PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM

Átírás

1 PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM Biológia Doktori Iskola Összehasonlító Neurobiológia Program A nyálmirigy aminerg és peptiderg szabályozása valamint a nyálelválasztás molekuláris mechanizmusa az éti csigában (Helix pomatia) PhD értekezés Pirger Zsolt PÉCS,

2 A nyálmirigy aminerg és peptiderg szabályozása valamint a nyálelválasztás molekuláris mechanizmusa az éti csigában (Helix pomatia) Pirger Zsolt PhD értekezés Témavezető: Dr. Kiss Tibor, DSc Magyar Tudományos Akadémia Balatoni Limnológiai Kutatóintézet, Tihany Pécs-Tihany,

3 BEVEZETÉS A szájnyíláson keresztül a szájüregbe jutott táplálék előemésztését, falattá történő formálását, valamint a nyelés elősegítését a nyál biztosítja. A külön szervként elkülönülő nyálmirigy a soksertéjű gyűrűsférgeknél jelenik meg elsőként, majd valamennyi állattörzsben megtalálható különböző fejlettségi állapotban. A ragadozó, illetve növényevő életmód meghatározza a kiválasztott nyál összetételét. Egyes ragadozó életmódot folytató állatok nyálmirigysejtjei méregtermelésre is specializálódtak, mint pl. a Conus csigák nyálmirigyei, amelyek a conotoxint termelik, vagy a vérszívó rovarok, férgek nyálmirigyei, melyek antikoaguláns faktorokat termelnek. Eltérően a gerincesektől, a nyálmirigyek szekretoros mirigyvégkamrái a gerinctelenek esetében morfológiailag elkülönülő sejttípusokból épülnek fel. Ezek a különböző sejtek termelik a nyál egyes összetevőit, a fehérjéket, enzimeket, nyákot, mérgeket és antikoaguláns faktorokat. A sejtek összehangolt működését idegi szabályozás tartja fenn. A gerincesekben a nyálmirigy paraszimpatikus kolinerg és szimpatikus adrenerg bemeneteket kap. A gerinctelen szervezetek, köztük pl. a rovarok nyálmirigyében is jelen van a kolinerg szabályozás. Azonban számos szövettani, elektrofiziológiai és farmakológiai vizsgálat támasztotta alá, hogy a rovarokban a nyálmirigy idegi szabályozásában dopamin (DA) a jelentősebb ingerületátvivő. A rovarok nyálmirigyében a DA mellett további más transzmitterek és/vagy modulátorok, mint a szerotonin (5-HT), a proktolin és a nyálzást stimuláló peptid (SG-SASP) is képesek kiváltani nyálfelszabadulást. Noha a csigák pofa dúcaiban kimutatták a táplálkozási rendszert szabályozó DA-erg neuronokat, melyek fontos szerepet játszanak a táplálkozási mintázatgenerátor aktiválásában, a DA nyálmirigyben betöltött pontos szerepét nem tisztázták ezidáig. Továbbá, a csigák nyálmirigyének működésében, hasonlóan a DA-hoz, nem ismerjük a 5-HT és az acetilkolin (ACh) nyálelválasztásban betöltött szabályozó szerepét sem. A mirigysejtekből a szekréció történhet exocitozissal és holokrin vagy apokrin mechanizmussal. Holokrin szekrécióval működő mirigyek, mind a gerinctelen, mind a gerinces szervezetek körében ismertek, mint pl. a faggyúmirigyek, a madarak uropygiális (tollászkodó) mirigyei, a halak axilláris mirigyei, a Harder mirigyek és a halak, pókok, puhatestűek méregmirigyei. Ezeknél a mirigyeknél, a holokrin szekréció folyamatos váladéktermelést eredményez, így a szekrétum kiválasztása a felhasználáskor a tartalékból történik. A holokrin mirigyek végkamra sejtjei a váladéktermelésnél elpusztulnak és az egész sejt szekrétummá alakul át. Egyes szerzők szerint a holokrin szekréció egy szabályozott mechanizmus, amely azonos lehet az apoptózissal vagy a nekrózissal. Leírták, hogy a Biomphalaria straminea csiga faj nyálmirigyének sejttípusai holokrin szekréció során szabadulnak meg váladékuktól. A holokrin szekrécióval történő nyálfelszabadulás molekuláris mechanizmusát azonban nem ismerjük. A puhatestűek (Mollusca) a Földön ma élő második legnagyobb állatcsoport, fajszámában, csak az ízeltlábúak haladják meg. A törzs legnépesebb osztályát a csigák (Gastropoda) alkotják, melyek kevés számú, jól azonosítható idegsejtjeik miatt az idegrendszeri kutatások és különböző fiziológiai folyamatok sejtszintű vizsgálatainak kedvelt objektumaivá váltak. Legnagyobb termetű hazai fajunk, az éti csiga (Helix pomatia L., Pulmonata, Gastropoda) nyálmirigyének, mint viszonylag egyszerű modellnek a vizsgálata alapvető ismeretekhez vezethet nyálelválasztás sejtszintű és molekuláris mechanizmusának, valamint az idegrendszer szabályozó és integratív szerepének a megismerésében. A központi idegrendszer és a perifériális szervek közötti kémiai szignalizáció, valamint a modulálás mechanizmusai számos esetben hasonlóak a gerincesekben lejátszódó folyamatokkal, de ezek fajspecifikusak is lehetnek. CÉLKITŰZÉSEK Az éti csiga nyálmirigyének anatómiai felépítéséről, idegi szabályozásáról számos, azonban gyakran ellentmondó, információ áll rendelkezésünkre, szemben az acinussejtek nyugalmi állapotát fenntartó ionkonduktanciákkal, a mirigysejtek elektromos tulajdonságaival, azok 3

4 neurokémiai modulálhatóságával, elektrotónusos kapcsolataival, illetve a nyálfelszabadulás molekuláris mechanizmusával, melyekről nincsenek információink. Munkánk célja az volt, hogy elektrofiziológiai, immuncitokémiai, biokémiai és molekuláris biológiai módszerek segítségével vizsgáljuk a Helix nyálmirigyének működését, aminerg és peptiderg modulációját, valamint a nyálfelszabadulás lehetséges celluláris mechanizmusait. Célul tűztük ki tehát, hogy: i) azonosítsuk az éti csiga nyálmirigyét felépítő mirigysejt típusokat ii) leírjuk a mirigysejtek elektromos tulajdonságait és jellemezzük az azokat fenntartó ionáramokat, ionpumpa mechanizmusokat iii) vizsgáljuk a mirigy összehangolt működésének hátterében álló sejtközötti kommunikációs lehetőségeket, azok megjelenését, sejtfelszíni eloszlását iv) tanulmányozzuk a nyálszekréció celluláris eseményeit, nyomon kövessük a cisztás sejtek sorsát a nyálfelszabadítás mechanizmusában v) teszteljük transzmitterek és modulátorok hatását a nyálszekrécióra vi) azonosítsuk a nyálszekréciót hatásosan modulálni képes peptidet vagy peptideket vii) vizsgáljuk a sejthalál lehetséges szerepét a nyálszekrécióban, annak befolyásolhatóságát egyrészt transzmitter és modulátor molekulákkal (DA, 5-HT, ACh), másrészt egy ismert antiapoptotikus peptiddel, a PACAP-al ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Kísérleti állatok, preparálás és szövet-előkészítés Kísérleteinkben a kifejlett Helix pomatia aktív, inaktív és hibernált egyedeinek nyálmirigyét használtuk fel. A relaxált állatokat a bonctálban rögzítettük, majd a bélcsatornát a nyálmiriggyel és a bukkális masszával együtt eltávolítottuk. Ezután a bélről a nyálmirigyet lefejtettük, majd kitűztük. Az elektrofiziológiai kísérletekhez a nyálmirigyet beidegző neuronokat tartalmazó pofadúcokat is kipreparáltuk a miriggyel együtt. A mirigyet 2-3 mm 2 -es darabokra vágtuk, majd ezeket rögzítettük a regisztráló edényben. A kitűzött mirigyeket normál fiziológiás oldattal (mmban megadva, 80 NaCl, 4 KCl, 10 CaCl 2, 5 MgCl 2, 10 TRIS-HCl desztillált vízben oldva és beállítva NaOH-al a ph=7,4-re) áramoltattuk 1-2 ml/perc sebességgel. Szövettani vizsgálatok A fénymikroszkópos klasszikus szövettani és az elektronmikroszkópos vizsgálatokra az 1% PFA-t és 2,5% glutáraldehidet tartalmazó 0,1 M PBS-ben fixált majd dehidrált szöveteket Aralditba ágyaztuk, majd félvékony, illetve ultravékony metszeteket készítettünk. Az így készült félvékony metszeteket 1%-os toluidinkék oldattal festettük. Az ultravékony elektronmikroszkópos metszeteket utófixáltuk 1% OsO 4 -ot tartalmazó 0,1 M Na-cacodylatpufferben, majd JEOL 1200EX készülékkel vizsgáltuk azokat. A mirigyet a sejttípusok elkülönítésének céljából timsós hematoxilinnal és bázikus fuxinnal, míg a sejtosztódás kimutatására, HE-vel festettük. A festett metszeteket Zeiss Axioplan fénymikroszkópban vizsgáltuk. Immuncitokémiai eljárások Valamennyi általunk alkalmazott módszer az indirekt kétlépéses (fluoreszcens festékkel, vagy peroxidázzal kapcsolt IgG), illetve a Sternberger-féle (1979) háromlépéses peroxidáz-anti- 4

5 peroxidáz eljárás elvén alapult. A szövetelőkészítés során a 4% PFA-t tartalmazó 0,1 M PBS-ben rögzített mintákat 20%-os szacharóz oldatban inkubáltuk, majd Tissue-Tek fagyasztóközegbe ágyaztuk, kriosztátban fagyasztottuk végül µm-es metszeteket készítettünk. A metszeteket az elsődleges antitestekkel, majd a megfelelő másodlagos antitestekkel inkubáltuk. A nyálmirigy korai apoptotikus folyamatainak megjelenítéséhez Annexin V-CY3, valamint TACS-XL DAB in situ apoptózis detektáló kittet használtunk. Az apoptotikus folyamatok során, a mitokondriumban lejátszódó potenciálváltozások nyomon követésére MitoCapture kitet alkalmaztuk. Western-blot analízis A nyálmirigy fehérje tartalmát SDS-pufferben történő homogenizálással feltártuk. A homogenizátumot centrifugálással tisztítottuk, a felülúszót eltávolítottuk és SDS-minta-pufferrel 1:1 arányban hígítottuk. A mintákat denaturáltuk, 10-15% SDS-poliacrilamid gélen szeparáltuk a fehérjéket elektroforézissel, majd PVDF membránra elektroblottoltuk azokat. A blotolás után a membránt tejporral blokkoltuk, majd a fehérjéket a megfelelő elsődleges antitestekkel reagáltattuk. Az immunreakciót a másodlagos antitesttel történő inkubálást követően DAB és H 2 O 2 oldattal intenzifikáltuk. A minták átlagos, totál fehérje tartalma ~85 µg volt, amit Bradford reagenssel határoztuk meg. Az immunhisztokémia és a WB kontrollkísérletei A legtöbb antitestnél preabszorbciós kontroll kísérleteket végeztünk a felismerési szekvenciát specifikusan blokkoló peptiddel. A preabszorbciós kontrollban nem kaptunk jelölést. Az innexin- 2 és az aktív-kaszpáz-3 antitestek esetében nem rendelkeztünk blokkoló peptidekkel, így WB kísérletekben ellenőriztük a specificitást, afrikai vándorsáska nyálmirigy- és patkány agyihomogenizátumot használva pozitív kontrollként. A WB kísérletek belső kontrolljaként antiaktin antitestet alkalmaztunk. Minden esetben készítettünk negatív kontrollokat is az elsődleges és a másodlagos antitestek kihagyásával. Mivel a negatív kontroll kísérletek esetében nem detektáltunk jelet, és a pozitív kontrollal megegyező sávokat kaptuk, a kontrollok alapján a csiga minták jeleit specifikusnak tekintettük. Elektrofiziológiai vizsgálatok Az idegingerlések során a négyszög impulzusokat bipoláris, ezüst elektródán keresztül közvetítettük a pofadúcokat összekötő komiszúrákon keresztül. Az anyaghatások vizsgálatánál az ACh, 5-HT és DA transzmittereket egy mikroperfúziós rendszerrel perfundáltuk a mérőedényen keresztül. Az anyagok végkoncentrációja soha nem volt magasabb, mint M. Áramméréseinkben a kálium áramokat TEA és 4-AP specifikus kálium csatorna blokkolók jelenlétében azonosítottuk. A kalcium áramok blokkolása céljából CdCl 2 -ot oldottunk a normál fiziológiás oldatban. A klorid áramok azonosításához acetát ionokkal helyettesítettük a Cl - -at izomoláris mennyiségben. A klorid csatornák blokkolására NPPB-t alkalmaztunk. A mirigysejtek nyugalmi membránpotenciálját, az idegingerlésre és anyaghatásra történő elektromos változásokat, valamint az ionáramokat Axoclamp 2B erősítővel erősítettük, majd szűrtük és egy TL-1, illetve Digidata 1200 jelátalakító segítségével digitalizáltuk. Az intracelluláris elektródákat boroszilikát üveg kapillárisokból vertikális elektródahúzóval készítettük. Az MP mérésekben MΩ, míg a voltage-clamp mérésekben 4-8 MΩ ellenállású elektródákat alkalmaztunk. Az egy-mikroelektródás voltage-clamp mérésekben a protokollokpclamp programmal generáltuk. Az elektrofiziológiai adatokat Origin 6.07-es programmal dolgoztuk fel. 5

6 Programozott sejthalál indukálása és kvantifikálása a nyálmirigyben A nyálmirigy sejtekben a programozott sejthalált különböző anyagokkal és a nyálidegen keresztüli elektromos stimulációval váltottuk ki. A szerveket 10-4 és 10-8 M DA és 5-HT oldatokkal inkubáltuk. Más esetekben, a DA kezelés előtt DA receptor antagonistákkal (fluphenazin, etikloprid), vagy a K-csatorna blokkolókkal (TEA; 4-AP) előinkubáltuk a nyálmirigyeket. A kezelések után a mintákat 4% PFA oldatban rögzítettük, majd 10 µm metszeteket készítettünk. A TACS-XL pozitív (apoptotikus) sejtek számát az egyes állatok nyálmirigyéből (n=6-8) készített metszetek három területének (1,8 mm 2 területet használtunk 400-as nagyításnál) átlagaként határoztuk meg. A specifikusan jelölt (TACS-pozitív) és a nem jelölt (TACS-negatív) sejtek egymáshoz viszonyított arányát egységnyi területen Zeiss Axioplan mikroszkópban számoltuk, majd az átlagértékeket ábrázoltuk oszlopdiagramon a SEM feltüntetésével OriginPro7.5-ös programot használva. Radioimmunoassay (RIA) A PACAP27 és PACAP38 tartalom RIA-val történő meghatározásának céljából a mintákat megfelelően előkészítettük. A PACAP38 C-terminális fragmentje (PACAP24-38) és a PACAP27 jodidálva volt és az egyes frakciókat fordított-fázisú HPLC-vel szeparáltuk annak megfelelően. A mono-jodidált formát a RIA mérés nyomjelzőjeként alkalmaztuk. A szintetikus PACAP38 és 27 formákat standardként használtuk. A meghatározás során 100 µl antitestet valamint 100 µl RIA nyomjelzőt és 100 µl PACAP standardot vagy mirigy mintát összemértünk, majd inkubáció után, elkülönítettük az antitest kötött fehérjéket a szabad fehérjéktől 100 µl szeparáló oldattal. A centrifugálást követően a felülúszót óvatosan leöntöttük, és a minták radioaktivitását egy gammaszámlálóban mértük. A nyálmirigy minták PACAP38 és PACAP27 koncentrációja leolvasható volt a megfelelően elkészített kalibrációs görbéről. Citokróm-c meghatározás A nagyobb detektálható jel reményében a vizsgálatokban inaktív állatok nyálmirigyét alkalmaztuk. A mirigyek egy részét kontrollként használtuk méréseinkben (n=6; 0,197g) míg másik részüket (n=6; 0,188g) 10-4 M DA oldatba áztattuk 30 percig. Ezt követően mindkét mintát homogenizáltuk izo-ozmotikus cukor oldatban. A módosított, eredetileg Whittaker (1965) által leírt differenciált centrifugálási módszer alapján szeparáltuk a mitokondriális és a sejtalkotóktól mentes citoszól frakciót. A tiszta citoszól frakció tartalmazta a leadott citokróm-cmolekulákat. A mitokondriális frakcióban a citokróm-c leadását CaCl 2 hozzáadásával indukáltuk és folyamatosan mértük fotométerrel az áteső fény abszorpcióját. A citokróm-c abszorbanciáját (A) a kontroll és a DA-kezelt mintákban 540 nm-nél spektrofotométerrel mértük. A citokróm-c meghatározott abszorbancia értékeit OriginPro7.5 programmal dolgoztuk fel. EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK A csigák nyálmirigyében alapvetően négy sejttípust különítettünk el félvékony metszeteken toluidinkék festés mellett: a nyálkasejtet, a szemcsés sejtet, a vakuoláris sejtet és a cisztás sejtet. A negyedik sejttípus, a cisztás sejt a vakuoláris sejtek érési folyamatának eredményeképpen alakul ki a vakuólumok összeolvadásával. Véleményünk szerint, ez a sejttípus az aktív állatok nyálmirigyében gyakori és szoros kapcsolatban áll a nyálfelszabadulással. A csigák nyálmirigyére vonatkozó korábbi irodalmi adatok szerint a mirigysejtek igen széles skáláját írták le azonos csigafajok esetében is. Ennek hátterében a szezonális változások mellőzése, illetve az aktív és inaktív állapotok definiálásának a hiánya állhat. A mirigyállományban a különböző 6

7 sejttípusok acinusokba tömörülnek, melyekben elszórtan savós és nyákos mirigyváladékot termelő sejteket találtunk. Ebből adódóan a felszabaduló nyál kevert összetételű, amely enzimekben gazdag emésztő- és fehérjékben szegény hígító nyálat tartalmaz. A HE festéssel az acinusok perifériás területein osztódó sejtek rétegét azonosítottuk. Az osztódó sejteket korai proliferációt detektáló Ki67 antitestekkel is kimutattuk. Ezeknek az osztódó sejteknek a száma aktivitásfüggést mutatott, az aktívan táplálkozó állatok nyálmirigyében erőteljesebb volt a proliferáció. Feltételezések szerint, a cisztás sejtből a nyálfelszabadulás holocrin mechanizmussal történik. Ezt a feltételezést erősítették meg adataink, miszerint az osztódó sejtek mellett a félvékony, toluidinkék festett sorozatmetszeteken intralobuláris nyálvezetékek mentén sejttörmeléket azonosítottunk az aktív állatok nyálmirigyében. A sejttörmelék mennyisége, hasonlóan a proliferatív sejtekhez, függött az állat aktivitási állapotától. Az aktív állatokban a sejttörmelék mennyisége nagyobb volt, mint az inaktív állatok nyálmirigyében. A sejttörmelék az érési ciklus eredményeként pusztuló, a sejthalál klasszikus morfológiai és élettani jellemzőit mutató mirigysejtek maradványa. Az érés során kialakuló cisztás sejtek váladékukat a sejtpusztulás során adják le. Az aktív állatok nyálmirigyében a vacuoláris és cisztás sejtek pusztulási folyamatát apoptózisként azonosítottuk Annexin V-Cy3 és TACS-XL in situ apoptózis detektáló kitek segítségével. A nyálmirigy ultrastruktúrális vizsgálata során különböző típusú membránkapcsolatokat tártunk fel a szomszédos mirigysejtek között. A nem specializált lazább sejtkapcsolatok esetében széles extracelluláris tér volt látható (20 és 150 nm). A szorosabb membránkapcsolatokban a szomszédos sejtek membránja közötti távolság erőteljesen lecsökkent (10-20 nm). Máskor, az egymással parallel futó membránszakaszokon megnövekedett elektron denzitás volt megfigyelhető, elkülönült, széles sejt közötti térrel (~60 nm). Ezt a specializált membránkapcsolatot dezmoszóma-szerű sejtkapcsolatnak azonosítottuk. A szomszédos mirigysejtek klasszikus kommunikációs csatornája, a réskapcsolat (gap-junction) is kimutatható a mirigysejteken, melyet szoros membránkapcsolat jellemez (2-4 nm). Immunhisztokémiai technikát alkalmazva azonosítottuk ennek a specializált mirigykapcsolatnak a hátterében álló molekuláris struktúrákat, az innexineket. Az elektronmikroszkópos felvételeken azonosított elektrotónusos sejtkapcsolatok jelenlétét elektrofiziológiai méréseink is alátámasztották, ugyanis azt találtuk, hogy két egymáshoz közeli, mintegy 7-10 sejt távolságban elhelyezkedő (kb. 300 µm) mirigysejt között az ingerület elektrotónusos terjedése jó. A sejt-sejt közötti elektrotónusos kapcsolatok a szegényes beidegzés ellenére biztosítják a mirigy szinkronműködését. A mirigysejtek MP értéke a -30 és -80 mv-os értéktartomány közé esett, átlagos értéke -56,6 ± 9,8 mv-nak adódott (n=483) normál fiziológiás oldatban. Ez az átlagérték nem mutatott jelentős eltérést a gerincesek, vagy a rovarok exokrin nyálmirigysejtjeinek MP értékétől. A nyugalmi MP fenntartásában elsősorban a K + -ok vettek részt, de kimutattuk, hogy az elektrogén Na-pumpák és a Cl - -ok szerepe is jelentős. A mirigysejtek mikroelektródával történő megszúrásuk után általában nem mutattak elektromos aktivitást, azonban egyes esetekben transzmitter felszabadulás okozta spontán miniatűr potenciálokat figyeltünk meg. Alkalmanként, a miniatűr potenciálok összegződtek és EPSP-ok voltak rögzíthetők, de regeneratív AP-t nem detektáltunk. Néha AP-szerű, un. junctios potenciálokat láttunk, melyek amplitúdója 5 és 25 mv között mozgott. A mirigysejtekben feszültség-függő inward és outward membrán áramokat regisztráltunk adott lépéssel depolarizálva a sejtet egy-mikroelektródás voltage-clamp technikával. A mérések során meghatároztuk a mirigysejtek működésében részt vevő ionáramokat, úgy mint a I K, I A, I K(Ca) és az I Ca -t. A totál outward K-áram 62%-a TEA szenzitív I K komponens, míg 27%-a kalcium-függő I K(Ca) komponens volt. A mirigysejtpopuláció egy részében 4-AP szenzitív I A áramkomponens is mérhető volt, ami a totál áram 55%-t tette ki. Az inward áram valószínűleg egy T-típusú kalcium-csatornán keresztül vándorolt és Cd 2+ -al 100%-ban blokkolható volt. Ezek az ionáramok határozzák meg és tartják fenn a mirigysejtek elektromos tulajdonságait. 7

8 A pofadúcból eredő és a nyálmirigy működését szabályozó nyálideg elektromos ingerlése 30 mv körüli depolarizációt váltott ki a nyálmirigysejtekben. Hasonló depolarizációs válaszokat regisztráltunk, ha a mirigyet M végkoncentrációjú ACh-al, DA-al és 5-HT-al kezeltük. A legerőteljesebb depolarizáló hatása az idegingerlésnek volt. Az idegingerlés, az ACh és a monoamin kezelés hatására kialakuló MP változás a mirigysejtekből kiváltott szekretoros potenciálként azonosítható. A szekretoros potenciál kialakításának hátterében álló idegvégződéseket elektronmikroszkópos felvételeken azonosítottuk a mirigysejtek között. A varikozitások szoros (16-20 nm), de nem specializált kapcsolatokat alakítanak ki a mirigysejtekkel. A különböző transzmitter molekulák hatását a felszabadított nyál mennyiségének mérésével is teszteltük. A szekretoros potenciálok indukálásában a leghatásosabb szignálmolekula az ACh, míg a nyálelválasztás szabályozásában a DA volt. Az idegrendszerben hatásos neuropeptidek, mint pl. MIP, FMRFa, CARP, szekretoros potenciált nem generáltak, azaz feltehetően a nyálelválasztás szabályozásában nincs transzmitter funkciójuk. Különbséget találtunk az aktívan táplálkozó, illetve inaktív állatok nyálmirigye között a TUNEL-pozitív (apoptotikus) sejtszám tekintetében. Az aktív állatok nyálmirigyében megnövekedett TUNEL-pozitív sejtszám volt detektálható, szemben az inaktív mirigyekkel. A mirigysejtek közül elsősorban a vakuoláris- és cisztás sejtek mutattak TUNEL pozitivitást. Ez arra utalt, hogy a táplálkozás során ezek a sejtek a megfelelő jelre apoptózis során elpusztultak, miközben leadták az általuk termelt nyálat. De mi lehetett az apoptotikus szignált kiváltó jel? Korábbi biokémiai mérések igazolták, hogy a DA koncentrációja az éhes, táplálkozását megkezdő állatok nyálmirigyében szignifikánsan magasabb, mint a jóllakott állatokéban. Eredményeink szerint a nyálelválasztás leghatásosabb transzmittere, a DA, amely képes volt az apoptotikus sejtszámot jelentősen megnövelni az inaktív állatok nyálmirigyében. Hasonló eredményeket kaptunk az idegingerléssel is, mely során többek között DA szabadul fel az idegvégződésekből. A DA a D2 receptoron keresztül fejti ki hatását, ugyanis a receptor eticlopriddal történő szelektív blokkolásakor a DA apoptózis indukáló hatása elmaradt. A TEA, mint az I K szelektív blokkolója gátolta a DA apoptózis stimulációját, míg a tranziens K-áramot blokkoló 4-AP hatástalan volt. Ez azt jelentette, hogy a DA apoptózis stimuláló hatását részben a D2 receptorokon hatva, részben pedig a K + homeosztázisának befolyásolásával fejti ki. A DA által kiváltott MP változás (szekretoros potenciál) az intracelluláris K + koncentráció csökkentésén keresztül befolyásolja a mitokondriumok transzmembrán potenciálját (MMP) is. Kialakulnak a mitokondrium membránpórusai, melyek elmélyítik a MMP megváltozását. A membránpórusok kialakításában résztvevő számos elem közül az inaktív Bcl2 és az aktív Bad fehérjék részvételét mutattuk ki a mirigysejtekben WB technikával. Az antiapoptotikus (Bcl2) és a proapoptotikus (Bad) fehérjék aránya, amely eldönti a sejt sorsát azáltal, hogy elindul-e az apoptózis intrinsic útvonala, alapvetően függött az állat aktivitási állapotától ill. a DA szinttől. A pro- és antiapoptotikus fehérjék arányát a DA kezelés az aktív Bad molekula felé mozdította el,alátámasztva a DA apoptózist serkentő hatását. A kialakított membránpórusokon keresztül megnőtt a mitokondrium mebránjának az áteresztőképessége és a citokróm-c, mint legfontosabb apoptózis indukáló faktor a citoplazmába transzlokálódott. Az inaktív állatok nyálmirigyében a DA kezelés fokozni tudta a citokróm-c mitokondriumból történő felszabadulását. A citokrom-c a kaszpáz-9 és az APAF-1 molekulákkal kialakítja az apoptoszómát, ami az apoptózis legfontosabb szabályozó molekuláját, a kaszpáz-3-at aktiválja az intrinsic apoptotikus szignálban. Immunhisztokémiai és WB technikával a megfelelő antitestek felhasználása mellett azonosítottuk a cisztás sejtekben az aktív-kaszpáz-3-at, mint az apoptózis legfontosabb irányító és végrehajtó molekuláját. Az aktív-kaszpáz-3 immunopozitív jeleket a cisztás sejtek citoplazmájában a mebránközeli régióban azonosítottuk kizárólagosan. A DA képes volt megemelni az aktív-kaszpáz-3 molekula mennyiségét a jelátviteli mechanizmus eredményeként. Azonban eticloprid jelenlétében a DA kaszpáz-3 aktiváló hatása blokkolható volt. A kaszpáz-8 molekulát, amely az extrinsik és intrinsik útvonalat összekapcsolja, a jelátviteli folyamatokban nem tudtuk kimutatni, így feltételezhető, hogy a klasszikus extrinsik útvonal nem vesz részt a 8

9 mirigysejtek apoptotikus folyamataiban. Véleményünk szerint valamely más útvonal és/vagy ezidáig nem azonosított molekula(ák) kapcsolja össze a receptor közvetített DA hatást és az apoptózis intrinsic útvonalát egymással. Ezt alátámasztja az MßCD jelenlétében megismételt DA inkubáció alatt tett megfigyelés is. Az MβCD gátolja a membránban a ceramid közvetítette lipidszigetek kiépülését, amelyen a jelátviteli útvonal egyes elemei, mint receptorok, ioncsatornák, enzimek, stb. horgonyoznak. Amikor a ceramidot gátoljuk a lipid-szigetek kiépülése nem történik meg, a szignáltranszdukció sérül, így a DA hatás nem jut el a mitokondriumig, ennek következtében a DA citokróm-c felszabadulást serkentő hatása elmarad. Valószínű, hogy a ceramid kulcs molekulája a jelátviteli folyamatoknak a nyálmirigyben. A nyálmirigyben megfelelő antitestek felhasználásával PACAP tartalmú mirigysejteket detektáltunk, míg PACAP immunoreaktív idegelemeket, a gerincesek exokrin mirigyeivel ellentétben, nem azonosítottunk. RIA mérések eredményeként kimutattuk a PACAP mindkét formáját a mirigyszövetben, melyek koncentrációja aktivitásfüggést mutatott. Biokémiai méréseinkkel igazoltuk, hogy a PACAP funkcióképes molekula a mirigysejtekben, mivel a PACAP kezelés hatására 50%-al megnövekedett a camp koncentrációja (camp assay kit, Biorad). Kimutattuk a PACAP antiapoptotikus hatását a mirigysejtekben, ugyanis a DA és a colchicine apoptózist indukáló hatását a PACAP leblokkolta. A PACAP hatás a kaszpáz-3 molekulák esetében is kimutatható volt. A PACAP jelenlétében a DA nem volt képes megemelni az aktív-kaszpáz-3 molekula koncentrációját a mirigysejtekben. ÖSSZEFOGLALÁS Munkánk célja az volt, hogy elektrofiziológiai, immuncitokémiai, biokémiai és molekuláris biológiai módszerekkel vizsgáljuk a nyálmirigy működését, különös tekintettel a nyálfelszabadulás molekuláris mechanizmusára. Az éti csiga nyálmirigye, mint minden szerv, az idegrendszer irányítása alatt áll. A gerinces mirigysejtektől elektromos tulajdonságaik szempontjából nem különböző egyes mirigysejt típusok acinusokba tömörülnek, melyben elektrotónusosan kapcsoltak egymással. Ez, a viszonylag szegényes beidegzés ellenére biztosítja a nyálmirigy szinkron működését. A mirigysejtek között található idegvégződésekből a nem szinaptikus kapcsolatokon keresztül, az idegingerlés során felszabaduló transzmitterek (DA, 5- HT, ACh) szekretoros potenciálokat generálnak, melyek hatására a nyálsejtekből megtörténik a nyálfelszabadulás exocitózissal, illetve vacuoláris és cisztás sejtek esetében holokrin szekrécióval. A holokrin szekrécióval egyenértékű folyamatként a nyálszekrécióban az apoptózis azonosítható. Az apoptózis meghatározott morfológiai és biokémiai elváltozásai, mint foszfatidilszerin molekulák külső membránba történő megjelenése, a citoplazmatikus és nukleáris elemek fragmentációja, a fehérjék degradációja és a sejtmembrán felszakadozása megfigyelhető volt a mirigysejtekben. Az elsődleges nyálvezetékek mentén megjelenő sejttörmelék a felszabaduló nyállal eliminálódott. Az apoptózis ebben a formájában a mindennapi nyálszekréció eszköze, s mint ilyen fiziológiai folyamat. Az apoptózist intrinsic és extrinsic szignálok szabályozzák. Az intrinsic útvonal aktiválódásának eredményeként a mitokondriumból citokrómc szabadul fel a citoplazmába. Kísérleteink igazolták, hogy a nyálelválasztás molekuláris mechanizmusa során a transzmitterként felszabaduló DA a D2 receptoron keresztül stimulálja a citokróm-c transzlokációját, amely folyamat a pro- és antiapoptotikus Bcl-2 fehérjék szabályozása alatt áll. Mindemellett a fokozott K + leadás is képes apoptózist indukálni. A DA stimulálta a mirigysejtekben a TEA szenzitív K-csatornák működését, megnövekedett a K-efflux, ami apoptotikus szignált generált. Az alacsony intracelluláris K + koncentráció közvetlenül is képes fokozni a kaszpáz-3 aktivációját. Igazoltuk, hogy a DA a D2 receptorokon közvetlenül illetve a K + homeosztázisán keresztül képes az apoptózis végrehajtó molekuláját, a kaszpáz-3-at aktiválni. A nyálelválasztásban az extrinsic és intrinsic útvonalakat összekapcsoló folyamat ez idáig ismeretlen, ugyanis a kapcsoló molekulát, a kaszpáz-8-at nem sikerült kimutatni a jelátviteli 9

10 mechanizmusban. DA által aktivált apoptotikus folyamatok hatásosan blokkolhatók az éti csiga egyik endogén peptidjével, a PACAP-al. A PACAP hatás célmolekulája a kaszpáz-3 molekula. 10

11 KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE A disszertáció alapjául szolgáló közlemények Pirger, Zs., Elekes, K., Kiss, T. (2004): Functional morphology of the salivary gland of the snail, Helix pomatia. Acta Biol. Hung; 55:1-4. IF: 0,447 Pirger, Zs., Elekes, K., Kiss, T. (2006): Electrical properties and cell-to-cell communication of the salivary gland cells of the snail, Helix pomatia. Comp. Biochem. Phys. Part A; 145:7-19. IF: 1,553 Pirger, Zs., Németh, J., Hiripi, L., Tóth, G., Kiss, P., Lubics, A., Tamás, A., Hernádi, L., Kiss, T., Reglődi, D. (2008): PACAP has anti-apoptotic effect in the salivary gland of an invertebrate species, Helix pomatia. J. Mol. Neurosci.; in press. IF: 2,965 Hernádi, L., Pirger, Zs., Kiss, T., Németh, J., Márk, L., Kiss, P., Tamás, A., Lubics, A., Tóth, G., Shioda, S., Reglődi, D. (2008): The presence and distribution of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and its receptor (PAC1-R) in the snail Helix pomatia. Neuroscience; 155(2): IF: 3,427 Pirger, Zs., Rácz, B., Kiss, T. (2009): Mitochondrial-caspase dependent programmed cell death provides a physiological mechanism for mucus release from the snail salivary gland. Biol. Cell; in press. IF: 4,303 A disszertációhoz kapcsolódó konferencia előadások, poszterek Pirger, Zs., Elekes, K., Kiss, T. (2003): Morphological changes accompanying the saliva production in the salivary gland of the snail, Helix pomatia. 10 th Symp. Invertebr. Neurobiol. (ISIN), Tihany (abstract). Pirger, Zs., Elekes, K., Kiss, T. (2004): Aminergic and peptidergic regulation of the snail salivary gland: electrophysiology and immunocytochemistry. IBRO-MITT Internat. Workshop, Budapest. Clinical Neurosci., Ideggyógyászati Szemle, 57:75, 1. különszám. Pirger, Zs., Elekes, K., Kiss, T. (2004): Aminergic and peptidergic regulation of the snail gland: electrophysiology and immunocytochemistry. IV. Magyar Sejtanalitikai Konferencia, 2004, Budapest (abstract). Pirger, Zs., Elekes, K., Kiss, T. (2004): Aminergic and peptidergic regulation of the snail gland: electrophysiology and immunocytochemistry. 4 th Forum Europ. Neurosci. (FENS), Lisbon, Portugal, abstract no. A-082. Pirger, Zs., Elekes, K., Kiss, T. (2005): Electrical properties and voltage-gated ion-channels of the snail, Helix pomatia, salivary gland cells. A Magyar Biofizikai Társaság XXII. Kongresszusa, Debrecen (abstract)pirger, Zs.,. Elekes, K., Kiss, T. (2005): Electrical properties and voltage-gated ion-channels of the salivary gland cells of the snail, Helix pomatia. 15 th IUPAB and 5 th EBSA Internat. Biophysics Congress, France, Montpellier. Eur. Biophys. J. 34:651, number 6., abstract no. P-276. Pirger, Zs., Kiss, T. (2006): Nyálfelszabadulás apoptózissal az éti csiga nyálmirigysejtjeiből. V. Magyar Sejtanalitikai Konferencia, Budapest, abstract no. A Pirger, Zs., Kiss, T., Németh, J., Hernádi, L., Reglődi, D. (2007): The presence and distribution of pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) and its receptor (PAC-R) in the snail; oral presentation.11th Symposium on Invertebrate Neurobiology (ISIN), Tihany, Hungary Pirger, Zs, Reglodi D, Hernadi L, Nemeth J, Toth G, Kiss P, Lubics A, Kiss T. (2007): PACAP has antiapoptotic effect in the salivary gland of a molluscan species, Helix pomatia. 8 th Symposium on VIP, PACAP, and Related Peptides, Manchester and Burlington, Vermont, USA; J. Mol. Neurosci. 33:

12 Egyéb közlemények Pirger, Zs., László, Z., Kiss, T. (2006): G-protein coupled receptor kinase-like immunoreactivity in the snail, Helix pomatia, neurons. Brain Res.; 1122(1):10-7. IF: 2,341 Nikitin, ES., Vavoulis, DV., Kemenes, I., Marra, V., Pirger, Zs., Michel, M., Feng, J., O'Shea M, Benjamin PR, Kemenes, G. (2008): Persistent sodium current is a nonsynaptic substrate for long-term associative memory. Curr. Biol.; 18(16): IF:10,539 Könyvfejezet Kiss, T., Pirger, Zs., (2006): Neuropeptides as modulators and hormones in terrestrial snails: Their occurrence, distribution and physiological significance. part 4. Transworld Research Network, (ISBN: ), Invertebrate neuropeptides and hormones: Basic knowledge and recent advances; Editor: Honoo Satake, Kerala, India Egyéb konferencia előadások, poszterek Pirger, Zs., Szappanos, H., Gönci, M. (2003): Purinerg signaling mechanisms in cultured mouse skeletal muscle cells. 9 th Conference of the Hung. Neurosci. Soc., Balatonfüred; Clinical Neurosci., Ideggyógyászati Szemle, 56:71, 2. különszám. Pirger, Zs., László, Z., Kiss, T. (2005): Occurrence and the role of G-protein coupled receptor kinase in the desensitization of mytilus-inhibitory peptide receptors in Helix pomatia. 11 st. MITT kongresszus, Pécs; Clinical Neurosci., Ideggyógyászati Szemle, 58:77, 1. különszám. Pirger, Zs., László, Z. and Kiss, T. (2006): G-protein coupled receptor kinase-like immunoreactivity in the snail, Helix pomatia. 5th Forum of European Neuroscience (FENS), Vienna, Austria, abstract no. A Pirger, Zs., Juhász-Vedres, G., Kiss, T. (2007): Distribution and localization of different sodium channel subtypes in snail; poster presentation. 11th Symposium on Invertebrate Neurobiology (ISIN), Tihany, Hungary Kiss, T., Pirger, Zs., Kemenes, G., (2007): Food-aversive conditioning increases persistent Nacurrent in withdrawal interneurons; poster presentation. 11th Symposium on Invertebrate Neurobiology (ISIN), Tihany, Hungary Hiripi, L., Pirger, Zs., Kiss, T., Elekes, K. (2007): Protein phosphorylation in the heart and foot of Helix pomatia during active state; oral presentation. 11th Symposium on Invertebrate Neurobiology (ISIN), Tihany, Hungary Pirger, Zs., Elekes, K., Kiss, T., Hiripi, L. (2007): Activity state of Helix pomatia is regulated by a serotonin-receptor coupled to adenyl-cyclase; poster presentation. Society for Neuroscience, San Diego, California, USA Kiss, T., Pirger, Zs. (2008): A perzisztens Na-csatornák és szerepük az elemi tanulásban; előadás. 38. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, Magyarország Reglodi, D., Pirger, Zs., Mark, L., Nemeth, J., Hiripi, L., Kiss, P., Lubics, A., Tamas, A., Kiss, T. (2008): Activity-dependent changes in the protein composition of Helix pomatia with special reference to pituitary adenylate cyclase activating polypeptide; 24. Conference of European Comparative Endocrinologists (CECE), Genoa, Italy 12

13 UNIVERSITY OF PÉCS Biological Doctoral School Comparative Neurobiology Program The aminergic and peptidergic modulation of salivary gland and molecular mechanism of saliva release in terrestrial snail (Helix pomatia) PhD. thesis Zsolt Pirger 13

14 2008, PÉCS The aminergic and peptidergic modulation of salivary gland and molecular mechanism of saliva release in terrestrial snail (Helix pomatia) Zsolt Pirger PhD. thesis Supervisor: Dr. Tibor Kiss, DSc Balaton Limnological Research Institute Hungarian Academy of Sciences, Tihany 2008, Pécs -Tihany 14

15 INTRODUCTION Saliva is responsible for the predigestion of food entering the mouth cavity through the mouth, its formation to mouthful, and for the promotion of swallowing. The salivary gland as a separate organ first appeared in bristle worms (Polychaeta), and then in all animal phyla in various developmental states. The composition of released saliva is determined by the predatory or herbivorous lifestyle. The salivary gland cells of some predator species are even specialized in poison production, such as the salivary glands of Conus snails which produce conotoxin, or the salivary glands of bloodsucker parasites which produce anticoagulant factors. Unlike in vertebrates, the secretory acini of the salivary glands of invertebrates consist of morphologically diverse cell types. Various cell types produce different components of the saliva, such as proteins, enzymes, mucus, poisons or anticoagulant factors. The function of the salivary cells is coordinated by the nervous system. In vertebrates, the salivary gland is under parasympathetic (cholinergic) and sympathetic (adrenergic) regulation. Cholinergic regulation is also present in the salivary gland of invertebrates for example in insects. However, several histochemical, electrophysiological and pharmacological examinations have shown that dopamine (DA) is the most important neurotransmitter in the nerve modulation of the insect salivary gland. Besides DA, other transmitters and/or modulators, such as serotonin (5-HT), proctolin and SG-SASP can also trigger saliva release in the salivary gland of insects. In the buccal ganglia of snails, DAergic neurons have been found, which regulate the food-in-take system and play a prominent role in the activation of the central pattern generator of feeding. However, the role of DA in the salivary gland has not yet been identified. Furthermore, the regulatory role of 5-HT and acetylcholine (Ach) in saliva secretion is not known either, in the salivary gland of snails. The secretory product of the exocrine salivary gland is excreted into the mouth cavity through the salivary duct. Excretion from the salivary gland cells may take place by exocytosis and holocrine or apocrine mechanism. Holocrine secretion is known both in invertebrate and vertebrate organisms, such as, for example, in the sebaceous glands, the uropygial glands of birds, the axillary glands of fish, the harderian glands, and in the venom glands of fish, spiders and molluscs. In these glands, holocrine secretion results in continuous excretion, so mucus is released from stock when needed. During mucus release the acinar cells of the holocrine glands perish, transforming the whole cell into secretory product. According to some authors, holocrine secretion is a controlled mechanism, which could be similar to apoptosis or necrosis. The salivary gland cells of the snail species Biomphalaria straminea have been described to release mucus by holocrine secretion. However, the molecular mechanism of the saliva release by holocrine secretion is not yet known. Molluscs represent the second largest animal group living on the Earth at present, only Arthropods have more species. The class of snails (Gastropoda) is the most populous one with in the phylum. Thanks to their few and easily to identifiable neurons, snails have become popular objects of neuronal research and of the cell-level examination of various physiological processes. We examined the salivary gland of the terrestrial snail (Helix pomatia L., Pulmonata, Gastropoda), the largest snail species in Hungary, using it as a relatively simple model to explore the cellular and molecular mechanisms of the salivation and to explore the regulatory and integrative role of the nervous system in this process. Chemical signalization and the mechanisms of modulation between the central nervous system and peripheral organs are similar to the processes in vertebrates in several cases, but they may be species specific as well. AIMS There are a number of frequently contradictory information on the morphology and neuronal regulation of the salivary gland of Helix pomatia. However, we do not have any information 15

16 about ion conductance of the acinar cells, both in resting and active states, about neurochemical modulation and electrical coupling of acini or the molecular mechanism of saliva release. Therefore, our aims were to study the aminergic and peptidergic modulation of the salivary gland of Helix, and the cellular mechanisms of saliva release, applying electrophysiological, immunohistochemical, biochemical and molecular biological methods. Our aims were: i) to identify the different gland cell types of the salivary gland of Helix; ii) to describe the electrical properties of salivary gland cells, and to characterise their ion currents and ionic pump mechanisms; iii) to examine the possibilities of cell to cell communication that ensure the synchronised activity of the gland, and to study appearance and distribution these molecules on the cell surface; iv) to study the cellular mechanisms of saliva secretion, to follow up the destiny of cystic cells during the mechanism of saliva release; v) to test the effect of transmitters and modulators on saliva secretion; vi) to identify the peptide(s) that can effectively modulate saliva secretion; vii) to observe the potential role of apoptosis in saliva release, and its responsiveness to transmitters and modulator molecules (DA, 5HT, ACh), and to a well known antiapoptotic peptide, PACAP. MATERIALS AND METHODS Experimental animals and preparation Experiments were carried out on the salivary gland of adult active, inactive and hibernated specimens of Helix pomatia. The relaxed animals were fixed in the preparation chamber, then the intestine with salivary gland and buccal mass was dissected. Thereafter, the salivary gland was detached from the intestine, and pinned out. In the case of electrical stimulation, the buccal ganglia, which contain the salivary gland innervating neurons, were also prepared together with the salivary gland. Approximately 2-3 mm 2 pieces of the anterior salivary gland were pinned out into the recording chamber and used for voltage clamp experiments. Both whole salivary glands and pieces of the gland were perfused at a rate of 1-2 ml/min with normal physiological saline (in mm; NaCl 80, KCl 4, CaCl 2 10, MgCl 2 5 and TRIS-HCl 10, dissolved in distilled water and adjusted with NaOH to ph=7.4) Histochemistry For light microscopic histochemical and electron microscopic experiments, the fixed (1% paraformaldehyde and 2.5% glutaraldehyde diluted in 0.1 M PBS) and dehydrated tissues were embedded into Araldite, then semi-thin and ultra-thin sections were prepared. The semi-thin sections were stained with 1% toluidine-blue. The ultra-thin sections were postfixed with 1% OsO 4 diluted in 0.1 M Na-cacodylate buffer then viewed in a JEOL 1200EX electron microscope. In order to distinguish the mucous and serous cell types in the gland and to demonstrate cell proliferation, glands were treated for PAS-like and HE staining. The stained sections were analyzed in a Zeiss Axioplan microscope. Immunocytochemistry In our experiments indirect two-step methods (by fluorescent stains, or peroxidase conjugated IgG) or Sternberger s three-step peroxidase-anti-peroxidase (PAP) method (1979) was used. The samples were fixed in 4% paraformaldehyde, diluted in 0.1 M PBS, then incubated in 20% 16

17 sacharose solution, thereafter were embedded into Tissue-Tek and finally µm thick cryostate sections were taken. The sections were incubated with primary and thereafter labeled with secondary antibodies. The early apoptotic processes of salivary gland were visualized by Annexin V-CY3 and TACS- XL-DAB in situ apoptosis detection kit according to the manufacturer s instructions. MitoCapture apoptosis detection kit was used to detect changes in the mitochondrial membrane potential (MMP), associating with the early stages of apoptosis. Western-blot analysis Protein samples of salivary gland were prepared by homogenization in SDS-buffer. The homogenates were cleared by centrifugation then the supernatant was removed and diluted 1:1 in SDS sample buffer. After this the mixtures were denatured and samples were loaded and separated in SDS/PAGE (10% or 15% gels) and then electrophoretically transferred to PVDF membranes. The blots were blocked with dried skimmed milk then the proteins were incubated with the primary antibody and thereafter treated with HRP-conjugated secondary antibody. Blots were visualized in TRIS-HCl containing DAB and H 2 O 2 solution. The average protein content of samples was 85 µg, determined with the Bradford method. Control experiments in immunocytochemistry and WB analysis Preabsorption control experiments were made for most antibodies with specific blocking peptides. No immunostaining could be observed after the control experiments. We did not have specific blocking peptides for innexin-2 and active-caspase-3 antibodies, so we controlled the antibody specificity in WB experiments, using homogenates of the salivary gland of Locusta migratoria and rat brain as a positive control. In the positive control experiments we could detect similar bands from snail samples and from the locust or rat. The antibodies reacted specifically in snail samples because in method control experiments we did not detect any reaction in blot. Actin was used as an internal control. Electrophysiology In case of nerve stimulation the square wave pulses were delivered by bipolar metal electrodes through the buccal commissure. The transmitters (ACh, 5-HT, DA) were applied by a microperfusion system. The final concentration of the substances was not higher than M. In voltage-clamp experiments the potassium currents were identified with specific blockers such as TEA and 4-AP. Inward calcium currents were blocked by adding CdCl 2 to the physiological solution. In Cl - free solution Cl - was substituted by acetate in equimolar amount. NPPB was used to block the Cl - channels. In order to measure the resting membrane potential of salivary gland cells and electrical changes upon nerve stimulation or transmitter application, and to record ion currents, an AxoClamp 2B amplifier was used. Data were filtered then digitalized by TL-1 or Digidata 1200 converter. Intracellular recording electrodes were pulled from borosilicate glass using a vertical puller. In the MP measurements MΩ, while in voltage-clamp experiments 4-8 MΩ recording electrodes were used. In one-microelectrode voltage-clamp experiments the protocols were generated by pclamp Data of electrophysiological traces were plotted and analyzed with Origin 7.5. software. Induction and quantification of apoptosis in the salivary gland In the salivary gland cells apoptosis was elicited chemically or by the electrical stimulation of the salivary nerve. The glands were incubated with DA and 5-HT at 10-4 or 10-8 M concentrations. In other cases, the salivary glands were preincubated with DA receptor antagonists (fluphenasine, eticlopride) or K-channel blockers (TEA, 4-AP) before DA treatment. After pharmacological treatments the samples were fixed in 4% PFA then 10 µm sections were made. 17

18 The number of TACS-XL positive cells was estimated by counting cells in three visual fields (1.8 mm 2 areas viewed at 400x magnification) per gland. The procedure was repeated on six to eight gland in each type of experiment. The number of specific labeled (TACS-positive) and nonlabeled cells was counted on 1.8 mm 2 areas under a Zeiss Axioplan microscope. Data were plotted as means ± S.E.M. using Origin 7.5. RIA For identification of PACAP27 and PACAP38 and measurement of their content by RIA, the samples were prepared as previously described. C-terminal fragment of PACAP38 (PACAP24-38) and PACAP27 were iodinated and the reaction mixtures were separated on a reverse-phase HPLC column. The mono-iodinated products were applied as RIA tracers. Synthetic PACAP38 and PACAP27 were used as standards. During the assay procedures the 100 µl antisera, 100 µl RIA tracers and 100 µl standards or salivary gland extract samples were mixed and then the antibody-bound peptides were separated from the free ones by addition of 100 µl separation solution. Following centrifugation the tubes were gently decanted and the radioactivity of the precipitates was measured in a gamma counter. PACAP38 and PACAP27 concentrations of the salivary gland extract samples were read from the appropriate calibration curve. Detection of cytochrome-c In our experiments we used the salivary gland of inactive snails. One part of the glands served as control (n=6; 0.188g) and the second part (n=6; 0.197) was exposed to 10-4 M DA solution for 30 min. Thereafter the samples were homogenized in iso-osmotic sucrose solution. Differential centrifugation was carried out by modified according to Whittaker s method (1965) in order to separate the mitochondrial and cytosolic fractions. The pure cytosolic fraction contained the translocated cytochrome-c molecule. Release of the cytochrome-c from mitochondrial fraction was elicited by CaCl 2 and its absorbance (A) was measured continuously photometrically. The absorbance of cytochrome-c was measured in control and DA-treated samples at 540 nm by a spectrophotometer. The determined absorbance of cytochrome-c values was plotted using OriginPro 7.5. software. RESULTS AND CONCLUSIONS Four gland cell types could be identified in the salivary gland of Helix in toluidine-blue stained semi-thin sections: the mucocyte, the granular cell, the vacuolated cell and the cystic cell. The cystic cell is considered as the last stage of the secretory cycle, which is the maturation mechanism of vacuolated cells. During maturation, the vesicles in vacuolated cells fuse and form large saliva droplets inside the cystic cell. According to our observation, this cell type is frequent in the salivary gland of active animals, and has a role in saliva secretion. Early histological studies revealed a remarkably wide range of salivary gland cell types within one species. According to our opinion, the reason of it could be that seasonal changes and/or the active and inactive states the animals were disregarding. In the salivary gland the various cell types form acini, in which serous and mucous cell types were found to be interspersed, as revealed by PASlike staining. Consequently, the released saliva is a mixture, containing digesting saliva full of enzymes and diluted saliva poor in proteins. Such mixed, so-called seromucous salivary glands are atypical in vertebrates. A layer of dividing gland cells could be observed at the edges of the acini, following HE staining. The early proliferation of gland cells in the acini was demonstrated using Ki67 antibody, too. The number of dividing cells showed activity dependence, because cell proliferation was stronger in the salivary gland of active animals. According to literature data, saliva secretion from the cystic cell takes place by holocrine mechanism. This conlusion was supported by our data that cell debris was found along the intralobular duct, in toluidine-blue stained semi-thin sections of the 18

19 salivary gland of active animals. Similar to cell proliferation the amount of cell debris depended on the activity state. It was greater in active animals than in the salivary gland of inactive animals. We supported, that cell debris is the remnant of those gland cells, which show morphological and physiological changes typical for apoptosis. Cystic cells formed in the secretory cycle gave off their product through cell degeneration. The degeneration process of vacuolated and cystic cells was identified as apoptosis in the salivary gland of active animals, using Annexin V-Cy3 and TACS-XL in situ apoptosis detection kits. The ultrastructural analysis of the salivary gland revealed various types of membrane contacts, including both close and loose membrane appositions intermingling between adjacent glandular cells. Unspecialized, loose cell contacts were characterized by wide extracellular space, the distance between the opposing gland cell membrane segments varying between nm. Close membrane appositions were characterized by unspecialized membrane segments separated by a space of nm. In other cases, longer parallel membrane segments displayed increased electron density, and were separated by wide intercellular space (~60 nm). These membrane contacts were identified as zonula adherens or desmosoma-like structures. Tight membrane contacts (2-4 nm), the classic communication channels in adjacent glandular cells, could also be identified occasionally along short membrane segments. These structures were identified as gapjunction-like contacts. The molecular structures that form gap-junction-like contacts, called innexins, could be detected with applied fluorescence immunohistochemical method. The identified gap-junction-like contacts were also supported by electrophysiological experiments. In electrophysiological recording gland cells revealed a good coupling coefficient from 7-10 cells distance (approx. 300 µm), so the electrical stimulus spreading from cell to cell was good. These cell contacts help synchronize gland secretion despite their poor innervations. The resting MP value of salivary gland cells was in the range of -30 and -80 mv, the average value was ± 9.8 mv (n=483) in normal physiological solution. This average value did not show any significant difference from the MP value of the exocrine salivary glands of vertebrates or insects. MP was determined principally by the distribution of K + across the membrane, but the electrogenic Na + -pumps and Cl ions also have important role. Following microelectrode penetration, salivary gland cells usually remained electrically silent, although in some cases spontaneous miniature potentials were detected. These miniature potentials occasionally were added up and we could record EPSPs, but overshooting action potential could be never recorded. Sometimes action potential-like potentials, so called junction potentials were recorded with amplitude values between 5 and 25 mv. In order to study the ionic-currents of the salivary gland cells, single electrode voltage-clamp technique was used. Voltage-dependent inward and outward membrane currents could be recorded after the step depolarization of voltage-clamped gland cells. Four different voltageclamp currents could be recorded from the salivary gland cells of the snail, as fellows: I K, I A, I K(Ca) and I Ca. 62% of the total outward K-current consisted of TEA sensitive I K components, while 27% was Ca 2+ -dependent I K(Ca) K + -current component. 4-AP sensitive I A component was also recorded in a part of the gland cell population, making up 55% of the total current. The voltage-gated inward current probably carried by a T-type Ca-channel, and it could be blocked 100% by Cd 2+. These ion currents determined the electrical properties of gland cells. Electrical stimulation of the salivary nerve, which originates from the buccal ganglia and innervates the salivary gland, elicited a depolarizing response of approx. 30 mv in the salivary gland cells. Similar depolarizing response could be elicited by ACh, 5-HT or DA microperfusion onto the cell surface. The concentration of transmitters was below M. The stimulation of the salivary nerve gave a strongest depolarizing effect. The MP change (depolarization) induced by nerve stimulation, ACh or monoamine treatment couldbe identified as secretory potential. Nerve endings, possible containing the transmitters that induce secretory potential, were formed among the gland cells. The varicosities were deeply embedded in the salivary gland cells and formed a close but unspecialized contact with gland cells, so we cannot speak about true synaptic 19

20 membrane appositions. We examined the effects of various transmitter molecules on the amount of mucus release. Secretory potential was induced most effectively by ACh, while the saliva secretion was regulated best by DA. The potent neuropeptides of the nervous system, such as MIP, FMRFa, CARP, etc., did not generate secretory potential, so these neuropeptides do not seem to function as transmitters. In inactive animals TUNEL-positive (apoptotic) cells comprised a small proportion of the salivary gland, however, in gland of active snails the number of TUNEL-positive cells increased significantly. The vacuolated and cystic cells were identified as TUNEL-positive cells among gland cells. These results suggest that the vacuolated and cystic cells degenerated by apoptosis, and gave off their product during feeding. But what could be the apoptosis inducing signal? According to earlier biochemical measurements, DA concentration was significantly higher in the salivary gland of animals that are hungry or just about to feed, than in satiated animals. Our results suggest that the most potent transmitter in saliva secretion is DA, which is able to increase the number of apoptotic cells in the salivary gland of inactive animals. Similar results were obtained by nerve stimulation, during which DA was released from the nerve endings. DA acts through D2 receptors, because the selective blocking of these receptors with eticlopride blocked the effect of DA in eliciting apoptosis. TEA, the selective antagonist of I K, prevented the effect of DA on inducing apoptosis, while the transient K-channel blocker 4-AP had no effect. These experimental results support that the effect of DA on eliciting apoptosis was exerted partly through D2 receptors and partly through the regulation of K + homeostasis. The MP change (secretory potential) induced by DA was able to influence the mitochondrial transmembrane potential (MMP) through the decrease of intracellular K + concentration. The permeabilization of the outer mitochondrial membrane was formed by the pro-apoptotic stimuli. Furthermore, the WB analysis of salivary gland homogenate revealed the presence of a substantial endogenous level of inactive Bcl2 and active Bad proteins, which take part in the permeabilization of the mitochondrial membrane. The ratio of antiapoptotic (Bcl2) and proapoptotic (Bad) proteins determines the destiny of a cell by activating the intrinsic pathway of apoptosis. The ratio depended on the activity state of the animals and on the DA level. It was observed, that DA treatment increased the amount of active Bad molecules, supporting the role of DA in apoptosis. Through the permeabilized mitochondrial membrane, cytochrome-c, as the most importan apoptosis inducing factor was translocated to the cytosol. It was observed, that DA was able to induce the release the cytochrome-c from mitochondria in the gland of inactive animals. The release of cytochrome-c together with caspase-9 and APAF-1 molecules form the apoptosome, which activates caspase-3, the effector molecule of apoptosis, during the intrinsic apoptotic signal. Active-caspase-3 molecules, the most important effector and leading molecule in apoptosis, were observed exclusively in the cytoplasm and membrane region of cystic cells by immonohistochemical and WB methods. DA significantly increased the number of cells containing active-caspase-3 both in inactive and active animals. However, eticlopride was able to block the caspase-3 activating effect of DA. The presence of caspase-8 was not found in signaltransduction pathways, so we concluded, confirmed that the classical extrinsic pathway of apoptosis is absent in the salivary gland of snails. However the extrinsic and intrinsic apoptotic pathways could be linked by an unknown mechanism. We hypothesized that another pathway and /or unknown molecule(s) connect the effect of DA with the intrinsic pathway of apoptosis. This was also supported by MßCD, which is a non-toxic oligosaccharide, during DA incubation. The effect of DA was blocked by MßCD, which is known to prevent the involvement of ceramide in the lipid raft formation of the membrane thereby blocking signal transduction pathway. Lipid depletion with MßCD in the salivary gland cell membrane significantly decreased the DA-induced cytohrome-c release into the cytosol. So we concluded that ceramid can be an important molecule in signal transduction pathway of the salivary gland. 20