Koraszülöttek, újszülöttek tüdo és. agykárosodásának etiológiájára valamint. pathogenezisére irányuló vizsgálatok. Írta: Dr.

Átírás

1 Koraszülöttek, újszülöttek tüdo és agykárosodásának etiológiájára valamint pathogenezisére irányuló vizsgálatok. Írta: Dr. Hargitai Beáta Témavezeto: Prof. Dr. Szende Béla 2004 Budapest

2 Tartalomjegyzék 1. Bevezetés 5 2. Célkituzések 7 3. Irodalmi áttekintés A koraszülöttek krónikus tüdobetegségének (Chronic Lung Disease, CLD) morphológiájával és pathomechanismusával kapcsolatos újabb adatok A koraszülött újszülöttek agykárosodásának pathomechanizmusára és morphológiájára vonatkozó irodalmi adatok A hypoxiás-ischaemiás encephalopathia (HIE) és az agyi eredetu gyermekbénulás (AB) változó etiológiája A prenatális agykárosodás klinikai és patológiai bizonyítékai A placenta patológia és a prenatális agykárosodás összefüggései Anyagok és módszerek 4.1. Az apoptózis kimutatása koraszülöttek szerveiben, különös tekintettel a központi idegrendszer elváltozásaira Vizsgálati anyag I Patológiai feldolgozás és apoptózis kimutatása I Értékelés I Vizsgálati anyag II Patológiai feldolgozás és apoptózis kimutatása II Értékelés II A placenta patológia és az agyi eredetu gyermekbénulás összefüggésének vizsgálata, különös tekintettel a vanishing twin

3 jelenség etiológiai szerepére Az ALSPAC Tanulmány Vizsgálati anyag Patológiai feldolgozás Statisztikai feldolgozás Eredmények 5.1. Az apoptózis kimutatása koraszülöttek szerveiben, különös tekintettel a központi idegrendszer elváltozásaira Apoptózis koraszülöttek tüdo szövetében Apoptózis koraszülöttek agyszövetében Apoptózis a koraszülöttek vese és máj szövetében 5.2. A Vanishing Twin jelenség etiológiai szerepének vizsgálata az újszülöttek neurológiai károsodásában és az agyi eredetu gyermekbénulásban A makroszkópos vizsgálat eredménye A mikroszkópos vizsgálat eredménye Multiplex léziók vizsgálata 5.3. A placenta elváltozásai és az agyi eredetu gyermekbénulás összefüggéseinek vizsgálata Makroszkópos és mikroszkópos vizsgálat eredménye Multiplex elváltozások vizsgálata Különbözo súlyosságú tüneteket mutató betegcsoportok szétválasztása 5.4. Az ismeretlen eredetu krónikus villitis (Villitis of Unknown Etiology, Villitis of Unknown Origin, VUO) és a magzati thrombotikus elváltozások összefüggésének vizsgálata

4 6. Megbeszélés 6.1. Az apoptózis kimutatása koraszülöttek szerveiben, különös tekintettel a központi idegrendszer elváltozásaira 6.2. A Vanishing Twin jelenség etiológiai szerepének vizsgálata az újszülöttek neurológiai károsodásában és az agyi eredetu gyermekbénulásban. A placenta elváltozásai és az agyi eredetu gyermekbénulás összefüggésének vizsgálata Fontosabb új eredmények és megállapítások Köszönetnyilvánítás Melléklet Irodalomjegyzék A témában megjelent publikációk jegyzéke Egyéb közlemények A témában megjelent idézheto absztraktok Egyéb idézheto absztraktok 89 4

5 1. Bevezetés A szülészeti gyakorlatban és a perinatális intenzív ellátásban mutatkozó fejlodés jelentos változást hozott a szülés alatti (sub partu) hypoxiás károsodás (acut perinatális asphyxia) gyakoriságában, az ilyen események elofordulása jelentosen ritkult. Összességében azonban az újszülötteket érinto hypoxiás-ischaemiás agykárosodások (Hypoxiás-Ischaemiás Encephalopathia, HIE) valamint az agyi eredetu gyermekbénulások (Cerebral Palsy, CP) száma nem csökkent a legfejlettebb egészségügyi ellátást biztosító országokban sem, továbbra is nagy kihívást jelentve a neonatológusoknak, gyermekneurológusoknak, de az egész társadalomnak. (21;55) A HIE epidemiológiája, okainak feltárása, pathomechanizmusának felderítése a perinatális tudományágak egyik leggyakoribb kutatási témája. Ismertté vált, hogy az agykárosodást eltéro térbeli mintázat jellemzi az érett újszülöttekben és a koraszülöttekben, a szövetpusztulás mértéke pedig függ a szöveti érettség fokától, valamint a károsító hatás jellegétol (elhúzódó szöveti hypoxia versus hypotonia). A hypoxia az éretlen agyban foként a periventrikuláris germinális réteg sejtjeinek pusztulását illetve az itt elhelyezkedo kis erek falának károsodását és következményes kamrai és állományi vérzést okoz, míg az érettebb agyszövetben a subcortikális struktúrák, bazális ganglionok, thalamus, agytörzs neuronjainak degenerációját és elhalását eredményezi. Megfigyelheto, hogy a pusztuló sejtek egy része a programozott sejthalál legismertebb formájának, az apoptózisnak a morfológiai jellemzoit mutatja. Az apoptózis számos fiziológiás folyamatban aktív szerepet játszik az embryonális és magzati fejlodés során, azonban a koraszülött újszülöttek szöveteit éro fizikai és kémiai hatások is (hypoxia, hypotonia, mesterséges lélegeztetés okozta volu-és barotrauma, steroid és más gyógyszerek) beindíthatják a programozott sejthalál folyamatát, következményes szövetkárosodást okozva. Az apoptózis jelenség elofordulását, morphológiáját és a pathomechanizmusban játszott 5

6 szerepét vizsgáltuk koraszülött újszülöttek tüdo, vese, máj, és agyszövetében 1996 és 2000 között, az I. Sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben. Sokat változott az utóbbi két évtizedben az újszülöttek hypoxiás agykárosodásának és az agyi eredetu bénulás etiológiájának megítélése. Míg mintegy húsz évvel ezelott foként a perinatális acut asphyxiát tették felelossé a súlyos szövodményekért, a nemrégiben megjelent közlemények szerint az esetek dönto többségében, %-ban a terhesség során korábban jelentkezo, krónikus intrauterin hypoxia áll a háttérben. Ma már orvostörténeti érdekesség, hogy saját korát megelozve, Sigmund Freud 1897-ben valószínusítette az agyi eredetu gyermekbénulás prenatális eredetét, szemben Little hypothesisével (1862), mely a perinatális események, elsosorban a sub partu asphyxia etiológiai szerepét hangsúlyozta. Az intrauterin károsító hatás jellegének, intenzitásának, idopontjának és tartamának vizsgálatára, becslésére ad lehetoséget a placenta patológiai feldolgozása. Számos olyan morfológiai eltérést, kórképet írtak le a placentában, melyek szoros összefüggést mutattak az újszülöttek súlyos neurológiai károsodásával és az agyi eredetu bénulással. Ezek közül kiemelendo a magzati chorion ér és/vagy törzsboholy ér thrombosis, súlyos chorioamnionitis, monochoriális placentáció során kialakuló iker-iker transzfúzió az ikerpár egyik tagjának második trimesterbeli elhalásával. Egy nemrégiben ismertetett hypothesis szerint az ikerpár egyik tagjának a terhesség korai szakaszában történo elvesztése (Vanishing Twin jelenség, VT jelenség) is eredményezhet súlyos központi idegrendszeri károsodást az ikerpár túlélo tagjában. A placenta patológia és az újszülöttek súlyos, hypoxiás eredetu neurológiai károsodása valamint agyi eredetu bénulása közötti összefüggés vizsgálatára, valamint a VT jelenség etiológiai szerepének kutatására nyílt lehetoségem 2000 és 2002 között a Bristoli Egyetem St. Michael Kórház Patológiai osztályán, az Avon Longitudinal Study of Parents and Children (The ALSPAC Study) program keretében. 6

7 2. Célkituzések és 2000 között az I. Sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben koraszülött újszülöttek szerveinek diagnosztikus szövettani vizsgálatát végeztük, melynek során több károsodott szervben is megfigyeltük az apoptózis morfológiai jeleit. Feltételeztük, hogy a lélegeztetésre szoruló koraszülöttekben, a bronchopulmonális dysplasia acut- subacut stádiumának túlélése és a krónikus tüdobetegség kialakulása során, az epitheliális sejtek pusztulásában az apoptózis szerepet játszhat. Hasonlóképpen, a vese tubulus hámsejtjeinek károsodásában, a számos gyógyszer hatásának és hypoxiának kitett májban, valamint a koraszülöttekben igen gyakori periventrikuláris régiót és germinális réteget érinto kórképekben is vizsgálni kívántuk a sejtelhalás mechanizmusát. 2. Az apoptotikus sejtek kimutatása mellett célunk volt a jelenség gyakoriságának felmérése is, hogy megtudjuk, az egyes kórképekben milyen mértékben játszhat szerepet a programozott sejthalál. Négy eset kapcsán végzett megfigyeléseink alapján leírtuk, hogy az apoptózis megfigyelheto a koraszülöttek hypoxiás agykárosodásában, s további vizsgálatokat terveztünk, nagyobb számú anyagon, az apoptózis gyakoriságának, lokalizációjának és esetleges etiológiai szerepének pontosabb megismerése céljából. 3. Az ALSPAC tanulmány keretében végzett munkánk célja az újszülöttekben eloforduló hypoxiás-ischaemiás agykárosodás prenatális etiológiai faktorainak pontosabb megismerése, megértése volt, a placenta morfológiai vizsgálata segítségével. Célunk volt, hogy felderítsük, melyek azok a placentális elváltozások, amelyek szoros összefüggést mutatnak az újszülöttek súlyos neurológiai károsodásával, melyek azok, amelyek gyakrabban fordulnak elo, de nem mutatnak szignifikáns különbséget a kontroll esetekhez viszonyítva. 4. Fontosnak tartottuk meghatározni, melyek azok a morfológiai eltérések, amelyek azonos gyakorisággal fordulnak elo a kóros és a kontroll esetekben, mert ezek klinikai jelentoséggel nem bírhatnak, tehát normál variánsoknak tarthatók. 7

8 5. A tanulmány egyik igen érdekes célja volt Pharoah és mtsa. nemrégiben közölt elméletének az ún. Vanishing twin hypothesisnek a vizsgálata, mely azt sugallja, hogy az agyi eredetu bénulás hátterében, sok esetben, egy elso trimeszterbeli embryo/ magzatvesztéssel járó, egyébként fel nem ismert ikerterhesség áll. Ehhez a tanulmányhoz elozetesen szükséges volt a vanishing twin (VT) jelenség morfológiai kritériumainak meghatározása, emellett vizsgálni kívántuk azt is, hogy a placentában milyen egyéb, kóros elváltozások társulhatnak a VT jelenséghez. 6. További céljaink között szerepelt annak megfigyelése, hogy az egyes placentális elváltozások milyen viszonyban vannak egymással, vannak-e közöttük olyanok amelyek gyakran fordulnak elo együttesen. 8

9 3. Irodalmi áttekintés A koraszülött újszülöttekben az éretlenség által okozott súlyos szövodmények közül a leggyakoribb halálokok között szerepel a tüdok éretlenségével kapcsolatos légzési elégtelenség, valamint az agy éretlensége miatt fellépo agykamrai vérzés. Az elmúlt évtizedekben, a szülészeti és a neonatális intenzív ellátásban érzékelheto, hatalmas fejlodés következtében a kis súlyú és igen kis súlyú koraszülöttek túlélési esélye jelentosen javult, a hosszabb élettartam azonban a krónikus szövodmények incidenciájának növekedésével járt együtt. Mind a központi idegrendszeri károsodások késoi következményei, mind a krónikus tüdobetegség utánkövetést, gondozást, esetenként folyamatos ápolást igényel, és fontos közegészségügyi problémát jelent a fejlett egészségüggyel rendelkezo országokban (26;36), ezért számos szakterület képviseloinek frekventált kutatási témája A koraszülöttek krónikus tüdobetegségének (Chronic Lung Disease, CLD) morphológiájával és pathomechanismusával kapcsolatos újabb adatok A bronchopulmonális dysplasia (Bronchopulmonary Dysplasia, BPD) elnevezést 1967-ben Northway vezette be, a mesterséges lélegeztetésben részesült és súlyos, idiopátiás respiratorikus distress szindrómán (Idiopathic Respiratory Distress Syndrome, IRDS) átesett koraszülött újszülöttek krónikus tüdobetegségének leírására (56). Késobb bebizonyosodott, hogy bár nagyon gyakran IRDS talaján fejlodik ki a BPD, valójában az IRDS csak egy a számos klinikai és radiológiai tünetcsoport között, mely a BPD hátterében állhat (27). Kialakulásában fontos tényezo a tüdo éretlensége, valamint egy, a primer respiratorikus bronchiolusok hámsérülését, és diffúz alveoláris károsodást (Diffuse Alveolar Damage, DAD) 9

10 okozó hatás. A károsodás regeneratorikus folyamatokat indít el. A BPD kezdeti stádiumában a hyalinmembrán betegség szöveti képét látjuk. A korai acut exudativ stádiumban (1-2 hét túlélés után) perzisztáló hyalin membrán, bronchiolitis obliterans, bronchioláris nekrózis és kezdodo septális fibrózis jellemzo. Szubakut fibroproliferatív stádiumban (3-4 hét túlélés után) fokozódó interstitialis és perialveolaris fibrózis, simaizom proliferáció, bronchiolitis obliterans és bronchiolus tágulat, tág acinusok, elvétve hyalin membrán maradvány látható. A tüdo szerkezet remodellálódásának krónikus fibroproliferatív stádiumában (több hónap túlélés után) megfigyelheto az elorehaladott fibrózis, simaizom proliferáció, végül lépesméz tüdo képe alakul ki, vaskos septumokkal és lekerekedett, tág acinusokkal. (1. Ábra) 1. Ábra. Krónikus tüdobetegség, krónikus fibroproliferatív stádium (HE, X 200) A BPD klasszikus szöveti képe az utóbbi években ritkábban látható, helyette más formák jelennek meg. A krónikus tüdobetegség egy újabban leírt variánsát igen kis súlyú koraszülöttek túlélése esetén észlelték. Az IRDS-sel induló, a korai stádium után fokozódó alveolus kollapszus, máshol ezzel párhuzamosan kialakuló alveolus tágulat jellemzi a 10

11 kórképet. Szövettani vizsgálattal megfigyelheto az igen tág, összenyíló légurök mellett elhelyezkedo, légtelen tüdomezok jelenléte s feltuno a fibrózis hiánya (korábban ezt, mint Wilson-Mikity szindrómát írták le) (23). Úgy vélik, a kórkép kialakulásában nagyobb szerepet játszik a fiziológiás fejlodési és érési szignálok hiányában kialakuló alveolaris fejlodési zavar, mint az oxigén toxicitás. Az is valószínusítheto, hogy a kezdeti károsodás és a regenerációs folyamatok képesek az alveolus proliferációt gátolni (23). A krónikus tüdobetegség kialakulása folyamán a neutrophil granulocyták és a proinflammatorikus cytokinek kulcsszerepet játszanak (74) és egyes solubilis adhéziós molekulák szintjének korai emelkedése a krónikus tüdobetegség korai, klinikai markereként szolgálhat (60). A magzat tüdejének fejlodése során a mesenchymális és epitheliális sejtek apoptózisa meghatározott idoben és anatómiai struktúrákban figyelheto meg (45). A programozott sejthalálnak a károsodott tüdo remodellálásában betöltött szerepét csak felnott beteganyagon vizsgálták, s leírták, hogy a II. típusú pneumocyták resolutiójában dönto szerepet játszik (5). Az apoptózis és a koraszülöttek krónikus tüdobetegségének összefüggésére vonatkozó adatot nem találtunk az irodalomban A koraszülött újszülöttek agykárosodásának pathomechanizmusára és morphológiájára vonatkozó irodalmi adatok Az újszülöttek hypoxiás-ischaemiás agykárosodásának, a hypoxiás-ischaemiás encephalopathiának a mintázata, morfológiája nagymértékben függ az érettség fokától. A különbözo területek szelektiv vulnerabilitása az érettség mellett függ a károsító hatástól is (hypoxia vagy hypotenzió) (7). Koraszülöttekben elsosorban a germinalis matrix vérzéssel, agykamrai vérzéssel és periventrikuláris leukomalácia kialakulásával kell számolnunk. Az embryonális illetve magzati fejlodés során a subependymalis germinalis rétegben (germinal 11

12 layer) neuroglia ossejtek találhatók, melyek az embryonális fejlodés során, a 7. terhességi héttol kezdve a cortexbe vándorolnak. A neuroblast migratio következtében a germinalis réteg zsugorodik és a terhességi hétre csak sejt szigetek (germinal matrix, germinal zone) láthatók subependymalisan, az oldalkamra frontalis és occipitalis szarva körül, valamint a nucleus caudatus és a thalamus közötti árokban. A germinalis matrixban viszonylag kevés arteriás kapilláris található, az artériás áramlás igen lassú. Ezzel szemben, a vena Galeni rendszeréhez tartozó kis-venás hálózat suru, de a sepruszeru eloszlást mutató venulák között alig található anastomosis. Többnyire számos etiológiai faktor együttes fennállása (HMD, hypoxia, hypothermia, hypercapnia, acidosis, emelkedett jobb pitvari nyomás, mechanikus lélegeztetés) következtében az agyi vénás nyomás megemelkedik, és a kapilláris-venula junctióknál vérzés keletkezik. A folyamatot súlyosbítja, hogy az asphyxia miatt az ér permeabilitás fokozott, az agyi áramlás autoregulációja károsodott, az agyi vérnyomás instabil és a matrixban a fibrinolitikus aktivitás emelkedett. A germinalis matrix vérzés több gócban is kialakulhat, gyorsan terjed, a matrixot pusztítva, de a környezo fehérállományt kevésbé károsítva. A terjedés iránya a kamrarendszer felé mutat, ekkor intraventriculáris vérzésrol (IVH) beszélünk. Az IVH másik forrása a germinalis matrix mellett a plexus chorioideus lehet. A periventricularis leukomalacia kialakulásában szintén az instabil vérnyomás játszik fontos szerepet itt azonban a vérnyomás esés kapcsán kialakuló, csökkent perfusio vezet a végartériák ellátási területének ischaemiájához. A még nem tökéletesen myelinizálódott szövet különösen érzékeny a hypoxiára. Kórbonctani vizsgálat során, a fehérállományban, az oldalkamra külso szögleténél, a temporális lebenyben és a tapetum területén sárgásfehér gócok láthatók, melyeket krétafehér gyuru szegélyezhet. Az elváltozás általában többgócú, mindkét féltekében megfigyelheto. Szövettanilag kollikvációs nekrózis képe látható, duzzadt, töredezett axonokkal, mikrogliás, astrocytás reakcióval és makrofágokkal. A folyamatot különbözo mértéku oedema kíséri. Az akut szakasz átvészelése után két jellegzetes kórkép 12

13 alakulhat ki. A centrum semiovale nekrózisa, melynek során az érintett agyállomány gliózisa, calcium depositio, majd atrophia és hydrocephalus ex vacuo alakul ki. A másik forma a több gócú szöveti dezintegrációval és szövetvesztéssel jellemezheto polycystás encephalopathia (multicystic periventricular leukomalacia, polyporencephalia). (2. Ábra) 1. Ábra. Multicystikus periventriculáris leukomalacia késoi következménye- status lacunaris cerebri 18 hónapot élt koraszülöttben Az apoptózis a központi idegrendszer fejlodésében és differenciálódásában is bizonyítottan lényeges szerepet játszik. Caspase-9 hiányos knockout egerekben a szabályozatlan szövetburjánzás következményeként megnagyobbodott, az arckoponya elé boltosuló agy alakul ki, a kamrafalak megvastagodásával együtt (46). Állatkísérleti modellben és szövettenyészetben többen is megfigyelték az apoptózis kialakulását hypoxiás vagy oxydativ agykárosodás esetén (2;19;76), azonban humán anyagon végzett megfigyelés eredménye a vizsgálataink idején még nem állt rendelkezésre. 13

14 A hypoxiás-ischaemiás encephalopathia (HIE) és az agyi eredetu gyermekbénulás (AB) változó etiológiája A hypoxiás-ischaemiás idegrendszeri károsodás okaival, következményeivel foglalkozó tanulmányok és elemzések összehasonlítását megnehezíti, hogy sokszor heterogén betegcsoportot vizsgálnak, nincs pontosan definiálva a károsodás típusa. A cerebral palsy, severe neuropathological sequels, brain injury, neurologic damage etc. elnevezések általában heterogén neurológiai tünetekkel jellemezhetok, a neurológiai károsodás enyhébb és súlyosabb formáit is felölelik, s olyan entitásokat is lefednek, melyek valójában nem hozhatók összefüggésbe intrapartum hypoxiával. Egy 2004-ben publikált állásfoglalás összefoglalja és pontosan definiálja azokat a kritériumokat, melyeknek teljesülnie kell ahhoz, hogy intrapartum (sub partu) hypoxiás károsodás következtében kialakuló, agyi eredetu gyermekbénulásról (AB) beszélhessünk. Eszerint a neurológiai típus spastikus quadriplegianak, vagy dyskinesisnek felel meg, a 34. terhességi héten vagy azután születo újszülöttben nem sokkal a születés után neonatális encephalopathia tünetei, valamint metabolicus acidozisra jellemzo köldökzsinór vagy magzati vér értékek (ph < 7.00 és bázis deficit = 12 nmol/l) szükségesek a diagnózis felállításához (50). Az agyi eredetu gyermekbénulás és a súlyos, vagy mérsékelt központi idegrendszeri elváltozások egyéb neurológiai formái mögött az antenatális (prenatális, intrauterin) idoszakban fellépo akut vagy krónikus károsító hatás áll, és realisztikus becslés szerint agyi eredetu bénulásoknak csak mintegy 10%-át teszik ki a sub partu hypoxiás károsodásból származtatható esetek (4). Ezek a megállapítások megkérdojelezték azt az orvosi és társadalmi köztudatban régóta gyökeret vert feltevést, miszerint az AB hátterében a szülés közben fellépo károsodás, tehát elhanyagolt szülésvezetés, szülészeti mulasztás áll. Ezzel szemben, Blair 1988-ban közölt tanulmányában (14) rámutatott, hogy Nem bizonyított, hogy a jelenlegi fejlett szülészeti gyakorlattal 14

15 tovább csökkentheto az AB kockázata. Számos esetben a bénulás antenatális oka valószínusítheto. Az antenatális rizikó faktorok vizsgálata az érdeklodés középpontjába került és számos tanulmány foglalkozott a kérdéssel, melyek közül csak néhány érdekes munka ismertetésére vállalkozhatunk a dolgozat kereti között. Nelson és Ellenberg tanulmányában 1959 és 1966 között született újszülöttek anyagát dolgozta fel, ez ido óta a szülészeti gyakorlat lényegesen változott. Kockázati tényezoként számos anyai okot (anyai mentális retardatio, súlyos proteinuria, harmadik trimesterbeli vérzés, oestrogen vagy thyroxin kezelés, asymptomatikus szívbetegség, cervix incompetentia), magzati és placentális tényezoket (32. gestatios hét elotti szülés, 2000 g alatti születési súly, medence végu fekvés, congenitális malfomatio, chorionitis, kis tömegu placenta, placenta praevia, abruptio) írt le (55). Naeye 150 érett, és AB tüneteit mutató újszülött anyagán végzett tanulmányában mindössze 9 esetben (6%) mutatott ki sub partu asphyxiát az AB hátterében. Nem talált szignifikáns összefüggést krónikus antenatális hypoxiával járó kórképek (anyai anaemia, preeclampsia, krónikus hypertenzió, harmadik trimesterbeli váratlan vérnyomásesés, terminus túllépés, ikerterhesség) és az AB között. A quadriplegiával járó AB-ok 75%-a magyarázható volt, azonban a nem-quadriplegiás AB-ok 60 %-ának az okára nem derült fény (54). Az AB Blair és Stanly által azonosított antenatális rizikófaktorai az amnion volumen eltérései, elhúzódó burokrepedés koraszülés folyamán, congenitális malformatio, macerált, intaruterin elhalt ikerpár voltak. Anyai tényezoként a magas anyai életkort (> 35 év), thyroxin kezelést, anamnesisben szereplo halvaszülést találták (12;13). O Shea a subependymális vérzés és agykamrai vérzés prenatális rizikófaktorait tanulmányozta igen kis súlyú koraszülöttekben és azt találta, hogy a per vias naturales úton történo szülés emeli a kockázatot (57). 15

16 Gaffney és mtsai. 56 halva született vagy az elso három nap folyamán elhalt újszülött anyagát tanulmányozták a prenatális fehérállomány károsodás vonatkozásában. Nem találtak összefüggést a legtöbb anyai szociális faktorral, preeclampsiaval, toxemiával, antepartum vérzéssel, polyhydramnionnal, chorioamnionitissel, ido elotti burokrepedéssel, elhúzódó burokrepedéssel és anyai infectióval. Szignifikánsan gyakoribb volt a fehérállomány károsodás intrauterin növekedési retardatió, oligohydramnion, meconiumos magzatvíz fennállása esetén, valamint gyakrabban fordult elo egyedülálló anyák magzataiban, mint házasságban élo anyák esetén (29). Spinillo és mtsai. kis súlyú (< 2500 g) újszülöttekben, harmadik trimesterbeli vérzéssel szövodött terhességekben, szignifikánsan magasabbnak találta az AB és neonatális elhalás kockázatát ido elotti placenta leválást (abruptio placentae) követoen. A túlélo újszülöttekben a harmadik trimesterbeli vérzés enyhe fokú fejlodés-neurológiai eltérésekkel társult (70). Gaffney és mtsai. tanulmányával (28) ellentétben Adamson és mtsai. munkája azt sugalmazta, hogy a neonatális encephalopathia nem intrapartum hypoxiával magyarázható, hanem olyan antenatális eseményekkel függ össze, mint terhességi vérzés, anyai thyroxin kezelés, ido elotti burokrepedés. Kapcsolat mutatkozott még a neonatalis encephalopathia és congenitális malformatiok, valamint a konvulzió családi anamnesisben való elofordulása között (1). Murphy eset-kontroll tanulmányában 59 AB esetben vizsgálta az AB rizikófaktorait koraszülöttekben (<32 gestatiós hét), 234 kontroll esethez hasonlítva. Az anyai veszélyezteto tényezok közül egyedül a paritás mutatott szignifikáns különbséget, magasabb számú terhesség esetén nagyobb volt az AB kockázata. A vizsgált 52 antenatális faktor közül (a koraszülésen kívül) az elhúzódó burokrepedés, a chorioamnionitis és az anyai infectio mutatott összefüggést az AB-sal. A preeclampsia szignifikánsan csökkentette az AB kockázatát, valamint az intrauterin növekedési retardatio sem társult az AB-sal. Az intrauterin 16

17 növekedési retardatió azonban az újszülöttek 80%-ban anyai preeclampsia talaján alakult ki. A Sectio Caesarea csökkentette az AB kockázatát függetlenül a terheségi kortól és az antenatális szövodményektol. A preeclampsia érdekes módon a germinális matrix vérzés és agykamrai vérzés kockázatának csökkenésével társult, míg ugyanezen vérzéses szövodmények az AB kialakulásának kockázatát fokozták igen kis súlyú koraszülöttekben (53). 98 koraszülött újszülött (26-35 gestatios hét) anyagán végeztek Resh és mtsai. esetkontroll tanulmányt, melyben azt a következtetést vonták le, hogy a cystikus periventriculáris leukomalácia kockázatát szignifikánsan emeli az ido elotti burokrepedés, a chorioamnionitis, a hyperbilirubinaemia, és az ikerterhesség. A bilaterális vagy parieto-occipitális cysták, az AB kockázatát növelték, s a cysta nagysága is kockázati tényezot jelentett, olyannyira, hogy a 20 mm feletti átméroju cysták valamennyi esetben AB kialakulásához vezettek, míg az anterior lokalizációjú, soliter, kis cysta nem járt neurológiai eltéréssel (65). Pharoah és mtsa. 434 ikerpárt vizsgáltak, ahol az ikerpár tagjai azonos nemuek voltak, valamint egyikük intrauterin elhalt. A túlélok közül 59 újszülöttkorban, 7 az elso négy héten belül, 5 pedig csecsemokorban (< 1 év) halt meg. Tíz gyermekrol az utánkövetés során nem kaptak adatot. A háziorvosnak küldött kérdoívet a 353 túlélo csecsemorol 261 esetben válaszolták meg, mely szerint 23 gyermek szenvedett agyi bénulásban, 28 gyermeknek pedig más központi idegrendszeri károsodása alakult ki. Ezen adatokból számolva 1000 élveszületésre az AB prevalenciája 106 (95% CI [70-150]), a neurológiai károsodásé pedig 114/ 1000 (CI [80-160]). Ehhez hasonlóan 163 különbözo nemu ikerpár esetén is elvégezték a felmérést ahol az AB prevalenciája 29 (95 % CI [6-83]) a neurológiai károsodásé pedig 118 (CI [62-196]) volt 1000 túlélo csecsemore számítva. Ebbol azt a következtetést vonták le, hogy az ikerpár élveszületett tagjára nézve az AB kockázata emelkedett, átlagosan 20% (95% CI [16-25]). Az AB terhességi kor specifikus prevalenciája az ikerpár egyik tagjának elhalása 17

18 esetén sokkal magasabb, mint az általában, az iker populációban. A szerzok elképzelhetonek tartották azt is, hogy sok esetben az elhalt iker nem került felismerésre, vagy ha igen, akkor sem regisztrálták a születési statisztikában és a szüloket sem informálták. Az ilyen esetek száma ismeretlen, de esetleg magyarázatot adhat az AB esetek egy részének etiológiájára. Ez a felismerés vezetett a vanishing twin hypothesis -hez, mely szerint monochorionikus terhességben az ikerpár egyik tagjának korai (elso trimesterbeli) elvesztése emeli a túlélo ikerben az AB kockázatát (58;59) A prenatális agykárosodás klinikai és patológiai bizonyítékai Klinikai vizsgálatok alapján készült tanulmányok megerosíthetik az agykárosodás prenatális voltát. Bejar és mtsai. 127 koraszülött (<36 terhességi hét) koponya ultrahangos vizsgálatának elemzése során megállapították, hogy 13 újszülöttnek (10,3%) a harmadik életnapon cysticus elváltozása volt, ebbol 11 újszülöttben már az elso napon látható volt a cystikus lézió. Mindez alátámasztja, hogy prenatálisan történt a károsodás. Hat fehérállomány károsodásban szenvedo újszülött meghalt, három esetben történt postmortális vizsgálat s ezen esetekben az ultrahangos lelet igazolást nyert. A 7 túlélo agykárosodott gyermek közül 6 esetében 26 hónapos követést végeztek és azt találták, hogy 3 gyermek mentális és motoros funkciói normálisak voltak, míg 3 gyermek agyi bénulásban szenvedett (8). Skolnick is az antenatális agykárosodás ultrahangos dokumentációjára vállalkozott, 512 koraszülött vizsgálata során 11 újszülöttben írt le cystikus periventrikuláris leukomaláciát és 3 esetben porencephaliás cystát, az elso hét során. A prenatális ultrahang vizsgálat során is leírtak hasonló elváltozásokat, azonban számadatokat ezzel kapcsolatban nem közöltek (69). A prenatális agykárosodás incidenciáját vizsgálta Squier és Keeling, 165 esetbol álló autopsziás anyagon, ezen belül 39 halvaszületés vagy spontán vetélés (21-42 terhességi hét), 18

19 90 élveszületett, de elso hét során exitált újszülött, valamint 36 indukált vetélésbol származó magzat (16-24 terhességi hét) agya került részletes makroszkópos és szövettani feldolgozásra. Tíz halvaszületés esetében (29-40 terhességi hét) írtak le diffúz fehérállomány károsodást, kettoben az oldalkamrába töro germiális matrix vérzést találtak. A 75 élve született újszülöttbol 12 az elso három életnap folyamán exitált, ezekben az esetekben prenatális ischaemiás károsodás jeleit észlelték, ebbol öt esetben típusos periventrikuláris leukomaláciát is diagnosztizáltak. További öt újszülöttben diffúz fehérállomány gliosis és ischaemia jelei, két esetben pedig a subcortikális fehérállomány cystikus destrukciója, felette cortikális gliosis, valamint a szürke magvak, az agytörzs és a kisagy gliosisa volt megfigyelheto. A 4-7 napot túlélok közül 15-bol három esetben találtak ischaemiás agykárosodást. Egy 4 napot túlélo újszülöttben, legalább öt nappal azelott történtnek megfelelo morfológiai eltéréseket dokumentáltak (71). Iida és mtsai. 128 újszülött (23 terhességi hét <) anyagának neuropatológiai vizsgálatát végezték el, akik az elso 30 életnap során exitáltak. Közülük 71 az elso három napon belül meghalt, illetve ez a csoport foglalja magába a halvaszületéseket is (10). A 71-bol 12 esetben (2 halvaszületett) prenatális leukomaláciát valószínusítettek a talált szövetkárosodás és szöveti reakció kora alapján. Hét újszülött a koraszülött csoportba (44 eset, <32 terhességi hét) tartozott (15,9%) és 5 a 27 érett újszülött (37 terhességi hét = ) közül került ki (18,5%). A koraszülöttek kiterjedt periventriculáris fehérállomány károsodást szenvedtek, míg az érett újszülöttekben gócos fehérállomány pusztulás volt megfigyelheto. A szerzok ezt a jelenséget a koraszülöttek érfejlodésének éretlenségével magyarázták (38). 19

20 A placenta patológia és a prenatális agykárosodás összefüggései A prenatális agykárosodás bekövetkezésének hozzávetoleges idopontja, a károsító hatás jellege, akut vagy krónikus volta megválaszolatlan kérdések maradnának a placenta részletes patológiai feldolgozása nélkül. A placentában látott kóros eltérések felismerése és helyes értelmezése azonban számos információval szolgálhat egyes anyai kórképekrol, a magzat állapotáról, valamint hypoxiás hatás vagy intrauterin infekció fennállásáról. Ezért számos tanulmány foglalkozik a placenta patológiás eltérései és a perinatális idegrendszeri károsodások összefüggéseinek elemzésével. Grafe 98 intrauterin vagy az elso órában elhalt újszülött (18-41 terhességi hét) anyagát tanulmányozta, minden esetben teljes makroszkópos és mikroszkópos neuropatológiai feldolgozás, valamint ettol függetlenül végzett placenta vizsgálat történt. A neuropatológiai eltérések megoszlása a következo volt: germinális matrix vérzés, kamrai vérzés 15/98, fehérállomány károsodás gliosissal vagy necrosissal 27/98, neuronális necrosis 6/98. A vizsgált placentális eltérések közül szignifikáns összefüggés mutatkozott a fehérállomány necrosis és a krónikus vasculáris elváltozások (abruptio, régi infarctus, magzati chorion ér thrombosis), köldökzsinór elváltozások (méretbeli eltérések, velamentózus tapadás), meconium pigmentáció között. Összefüggést találtak a neuronális necrosis és a placentális krónikus vasculáris elváltozások között is. A germinális matrix vérzés csak a funisitissel asszociálódott. A chorioamnionitis egyik neurológiai problémával sem mutatott összefüggést (35). Altshuler 10 olyan esetet ír le, ahol a meconium a köldökzsinór vasculáris necrosisát okozta. A tanulmányt 1100 krónikus meconium pigmentációt mutató placentán végezte. A tízbol egy újszülött kevéssel születés után exitált, három másik gyermek neurológiai tüneteket 20

21 mutatott két éves korára. Altshuler valószínusítette, hogy a magzati hypoperfúziót baktériumok által kiváltott placentális és umbilicális vasoconstrictio okozza (3). Redline és mtsa. a magzati ér thrombosis klinikai jelentoségére világított rá (62), majd Kraus dokumentálta a placenta magzati ereinek thrombosisát, 15-bol 11 esetben AB-ban szenvedo gyermekek méhlepényében, orvosi muhiba perek folyamán. Azt a következtetést vonta le, hogy az in utero bekövetkezett thromboticus események magyarázhatják az AB pathogenezisét és hogy az örökletes koagulopathiák preventiv kezelése szükséges lehet terhesség során, mivel növelhetik a magzatban az AB kialakulásának kockázatát (43). Redline és mtsai. retrospektiv eset-kontroll tanulmányukban 9 olyan elváltozást írtak le, melyek összefüggést mutattak érett újszülöttekben kialakuló neurológiai károsodással: meconium okozta vasculáris necrosis, súlyos, magzati chorioamnionitis, magzati chorion ér thrombosis, a magvas vörösvértestek számának emelkedése a boholycapillárisokban, abruptio, diffúz krónikus villitis, extenzív avasculáris villus képzodés, diffúz chrorioamnionikus haemosiderosis, valamint extenzív perivillozus fibrin lerakódás. Igen kis súlyú koraszülöttek neurológiai károsodása összefüggést mutatott a chorion erek friss thrombosisával, és súlyos villus oedemával (61;63). 21

22 4. Anyagok és módszerek 4.1. Az apoptózis kimutatása koraszülöttek szerveiben, különös tekintettel a központi idegrendszer elváltozásaira Az apoptózis kimutatásával kapcsolatos vizsgálatainkat 1996 és 2000 között, koraszülött újszülöttek különbözo szerveiben, az I. Sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben végeztük Vizsgálati anyag I. Elso vizsgálat sorozatunkhoz 24 koraszülött újszülött (24-36 terhességi hét) anyagát választottuk ki, ahol a halál közvetlen oka légzési elégtelenség vagy agykamrai vérzés volt. A legrövidebb túlélési ido 10 óra, a leghosszabb 27 hét volt. Valamennyi újszülött neonatális intenzív terápiás centrumba (SE I. Sz. Szülészeti és Nogyógyászati Klinika és SE II. Sz. Gyermekgyógyászati Klinika) került megszületése után és gépi lélegeztetésben részesült. Valamennyi koraszülött esetében dokumentálták az IRDS klinikai és radiológiai tüneteit, a tüdok rutin posztmortális szövettani vizsgálata során pedig minden esetben hyalin membrán betegség vagy bronchopulmonális dysplasia különbözo stádiumainak jelei mutatkoztak. A klinikai adatokat az Eredmények fejezetben közölt táblázatokban foglaltuk össze (1., 2., 3. Táblázat). A klinikai adatok gyujtésében és értékelésében Dr. Hajdú Júlia, Dr. Harmath Ágnes az I. Sz. Szülészeti és Nogyógyászati Klinika és Dr. Pataki Margit a II. Sz. Gyerek Klinika neonatológusai vettek részt. Kontrollként két diaphragma herniában szenvedo, koraszülés indukció során, sub partu elhalt magzat (27. és 36. terhességi hét) szerveibol készült 22

23 metszeteket használtuk, az értékelés során, vakon vizsgálva. Ezekben az apoptotikus sejtek száma igen alacsony volt Patológiai feldolgozás és apoptózis kimutatása I. A posztmortális vizsgálatra a SE I. Sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben került sor, meghatározott protokoll szerint, 1993 és 1999 között (52). Minden esetben szövettani mintavételre került sor a tüdokön kívül a májból és mindkét vesébol. Az agy esetén az oldalkamra falából, valamint a makroszkóposan azonosítható elváltozásokból történt kimetszés szövettani vizsgálatra. A szöveteket 10 %-os formalinban fixáltuk, majd szokásos módon paraffinba ágyaztuk. 5 µm vastag sorozatmetszeteket készítettünk Superfrost-Plus lemezre (Menzel-Glaser, Freiburg, Germany), és a deparaffinált metszeteket hematoxylineosinnal (HE) festettük. Minden metszési magasságból félretettünk egy-egy metszetet TUNEL (Terminal deoxynucleotidil transferase-mediated nick end-labelling) reakció céljára. A TUNEL reakció az apoptózis kimutatására szolgáló módszer, melynek során a fragmentálódott DNS törvégeket deoxynucleotidokkal jelöljük, majd egy elohívó rendszer segítségével a beépült deoxynucleotidokat detektáljuk. Eloször a HE festett metszeteket vizsgáltuk meg, s a legalkalmasabbnak mutatkozókat kiválasztottuk, szervenként két metszetet. Az ezekkel közel azonos síkból készült lemezeken végeztük el a TUNEL reakciót (ApopDETEK Cell Death Assay System; Enzo, New York, U.S.A. A beépült deoxynucleotidok detektálására torma peroxidáz-diaminobenzidin in situ detektáló rendszert használtunk (Simply Sensitive Horseradish Peroxidase-DAB In Situ Detection System; Enzo, New York, U.S.A.). 23

24 Értékelés I. A pozitív reakciót adó, apoptotikus sejtek arányát értékeltük az alveoláris és bronchioláris hámban, vesetubulus hámsejtekben, a neuronokban és gliasejtekben illetve a germinális matrix sejtjeiben, és a hepatocytákban. A tüdoben, a hámsejtekben látott apoptózis súlyossági fokának megállapításánál a Bardales és mtsai. által publikált adatokat vettük figyelembe, akik ARDS-ben vizsgálták a II. típusú pneumocyták apoptózisát, és kifejezetten emelkedett apoptotikus aktivitást véleményeztek, ha a hámsejteknek legalább 30%-a TUNEL reakcióval pozitív volt. Az aktivitást gyengének illetve jelentéktelennek tartották a szerzok 5% alatt (5). Hasznos adatokat tartalmazott Kresch és mtsai. munkája, mely patkány magzatokban írta le az apoptózis elofordulását és változását az ontogenezis során. Mind a mesenchymális, mind a hámsejtek apoptotikus aktivitása alacsony a magzati életben, a sejtek 0,6-1%-át érinti. Az érett újszülött patkányokban az elso életnap folyamán 9-12%-os aktivitást észleltek, mely aztán gyors csökkenést mutatott. Utóbbi adat szintén a mesenchymális és hámsejtek együttes számára vonatkozik (45). A magzati illetve újszülött vese csatorna hámsejtekben eloforduló apoptotikus aktivitásra vonatkozó irodalmi hivatkozás nem állt rendelkezésre, így a tüdohöz hasonló kiértékelési rendszert használtunk. A tüdoben és a vesében kifejezett apoptotikus aktivitásként értékeltük (++), ha a terminális légút vagy a vesetubulus sejtjeinek 30%-a, vagy több mint 30%-a pozitív reakciót adott. Enyhe aktivitáson (+) az ez alatti értékeket értettük, míg pozitív reakció hiányában nem beszélhetünk aktivitásról (-). A magzati agyban eloforduló apoptotikus aktivitásra vonatkozóan két publikáció is 1% körülinek határozta meg az apoptotikus sejtek arányát emlos (patkány, tengerimalac) magzatokban a fejlodo cortexben és három ezrelék körülinek a subcorticális fehérállományban, az élet elso tíz napjában (15;25). Az értékelési rendszerünk kialakításakor humán anyagra vonatkoztatott adat nem állt rendelkezésre sem az agy sem a máj esetében. 24

25 Az agyban, és a májban 10 különbözo látótérben számoltuk a pozitív reakciót adó sejteket, x20 objektívet használva. Kifejezett apoptotikus aktivitáson (++) azt értettük, ha x 20 látóterenként átlagosan több mint 10 sejt mutatott pozitivitást sejt esetén enyhe aktivitásról (+) beszéltünk. Kevesebb mint 5 pozitív sejt igen alacsony aktivitást illetve a tényleges aktivitás hiányát jelentette (-), az elore meghatározott, semiquantitativ értékelési rendszerünkben. Az eredmények feldolgozása után érdemesnek tartottuk a koraszülöttek agykárosodásának további vizsgálatát Vizsgálati anyag II. A második vizsgálat sorozatunkat is az I. Sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben végeztük között. 12 koraszülött (24-34 terhességi hét) posztmortális vizsgálatának anyagát használtuk fel. A koraszülött újszülötteket az I. Sz. Szülészeti Klinika Neonatális Intenzív Centrumában kezelték, valamennyien mesterséges lélegeztetésben részesültek és klinikailag diagnosztizált IRDS-ben szenvedtek. Hypoxiás-ischaemiás encephalopathia klinikai tünetei nyolc esetben manifesztálódtak, egy esetben kóros koponya ultrahang lelet keltette neurológiai károsodás gyanúját, három esetben az ultrahang lelet nem volt elérheto és a betegeknél neurológiai tüneteket nem dokumentáltak, azonban a posztmortális vizsgálat igazolta az agykárosodást. A koraszülöttek kliniko-patológiai adatait a 4. Táblázatban foglaltuk össze az Eredmények fejezetben. A klinikai adatok gyujtésében és elemzésében Dr. Hajdú Júlia és Dr. Cziniel Mónika nyújtott segítséget Patológiai feldolgozás és apoptózis kimutatása II. A posztmortális vizsgálatra minden esetben 24 órán belül sor került, hogy kiküszöböljük az autolysis okozta mutermékek kialakulását. Az agy makroszkópos vizsgálata és a kimetszések készítésekor felhasználtuk a koponya ultrahang során készült részletes 25

26 leírást, mely a gócos elváltozások helyét pontosan behatárolta. Ezen területekbol, valamint az elváltozással szimmetrikus ép területbol készítettünk blockokat. Emellett reprezentatív kimetszéseket készítettünk, melyek tartalmazták az oldal kamra falát a germinális matrix-szal, a periventriculáris fehérállományt és a felette elhelyezkedo kéregállományt. A szöveteket az elso vizsgálatnál leírtakhoz hasonlóan kezeltük és esetenként 2-4 területrol, 3-3 sorozat metszetet készítettünk elo, HE festésre, Nissl festésre és TUNEL reakcióra. A TUNEL reakció elvégzéséhez a neurogén sejtek apoptózisának kimutatására javasolt NeuroTACS Kit állt a rendelkezésünkre (NeuroTACS II In Situ Apoptosis Detection Kit RandD Systems Inc., Minneapolis, U.S.A.) A kit tartalmazott egy permeabilizáló reagenst, mely finoman, a sejt struktúra megorzése mellett tette átjárhatóvá a sejtmembránokat. Emellett, a kit fejlesztésénél tekintettel voltak az agyszövet esetén adódó általános problémákra, mint pl. törékenység, eros háttér reakció, gyenge háttér festodés a legtöbb szokványos festékkel. A kithez technikai pozitív kontroll is tartozott. Negatív kontrollként a makroszkópos és mikroszkópos elváltozást nem mutató területbol készült kimetszéseket használtuk, illetve a kamrafalból készült metszeteken belül a homolaterális temporo-parietális cortex területét belso negatív kontrollnak tekintettük Értékelés II. A metszetek értékelését két független vizsgáló végezte (Dr. Sergi, Consolato, University of Bristol és Dr. Hargitai Beáta, SE I. Patológiai Intézet), eltéro eredmény esetén a vizsgálók közös véleményt alkottak. 10 random módon választott x20 objektivvel vizsgált mezoben a pozitív reakciót mutató sejteket számoltuk. Az apoptotikus aktivitást 15 pozitív sejt/mezo felett erosnek, sejt/mezo esetén mérsékeltnek, 10 sejt/mezo alatt enyhének tartottuk. Az elozo vizsgálatunkhoz képest szigorúbb kritériumok bevezetését a specifikus kit alkalmazása miatt tartottuk indokoltnak. 26

27 4.2. A placenta patológia és az agyi eredetu gyermekbénulás összefüggésének vizsgálata, különös tekintettel a vanishing twin jelenség etiológiai szerepére Az ALSPAC Tanulmány A placenta patológiájának klinikai összefüggéseivel foglalkozó vizsgálatainkat 2000 október és 2002 október között végeztük a St. Michael s Hospital Paediatric Pathology Dep. osztályán, mely a University of Bristol Medical Faculty oktatókórháza. Munkánk egy kiterjedt WHO tanulmány keretében jöhetett létre, melynek elindításáról 1985-ben döntöttek és ELSPAC (Europian Longitudinal Study of Pregnancy and Chidhood) néven vált ismertté. Az ELSPAC egyik centruma a bristoli egyetemen jött létre The ALSPAC Study (Avon Longitudinal Study of Parents and Children) vagy másként Children of the Nineties (Gyermekek a kilencvenes években) elnevezéssel. A tanulmány célja az egyén genotypusának és a környezeti tényezok kölcsönhatásának vizsgálata egy homogén, azonos földrajzi területen (Avon megye) élo populációban. Mintegy gyermek vett részt a tanulmányban, akiknek adatait fogantatástól kezdve, napjainkig gyujtik, ma a résztvevok évesek, követésüket serdülokorig folytatják. A szülokkel kapcsolatos adatokat is rögzítették, tárolják. Az adatok egyebek között- a genotypusról, szülészeti szurovizsgálatokról, orvosi beavatkozásról, gyógyszerelésrol, szülés módjáról, szövodményeirol, életmódbeli tényezokrol, mint pl. cardiovasculáris rizikó faktorokról, szociális helyzetrol, viselkedési attitüdökrol, a gyermek fizikai és szellemi fejlodésérol nyújtanak információt. A tanulmány részletes módszertanát, az összegyujtött adatokra vonatkozó információkat, a rendkívül gondosan biztosított etikai hátteret, az adatok biztonságos tárolását és bizalmas kezelését a szervezok rendszeresen ismertetik közleményeikben (33). 27

28 A munkánkhoz szüksége etikai engedélyt a Research Ethics Comittee, United Bristol Healthcare NHS Trust bocsátotta ki. Valamennyi biológiai minta és placenta vizsgálata szüloi beleegyezési nyilatkozat birtokában történt Vizsgálati anyag A vizsgálatra kerülo méhlepényeket a Bristol Placenta Bankból választották, ahol kb , az Avon megyei populációt reprezentáló speciment tárolnak, melyeket 1991 április és 1992 december között gyujtöttek össze. Az anyagokat formalinban fixálva tartják, számozott tárolókban. A specimen száma és a szülok vagy a gyermek klinikai adatai közötti kapcsolat csak az ALSPAC bizonyos statisztikus munkatársai számára hozzáférheto, adatvédelmi okokból. A vanishing twin jelenségre irányuló vizsgálatokra 49 méhlepény állt rendelkezésre, ahol az anya igen választ adott a kérdoív azon kérdésére, hogy A terhessége folyamán állapítottak-e meg önnél ikerterhességet?, azonban csak egy gyermeket hoztak világra. Valamennyi index placentához két kontrollt választottak (98 kontroll), melyek terhességi korra, anyai életkorra és nemre nézve egyeztetve voltak. Az AB és placenta patológia közötti összefüggés vizsgálatára 21 méhlepény állt rendelkezésre, ahol 12 gyermeknél súlyos, 9 gyermeknél enyhébb formájú agyi bénulást diagnosztizáltak a születés utáni négy héten belül. Minden esethez három kontroll placentát rendeltek (63 kontroll), melyek terhességi korra, anyai életkorra és nemre egyeztetve voltak. A két tanulmány részére kiválasztott anyag egyszerre került vizsgálatra, a klinikai adatok a vizsgálónak nem álltak rendelkezésére, a patológiai feldolgozás tehát vakon történt. 28

29 Patológiai feldolgozás Az index és kontroll placentákat egy patológus (Dr. Hargitai Beáta) vizsgálta, majd az anyag 10%-át egy független vizsgáló (Prof. Jeremy Berry) újravizsgálta. A két vizsgálat eredménye között statisztikai különbség nem volt kimutatható. A makroszkópos és mikroszkópos elváltozások esetén az irodalomban rendelkezésre álló, legújabb definíciókat használtuk (10;42;48;61;63), néhány elváltozás esetén általunk lefektetett kritériumokat alkalmaztunk, ezeket a Függelék c. alfejezetben részletezzük. A makroszkópos vizsgálat elso lépéseként valamennyi placentát röntgen vizsgálatnak vetettük alá, Faxitron X-ray Cabinet készülékben, a filmeken tanulmányoztuk a kalcifikáció jelenlétét, eloszlását, súlyosságát, valamint magzati szkeletális elemek után kutattunk. Ezután a formalin fixált placentákat egyenként vizsgáltuk, tömegét, kiterjedését (szélesség, hosszúság, átlagos vastagság) megmértük. Leírtuk az esetleges alaki rendellenességeket, a magzati vagy anyai felszínen látható elváltozásokat. A köldökzsinór hosszát, átmérojét, a metszlapján látható erek számát, a csavarulatok gyakoriságát, irányát, a köldökzsinór gócos eltéréseit megfigyeltük és rögzítettük. A magzatmembrán tapadását, színét, s subchorionális felszínes elváltozásokat, a magzati erek makroszkópos eltéréseit is vizsgáltuk. A placentát 1cm-es szeletekre vágtuk és leírtuk a metszlapokon eloforduló esetleges eltéréseket. Az így nyert adatokat egy általunk tervezett és elore elkészített Makroszkópos vizsgálati adatlap -on rögzítettük (1. Melléklet). Minden placentából szövettani blockot készítettünk standard protokoll szerint. Az 1. számmal jelzett blockba a köldökzsinór placentális vége és a membrán, a 2. sz. blockba a köldökzsinór magzati vége, a 3. sz. blockba egy széli kimetszés, a 4. sz. blockba az anyai felszínbol készült lapszerinti metszés, az 5-6. sz. és 7-8. sz. blockokba centrális ill. paracentrális, teljes vastagságú kimetszések kerültek, a további számozott blockokban az esetleges elváltozásokat indítottuk szövettani feldolgozásra (2. Melléklet). A szövettani feldolgozás szokványos módon történt, dehydrálás, paraffinba ágyazás, 5µm-es 29

30 metszetek készítése, dehydrálás után HE festésre került sor. Egyes esetekben kórokozó kimutatására PAS reakciót, vas tartalmú pigmentáció azonosítására Berlini-kék festést, ér rendellenességek vizsgálatára Elastica-Van Gieson festést alkalmaztunk. A mikroszkópos vizsgálat folyamán 52 entitást vizsgáltunk, melyek között szerepeltek olyan eltérések melyeket korábban az irodalomban már összefüggésbe hoztak súlyos vagy kevésbé súlyos klinikai következményekkel, de vizsgáltunk olyanokat is melyekrol addig még nem készült ilyen jellegu tanulmány. A mikroszkópos vizsgálat eredményét a Mikroszkópos vizsgálati adatlapon rögzítettük (3. Melléklet). Az egyes metszeteket egyenként értékeltük, majd a talált eltéréseket egy adott entitásra vonatkoztatva összegeztük. Ezt az eredményt a SR oszlopban tüntettük fel a vizsgálati lapon és ezekkel az értékekkel dolgoztunk a továbbiakban. A makroszkópos és mikroszkópos vizsgálatok eredményeit egy Microsoft Access adatbázisban rögzítettük, a változók és értékek definíciója a 4. Mellékletben látható Statisztikai feldolgozás A patológiai és klinikai adatok egyeztetése egy harmadik személy által történt, egy számítógépes protokoll segítségével, anonim módon, megszüntetve minden kapcsolatot az eredeti adatbázissal. Az adatok elemzése Stata (6.0 Windows) program segítségével történt. Fisher Exact tesztet használtunk annak eldöntésére, hogy az egyes patológiás entitások gyakrabban jelentkeznek-e az index placentákban (univaribilis asszociáció). Az index és kontroll placenták összehasonlítására kondicionális logisztikus regressziós modellt alkalmaztunk, az odds ratio-t (OR) és a 95%-os konfidencia tartományokat (CI) kiszámítottuk. A kontinuus parametrikus adatok elemzésére (pl. placenta tömeg, köldökzsinór átméro) Student-t próbát, míg a nem-parametrikus változókra (placenta hossz, szélesség, vastagság) Mann Whitney U tesztet használtunk. Azokat az összefüggéseket, ahol az eltérést 30