Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Pathobiokémia Program

Átírás

1 Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Pathobiokémia Program A tetrahidrobiopterin szerepe a humán placenta NOszintázának szabályozásában és kémiai stabilizálása aszkorbáttal Ph.D. értekezés tézisei Dr. VALENT SÁNDOR Témavezeto: Prof. Dr. Tóth Miklós Semmelweis Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet Budapest, 2004

2 2

3 Bevezetés: Az NO-szintáz enzim muködése során tetrahidrobiopterin (BH 4 ) jelenlétében argininbol és molekuláris oxigénbol monooxigenáz I. és II. reakció során citrullint és nitrogén-monoxidot (NO) képez, elektrondonorként pedig NADPH-t használ. A humán placentában domináló endoteliális NO-szintáz izoforma muködéséhez ezen kívül Ca 2+ -kalmodulin jelenléte is szükséges. Az elektronok a reduktáz domén elektrontranszport láncán át FAD, FMN és BH 4 részvételével az oxigenáz domén hem csoportjához kötött O 2 -re transzferálódnak. Az enzim homodimér formában aktív, alegységenként egy BH 4 -et köt meg. Az elso, szorosan kötött BH 4 az enzim alapaktivitásának biztosításában játszik szerepet és a második BH 4 kötodésére homotróp antikooperatív hatást gyakorol. A második BH 4 -gyel telítve az enzimet, az enzimaktivitás szeresére fokozható. BH 4 depléció esetén a reduktáz és az oxigenáz domén muködése szétkapcsolódik. Az elektrontranszfer szétkapcsolt állapotban szuperoxid képzodését eredményezi, ami NO-val agresszíven oxidáló peroxinitritet képezhet. A humán placentában innerváció hiányában a vazoreguláció humorális tényezoi, így az NO szerepe alapveto fontosságú. Az NO-t termelo enos enzim a boholyerek 3

4 endotéliumában és a szincíciotrofoblasztban mutatható ki. Az oxidatív stressz hatására bekövetkezo anyai endotélium aktiválás és diszfunkció a terhesség alatt eloforduló, magasvérnyomással és proteinúriával járó kórkép, a preeclampsia fontos patogenetikai tényezoje lehet. Úgy vélik, hogy az anyai endotélium oxidatív stressz kiváltotta aktiválása és diszfunkciója a preeclampsia fo patogén tényezoje lehet. A BH 4 kémiai sajátsága, hogy gyorsan autooxidálódik, eközben H 2 O 2 képzodik. Mivel a de novo BH 4 szintézis mértéke a placentában csekély és a BH 4 oxidált származékai a sejtekbol kiürülhetnek, minden fiziológiás körülmény és tényezo, ami elosegíti a szükséges BH 4 koncentráció fenntartását, fontos lehet a kielégíto NO képzodés szempontjából. Humán umbilikális és sertés aorta endotél sejtekben, valamint in vivo egér aortában is igazolták az aszkorbát hatására bekövetkezo BH 4 koncentráció emelkedését és az NOszintáz aktivitás fokozódását. A BH 4 -et az aszkorbát vizes oldatban stabilizálja. Ennek mechanizmusára eddig nem adtak magyarázatot. 4

5 Célkituzések: 1. Hogyan befolyásolja a BH 4 koncentrációja a placentáris enos aktivitását? 2. Mi a BH 4 koncentráció tartomány preeclampsiás terhesek placentájában és hogyan befolyásolja ugyanezen terhesek placentáris enos aktivitását a BH 4 koncentráció változása? 3. Mi az aszkorbát BH 4 koncentrációt stabilizáló hatásának kémiai mechanizmusa, hatékonyak-e az aszkorbát placentában eloforduló fiziológiás koncentrációi, milyen tényezok befolyásolhatják az aszkorbát hatását? 4. Olyan módszer kidolgozása, amely lehetové teszi a BH 4 oxidáció kinetikai vizsgálatát fiziológiás koncentrációjú aszkorbát jelenlétében. 5. Fokozhatja-e in vitro körülmények között az aszkorbát a placentáris enos aktivitását, s lehet-e ennek in vivo jelentosége? Módszerek: Az enos enzimaktivitást radioaktívan jelölt arginin citrullinná alakulásának sebességével mértük. 5

6 A szöveti BH 4 koncentráció meghatározása Fukushima és Nixon módosított eljárása alapján HPLC analízist követo fluoreszcens spektrofotometriával történt. A placentában lévo teljes aszkorbát koncentrációt Denson és Bowers dinitrofenil-hidrazin konjugációs módszerével, valamint a csak redukált formában lévo aszkorbátot Omaye és mtsai. dipiridiles módszerével mértük. A preeclampsiát Roberts és Redman kritériumai alapján definiáltuk. A BH 4 (OD max = 295 nm) és az aszkorbát (OD max = 265 nm) oxidációját spektrofotometriás módszerrel mértük. Az eredmények statisztikai kiértékeléséhez Student és Wilcoxon t próbát, egyirányú variancia analízist (ANOVA) és Bonferroni post hoc tesztet használtunk. Eredmények: Elso trimeszterbol származó placenta homogenizátumában az NO-szintáz enzimaktivitását a BH 4 koncentráció 20 nmol/l - 1? mol/l között 2.5 szeresére fokozza. A BH 4 koncentráció további növelésével már nem detektálható NO-szintáz aktivitás növekedés. A placenta BH 4 koncentrációja a terhesség folyamán csökken, az elso trimeszterben 189 ± 79 pmol/g szövet, a terhesség végén: 56 ± 6

7 23 pmol/g szövet (átlag ± SD). Munkacsoportunk korábbi, nagy mintaszámú mérései alapján a BH 4 telítési görbe kettos reciprok ábrázolásával meghatározott EC 50 érték 79 nmol/l. Ezekbol az adatokból meghatározható, hogy elso trimeszterben az NO-szintáz átlagosan a v max 70%-ával, terminusban 41%-ával muködik. Normális szülésekbol (n=4) és a preeclampsiás terhesek BH 4 -reszponzív csoportjából (n=3) származó placentákban az NO-szintáz relatív aktivitását a BH 4 hozzáadása az elso trimeszter placentáiban találthoz hasonlóan fokozza. A BH 4 - rezisztens csoportban (n=7) a fenti fiziológiás koncentrációkban hozzáadott BH 4 nem váltja ki az NO-szintáz enzimaktivitásának fokozódását. Farmakológiás koncentrációban (50? mol/l) alkalmazva a BH 4 -et, a BH 4 - rezisztens csoportban is az NO-szintáz aktivitás fokozódása észlelheto, de ennek mértéke elmarad a normális és a BH 4 - reszponzív csoportban megfigyelttol. A három csoportban a szöveti BH 4 koncentráció értékei szignifikánsan nem különböznek egymástól. Humán placenta mikroszómális frakciójában BH 4 jelenléte nélkül az aszkorbát nem vált ki enzimaktivitás növekedést. Fiziológiás koncentrációjú (0.5? mol/l) BH 4 jelenlétében azonban már 100? mol/l aszkorbát hozzáadása 7

8 szignifikánsan fokozza az NO-szintáz aktivitását. Ez érvényesülhet a placentában is mert elso trimeszterben ± 12.5, terminusban pedig ± 85.2 µmol/kg szövet (átlag ± SD) a normális placenta aszkorbát tartalma. Másik kísérletünk szerint 5 mmol/l aszkorbát jelenlétében fiziológiás koncentrációjú BH 4 NO-szintáz aktivitást fokozó hatása szignifikánsan magasabb mint a kontrol érték, míg nagyobb farmakológiai BH 4 koncentrációknál az effektus elmarad. Az aszkorbát lassan autooxidálódik, de BH 4 hozzáadásakor oxidációja jelentosen felgyorsul. Olyan koncentrációjú kataláz hozzáadásakor, ami az autooxidációs folyamatok során keletkezo hidrogénperoxidot biztosan eltávolítja az oldatból, a BH 4 jelenlétében mért aszkorbát oxidáció kezdeti sebessége jelentosen lecsökken, de szignifikánsan, mintegy kétszer magasabb marad, mint a BH 4 hozzáadása nélkül, de kataláz jelenlétében mért érték, ami az aszkorbát közvetlen BH 4 stabilizáló hatására utal. A 36?mol/l BH 4 -et 25, 50 és 100?mol/l aszkorbát jelenlétében inkubálva, az a BH 4 oxidációjának kezdeti sebességét koncentrációfüggo módon csökkenti. Katalázt és aszkorbátot tartalmazó oldatban a BH 4 oxidáció kezdeti sebessége tovább lassul. Kataláz nélkül a regenerálódó BH 4 moláris aránya az oxidálódó aszkorbáthoz képest 0.5, míg 8

9 kataláz jelenlétében 1.0, azaz ilyenkor a védohatás a BH 4 és aszkorbát koncentrációkra nézve ekvimoláris. Kataláz nélkül mérve a BH 4 oxidáció látszólagos másodrendu reakciósebességi konstansát (k) 100 µmol/l aszkorbát o C homérsékleti tartományban minden homérsékleten azonos mértékben csökkenti (az eredeti érték átlagosan 64 ± 0.77 %-ára, átlag ± SEM, n=12), míg kataláz jelenlétében az egyetlen változás az, hogy a csökkenés mértéke nagyobb (az eredeti érték 51 ± 0.67 %-a, átlag ± SEM, n=12). Az aszkorbát nélkül, illetve aszkorbát jelenlétében mért k értékeket Arrhenius szerint ábrázolva akkor is párhuzamos egyeneseket kapunk ha van kataláz az elegyben és akkor is ha nincs. Az így kapott egyenesek meredekségébol Arrhenius egyenlete alapján meghatároztuk a látszólagos aktiválási energiákat. Akár kataláz jelenlétében, akár anélkül végezzük a meghatározásokat, az aszkorbát az aktiválási energia értékét nem befolyásolja szignifikánsan. Az aktiválási energiák kataláz nélkül: ± 0.09 kj/mol (-aszkorbát) és ± 2.21 kj/mol (+aszkorbát), míg kataláz jelenlétében: ± 1.37 kj/mol (-aszkorbát) és ± 2.84 kj/mol (+aszkorbát, átlag ± SEM, n=3). 9

10 Megbeszélés: Fiziológiás koncentráció tartományban a BH 4 az NOszintáz aktivitást koncentrációfüggo módon fokozza. A terhesség folyamán a placenta BH 4 koncentrációja az elso trimeszterben mért érték 30%-ára csökken és terminusban a csökkent BH 4 koncentráció hozzájárulhat az ilyenkor található alacsonyabb NO-szintáz aktivitáshoz. Az individuális placenták igen eltéro BH 4 koncentrációja abban a tartományban változik, ami az enzimaktivitást jelentosen befolyásolni képes. Ebbol következik, hogy a BH 4 a placentáris NO szintáz aktivitás fontos szabályozó tényezoje lehet. A BH 4 -rezisztens preeclampsiás lepényekben az NOszintáz lehetséges szerkezeti változására visszavezetheto megváltozott BH 4 iránti affinitása állhat a BH 4 koncentráció emelés hatására elmaradó enzimaktivitás növekedés mögött. Elképzelésünk szerint az enzimaktivitás BH 4 rezisztenciája, valamint az oxigén redukció és az arginin oxidáció következményes szétkapcsolódása sokkal fontosabb szerepet játszhat a preeclampsia etiológiájában és patogenezisében, mint az NO-szintáz aktivitás abszolút értéke. A placenta NO-szintáz aktivitása preeclampsiában gyakran a normálisnál magasabb. Ez a magasabb NO-szintáz aktivitás a BH 4 rezisztenciával és a valószinu szétkapcsolódással társulva fokozott szuperoxid és 10

11 peroxinitrit termelésen keresztül oxidatív stresszt eredményezhet. Abból, hogy a BH 4 hatására fokozódó aszkorbát oxidációnak egy részét a kataláz nagy koncentrációi is csak részben képesek kivédeni, arra következtethetünk, hogy az aszkorbátot a BH 4 elsodleges oxidációs terméke, a kinoidális BH 2 (qbh 2 ) közvetlenül (azaz közbülso termék nélkül) oxidálni képes, miközben saját maga BH 4 -gyé redukálódik vissza. Ez azért is valószínu mert irodalmi adatok szerint a BH 2 -t az aszkorbát nem képes redukálni és ezért kísérleti körülményeink között az aszkorbát számára a kinoidális BH 2 lehet az egyetlen potenciális redox reakció partner. Azokból az eredményeinkbol, melyek szerint az Arrhenius féle aktiválási energiák közel azonosak akár aszkorbát jelenlétében, akár anélkül történik a BH 4 autooxidációjának mérése, arra következtetünk, hogy a BH 4 autooxidációja egy kisebb sebességi konstanssal jellemezheto, lassúbb reakció, mint a BH 4 képzodés qbh 2 -bol és aszkorbátból. Ebbol következik, hogy a BH 4 autooxidációja a ciklikus redox reakció leglassúbb, sebesség-meghatározó lépésének tekintheto. Kataláz azért képes az aszkorbát hatás potenciálására, mert a hidrogénperoxid gyors eltávolításával védi az aszkorbátot az oxidációtól és kedvez a magasabb 11

12 aszkorbát szint fenntartásának. Az aktiválási energiák, az hogy az aszkorbát alacsony koncentrációban is hatékony, valamint az elso és a harmadik trimeszterbol nyert placenták viszonylag magas aszkorbát koncentrációi arra utalnak, hogy az aszkorbát normális placentában eloforduló koncentrációi képesek a BH 4 autooxidáció gyors ellensúlyozására. Következtetések: 1. Összehasonlítottuk a normális elso trimeszterbeli és a terminus körüli placentából származó enos enzim aktiválásához szükséges BH 4 koncentrációkat a BH 4 szöveti koncentrációjával és megállapítottuk, hogy a terhesség során a BH 4 koncentráció csökkenése valamint egyéni variációja jelentos különbségeket okozhat az enos aktivitásában. 2. Tíz preeclampsiás terhességbol származó terminuskörüli placentában is megvizsgáltuk a BH 4 szintet, és az enos aktivitás BH 4 koncentráció függését. A tízbol hét esetben az enos enzim csökkent aktiválhatóságát találtuk, amit a BH 4 koncentráció különbségével nem lehet magyarázni. Felteheto, hogy a preeclampsiák egy részében az enos BH 4 kötésének defektusa hozzájárul a szuperoxid, hidrogénperoxid és peroxinitrit fokozott képzodéséhez és az oxidatív stressz kialakulásához. 12

13 3. Mivel az enos enzim aktivitását a placenta BH 4 koncentrációja jelentosen befolyásolja, minden olyan kémiai folyamat, ami a BH 4 szintet stabilizálja, fontos lehet a fetoplacentáris és maternoplacentáris perfúzió fenntartásában. Ilyen stabilizáló faktor az aszkorbát, ami in vitro, fiziológiáshoz közel álló körülmények között növeli az enos aktivitását. 4. Fiziológiás koncentrációjú aszkorbát BH 4 stabilizálására kifejtett hatásának mechanizmusát, egy általunk kidolgozott spektrofotometriás módszerrel lehet vizsgálni. 5. Megállapítottuk, hogy az aszkorbát elsosorban a kinoidális BH 2 (qbh 2 ) közvetlenül BH 4 -gyé történo redukálásával stabilizálja a BH 4 koncentrációt, de ehhez hozzájárul a BH 4 autooxidációja során képzodo H 2 O 2 eltávolítása is. 6. Megállapítottuk, hogy kataláz potenciálja az aszkorbát BH 4 koncentrációt stabilizáló hatását, mert a BH 4 autooxidációja során képzodo H 2 O 2 lebontásával kivédi az aszkorbát oxidációját és hozzájárul a hatékony aszkorbát szint fenntartásához. 13

14 Az értekezés témájával összefüggo publikációk: Cikkek: 1. Valent S., M. Tóth. Spectrophotometric analysis of the protective effect of ascorbate against spontaneous oxidation of tetrahydrobiopterin in aqueous solution: kinetic characteristics and potentiation by catalase of ascorbate action. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 36(7): , IF: 3,044 (2002-ben) 2. Tóth M., Z. Kukor, S. Valent. Chemical stabilization of tetrahydrobiopterin by L-ascorbic acid: contribution to placental nitric oxide synthase III activity. Molecular Human Reproduction. 8(3):271-80, IF: 2, Kukor Z., S. Valent, M. Tóth. Regulation of nitric oxide synthase activity by tetrahydrobiopterin in human placentae from normal and preeclamptic pregnancies. Placenta. 21(8):763-72, IF: 2,587 Idézheto absztraktok: 4. Eloadások és poszterek: 9. 14

15 A disszertáció témájával nem összefüggo publikációk: Cikkek: 1. Tóth P., H. Lukács, G. Gimes, A. Sebestyén, S. Valent, N. Pásztor, A. Pajor, Ch.V. Rao, F. Paulin. The role of LH/hCG receptors in premature delivery. Magyar Noorvosok Lapja. 66(2):95-9, Regéczy N., S. Valent, L, Kormos, M. Hajdu, L. Gopcsa, K. Pálóczi. Telomere length analysis on cord blood cells by the flow-fish method. Haematologia. 32(3):265-9, IF: 0, Gimes G., S. Valent. Clinical experiences with a gestodene containing oral contraceptive. Acta Pharmaceutica Hungarica. 68(5):289-93, Könyvrészlet: Valent S. Veszélyeztetett terhesség Rh isoimmunisatio miatt. In Betegségenciklopédia, Ed: Kornya L. Springer Tudományos Kiadó Kft. Budapest, Vol. 2: , Idézheto absztraktok: 13. Eloadások és poszterek:

16 16