográfia, fordított fázisú kromatográfia, ioncserélő kromatográfia, gélkromatográfia) mind a fehérjék és lebontási termékeik, mind a nukleinsavak és lebontási termékeik preparálásánál és analízisénél alkalmazták (Mant és Hodges, 1991; Lough és Wainer, 1996; Janson és Ryder, 1989; Henschen és mtsai, 1985). A nagynyomású folyadékkromatográfiás elemzés a gabonafélék értékét meghatározó fehérjék azonosításánál is helyt kapott, különös tekintettel a nemesítésre. A fordított fázisú nagynyomású kromatográfiát Bietz (1983) alkalmazta először a gabonafehérjék jellemzésére és elválasztására. Ismeretes, hogy a gabonafehérjék rosszul oldódnak és hajlamosak a polimerizációra. SynChropak RP-P (C-18 oldalláncú) oszlopon acetonitril-trifluorecetsav gradiens alkalmazásával az alacsony molekulatömegű gliadinfrakció, az ω-gliadinok és az 81

90 7. Elválasztástechnika etilalkoholban oldható, redukált glutenin-alegységek elválaszthatók. A búzagliadinok elválasztását HPLC-vel Hübner és Bietz (1985) írta le. Bietz és Hübner (1992) a gluténfrakció kromatográfiás képének számítógépes analízisével jó közelítéssel tudta minősíteni a búza sütőipari minőségét. A gabonafehérjék nagynyomású folyadékkromatográfiás analízisével és alkalmazásával a gabonaminősítésben Örsi és Békés (1986), Sharobeem-samy és mtsai (1985) foglalkoztak, Örsi és Lásztity (1993) pedig magyarországi rozs- és gabonafélék fehérjéinek összehasonlítását végezte nagynyomású folyadékkromatográfiával. A különböző búzafajták fehérjéinek kromatográfiás képét összehasonlítva (38. ábra) az egyes frakciók elúciós helyzete és csúcsmagasságban kifejezhető mennyisége értékes adalékot szolgáltat a gabonanemesítőknek, alkalmas a fajták genetikai tisztaságának vizsgálatára (Kick és mtsai, 1992). Két fajta közti különbséget mutatott ki nagynyomású ioncserélő kromatográfia segítségével Batey (1983) is. 38. ábra - Két búzafajta gliadin frakciójának kromatográfiás képe Eagle (a) és Condor (b) búzafajták gliadin frakciójának elválasztása a gyenge anioncserélő MonoQ HR5/5 oszlopon. Eluens 10 mmol/1 CAPS, ph 10,4-10 mmol/1 CAPS + 0,4 mol/1 nátrium acetát. Gradiens 0%-100% B, 20 perc alatt. (Kick és mtsai, 1992) A nagynyomású folyadékkromatográfia jelentős eszköz a biotechnológiai kutatásokban. Alkalmazható pl. DNSfragmentumok analízisére, és ezzel a módszerrel sikerült igazolni transzformált élesztőben az α-gliadin megjelenését (Blechl és mtsai, 1992, 39. ábra). 39. ábra - Élesztőben szintetizált a-gliadin kimutatása nagynyomású folyadékkromatográfiával Az élesztőből izolált és Sephadex LH-20 oszlopon előzetesen tisztított fehérjefrakciót fordítottfázisú kromatográfiával, Vydac C-4 oszlopon kromatografálták. Gradienshez használt A-oldat: 0,1% TFA vízben, B-oldat: acetonitril-propanol 3:1, TFAO,1%. Elució 5 ml A-, majd 65%-ig lineárisan emelkedőén B-oldattal (5 perc-85 perc). (Blechl és mtsai, 1992) 82

91 7. Elválasztástechnika A kapilláris elektroforézis (CE) elve, alkalmazása Az elektroforézises technika CE irányú fejlődését a nagy felbontóképességű, automatizálható és megbízható mennyiségi elemzést szolgáltató módszerek iránt fellépő sürgető igény ösztönözte. Az egyik ilyen igény az Amerikai Egyesült Államokban beindított Human Genome Project (az emberi géntérkép feltárását célzó nagyszabású program), amely nagyfelbontású, gyors analitikai módszereket kíván a kromoszómatérképezés, a szekvenciakutatás, a hibridizációs és a mutációs analízis területén. Lényege: a minta összetevőinek (ionok, neutrális molekulák, makromolekulák) nagy (kv nagyságrendű) feszültséggel végzett elektroforetikus elválasztása kvarc kapillárisban. A kapilláris lehet belülről filmréteggel bevont, géllel, micellákkal vagy különböző ph-jú pufferrel töltött. Az elválasztás gyors (gyakran rövidebb, ritkán hosszabb, mint 20 perc), a felbontóképesség nagy (a kapillárisfal belső részénél kialakuló, ún. elektroozmotikus áramlás mindkettőt segíti), a mintaigény kicsi (általában 10 20μl) és a CE-készülék tömegspektrométerhez is csatlakoztatható. Az elválasztott és a kapillárist elhagyó komponensek detektorral (pl. UV, vezetőképességi) jeleníthetők meg. A CE rendszer működési paraméterei programozhatók, a folyamat vezérlése és az adatgyűjtés számítógéppel végezhető A kapilláris elektroforézis elválasztási módjai A hagyományos és a kapilláris elektroforézisben az elválasztás elve azonos. A kapilláris elektroforézisben a következő elválasztási módok terjedtek el: zonális elektroforézis, gélelektroforézis, izoelektromos fókuszálás, izotachoforézis, micelláris elektroforetikus kromatográfia. 83

92 7. Elválasztástechnika Zonális elektroforézis A zonális elektroforézis a CE legegyszerűbb módja és az egyik leggyakrabban alkalmazott elválasztási technika. A zonális elektroforézis során a mintát kis térfogatban injektáljuk a kapilláris egyik végébe. A minta komponensei az alkalmazott erőtér hatására eltérő sebességgel mozognak és az elektroforézis előrehaladtával sávokra különülnek el. Izotachoforézis (displacement elektroforézis) Az izotachoforézisben a mintakomponenseket egy vezető (legnagyobb elektroforetikus mobilitású iont tartalmazó leading ) és egy záró (legkisebb elektroforetikus mobilitású iont tartalmazó terminating ) zóna közé szorítják be úgy, hogy az elektroforézis során a komponensek elektroforetikus mobilitáskülönbségük alapján elkülönülő sávokba sorakoznak fel, mely sávok azonos (a vezető ion által meghatározott) sebességgel haladnak. Micelláris elektrokinetikus kromatográfia (MEKC vagy MECC) A módszer átmenet az elektroforézis és a kromatográfia között, amely lehetővé te-szi két vagy több, töltéssel nem rendelkező komponens elektroforetikus elválasztását. A módszer rendkívül egyszerű: az elektrolitba detergenst kevernek a detergens kritikus micellakoncentrációja feletti értékben. A kialakuló micellák külső felszíne töltéssel rendelkezik, míg a micella belseje hidrofób. A töltéssel nem rendelkező mintakomponensek hidrofób jellegük szerint több-kevesebb időt a micellákban töltenek, melyek töltésük révén az elektród felé vándorolnak. A MEKC sematikus rajzát a 40. ábra mutatja be. MEKC-elválasztás során az alkalmazott detergensek különböző típusúak lehetnek. Anionos detergensek használatakor a micellák az anód felé vándorolnak, tehát a nyers szilikakapillárisokban létrejövő elektroozmotikus áramlással ellentétes irányban. Kationos detergensek esetében a micellák töltése pozitív, így a katód felé, tehát az elektroozmotikus áramlással megegyező irányban haladnak. Az elválasztás reprodukálhatóságának egyik alapfeltétele az elektroozmotikus áramlás állandó értéken tartása. 40. ábra - A micelláris elektrokinetikus kromatográfía sematikus rajza (Boèek és mtsai, 1988) A kapilláris elektroforetikus rendszer felépítése A kapilláris elektroforetikus készülék felépítése A CE-készülék egyszerű; sematikus rajza a 41. ábrán látható. Az alapkészülék nagyfeszültségű tápegységből, detektorból, adatfeldolgozó egységből és kapillárisból áll; házilag is összeszerelhető. Jelenleg a nagy HPLC műszergyártó cégek (Hewlett Packard, Perkin Elmer/Applied Biosystem, Beckman, ThermoSeparation, Waters, Dionex) az említettnél jóval bonyolultabb, automata mintaadagolóval ellátott, komputer által vezérelt készülékeket forgalmaznak, melyek képesek akár több napig is felügyelet nélkül üzemelni. 84