Oligonukleotid kimérák szintézise, termikus és enzimatikus stabilitása

Átírás

1 Oligonukleotid kimérák szintézise, termikus és enzimatikus stabilitása Ph.D. értekezés tézisei Készítette: Bajor Zoltán Témavezető: Prof. Dr. Ötvös László Magyar Tudományos Akadémia Kémiai Kutatóközpont Kémiai Intézet 2004

2 Előzmények, célkitűzések A génexpressziót a transzláció stádiumában gátló antiszenz oligonukleotidok (AON-ek) 1978-as felfedezésüket követően igen gyorsan az érdeklődés középpontjába kerültek. Az AON-ek kutatásának területén az utóbbi években egyre nagyobb jelentőségre tesznek szert az oligonukleotid kimérák. Az oligonukleotid kimérák részlegesen módosított gerincű oligonukleotid származékok, amelyek cukor-foszfát gerincének egy részét más típusú gerinc helyettesíti. A kimérák mind a természetes, mind pedig a teljesen módosított gerincű oligonukleotidoknál előnyösebb biofizikai és biokémiai tulajdonságokkal rendelkeznek, így antiszenz kemoterapeutikumként való felhasználásuk kecsegtető jövőt ígér. A klinikai vizsgálatok különböző fázisaiban lévő legtöbb AON, vagy homogén tiofoszfodiészter internukleozid kötésű (PS) származék vagy tiofoszfát-normálfoszfát (PS-PO) kiméra, amelyek elsősorban potenciális antivirális vagy tumorellenes szerek. Erre alapozva célul tűztük ki egy tiofoszfodiészter gerincű (PS) AON és 3 -terminálisához foszfodiészter kötéssel (PO) kapcsolt, növekvő számú 5-fluór-dezoxiuridin (FdU) egységeket tartalmazó, kiméráinak szintézisét valamint sejtproliferációra kifejtett hatásuk tanulmányozását. Az említett kimérák a tumorsejtben várhatóan kettős hatással rendelkeznek mivel az 5 -terminális tiofoszfát szekvencia antiszenz módon hat, a nukleázok hatására felszabaduló drog (FdUMP) pedig hagyományos módon, enzim (timidilát szintáz) inhibíció útján fejti ki hatását. Különböző 3 -láncvégi egységek 3 -exonukleáz stabilitásának vizsgálatára P 1 -tio-p 2 -oxo trinukleotidokkal előzetes enzimatikus hidrolízis vizsgálatokat végeztünk. 1

3 A természetes oligonukleotidok cukorfoszfát gerince helyett N-(2- aminoetil)glicin vázat tartalmazó peptid nukleinsavak (PNS-ek) megfelelnek az ideális AON-el szemben támasztott két legfontosabb követelménynek: nagyon stabil duplexeket képeznek oligonuklotidokkal, valamint a PNS lánc peptidkötései mind a proteázokkal mind a nukleázokkal szemben teljesen rezisztensek. Az említett előnyös tulajdonságok mellett a PNS oligomerek számos biológiai szempontból kedvezőtlen tulajdonsággal is rendelkeznek. A hátrányos tulajdonságok részben kiküszöbölhetők PNS-DNS kimérák alkalmazásával, amelyekben a DNS szakaszok biztosítják a kizárólag antiparalell duplexek kialakulását, a jobb vízoldékonyságot és sejtbejutási készséget valamint az RNáz H indukciót. Munkánk során olyan PNS-DNS kimérák szintézisét és tulajdonságaik vizsgálatát tűztük ki célul, amelyekbe a PNS egységek beépítése standard szilárd fázisú DNS szintézis protokoll alkalmazásával is megvalósítható. E célból oldatban dimer szintonokat állítottunk elő, amelyek 5 -terminálisát PNS, 3 -terminálisát DNS monomer alkotta. A PNS bázis timin, 5-propinil-uracil vagy 5-(1-hexin1-il)-uracil, míg a DNS bázis timin volt. A bázisban helyettesített származékok vizsgálatát oligodezoxinukleotidokon szerzett korábbi tapasztalatok indokolták, miszerint a pirimidin bázisok 5-alkinil helyettesítése, a szomszédos bázisok közötti vertikális kölcsönhatás, az ún. tapadás (stacking) erősödése következtében növeli a duplexstabilitást. Az említett homo-timidin analóg blokkokon kívül olyan dimer szintont is készítettünk, amelyben a PNS bázis timin, míg a DNS bázis adenin volt. E szintonok felhasználásával az önduplexképző PNS-DNS kimérák abszolút és relatív termikus stabilitását kívántuk tanulmányozni. 2

4 Alkalmazott vizsgálati módszerek A dolgozatban szereplő trinukleotidok szintézisére oldatfázisú hidrogén foszfonát ill. szilárdfázisú foszforamidit eljárást alkalmaztunk. Szilárdfázison a trimereket és a hosszabb oligomereket standard foszforamidit protokollt alkalmazva CPG hordozón, MilliGen/Biosearch 8700 DNS szintetizátorral állítottuk elő. Az oldatban lejátszódó reakciók előrehaladását vékonyrétegkromatográfia segítségével követtük. A nyerstermékek tisztítása egyrészt gravitációs szilikagél- másrészt ioncserésoszlopkromatográfia alkalmazásával történt. A szilárdfázison előállított oligomerek tisztaságát analitikai RP-HPLC-vel ellenőriztük, a kapott nyerstermékeket félpreparatív RP-HPLC alkalmazásával tisztítottuk. A szintetizált új molekulák szerkezetének meghatározását IR, 1 H-NMR és 31 P-NMR spektroszkópiával valamint ESI tömegspektrometriával végeztük. Az enzimatikus hidrolíziseket RP- és IE- HPLC segítségével követtük. Az oligonukleotid duplexek termikus stabilitását az UV abszorbancia hőmérséklet függésének mérése alapján határoztuk meg. Új tudományos erdemények I. P-tio-P-oxo (PS-PO) oligonukleotid kimérák mint potenciális prodrugok I. 1. Előzetes enzimatikus stabilitás vizsgálatok céljából oldatfázisban hidrogénfoszfonát módszerrel (G PS C PO AZT (1), G PS C PO T (2), T PS A PO AZT (3)) és szilárdfázison foszforamidit módszerrel (G PS C PO FdU (4), T PS A PO FdU (5), T PS A PO T (6)) három-három P 1 -tio-p 2 -oxo modell trinukleotidot szintetizáltunk. Az említett modellvegyületek kígyóméreg 3

5 foszfodiészterázos (SV PDE) hidrolízise során azt találtuk, hogy mind a hat trimer szubsztrátja volt az enzimnek, amely az alkalmazott körülmények között mind a hat trinukleotidot szelektíven a normál foszfodiészter kötésnél hasította. Mindkét sorozaton belül (G PS C PO X és T PS A PO X, ahol X= AZT (1, 3), FdU (4, 5) vagy T (2, 6)) a 3 -helyzetbe beépített timidin hasadt le a leggyorsabban. A bázismódosítás (C 5 -Me C 5 -F csere) és különösen a cukormódosítás (3 -OH 3 -N 3 csere) növelte az enzimatikus stabilitást. Az enzimatikus hidrolízisek sebessége a 3 -terminális egységeken kívül a szomszédos nukleozidoktól is függött. A T PS A PO X sorozaton (3, 5, 6) belül jóval nagyobb volt a hidrolízissebességek közötti eltérés mint a G PS C PO X sorozatban (1, 4, 2). A kimérák enzimatikus stabilitása abban az esetben ha a középső nukleozid 2 -dezoxiadenozin (3, 5, 6) ~2-5 ször nagyobb volt mint a középen 2 -dezoxicitidint tartalmazó trimerek esetében (1, 4, 2). I. 2. A modell gyakorlatban való alkalmazhatóságának vizsgálatára szilárd fázison foszforamidit módszerrel előállítottunk egy 18-as tagszámú tiofoszfát antiszenz oligonukleotidot (7) valamint 3 -terminális helyzetben foszfodiészter kötésekkel kapcsolt, 1, 3 és 6 FdU egységet tartalmazó, származékait (8, 9, 10). Szám Szekvencia (5-3 ) 7. C PS T PS G PS G PS G PS C PS A PS G PS A PS T PS T PS C PS C PS A PS A PS A PS C PS C 8. C PS T PS G PS G PS G PS C PS A PS G PS A PS T PS T PS C PS C PS A PS A PS A PS C PS C PO FdU 9. C PS T PS G PS G PS G PS C PS A PS G PS A PS T PS T PS C PS C PS A PS A PS A PS C PS C( PO FdU) C PS T PS G PS G PS G PS C PS A PS G PS A PS T PS T PS C PS C PS A PS A PS A PS C PS C( PO FdU) 6 4

6 Az antiszenz oligonukleotid (7) szekvenciája komplementer az MMP-9 mátrix metalloproteáz enzimet kódoló mrns egy hozzáférhető szakaszának szekvenciájával. Irodalmi adatok szerint egyértelmű korreláció van a mátrix metalloproteázok (MMP) családjába tartozó humán kollagenáz IV enzim aktivitása és a tumor áttétek kialakulása között, ezért az mrns szakasz antiszenz oligonukleotiddal való blokkolásának sejtproliferáció gátló hatását is vizsgáltuk. Az antiszenz molekula (7) szelektíven és hatásosan gátolta a humán kollagenáz IV (MMP-9) izoenzim bioszintézisét, de a sejtproliferációt egyáltalán nem a vizsgált HT-1080 fibroszarkoma sejtvonalon. Ugyanakkor az említett PS-PO kimérák (8, 9, 10) már egy nagyságrenddel kisebb koncentrációban is hatásosan gátolták a sejtproliferációt a referencia FdU-hoz képest, azonban a relatív hatékonyság nem korrelált a beépített FdU egységek számával. Bár a legkisebb IC 50 értékkel a hat FdU egységet tartalmazó kiméra (10) rendelkezett, azonban mind az egy FdU egységre, mind az egy FdU-t tartlmazó kimérára (8) számított relatív hatékonyság szempontjából is a három FdU-t tartalamzó kiméra (9) volt a legjobb. II. PNS-DNS kimérák szintézise, termikus és enzimatikus stabilitása II. 1. PNS-DNS kimérák biofizikai és biokémiai tulajdonságainak tanulmányozása céljából négy PNS-DNS dimer szintont (oeg_t NH T (11), oeg_up NH T (12), oeg_uh NH T (13), oeg_t NH da (14)) állítottunk elő oldatban (1. ábra). Az első lépésben 5-propinil- és 5-hexinil-uracilt szintetizáltunk propin ill. 1-hexin és 5-jód-uracil palládium-katalizált kapcsolásával. Az alkinil-uracilok valamint a timin brómecetsavas karboximetilezésével a kívánt N 1 -karboximetil származékokhoz jutottunk. Ezek kapcsolása N-(2- hidroxietil)-glicin t.butil észterrel mindhárom esetben a megfelelő N-(2-5

7 hidroxietil)-n-[(5-szubsztituált-uracil-1-il)acetil]-glicin t.butil észtereket szolgáltatta. A kapcsolt termékek dimetoxitritilezése, az észterek lúgos hidrolízise majd a reakcióelegy neutralizálása után a PNS-DNS dimerek szintéziséhez szükséges DMT-védett szabad karbonsav PNS egységeket izoláltuk. A kapott PNS egységek kimérákba történő beépítése a szilárdfázisú peptid- ill. oligonukleotid szintézis kapcsolási ciklusainak váltakozó alakalmazásával, hagyományos DNS szintetizátor segítségével, a különböző oldószerek ill. reagensek miatt komoly technikai akadályokba ütközne. Ezt elkerülendő a módosított PNS és DNS egységek közötti amidkötéseket oldatfázisban alakítottuk ki. A DMT-védett oeg_t, oeg_up és oeg_uh PNS egységek kapcsolása 5 -amino-5 -dezoxi-timidinnel ill. a DMT-védett oeg_t PNS egység kapcsolása 5 -amino-n 6 -benzoil-3 - t.butildimetilszilil-2, 5 -didezoxiadenozinnal, TBTU mint aktíválószer jelenlétében (a da származék esetében a 3 -deszililezést követően) a 3 - szabad OH-t tartalmazó DMT-védett dimereket szolgáltatta. O HO HN O N N R O O C N H HO B = timin 11. R = Me 12. R = 1-propinil 13. R = 1-hexin-1-il B = adenin 14. R = Me 1. ábra PNS-DNS dimer szintonok (oeg_t NH T (11), oeg_up NH T (12), O oeg_uh NH T (13), oeg_t NH da (14)) B Az így kapott vegyes dimerek nukleozidrészén lévő szabad 3 -OH foszfitilezése ill. szukcinilezése révén a szilárd-fázisú oligonukleotid 6

8 szintézisekben felhasználható reaktív származékokhoz jutottunk és standard foszforamidit DNS szintézis protokoll szerint mind láncvégi mind láncközi helyzetekbe beépítettük őket. Az oeg_t NH T (11) és a PNS uracil bázisán 5-alkinil szubsztituált származékainak (12, 13) beépítésével T 12 - és T 20 - míg az oeg_t NH da (14) beépítésével alternáló szekvenciájú (TdA) 10 - analogonokat szintetizáltunk. II. 2. A dimer szintonok beépítése mind a T 20 mind a (TdA) 10 származékok esetében T m pont csökkenést okozott a referencia T 20 :da 20 duplex ill. a (TdA) 10 önduplex T m pontjához képest, de a csökkenés jelentős mértékben függött a beépített dimer egységek számától és az oligomerekben elfoglalt helyétől is. Azt tapasztaltuk, hogy egy oeg_t NH T dimer egység (11) beépítése a T 20 középső helyzetébe jelentős T m pont csökkenést eredményez a referencia T 20 :da 20 duplexhez képest, ugyanakor az oeg_up NH T dimer (12) azonos elhelyezése kisebb csökkenést okoz. Mindkét dimer 3 -terminális beépítése csak kismértékű stabilitás csökkenéshez vezet, és itt is a propinil származék a jobb. Abban az esetben pedig ha öt dimer blokkban egymás mellett helyezkedik el a T végén a legkisebb destabilizáló hatást szintén az öt oeg_up NH T dimert (12) tartalmazó kiméránál tapasztaltuk. Ezek szerint a PNS részen az uracil 5-metil csoportjának cseréje propinilre a beépítés helyétől függetlenül minden esetben növelte a duplexstabilitást. Az 5-hexinil-uracil PNS egységet tartalmazó dimer (13) azonos számú és helyzetű beépítése viszonylag kis T m pont emelkedést eredményezett a timint tartalmazó hasonmásokhoz viszonyítva. Ennek oka az, hogy a hosszú oldallánc viszonylag nagy helyet foglal el a nagy árokban és a foszfát ionok körül elrontja a hidrátburok elrendeződését. A hármas kötés duplexstabilizáló és a hidrofób kölcsönhatás destabilizáló hatásainak 7

9 eredője pozitív és kismértékű T m pont növekedést okoz a megfelelő oeg_t NH T (11) tartalmú analogonok T m értékeihez képest. Az önduplexképző, alternáló szekvenciájú (TdA) 10 analogonok duplexstabilitásának vizsgála során meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a lánc közepén két oeg_t NH da dimer blokkot (14) tartalmazó kiméra T m pontja magasabb volt mint a középen csak egy oeg_t NH T egységet (11) tartalmazó T 20 -analóg kiméráé. Ennek valószínű oka az lehet, hogy az inter és intramolekuláris önduplexek egyensúlyi elegyében az utóbbi a domináns. Az intramolekuláris duplexben a középen lévő négy nukleotid egység hajtűt képez és a hibridizációban csak a fennmaradó nyolc bázispár vesz részt, így a középső négy nukleotid (a két oeg_t NH da dimer (14)) nem befolyásolja a T m pontot. II. 3. A dimer blokkok beépítése minden esetben növelte a stabilitást exonukleázokkal szemben. Az 5 -végen módosított kimérák sokkal kevésbé voltak rezisztensek az 5 -exonukleáz (borjúlép foszfodiészteráz, BS PDE) hasítással szemben mint a megfelelő 3 -módosított származékok a 3 -exonukleáz (SV PDE) hidrolízissel szemben. Ennek valószínű magyarázata a BS PDE nagyobb endonukleáz aktivitása lehet. Az enzimatikus stabilitás mindkét exonukleázzal szemben nőtt a PNS uracil bázis 5-alkinil lánchosszának növelésével, mivel a nagyobb térkitöltésű szubsztituens valószínűleg jobban gátolta a szubsztrát kötődését az enzimekhez. A növekvő számú (n = 1, 2, 3) oeg_t NH T dimer szintont 3 - vagy 5 -terminális helyzetben tartalmazó kimérák enzimatikus hidrolíziselegyéből vett minták HPLC kromatogrammjaiban egymástól eltérő retenciós időknél jelentek meg az egyes analogonok kiméra hidrolízistermékei. A kromatogrammokban megjelenő csúcsok retenciós ideje növekedett a beépített dimer blokkok számával, ami növekvő 8

10 hosszúságú enzimatikusan stabil fragmensek jelenlétére utal. A jelenség azzal magyarázható, hogy a vizsgált nukleázok (P 1 nukleáz, SV PDE, BS PDE) nem tudták hidrolizálni a timidin 3 -OH és a PNS gerinc N-(2- hidroxietil)glicin OH csoportjai közötti nem természetes foszfodiészter internukleozid kötéseket. Az eredmények hasznosítási lehetőségei Eredményeink valószínűsítik, hogy egy P-tio antiszenz oligonukleotidhoz normál foszfodiészter kötéssel FdU-t vagy más nukleozidokat kapcsolva hatékonyabb tumorgátló ill. antivirális szerek állíthatók elő. Az általunk szintetizált PNS-DNS dimerek láncvégi beépítése várhatóan jelentősen növeli különböző antiszenz oligonukleotidok rezisztenciáját exonukleázokkal szemben. 9

11 Az értekezés témaköréhez kapcsolódó közlemények 1. L. Ötvös, Z. Bajor, F. Kraicsovits, Gy. Sági, Zs. Tegyey: Synthesis and enzymatic characterization of P 1 -thio-p 2 -oxo trideoxynucleoside diphosphates having AZT, FdU or dt at the 3 -position. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2002, 21(1), L. Ötvös, Z. Bajor, Gy. Sági, V. Adleff, J. Kralovánszky, B. Budai, F. Tímár, A. Jeney: Solid phase synthesis and antitumor activity of P-thio antisense oligonucleotides having oligo-2 -deoxy-5- fluorouridylates at the 3 -end. in Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis and Combinatorial Libraries (R. Epton ed.) Mayflower Worldwide Ltd., Kingswinford, U.K. (közlés alatt). 3. Gy. Sági, Zs. Tegyey, Z. Bajor, F. Kraicsovits, J. Tomasz and L. Ötvös: Synthesis, thermal and enzymatic stabilities of PNA-DNA chimeras containing new dimer building units. in Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis & Combinatorial Libraries (R. Epton ed.) Mayflower Worldwide Ltd., Kingswinford, U.K., 2000, Z. Bajor, Gy. Sági and Zs. Tegyey: Solid phase synthesis, thermal stability and exonuclease resistance of various PNA-DNA chimeras. in Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis and Combinatorial Libraries (R. Epton ed.) Mayflower Worldwide Ltd., Kingswinford, U.K., 2002,

12 5. Z. Bajor, Gy. Sági, Zs. Tegyey, L. Ötvös: Synthesis, biophysical and biochemical properties of PNA-DNA chimeras. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2003, 22(5-8), Z. Bajor, Gy. Sági, Zs. Tegyey, F. Kraicsovits: PNA-DNA chimeras containing 5-alkynyl-pyrimidine PNA units. Synthesis, binding properties and enzymatic stability. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2003, 22(10), Egyéb közlemények 1. P. Bakó, K. Vízvárdi, Z. Bajor, L. Tőke: Synthesis and application in asymmetric synthesis of aza-crown ethers derived from D-glucose. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1998, P. Bakó, Z. Bajor, L. Tőke: Synthesis of novel chiral crown ethers derived from D-glucose and their application to an enantioselective Michael reaction. J. Chem. Soc. Perkin Trans.I., 1999, D. Csányi, Gy. Hajós, Zs. Riedl, G. Tímári, Z. Bajor, F. Cochard, J. Sapi, J. Laronze: Synthesis of two new heteroaromatic ß-carbolinefused pentacycles. Observation of a new intercalating agent. Bioorg.& Med.Chem.Lett., 2000, 10, Gy. Sági, Z. Bajor, R. Mizda, Gy. Kenesi: 31 P NMR studies on the putative chemoselective activation of nucleoside-3 -thiophosphate- O-esters. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2003, 22 (5-8),

13 Nemzetközi előadások 1. Gy. Sági, Zs. Tegyey, Z. Bajor, F. Kraicsovits, J. Tomasz and L. Ötvös: Synthesis, thermal and enzymatic stabilities of PNA-DNA chimeras containing new dimer building units. Sixth International Symphosium on Solid Phase Synthesis & Combinatorial Chemical Libraries, York, Nagy-Britannia, szeptember Z. Bajor, Gy. Sági, Zs. Tegyey, A. Jakab and J. Tomasz: Solid phase synthesis and nuclease resistance of various PNA-DNA chimeras. Seventh International Symphosium on Solid Phase Synthesis & Combinatorial Chemical Libraries, Southampton, Nagy-Britannia, szeptember Z. Bajor, Gy. Sági, F. Zsila, Zs. Bikádi and M. Simonyi: Influence of tt (PNA-DNA) dimer blocks on the stability of T 12 da 12 oligonucleotide duplexes. Eleventh FECHEM Conference on Heterocycles in Bioorganic Chemistry, Barcelona, Spanyolország, június Z. Bajor, Gy. Sági, Zs. Tegyey and L. Ötvös: Synthesis and biochemical properties of PNA-DNA chimeras. XV. International Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Leuven, Belgium, szeptember

14 5. Gy. Sági, Z. Bajor, R. Mizda, Gy. Kenesi: 31 P NMR studies on the putative chemoselective activation of nucleoside-3 -thiophosphate- O-esters. XV. International Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Leuven, Belgium, szeptember L. Ötvös, Z. Bajor, Gy. Sági, V. Adleff, J. Kralovánszky, B. Budai, F. Tímár, A. Jeney: Solid phase synthesis and antitumor activity of P-thio antisense oligonucleotides having oligo-2 -deoxy-5- fluorouridylates at the 3 -end. Eighth International Symphosium on Solid Phase Synthesis & Combinatorial Libraries, London, Nagy- Britannia, szeptember Gy. Sági, Z. Bajor, F. Sipos and L. Ötvös: Synthesis and properties of oligonucleotides containing base-modified PNA units. Bioorganic Chemistry Meeting, Budapest, Magyarország, december 4-5. Hazai előadások 1. Ötvös L., Bajor Z., Kraicsovits F., Sági Gy.: Oligonukleotid prodrogok: egy új gyógyszercsalád. MTA Kémiai Kutatóközpont Szakmai Napok, március Sági Gy., Tegyey Zs., Bajor Z., Kraicsovits F., Tomasz J., Ötvös L.: PNS-DNS hibrid oligonukleotidok szintézise termikus és enzimatikus stabilitása. MTA Kémiai Kutatóközpont, Szakmai Napok, március

15 3. Kraicsovits F., Sági Gy., Bajor Z., Ötvös L.: Vizsgálatok a telomeráz kemoterápiai és diagnosztikai alkalmazására. MTA Kémiai Kutatóközpont, Tudományos Napok, március Bajor Z., Jeney A., Sági Gy., Tegyey Zs., Kraicsovits F., Ötvös L.: Oligonukleotid prodrogok vizsgálata. Magyar Kemoterápiai Társaság XV. Konferenciája, Hajduszoboszló, június Kraicsovits F., Sági Gy., Bajor Z., Tegyey Zs., Sági J., Ötvös L.: Nukleázok specificitása. MTA Bioorganikus Kémiai Munkabizottság ülése, Budapest, október Jeney A., Ötvös L., Kralovánszky J., Adleff V., Budai B., Bajor Z., Sági Gy.: Telomeráz inhibíció és sejt proliferáció gátlás vizsgálatok oligonukleotidokkal. Magyar Kemoterápiai Társaság XVI. Konferenciája, Hajduszoboszló, május Sági Gy., Tegyey Zs., Bajor Z., Ötvös L.: Módosított Peptid- Nukleinsav (PNS) analógok szintézise és termikus stabilitása. Magyar Kemoterápiai Társaság XVI. Konferenciája, Hajduszoboszló, május Bajor Z., Sági Gy., Tegyey Zs., Kraicsovits F., Tomasz J., Ötvös L.: PNS-DNS kimérák szintézise és enzimatikus hidrolízise endo- és 3 - exonukleázok jelenlétében. Magyar Kemoterápiai Társaság XVI. Konferenciája, Hajduszoboszló, május

16 9. Bajor Z.: PNS-DNS kimérák szintézise, termikus és enzimatikus stabilitása. MTA Kémiai Kutatóközpont, Szerves Kémiai Szemináriumok, február Bajor Z., Sági Gy., Kraicsovits F., Tomasz J., Ötvös L.: PNS-DNS kimérák szintézise, termikus és enzimatikus stabilitása. V. Doktori Kémiai Iskola, Szokolya-Királyrét, Magyarország, május Sági Gy., Bajor Z., Tegyey Zs., Ötvös L.: Egyes módosított oligonukleotidok biokémiai tulajdonságai. Magyar Kemoterápiai Társaság XVII. Konferenciája, Szeged, június