Az autoimmun eredetű 1-es típusú diabetes mellitus klinikai spektrumának meghatározása immunológiai-genetikai és anyagcsere analízis segítségével

Átírás

1 1 2 Habilitációs tézisek Az autoimmun eredetű 1-es típusú diabetes mellitus klinikai spektrumának meghatározása immunológiai-genetikai és anyagcsere analízis segítségével Semmelweis Egyetem Budapest Általános Orvostudományi Kar III. sz. Belgyógyászati Klinika Budapest I. Bevezetés és célkitűzések Pánczél Pál dr. A cukorbetegség történetét végigkíséri a homogenitás/heterogenitás problémája. Sokáig úgy gondolták, hogy ha az egyén homozigóta a cukorbajt okozó tulajdonságra, akkor a súlyos, gyermekkori, sovány, azonnal inzulinra szoruló diabetes alakul ki, ha pedig heterozigóta, akkor az enyhébbnek gondolt, idősebb korban kialakuló, kövér, nem inzulin-függő betegség jelentkezik.

2 3 4 Ennek az volt az oka, hogy a cukorbetegséget a magas vércukorszint észlelése alapján kórismézzük, melynek hátterében azonban változatos kóreredet állhat. Az autoimmunitás felfedezése, a szérumban az inzulin szint mérhetővé válása, a hasnyálmirigy szigetsejt elleni autoantitestek kimutatása, az insulitis újrafelfedezése és a hisztokompatibilitási antigén rendszer feltárása voltak azok a fő tényezők, amelyek az addig juvenilisnek, inzulin-dependensnek, soványnak, stb. nevezett cukorbetegséget az autoimmun etiológiájú kórképek közé sorolták és világosan elkülönítették az inzulin-rezisztenciával és hasnyálmirigy béta-sejt funkciózavarral járó időskorinak, vagy nem-inzulin-dependensnek nevezett cukorbetegség formától. Ez a paradigmaváltás ben zajlott le. A diabetes mellitus és más szénhidrát anyagcserezavarok új osztályozásáról pedig 1980-ban jelent meg közlemény. Ez már etiológiai alapú klasszifikáció volt, de klinikailag az 1-es típusú diabetes az inzulin dependens diabetest jelentette, a 2-es típusú pedig a nem-inzulin-dependens diabetes szinonimájaként szerepelt. Saját munkánkban a nyolcvanas években a következőkkel járultunk hozzá az 1-es típusú diabetes mellitus autoimmun eredetének igazolásához: 1. epidemiológiai vizsgálattal bizonyítottuk egy szisztémás autoimmun betegséggel (rheumatoid arthritis) való gyakori társulását. 2. családvizsgálattal igazoltuk, hogy ennek a társulásnak a hátterében a közös immungenetikai sajátosságok állnak. 3. rheumatoid arthritises és 1-es típusú diabeteses betegekben hasonló immunszerológiai eltéréseket mutattunk ki. Az 1-es típusú cukorbetegséget az 1980-as osztályozásban hevenyen kialakuló, típusos tünetekkel járó, ketoacidózishoz vezető kórképként írták le. A családvizsgálataink során azonban észleltünk genetikailag 1-es típusú diabetesre hajlamos, szigetsejt elleni antitest pozitív, a szénhidrátanyagcsere-zavar különböző súlyosságú formáiban szenvedő, vagy ép szénhidrát anyagcseréjű egyéneket is. Felvetettük tehát, hogy az 1-es típusú diabetes klinikai heterogenitást mutat, klinikai spektruma van. A klinikai heterogenitás igazolása egyben újabb bizonyítéka lenne az autoimmun eredetnek, hiszen más autoimmun betegségeknek is van klinikai spektrumuk: a csak immunszerológiai eltérésekben megnyilvánuló betegségtől - a súlyos, életet veszélyeztető szervpusztulásig, ide értve például az ízületek pusztulását rheumatoid arthritisben. Mi állhat az 1-es típusú diabetes mellitus klinikai spektrumának a hátterében?

3 5 6 Az 1-es típusú diabetes mellitus kialakulásának 4 stádiumát különböztethetjük meg. Az első stádiumot a genetikai fogékonyság képezi, amely elsősorban a fő hisztokompatibilitási komplexhez köthető: fogékonysági gének a HLA DR3/DQ2 és a HLA DR4/DQ8 hordozó haplotípusok; a betegséggel szembeni, valószínűleg domináns védelmet jelent a HLA DR2/DQ6 pozitív típus. A második stádium a triggertényező behatása: jelenleg vírusinfekció (Coxsackie vírus törzsek, rubeolavírus, mumpsvírus), valamint a korai tehéntejtáplálást (tehéntejfehérje, mint antigén, 6 hónapos kor előtt) jön szóba. A harmadik stádium az immunológiai abnormalitások időszaka. A genetikailag fogékony egyénben a triggertényező behatására olyan immunológiai folyamatok indulnak el, amelyek fokozatosan a hasnyálmirigy béta-sejtek autoimmun eredetű, T-sejt közvetített pusztulását okozzák. A negyedik stádiumot a béta-sejtek teljes pusztulásával, az inzulinfüggő cukorbaj kialakulása jelenti. Az 1-es típusú cukorbaj kialakulására vezető folyamat harmadik stádiuma főleg felnőttkorban hosszú, évekig, évtizedekig tartó lehet. Az inzulintermelő kapacitás lassú beszűkülése miatt -elméletileg- egy adott időpontban vizsgálva a szénhidrátanyagcsere-zavar különböző súlyosságú formáját észlelhetjük: csökkent glukóz tolerancia, véletlenül, vagy szűrővizsgálattal felfedezett diabetes (melyben nem merül föl inzulinkezelés szükségessége), gesztációs diabetes, stb. Tehát hasonló patológiai folyamat változatos klinikai képben nyilvánulhat meg. Ez adhatja a 1-es típusú diabetes klinikai spektrumát. Elméletileg nem kizárható, hogy a folyamat megfordul és átmenetileg, vagy végleg megszűnik a szigetsejt ellenes autoimmun folyamat. Az 1-es típusú cukorbetegség klinikai spektrumának hátterében álló, a diabetesre vezető autoimmun folyamat harmadik stádiumának a felismerését fogalmaztuk meg fő célkitűzésként. Hogyan lehet az 1-es típusú diabetesre vezető folyamat harmadik stádiumát felismerni? Ennek az időszaknak a legkönnyebben vizsgálható jellegzetessége a szigetsejt elleni autoantitestek megjelenése. Elsőként az indirekt immunfluorescenciával kimutatható citoplazmatikus szigetsejt elleni antitesteket (ICA) mutatták ki. Az ICA a szérumban kis titerben van jelen, ezért kimutatása nehéz. A vizsgálat standardizálása évtizedig tartott. Célkitűzés (1/1.) volt tehát, hogy olcsó, nagyszámban végezhető, megfelelő specificitású, szenzitivitású és konzisztenciájú eljárás álljon a rendelkezésünkre és a vizsgálatot nemzetközi minőség-biztosítással végezzük. Célkitűzés (1/2.) volt, hogy a jó minőségben végzett ICA vizsgálattal szűrést végezzünk diabeteses rokonnal nem rendelkező, nem diabeteses populációban; 1-es típusú cukorbetegek nem diabeteses első fokú rokonságában; 1-es és klinikailag 2-es típusú cukorbetegek különböző alcsoportjaiban;

4 7 8 terhességi cukorbetegekben. Részben teszteltük az eljárás minőségét, részben, s ez volt a következő célkitűzésünk (1/3.), hogy a kiszűrt, ICA pozitív egyénekben keressünk egyéb paramétereket, amelyek igazolhatták a szigetsejt elleni autoimmun folyamat elindulását. Ennek során genetikai vizsgálatra (HLA meghatározásra), illetve anyagcsere vizsgálatra (gyakori mintavételezésű intravénás glukóz tolerancia teszt FSIVGTT) került sor. Célkitűzés (1/4.) volt, hogy az ICA vizsgálat indikációit megállapítsuk. Az ICA pozitív savók antitest keveréket tartalmaznak. Időközben tisztázták, hogy az ICA pozitivitást adó antitestek egy része a glutaminsav-dekarboxiláz (GADA), egy része a tirozin-foszfatáz (anti-ia2), egy része a GM2-1 glykolipid ellen termelődik. Az inzulin elleni autoantitestet a fagyasztott hasnyálmirigy metszeteken nem lehet kimutatni, de az is része a diabetesben észlelhető autoantitest repertoárnak. Célkitűzés (1/5.) volt, hogy a radioimmun módszerrel kimutatható GADA és anti-ia2 meghatározást is nemzetközileg minőségbiztosítsuk és drágasága ellenére, lehetőség szerint bevegyük vizsgálatainkba. Célkitűzés (1/6) volt, hogy pénzügyi szempontokat is figyelembe véve a különböző antitest meghatározások optimális sorrendjét és szükségességét meghatározzuk. A 2-es típusúként kórismézett, de ICA pozitív betegeket soroltuk a LADA (latent autoimmune diabetes in adults) típusba. Az antitest pozitivitáson kívül kritérium volt még, hogy a diabetes kórisméjekor a beteg legalább 35 éves legyen és a kórisme felállításától számított legalább fél éven keresztül ne szoruljon inzulinkezelésre. Célkitűzés volt (2/1.), hogy a klinikai és antropometriai analízis mellett genetikai és anyagcsere vizsgálatokkal a LADA típust beillesszük az 1-es típusú diabetes mellitus klinikai spektrumába, illetve (2/2.), hogy hosszmetszetben vizsgálva az 1-es, a LADA és a 2-es típusú cukorbeteg csoportban felmérjük béta-sej pusztulás sebességét az éhomi szérum C-peptid szint alakulásának összehasonlításával. A következő célunk (3/1.) az volt, hogy olyan genetikai eltérést találjunk, amely részben magyarázhatja, hogy az autoimmun eredetű diabetesen belül mi befolyásolja a szigetsejt pusztulás sebességét: gyors progresszió (klasszikus 1-es típus), vagy lassú progresszió (LADA). Ennek érdekében végeztük körükben a TNF-alfa polimorfizmus vizsgálatát. Vizsgáltunk továbbá még egy, a szigetsejt pusztulásra vezető cytotoxikus T-sejtes reakció befolyásolására vezető folyamatot (célkitűzés 3/2.): a hősokk-protein 60 egyes epitópjai (p277, p277-szerű, GAD-szerű) ellen irányuló humoralis immunreakcióról az 1-es típusú diabetes állatmodelljében kiderült, hogy a szigetsejt-specifikus T-sejtes reakciót gátolja, a TH1/TH2 reakció arány eltolása révén. Felmerült ennek alapján, hogy ilyen epitóppal való immunizálás lassítaná a hasnyálmirigy béta-sejtek pusztulását, s ez irányú humán kísérlet is történt.

5 9 10 Immunreguláló tényezőként fogható fel a chemokin rendszer, amelynek a vizsgálatát (CCR2 és CCR5 polimorfizmus) ugyancsak célul tűztük ki (3/3.). A vizsgálataink során találtunk egy olyan homogén betegcsoportot, amelyben a cukorbaj hevenyen, típusos tünetekkel és ketonuriával jelentkezett, de amelyben mindhárom szigetsejt elleni antitest vizsgálat negatív eredményt adott, s későbbiekben e betegek inzulin independenssé váltak. Célul tűztük ki (4.), hogy a klinikai adatok elemzésével, illetve genetikai és anyagcsere vizsgálattal határozzuk meg, hogy ez a betegcsoport beletartozik-e az 1-es típusú diabetes klinikai spektrumába (idiopátiás 1-es típusú diabetes?), vagy a 2-es típusú cukorbaj csoportba sorolható-e (ketózisra hajlamos 2-es típus?). II. Vizsgált betegek a. Az 1/1.-1/6. célkitűzéshez. Nem diabeteses, cukorbeteg rokonnal nem rendelkező felnőtt (n=50; 24 férfi, 26 nő; átlagéletkor 49 év, szélső értékek 35 és 82 év). Cukorbeteg rokon nélküli nem cukorbeteg gyermek (n=68; 38 fiú, 30 lány; átlagéletkor 9,8 év, szélső értékek 1-18 év). Frissen felfedezett, maximum 16 éves korú 1-es típusú cukorbeteg (n=257); frissen felfedezett 16 évesnél idősebb 1-es típusú cukorbeteg (n=134); egy éven túl felfedezett maximum 16 éves 1-es típusú cukorbeteg (n=84), egy éven túl felfedezett, 16 évesnél idősebb 1-es típusú cukorbeteg (n=28). 2- es típusú cukorbeteg (n=456; 230 férfi, 226 nő; átlagéletkor 58 év, szélső értékek év). Vírusfertőzést (varicella: n=32, EBV indukálta mononulcleosis infectiosa: n=24, mumps: n=35) 1 hónapon belül átvészelt nem cukorbeteg gyermek (n=91). Gesztációs diabetes (n= 68). 1-es típusú cukorbeteg anyák gyermekei (n=596). Maximum 16 éves (átlagéletkor 1,6 év, szélső értékek 4 és 16 év), frissen felfedezett 1-es típusú cukorbeteg gyermek (n=48) és 16 éves koron túl (átlagéletkor 28,5 év, szélső értékek év) frissen felfedezett 1-es típusú cukorbeteg (n=89). LADA típusú cukorbeteg (n=54, 25 férfi, 29 nő; életkori medián 59, 47,5-67 év). 2-es típusú cukorbeteg (n=190; 103 férfi, 87 nő; életkori medián 63 év, év). b. A 2/1. és 3/1. célkitűzéshez. LADA beteg (n=54, lásd fent). Huszonöt-éves kor után kialakult, frissen felfedezett 1-es típusú cukorbeteg (n=57; 30 férfi, 27 nő; életkori medián 44,5 év, év).2-es típusú cukorbeteg (n=190, lásd fent). c. A 2/2. célkitűzéshez. LADA beteg (n=76, 36 nő, 40 férfi; életkor 53+/- 14,5 év), 1-es típusú cukorbeteg (n= 154, 75 nő, 79 férfi; életkor 39+/- 14,8 év); 2-es típusú cukorbeteg (n= 226, 167 nő,59 férfi; életkor 57,8+/-13,6 év). d. A 3/2. célkitűzéshez: 83 frissen felfedezett 1-es típusú cukorbajos gyermek és 81 diabeteses rokonnal nem rendelkező, nem cukorbeteg gyermek. e. A 3/3. célkitűzéshez: es típusú cukorbetegségben szenvedő (9,3 év +/- 4,3 év) és 280 nem diabeteses gyermek (8,5 +/- 4,5 év).

6 11 12 f. A 4. célkitűzéshez. 77 frissen felfedezett, klinikailag 1-es típusúnak minősülő cukorbeteg közül kiválasztott 9 eset (6 férfi, 3 nő; 29 és 64 éves kor között). III. Vizsgálati módszerek a. Szigetsejt elleni citoplazmatikus autoantitest (ICA) meghatározás: indirekt immunofluorescenciás módszer. Antigénként 0 - ás vércsoportú, balesetben elhunyt, szervdonor személy hasnyálmirigyének cryostatos metszeteit használjuk. A hasnyálmirigyből készült blokkokat -70 C fokon tároljuk, 6 éve használjuk ugyanazt a pancreast. A vizsgálat standard operating protocol ja (SOP) rendelkezésre áll. A standardizálás során kísérletképpen 12 órája elhunyt cadaverből származó, Bouin oldatban fixált, paraffinba ágyazott pancreas blokkokból készült metszeteket is használtunk, deparaffinálás után. b. Glutaminsav-dekarboxiláz és tirozin-foszfatáz elleni autoantitest (GADA és anti-ia2) meghatározást RIA módszerrel végezzük (MEDIPAN Diagnostica, Németország). A SOP ugyancsak rendelkezésre áll. c. A C-peptid meghatározást RIA módszerrel végezzük (korábban BRAHMS Diagnostica,Berlin, majd Izotóp Intézet, Budapest). d. A gyakori mintavételezésű intravénás glukóz tolerancia teszthez 0,5 g/ts.kg glukózt adunk intravénásan; a vérvételek a beadás előtt, majd az 1., 3., 5., 10., 20., 30. percben történtek. e. A glukagon terheléses C-peptid vizsgálatot Glukagen-hypokit (Novo-Nordisk) intravénás adásával végezzük, vérvétel a beadás előtt, majd a 2., 6.,10., 20.percben történik. f. A HLA DR, DQ tipizálást sequence specific polymorphism (SSP) PCR metodikával végezzük (Olerup SSP DR és DQ kit, Saltsjobaden, Svédország). g. A human hősokk-protein 60 és annak egyes szintetikus peptidjei (GAD-szerű és p277-szerű epitóp) elleni antitest vizsgálatot ELISA módszerrel végeztük. h. A chemokin receptor CCR 2 és CCR5 polimorfizmust PCR-RFLP módszerrel vizsgálták a Heim Pál Kórház laboratóriumában. i. A HbA1c-t immunturbidimetriával, a szérum összkoleszterin, triglicerid és HDL-koleszterin szintjét enzimatikus assay vel, laboratóriumi automatán mértük. j. A statisztikai analízist SPSS for Windows version 9.0, vagy GraphPad Prism 3.0 programmal végeztük: nem paraméteres Mann-Whitney U teszt, chi négyzet próba, Fisher exact teszt. IV. Eredmények a. Az ICA vizsgálat standardizálására nemzetközi workshop -okat rendeztek. Ezek során kiderült, hogy a korábban javasolt, s az általunk kipróbált fixált hasnyálmirigy metszeteken, mint antigénen

7 13 14 végzett reakció alkalmatlan a meghatározásra. A vizsgálatot cryostatos, nem fixált hasnyálmirigy metszeteken is végeztük, amellyel végül 100 %-os specificitást és konzisztenciát, valamint 58%-os szenzitivitást értünk el. Ez volt a véglegesen javasolt metodika. Általános volt a tapasztalat, hogy a szenzitivitás növelése a specificitás rovására megy. A vizsgálat az asszisztens és az értékelő orvos részéről is nagy gyakorlatot kíván. Erre utal, hogy az eredmények jósága és a workshopokon való részvétel száma között pozitív összefüggés volt. b. A GADA és anti-ia2 vizsgálatok nemzetközi standardizálása is sikerrel járt. Minőségbiztosítás céljából vettünk részt az ugyancsak az IDW (Immunology and Diabetes Workshops) által szervezett Proficiency Programokon. A GADA-t illetően 83%-os specificitást, 94%-os konzisztenciát és 100%-os szenzitivitást; az anti- IA2-t illetően 100%-os specificitást, konzisztenciát és szenzitivitást értünk el. c. A cukorbeteg első fokú rokon nélküli, nem diabeteses 68 gyermek és 50 felnőtt között ICA pozitívet nem találtunk. d. A 16 éves, illetve fiatalabb korban frissen felfedezett 1-es típusú cukorbetegek 70,4%-ában; a 16 éves kor fölött frissen felfedezett hasonló cukorbajosok 70,8%-ában; a 16 éves korig kialakult, 1 éven túl fennálló 1-es típusú betegek 11,9%-ában, míg a 16 éves kor után kialakult hasonló betegek 21,4%-ában találtunk ICA pozitivitást. e. A 456 klinikailag 2-es típusú cukorbeteg 5,6%-a (26 fő) bizonyult ICA pozitívnak. Közöttük kell keresni a LADA típusú betegeket. f. Az említett vírusfertőzések növelték az ICA pozitivitás előfordulás gyakoriságát: 91 ilyen beteg közül 5 bizonyult pozitívnak. Az egyik mumpsvírus fertőzésen átesett ICA pozitív gyermeket évekig követtünk. Az ICA pozitivitás fokozatosan megszűnt, diabetese nem alakult ki. Ez a gyermek HLADR2/DQ6 hordozó, tehát 1-es típusú cukorbajra védelmet jelentő HLA típusú volt. g. A 63 korábban gesztációs diabeteses asszony közül 5 volt ICA pozitív, akik közül a terhesség alatt mindegyik inzulinra szorult, hárman a vizsgálat időpontjában inzulin dependens cukorbetegek, míg ketten cukorbetegek, de nem kaptak inzulint. Észleltünk még az előző csoporttól függetlenül 5 további gesztációs cukorbeteget, akiknek reklasszifikációja kapcsán ICA pozitivitást észleltünk és mindegyikük rövid idő alatt 1-es típusú cukorbeteg lett. Ezen 5 beteg közül egyik csak ICA, kettő ICA+GADA, kettő ICA+GADA+anti-IA2 pozitívnak bizonyult. Rendszeres ICA szűrésre GDM-ben eddig nem került sor. h. Az 1-es típusú diabeteses anyától származó 596 egészséges gyermek között 23 ICA pozitívat találtunk (3,9%), közülük 5 lett a hároméves megfigyelési idő alatt cukorbeteg. A két cukorbeteggé vált gyermek eredeti savójából a későbbiekben módunkban állt GADA és anti-ia2

8 15 16 vizsgálatot is végezni: mindkettő GADA pozitív, egyikük anti-ia2 pozitív is volt. Egy ICA negatív gyermeken is kialakult cukorbetegség. Ezt a savót is később vizsgáltuk GADA-ra és anti-ia2-re: előbbire negatív, utóbbira pozitívnak bizonyult. i. Az ICA mellett a GADA és anti-ia2 antitest vizsgálatot is elvégeztük frissen felfedezett gyermekkori (16 éves kor alatti) és felnőttkori (16 éves kor feletti) kezdetű 1-es típusú cukorbetegen. Az antitest negativitás aránya felnőttkori kezdetben sokkal gyakoribb (13,5%) volt a gyermekkori esetekhez képest (2,1%). Az anti- IA2 elsősorban a másik két antitesttel együtt fordult elő: gyermekkori előfordulási aránya nagyobb volt, mint felnőttekben: 68,85% vs. 41,62%. Csak ICA pozitív volt a 16 év alattiak 4,2%-a, szemben a 16 év felettiek 14,6%-ával. Az egyedüli GADA előfordulás a két betegcsoportban hasonló volt (4,2 és 6,7%). Leggyakoribb a 3 antitest együttes jelenléte volt: 48, illetve 36%. j. A LADA betegekben anti-ia2 önmagában nem fordult elő. Csak ICA pozitív volt az 54 ilyen beteg közül 18; csak GADA pozitív 14; ICA+GADA pozitív 12; GADA+anti-IA2 pozitív 1 és mindhárom antitestre pozitív 9. k. A mindhárom antitestre vizsgált es típusú beteg közül 5 csak ICA; 4 csak GADA pozitívnak bizonyult. Többes antitest előfordulást körükben nem észleltünk. Az antitest titer minden esetben a pozitivitás alsó határértéke közelében volt. A kórlefolyásuk és a szérum C-peptid szintjük is a 2- es típus kórisméjének felelt meg. l. Összehasonlítottuk a klinikai paramétereket, az éhomi szérum C-peptid szinteket, a szigetsejt elleni antitest mintázatot és az 1-es típusú diabetesre predisponáló HLA típusok előfordulását a LADA betegek és a felnőttkori kezdetű klasszikus 1-es típusú cukorbetegek csoportja között. Kontrollként a 2-es típusú cukorbetegek csoportját is felhasználtuk. A klinikai paraméterek közül a LADA és az 1-es típusú betegek alacsonyabb BMI-vel, összkoleszterinnel, és triglicerid koncentrációval és kisebb hypertonia prevalenciával rendelkeztek, mint a 2-es típusú betegek. A derék/csípő hányados LADA-ban kisebb volt, mint 2-es típusú diabetesben. A HDLkoleszterin LADA-ban és 1-es típusú diabetesben egyaránt magasabb volt, mint 2-es típusban. A LADA és az 1-es típus között nem volt lényeges különbség a metabolikus syndroma előbb említett paramétereiben. Az éhomi C-peptid szint a diagnóziskor a LADA és az 1-es típusban nem különbözött; a hosszabb kórlefolyású esetekben (1-10 év között) azonban a C-peptid szint 1-es típusban szignifikánsan alacsonyabbnak bizonyult a LADA-hoz képest. A diagnóziskor a LADA betegek C-peptid szintje a 2-es típusúakhoz képest szignifikánsan alacsonyabb volt. Tízévesnél hosszabb betegségtartamú 2-es típusban a C-peptid a kezdethez képest szignifikánsan csökkent és közelített a LADA típusúak hasonló csoportjában mért szinthez.

9 17 18 A szigetsejt specifikus autoantitesteket (ICA, GADA és anti-ia2) illetően azt észleltük, hogy LADA-ban az egyszeres, 1-es típusban a többszörös autoantitest pozitivitás volt jellemző. Mindkét felnőttkori autoimmun eredetű diabetesben az anti-ia2 antitest csak antitest kombináció részeként fordult elő. Az autoimmun diabetesre nagy rizikót jelentő HLA allélek (DR3/DQ2 és DR4/DQ8) előfordulási gyakoriságában a LADA és az 1-es típus között nem volt különbség; mindkettőben azonban lényegesen gyakoribb volt, mint az átlagnépességben. m. A LADA, az 1-es típusú és a 2-es típusú betegeket a betegségtartam alapján 3 csoportra osztottuk: 0-1 év; 1-10 év és >10 év betegségtartamú csoportra. Az 1-es típusban az első évben az éhomi C-peptid szint szignifikánsan tovább csökkent, LADA-ban a hasonló szintről induló C- peptid stagnálást mutatott. 2-es típusban csak az első tíz év után volt észlelhető szignifikáns éhomi C-peptid szint csökkenés. Az autoimmun cukorbetegek minden alcsoportjában a C-peptid szint alacsonyabb volt, mint a 2-es típusúak megfelelő alcsoportjában. n. A LADA és a felnőttkori kezdetű 1-es típusú diabetes között az ismerten nagy kockázatot jelentő HLA változatok előfordulási gyakoriságában nem volt különbség. Szignifikáns differenciát találtunk viszont a TNF2 allél ( G A szubsztitúció a TNF-alfa promoter régió -308-as pozíciójában) előfordulási gyakoriságában a LADA és az 1-es típus között: az említett allél - amely fokozott gyulladásos reakciót eredményezszignifikánsan ritkábban fordult elő LADA-ban az 1-es típushoz képest. o. A frissen felfedezett 1-es típusú cukorbeteg gyerekekben a p277 elleni, illetve a p277 szerű, valamint GAD-szerű szintetikus HSP 60 epitóp elleni antitest titer szignifikánsan magasabb volt, mint kontrollokban. A teljes rekombináns hsp 60 elleni antitest titer a két csoportban hasonlónak bizonyult. Az ICA, GADA és anti-ia2 titerek, illetve a HSP 60 epitóp elleni antitestek titere között nem volt összefüggés. p. A chemokin receptor (CCR) 2-64I allél-frekvencia 1-es típusú diabetesben szignifikánsan nagyobb volt, mint a kontrollokban. A chemokin receptor-5 delta-32 mutáció előfordulása a két csoportban hasonló volt. q. A ban frissen felfedezett, klinikailag 1-es típusúnak minősíthető, ketonuriás, azonnal frakcionált inzulinnal kezelt 77 betegünk közül 10 bizonyult szigetsejt elleni antitest (ICA, GADA, anti-ia2) negatívnak. Közülük 1 esetben a szérum C-peptid szint kimutathatatlanul alacsony volt. A többi 9 beteget vontuk be vizsgálatainkba: átlagéletkoruk 43,2 év (29-64 év); 3 nő, 6 férfi; a BMI átlagértéke 35,4 kg/m2 (27-55,5 szélső értékekkel); a derék/csípő hányados 0,9 és 1,1 közötti (átlag 1,01); az anamnézisben a diabetesre utaló panaszok tartama 1 hónap és 1 év között változott (átlag 3 hónap); a felvételi vércukor 15,9 és 33,2 mmol/l közötti (átlag 22,5), felvételkor a

10 19 20 HbA1c tartalom 10,9 és 16,6% közötti (átlag 14,1%); az éhgyomri C-peptid koncentráció 1,8 3,62 nmol/l közötti (átlag 2,35 nmol/l) volt. Két beteg genetikailag 1-es típusú cukorbajra hajlamosító HLA típusú (DR3/DQ2), három pedig ilyen cukorbajra közömbös típust hordozott. Négy esetben a tipizálás még nem történt meg. A megfigyelési idő alatt 3 beteg csak diétával, 1 diétával és metforminnal is egyensúlyban tarthatóvá vált. Öt beteg még egyre csökkenő adagban inzulint kap. Az eddigi megfigyelési idő (maximum 3 év) alatt eddig egy, már csak diétával kezelt betegen alakult ki interkurrens betegség nélkül ismét hyperglykaemia, ketosis, inzulin dependencia, amelynek során azonban a szérum C-peptid szint nem csökkent, s az inzulint rövid idő múlva ismét el lehetett hagyni. A glukagon terheléses C-peptid vizsgálat jó inzulintermelő kapacitást igazolt. V. Összefoglalás és következtetések Az összefoglalásban is a célkitűzések sorrendjében haladunk. 1/1. Az ICA standardizálási workshopok alapján kiderült, hogy a szervdonorból származó, 0 -ás vércsoportú egyén hasnyálmirigyének cryostatos, fixálatlan metszeteit kell az indirekt immunfluorescenciás vizsgálat során alkalmazni. A proficiency programok alapján laboratóriumunk a vizsgálatot megfelelő minőségben végzi, a GADA és anti-ia2 RIA módszerrel történő meghatározásával együtt. Elkészítettük a vizsgálatok SOP ját. A Qualicont által szervezett kísérleti jellegű hazai körvizsgálat során ismét kiderült a fixált pancreas használatának alkalmatlansága az ICA meghatározáshoz; a jelenlegi ELISA módszer alkalmatlansága a GADA meghatározáshoz. Hangsúlyozzuk, hogy magunk kizárólag RIA módszert alkalmaztunk. A nemzetközi minőségbiztosítás kereskedelmi forgalomban levő KIT-ekkel történő laboratóriumi vizsgálatok esetén is feltétlenül szükséges. Laboratóriumunk 2003-ban 728 ICA vizsgálatot végzett. Érdekességként megjegyezzük, hogy a Bouin-oldatban fixált, paraffinba ágyazott hasnyálmirigy blokkból készített metszetekben az inzulin deparaffinálás után is megmarad, ezért azok inzulin-elleni antitestek kimutatására alkalmasak. Ha második antitestként anti-human IgE-t alkalmazunk, inzulin allergia eseteiben inzulin specifikus IgE antitestek lehetnek kimutathatók. Az eljárás hozzátartozik az inzulin allergiás esetek kivizsgálásához, amelyben saját és mások eseteiben is gyakorlatot szereztünk. 1/2. és 1/3. Az említett nem cukorbeteg és a különböző típusú diabeteses populációban végzett

11 21 22 szigetsejt specifikus antitest szűrés során megállapítottuk az ICA előfordulási gyakoriságát a nem cukorbeteg átlagpopulációban, gyermekkori és a felnőttkori kezdetű 1-es típusú diabetesben, a válogatás nélküli, klinikailag 2-es típusúnak kórismézett (tehát a LADA-t is magában foglaló) cukorbetegségben. E tekintetben adataink megfeleltek az európai átlagnak. A tipológiai problémát jelentő esetekben az antitest vizsgálat alapján megállapított diabetes típus alátámasztására genetikai (HLA tipizálás) és anyagcsere (FSIVGTT, éhomi szérum C-peptid és 24 órás vizelet C-peptid ürítés) vizsgálatokra is sor került. Példaként röviden ismertetjük néhány betegünket, akiket immunológiai-genetikai és anyagcsere paraméterek meghatározásával tipizálhattunk. HL: 32 éves korában kórismézték cukorbetegségét (BMI=29, családi anamnézisben időskori diabetes), melyet tekintettel a korára, 1-es típusúnak minősítettek, inzulinra állították. Másfél év múlva további hízás, ismétlődő hypoglykaemia miatt utalták be. ICA negatív, éhomi C-peptid 0,5 nmol/l, vizelet C- peptid 33,5 nmol/24 óra. Szoros megfigyelés mellett az inzulint kihagytuk. Az eltelt öt évben sem szorult inzulinra, szénhidrát anyagcseréje rendezett. A szűrővizsgálat során felfedezett diabetest a beteg fiatal korát túlértékelve kórismézték 1-es típusúnak. KG: 31 éves korában kórismézték cukorbetegségét (BMI=34, családi anamnézisben időskori diabetes). 500 kalóriás diéta, testmozgás fokozása vércukrát csökkentette. Egy év múlva vizsgáltuk: ICA pozitív, FSIVGTT során az inzulin szekréció első fázisa hiányzik, az éhomi érték a kimutathatóság határán. Rövid idő múlva inzulin dependencia alakult ki. Ebben az esetben a magas BMI volt túlértékelve, melynek alapján 2-es típus diagnózisa született. GI: 71 éves korban véletlenül felfedezett cukorbaj (BMI=25, családi anamnézisben időskori diabetes). 2 évig Gilemal+Adebit, ezt követően küldik: ICA pozitív, éhomi C-peptid a szérumban nem kimutatható. HLA DR3/DQ2-DR4/DQ8 pozitív. A legidősebb LADA betegünk. NV: 16 éves korban, édesanyja hasonló diabetese miatti szűrővizsgálat során kiderült cukorbetegségben szenvedőt (BMI=20, családban nagyanyja is enyhe diabetesben szenvedett) 1-es típus feltételezése miatt küldik. ICA negatív, éhomi C-peptid 0,7 nmol/l, vizelet C-peptid 27,8 nmol/24 óra. Tekintettel a családi anamnézisre is MODY-t állapítottunk meg. Azóta sem (10 éve) merült föl inzulinkezelés szükségessége. PN: 24 éves korban kórismézett, átmenetileg inzulinnal kezelt gesztációs diabetes (BMI: a szülés után 20). ICA, GADA, anti-ia2 pozitív. 3 hónap múlva inzulin dependens diabetes. PZ: 16 éves korában ép szénhidrát anyagcserét találtunk. Vizsgálatára testvére rheumatoid arthritise + 1-es típusú diabetese miatt került sor. ICA pozitív (ez a savó 10 év múlva vizsgálva GADA és anti-ia2 pozitívnak is bizonyult). Említett testvérével HLA identikus: HLA DR3/DR4 pozitív. Első fázisú inzulin szekréciója kiesett. Kétéves megfigyelés után inzulin

12 23 24 dependens cukorbaja lett. Ő volt az első hazai beteg, akinek az ICA pozitivitását még szénhidrátanyagcserezavar észlelése nélkül találtuk. GA: 8 éves, parotitis epidemica-n átesett beteg. A betegség kezdete után 3 héttel levett vérminta ICA pozitív. 2 alkalommal végzett FSIVGTT normális lefutású görbét adott. HLA DR2/3 hordozó. ICA pozitivitása fokozatosan megszűnt. 8 évig figyelve cukorbaj nem alakult ki. E beteg példája annak, hogy a kialakult szigetsejt elleni autoimmun folyamat megszűnhet. Ezt elősegíthette, hogy DR2 pozitív volt, azaz 1-es típus kialakulásával szemben valószínűleg domináns genetikai rezisztenciát hordozott. Esetismertetéseinkben az 1-es típusú diabetes tehát 2- es típus, GDM és LADA formájában nyilvánult meg. Egy esetben normális éhomi vércukorral, egészségesben találtunk 1-es típusú diabetest. Egy esetben pedig igazoltuk a szigetsejt elleni autoimmun folyamat megszűnését. A cukorbetegség legújabb osztályozása már különválasztja az etiológiai diagnózist és a szénhidrátanyagcsere-zavar mértékét (a normális szénhidrát anyagcserétől az élet fenntartásához inzulin-kezelés szükségességéig): kétdimenziós osztályozás. A diagnózishoz tartozó nyíl is kétirányúvá vált: így állhatott elő az első olvasásra furcsa eset, hogy 1-es típusú cukorbajosnak minősítettünk látszólag egészséges fiatalembert (PZ) és értekeztünk az 1-es típusú diabetes gyógyulásáról (GA), valamint az 1-es típusú diabetes klinikai spektrumába soroltunk klinikailag 2-es típusú, GDM és LADA betegeket. Megemlítjük, hogy a más diabetes szakrendelők által LADA gyanújával ICA szűrésre küldött anyagban a pozitív találati arány a kezdeti 5%-ról az utóbbi időben 40% körülire nőtt, köszönhetően annak, hogy a kollégák körében ennek a típusnak a klinikai jellemzői is jobban körvonalazódtak: családi anamnézisben nincs cukorbetegség, a beteg általában nem kövér, nem hypertoniás, nincs dyslipidaemia, nincs macroangiopathia, a szokásos kezelés mellett az anyagcsere állapot nem javul, sőt a megszokottnál gyorsabban romlik. A klinikum által fölvetett gyanú esetén pedig kérik az antitest vizsgálatot. Kiemelendő az 1-es típusú diabeteses anyák gyermekein végzett ICA szűrés, amellyel, (pozitív esetben kiegészítve a GADA és anti-ia2 antitest, valamint HLA típus és első fázisú inzulin szekréció meghatározással) 1-es típusú diabetes predikciót lehet végezni. Az ez irányú lelkesedést átmenetileg csökkentette, hogy az 1-es típusú cukorbaj prevencióját célzó tanulmányok negatív eredménnyel zárultak (ENDIT, DTP-1). 1/4. Eredményeink alapján az ICA vizsgálat indikációi a következők: -a felnőttkori latens autoimmun diabetes (LADA) szűrése a 2-es típusúnak kórismézett betegek körében.

13 az 1-es típusú cukorbetegek kiszűrése gesztációs diabetesben a kórismézéskor és a szülés utáni újra-osztályozáskor. -az 1-es típusú diabetes és a ketózisra hajlamos 2-es típusú diabetes elkülönítésére. -a serdülőkorban manifesztálódó 2-es típusú cukorbetegség differenciálása az 1-es típustól. -a MODY (maturity onset diabetes in the young) differenciálása az 1-es típustól. -az 1-es típusú diabetes mellitus predikciója 1-es típusú betegek első fokú rokonaiban. (jelenleg sajnos klinikai jelentőség nélkül). 1/5. és 1/6. A GADA és anti-ia2 vizsgálat nemzetközi minőségbiztosítását is elvégeztük a proficiency program -ok során és a különböző típusú cukorbetegekben elvégzett szűrővizsgálatok során meghatározhattuk ezen antitestek vizsgálatának -ICA vizsgálat melletti- indikációit és az antitest vizsgálatok gazdaságos sorrendjét (összehasonlításként az ICA vizsgálat anyagköltsége néhány 100 Ft, a GADA és anti- IA2 meghatározásé mintegy 3000 Ft). Mindezek alapján az alábbi megállapításokat tehetjük: felnőttkori kezdetű diabetesben az anti-ia2 vizsgálatnak nincs klinikai jelentősége. a LADA típus igazolására elsőként ICA vizsgálatot (ennek pozitivitása esetén további vizsgálatra nincs szükség), annak negativitása és továbbra is fennálló gyanú esetén GADA vizsgálatot célszerű végezni (jelenleg RIA metodikával). gesztációs diabetesben a reklasszifikáció során a LADA-ban követett eljárás célszerű. gyermekkori kezdetű típusos 1-es típusú diabetesben az antitest vizsgálatnak nincs klinikai jelentősége. MODY, illetve 2-es típus gyanúja esetén valószínűleg elegendő ICA negativitás igazolása. felnőttkori kezdetű, klinikailag típusosnak látszó 1-es típusú diabetesben, különösen, ha kövér betegről van szó, érdemes lehet ICA, annak negativitása esetén a GADA vizsgálatot is elvégezni. Mindkettő negativitása esetén érdemes a beteget megfigyelni ketózisra hajlamos 2-es típusú cukorbetegség irányában (C-peptid mérés). az 1-es típusú cukorbetegség predikciójának egyelőre nincs klinikai jelentősége. A predikcióhoz mindhárom antitest egyidejű meghatározása szükséges, pozitív esetben figyelembe kell venni, hogy egyszeres, vagy többszörös pozitivitás áll-e fenn, értékelni kell, hogy fogékonyságot, vagy rezisztenciát jelentő HLA típus van-e jelen, illetve, értékelni kell az FSIVGTT során nyert inzulin (C-peptid) görbe lefutását. 2/1. A metabolikus syndroma paramétereiben (testtömeg index és derék/csípő hányados, a hypertonia előfordulás, a lipid paraméterek) tekintetében az 1-es és a LADA típus nem különbözött, viszont mindkettő szignifikánsan különbözött a 2-es típusú cukorbeteg csoporttól. A szigetsejt elleni antitest pozitivitás mintázata az 1-es és

14 27 28 a LADA csoportban lényegesen eltért: az egyszeres autoantitest pozitivitás a LADA-ra, a többszörös autoantitest pozitivitás az 1-es típusra volt jellemző. Az 1-es típusú diabetesre nagykockázatú HLA típusok előfordulásában a LADA és 1-es típus között nem volt különbség, mindkettő szignifikánsan különbözött ezek tekintetében az átlagpopulációtól. Az éhomi C-peptid szint a kórismekor az 1-es és a LADA típusban hasonló volt, míg 2-es típusban mindkét autoimmun csoporthoz képest lényegesen magasabbnak bizonyult. Mindezen adatok alapján állíthatjuk, hogy a LADA típusú cukorbetegség az autoimmun eredetű 1-es típusú cukorbaj klinikai spektrumának része, attól csak a szigetsejt pusztulás sebességében tér majd el. 2/2. A kórlefolyás során a szigetsejt pusztulás sebességét vizsgálva azt találtuk, hogy amíg az 1-es típusban az első évben az éhomi C-peptid szint szignifikánsan tovább csökkent, addig LADA-ban a hasonló szintről induló C-peptid stagnálást mutat. 2-es típusban csak az első tíz év után észlelhető szignifikáns éhomi C-peptid szint csökkenés. Az autoimmun cukorbetegek minden alcsoportjában (0-1 év; 1-10 év; >10 év) a C-peptid szint alacsonyabb volt, mint a 2-es típusúak megfelelő alcsoportjában. Az éhomi szérum C-peptid szint alakulása alátámasztja azt a megállapítást, hogy a LADA és az 1-es típusú diabetes mellitus a szigetsejt pusztulás sebességében különbözik egymástól. 3. Ebben a pontban az autoimmun gyulladásos folyamat regulációját végző genetikai és humoralis tényezőket kívántuk vizsgálni, amelyek esetleg felelőssé tehetők azért, hogy az alapvetően azonos betegség változatos klinikai képben nyilvánulhat meg. 3/1. A TNF alfa promoter -308-as pozíciójában levő polimorfizmus vizsgálata arra utalt, hogy LADAban szignifikánsan gyakoribb az olyan allél, amely kisebb TNF-alfa produkcióval, kevésbé intenzív gyulladásos aktivitással járhat együtt. Ez lehet -ha nagyobb betegszámnál is bebizonyosodik- az egyik tényezője az 1-es típushoz képest lassúbb szigetsejt pusztulásnak. 3/2. A HSP 60 és egyes epitópjai elleni antitestek vizsgálata nem támogatta a p277 antigénnel való immunizálás esetleges jótékony hatásáról állatkísérletesen nyert eredményeket, de felvetette a HSP 60 esetleges szerepét a szigetsejt elleni autoimmun folyamatban. Itt a felnőttkori kezdetű 1-es típusú diabetessel, illetve a LADA-val való összehasonlítás folyamatban van. 3/3. A CCR 2 kemotaktikus faktor receptor polimorfizmusának 1-es típusú diabetesben észlelt sajátossága még további megerősítésre szorul, mivel a felelős kromoszómarégióban eddig IDDM locust még nem találtak. Itt sem történt még meg a felnőttkorban manifesztálódó cukorbaj esetekkel való összehasonlítás.

15 Eredményeink arra utalnak, hogy az idiopátiás 1-es típusú betegség valójában a 2-es típusú cukorbaj ketózisra hajlamos változata. Tehát nem képezi az 1-es típusú diabetes klinikai spektrumát. Ilyen betegek nem csak a japán és afrikai, hanem a kaukázusi népességben is előfordulnak. VI. A tézisek alapját képező közlemények jegyzéke Közlemények nemzetközi folyóiratban 1. Bonifacio, L., Boitard, C., Gleichmann, H., Shattock, M., Molenaar, J., Bottazzo, G., and coauthors (közötte:pánczél, P.): Assesment of precision, concordance, specificity and sensitivity of islet cell antibody measurement in 41 assays. Diabetologia, 1990, 33, If: 4,18 2. Szalai, Cs., Császár, A., Czinner, A., Szabó, T., Pánczél, P., Madácsy, L. Falus, A.: Chemokine receptor CCR2 and CCR5 polymorphisms in children with insulin-dependent diabetes mellitus. Pediatr. Res., 1999, 46, If: 2, Pánczél, P., Hosszúfalusi, N., Horváth, M., Horváth,A.: Advantage of insulin lispro versus human insulin in the treatment of a patient with type 2 diabetes mellitus and with insulin allergy. Allergy, 2000, 55, If: 2, Horváth, L., Cervenak, L., Oroszlán, M., Prohászka, Z., Uray, K., Hudecz, F., Baranyi, É., Madácsy, L., Singh, M., Romics, L., Füst, G., Pánczél, P.: Antibodies against different epitopes of heat-shock protein 60 in children with type 1 diabetes mellitus. Immunology Letters, 2002, 80, If: 1,546

16 Vatay, Á., Rajczy, K., Pozsonyi, É., Hosszúfalusi, N., Prohászka, Z., Füst, G., Karádi, I., Szalai, Cs., Grósz, A., Bártfai, Z., Pánczél, P.: Differences in the genetic background of latent autoimmune diabetes in adults (LADA) and type 1 diabetes mellitus. Immunology Letters, 2002, 84, If: 1, Hosszúfalusi, N., Vatay, Á., Rajczy, K., Pozsonyi, É., Horváth, L., Grosz, A., Gerő, L., Madácsy,L., Romics, L., Karádi, I., Füst, G., Pánczél, P.: Similar genetic features and different islet-cell antibody pattern of latent autoimmune diabetes in adults (LADA) compared to adult onset type 1 diabetes mellitus with rapid progression. Diabetes Care, 2003, 26, If: 5,404 Kutatói levél nemzetközi folyóiratban 7. Hosszúfalusi, N., Pánczél, P. és Jánoskuti, L.: Hyperinsulinemia predicts coronary heart disease risk in healthy middle aged men.. Circulation, 1999, 100, el 18. If: 9, Hosszúfalusi, N., Pánczél, P.: Clinical and genetic heterogeneity of latent autoimmune diabetes in adults (response to Fukui et al.). Diabetes Care, 2003, 26, If: 5,404 Közlemények hazai folyóiratban 1. Pánczél, P.,Külkey, O., Luczay, A., Bornemisza, B., Illyés, Gy., Halmos, T., Baranyi, É., Blatniczky, L., Mészáros, J., Kerényi, Zs., Gerő, L., Tamás, Gy., Hosszúfalusi, N., Horváth, L., Madácsy,L., Romics, L.: Hasnyálmirigy szigetsejt elleni antitestek vizsgálata a klinikai gyakorlatban. Orv. Hetil., 1999, 140, Idézettség: 1 (Mauricio, D, de Leiva, A.: Autoimmune gestational diabetes mellitus: a distinct clinical entity? Diabetes Metab Res 2001, 17, ) 2. Pánczél, P., Külkey, O., Hosszúfalusi, N., Horváth, L., Horváth, A., Kovács, L., Kerényi, Zs., Madácsy, L., Romics, L: Felnőttkorban kialakuló diabetes mellitus esetek hasnyálmirigy szigetsejt elleni autoantitest szűrése. Magyar Belorvosi Archívum, 1999, 52, Pánczél, P., Hosszúfalusi, N., Bornemisza Beryll, Horváth Laura, Jánoskuti, L., Füst, Gy., Rajczy, K., Vatay, Á., Prohászka, Z., Madácsy, L., Luczay, A., Blatniczky, L., Halmos, T., Körner, A., Szilvási, I., Romics, L.: A lassan kialakuló felnőttkori autoimmun diabetes (LADA): az autoimmun eredetű 1-es típusú

17 33 34 cukorbetegség klinikai spektrumának része. Orv. Hetil., 2001, 142, Vannai, J., Pánczél, P., Blatniczky, L.: Az első fázisú C-peptid elválasztás jelentősége diabéteszesek egyenes ági rokonainak vizsgálatában. Diabetologia Hungarica, 2002, X, Pál Pánczél, Tamás Halmos, Orsolya Külkey, Beryll Bornemisza, Nóra Hosszúfalusi, László Madácsy, Anna Körner, Andrea Luczay, László Blatniczky, Éva Baranyi, György Füst, Laura Horváth, Ágnes Vatay, László Romics: Immunogenetic and autoantibody analysis as a tool for the determination of the clinical spectrum of type 1 diabetes mellitus of autoimmune origin. Diabetologia Hungarica, 2002, 10 (suppl.2.), Önálló idézettség: 67 (2003. aug. 30-i állapot). Ismeretterjesztő közlemények választott szakterületének egyetemi végzettségű művelői részére 1. Pánczél, P.: Beszámoló a Juvenile Diabetes Foundation International Szigetsejt elleni antitest standardizálási workshop üléséről. /1987. New York/. Orv.Hetil., 1988, 129, Pánczél, P.: A lassan kialakuló felnőttkori autoimmun cukorbetegség. Családorvosi Fórum, 2002, 9, Eredeti közlemények összesített IF: 17,577 + kutatói levél IF 9,762 és 5,04