Immunológiai módszerek

Átírás

1 Immunológiai módszerek

2 poliklonális ellenanyagok monoklonális ellenanyagok specificitás heterogén homogén affinitás heterogén homogén izotípus heterogén homogén keresztreakciók gyakori nincs előállítás olcsó, egyszerű drága, speciális felszerelést igényel immunizálás tisztított antigénnel szennyeződés nem zavar mennyisége korlátozott korlátlan jellemzés specificitás/keresztreagáló képesség izotípus összetétel átlag affinitás finom specificitás izotípus affinitás ajánlott módszerek precipitáció agglutináció komplement aktiválás ELISA FACS / MACS blot - ELISA/RIA

3 A monoklonális ellenanyag előállítás menete George Köhler és Cesar Milstein, 1984 antigén tisztítás jelölés lépsejtek PEG mielómasejtek ellenanyag termelés sejtek HAT aszcitesz fagyasztás ellenanyag szelekció klónok felnövesztése klónozás

4 Antigén-ellenanyag kötődés kimutatása 1. Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek

5 Gél közegben végzett precipitációs módszerek Kétdimenziós egyszerű immundiffúzió Kétdimenziós kettős immundiffúzió antigén antigén ellenanyag Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek: 1. precipitáció - folyadékfázisban - gél közegben 2. agglutináció 3. komplement függő lízis ag agarba kevert ellenanyag antigén antigén ea ellenanyag Machini-módszer Agaróz gél ellenanyag Ouchterlonz/m=dsyer Ouchterlony módszer Agar gél 1/128 Ea 1/2 1/128 Ag 1/2 1/64 Ag 1/4 1/64 Ea 1/4 1/32 1/16 1/8 1/32 1/16 1/8

6 direkt Agglutináció indirekt Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek: 1. precipitáció - folyadékfázisban - gél közegben 2. agglutináció 3. komplement függő lízis passzív AB0 vércsoport Rh vércsoport antigének (Coombs teszt) autoantitestek vagy vírus antigének kimutatása

7 Komplement függő sejtlízis HLA tipizálás szerológiai módszere Másodlagos (szerológiai) reakciókon alapuló módszerek: 1. precipitáció - folyadékfázisban - gél közegben 2. agglutináció 3. komplement függő lízis alvadásgátolt PBMC szeparálás vér komplement forrás (friss nyúlsavó) allél-specifikus antisavók festék élő / pusztult sejtarány

8 módszer érzékenység ( g/ml ) jelzéses technikák ELISA < 0,001 RIA < 0,0001 immunfluoreszcencia < 1,0 precipitációs módszerek kettős immundiffúzió 1,0 10,0 ellenelektroforézis 0,1 1,0 immunelektroforézis 5,0 50,0 radiális immundiffúzió 1,0 10,0 rakéta elektroforézis 0,1 1,0 agglutinációk indirekt - direkt 0,01 1,00 passzív 0,005 0,1 agglutináció gátlás 0,001 0,01 komplement kötés 0,01 0,1

9 Antigén-ellenanyag kötődés kimutatása 2. Jelzéses technikák

10 Jelölés módja: - Enzimmel (HRPO, alkalikus foszfatáz) ELISA, ELISPOT, hisztokémia - Fluoreszcens festékkel (FITC, TRIC, Texasred, Rodamin, PE, CyChrom, Alexa) FACS, fluorescens mikroszkópia - Fémkolloidokkal (vas, arany) MACS, elektron mikroszkópia - Radioaktív izotópokkal RIA (radio immuno assay)

11 ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay) 1. direkt ELISA Enzimmel konjugált ellenanyag -- Ag % + szubsztrát + kromogén direkt 5 1 0,2 EA [c] mg/ml % direkt Ag [c] mg/ml ellenanyag antigén determinánsok jelzés (enzim, pl. HRPO; radioaktív izotóp;fluorokróm)

12 2. indirekt ELISA indirekt OD 10x 100x 1000x EA hígítás monoklonális reagens ellenanyag második ellenanyag (anti-egér immunoglobulin) poliklonális reagens antigén determinánsok jelzés (enzim, pl. HRPO; radioaktív izotóp;fluorokróm) + szubsztrát + kromogén

13 Szendvics ELISA 1. Coat készítés elsődleges ellenanyag szilárd fázishoz kötődik 2. antigén (ismeretlen konc.) (fehérjék, nukleinsavak, poliszacharidok, vírusok, baktériumok, sejtek) Standard: ismert koncentrációjú antigén higításai kvantitatív meghatározáshoz szükséges 3. Antigén secifikus második allanyag jelzett (-HRPO) formában (biotin-sztreptavidin=erősíti a színreakciót, ld. ábra) 4. Szubsztrát (H 2 O 2 ) + kromogén (pl. TMB) A redukált (színtelen) TMB kromogén oxidálódik színváltozás (kék) 5. Reakció leállítása (H 2 SO 4 ) színváltozás (sárga) 6. Spektrofotometriás mérés Az első réteg után blokkolás (szabad kötőhelyek fedése), a további lépések között mosás (nem kötődött molekulák eltávolítása)

14 ELISA kivitelezése:

15 ELISA kit különféle antigének mennyiségi meghatározására

16 Antigén-ellenanyag elsődleges kapcsolódásának kimutatásán alapuló: jelzéses módszerek 1. ELISA 2. Fénykibocsátás detektálásán alapuló módszerek Fluoreszcencia, lumineszcencia (Sejtanalitikai módszerek: FACS, CLM)

17 Fluoreszcencia Egy gerjesztett molekula elektronátmeneteit (relaxáció) kísérő foton kibocsátás (emittáció) Egy foton elnyelése, az ABSZORBCIÓ (1) váltja ki Egy gerjesztett elektronállapot (S1 ) jön létre, mely először a legalacsonyabb S1 vibrációs szintre relaxál (2), majd Fluoreszcencia kibocsátás vagy egyéb relaxációs folyamatok (3) során visszatér az alapállapotba: a kibocsátott fluoreszcencia mindig hosszabb hullámhoszú, mint az elnyelt hullámhossz Fluorofórok lényeges paraméterei Emissziós (kibocsátási) spektrum Gerjesztési (elnyelési, excitációs) spektrum

18 Miért jó fluoreszcens technikákat használni? pmol/l érzékenységű a radioaktív jelölés lenne hasonlóan érzékeny, de az veszélyes térbeli és időbeli feloldást is lehetővé tesz (határ: ns, ami a fluoreszcencia életideje) spekrofluorimetria multiparaméteres fluoreszcens mikroplate reader áramlási citofluorimetria (FACS) fluoreszcens mikroszkópia Fluorofórok A flurofórok olyan molekulák, melyek képesek az elnyelt fényt jó hatásfokkal fluoreszcencia formájában kibocsátani Természetes fluorofórok: Trp, Tyr, koenzimek, szteroidok, DNS/RNS Gyakori szintetikus és szemi szintetikus fluorofórok: Fluoreszcein, Rhodamin, Etídium bromid, Propídium jodid, fikobiliproteinek (RPE, APC)

19 Alapelvek Sejtszuszpenzió áramoltatása zárt keringési rendszerben Áramlási citofluorimetria (FACS) Hidrodinamikai fókuszálás kis keresztmetszetű kapilláris fejbe Egyszerre 1 sejt megvilágítása lézerrel Sejtről érkező fluoreszcencia és fényszórás detektálása Adatok digitálsi feldolgozása és tárolása

20 Áramlási citofluorimetria Mit detektálunk? fluoreszcens jeleket Fényszórás: a megvilágító lézer fénye beleütközik a detektálandó részecskébe (sejt, gyöngy, stb) Két típusa: előre szóródó (FSC=forward scatter) sejt méret oldalra szóródó (SSC=side scatter) granuláltság

21 Áramlási citofluorimetria Előnyök Sejtenkénti multiparaméteres analízis Nagy sebesség (akár sejt/perc) Sejtszortírozás lehetősége (tetszőleges tulajdonság alapján) Felhasználás Klinikumban: sejtpopulációk arányának, sejttípusok abszolút számának meghatározása, aktivációs állapot meghatározása, citokinek mérése Kutatásban: gyakorlatilag bármire : populációk mennyisége/minősége, sejtosztódás, sejtaktiváció, sejthalál, ionok, citokinek meghatározása

22 Eredmények feldolgozása

23 Sejtpopulációk a lépben. Kvadráns analízis limfocita markerekkel B limfociták FL-2 : sigm spec. antitest Nincs kettősen pozitiv sejt! T limfociták nem limfoid sejtek FL-1: anti-cd3

24 FL-2 : anti-cd8 sejtszám Kvadráns-analízis (pl. T sejt populációk a timuszban) érett, CD8+ citotoxikus T-limfocita (5-7%) TÍMUSZ éretlen, CD4+ és CD8+ T-limfocita (~ 80 %) TCR/CD3 expresszió? éretlen, CD4- és CD8- T-sejt (3-5 %) FL-1 : anti-cd4 FL-3 : anti-cd3 érett, CD4+ helper T-limfocita (~ 10 %) ( sejt)

25 Fluoreszcens (konfokális) mikroszkópia a minta előkészítése gyakorlatilag azonos a FACS-al lokalizáció meghatározására elsősorban itt is a sejtekről érkező fluoreszcens jelet detektáljuk

26 Konfokális fluoreszcens mikroszkópia lézer-pásztázás, optikai szeletelés: Z-scan, nm, digitális fluoreszcens képalkotás, 3D-rekonstrukció Fehérje-fehérje vagy fehérje-lipid kolokalizáció: CLSM Imaging Dendritikus sejt zöld: ic3b piros: LAMP-1( lizosz.asszoc.mb.prot.) sárga (overlay) : ic3b-lamp asszociáció

27 A fagocitózis vizsgálata Fagocitált partikulum: latex, élesztő, baktérium opszonizált (IgG és/vagy komplement) formában is - Inkubálás: 1 óra, 37 C - Értékelés: fénymikroszkóppal CLM vagy citofluoriméterrel pl. FITC-jelzett partikulumok fagocitózis index vagy fagocitózis % megállapítása, illetve flooreszcencia intenzitás mérése (Egér és humán makrofág sejtvonalak használata) Konfokális lézer mikroszkópos felvétel DC fagocitózisról

28 Sejtkultúra készítés és fenntartás: Pipetták Steril tenyésztőedények Steril tápfolyadék Steril fülke CO2 termosztát

29 IMMUNKOMPETENS SEJTEK IZOLÁLÁSA Primer sejtek (állati, emberi): - lép - tímusz - csontvelő - nyirokcsomó - hasüreg - vér Vér - vérplazma ( alakos elemek ) - eritrociták - trombociták - leukociták - granulociták - neutrofil - bazofil - eozinofil - limfociták - monociták Sejtvonalak: Korlátlanul osztódó állati és humán eredetű sejtek

30 IMMUNKOMPETENS SEJTEK IZOLÁLÁSA Sejtpopulációk elválasztásának alapja: 1. Fajsúly különbség Sűrűség grádiensen történő centrifugálás 2. Egyedi funkciók Monocita, makrofág: adherencia, fagocitózis Neutrofil granulocita, dendritikus sejt: fagocitózis B-sejtek: ellenanyag termelés (tapadása nylon-vattához) T-sejt: citotoxikus reakció (bvvs kötődés - rozetta-képzés) 4. Sejtfelszíni marker Panning technikák, FACS Komplement-mediált lízis (ellenanyaggal megjelölt sejtek komplement hozzáadására lizálnak, a markert nem expresszáló sejtek elkülöníthetők).

31 A limfocita populációk megoszlása emberi vérben

32 A vér összetevői vérsavó: natív (alvadásgátló mentes) vér része

33 Sűrűség grádiens centrifugálás VÉR B Plazma Ficoll Fajsúly: 1.077g/c m 3 T Gr Mo Centrifugálás: 500g, 30 min vvt PMNS: perifériás mononukleáris sejtek 80% T+B+Gr 10% Mo és B Mo Adherens sejtek (Mo) eltávolítása: adherencia (kitapasztás)

34 Monocita eredetű dendritikus sejtek (MDC) in vitro differenciáltatása ÉRETLEN DC immdc GM-CSF IL-4 CD14- MHCII+ CD83- MR+ TNF-α Patogén stimulus GM-CSF IL-4 Mo mamdc MONOCITA GM-CSF ÉRETT DC CD14+ MHCII+ MAKROFÁG CD14+ MHCII+ Mf CD14- MHCII++ CD80+ CD83+ CD86+ MR- Sejtek tenyésztése: NHS/FCS(magzati borjú savó)-tartalmú tápfolyadékban vagy szérummentes médiumban

35 FAGOCITASEJTEK FUNKCIONÁLIS JELLEMZÉSÉRE 5. Dendritikus sejtek antigén felvétele FITC-dextrán, torma-peroxidáz endocitózisa LEGGYAKRABBAN ALKALMAZOTT VIZSGÁLATOK 1. Korai aktivációjának kimutatása (NF-κB magi transzlokációja aktivált dendritikus sejtekben) 2. Dendritikus sejtek citokin produkciója (Pl. aktivált DC-k által termelt IL-12 meghatározása: mrns, microbead assay, ELISA, immunhisztokémia) 3. Dendritikus sejtek kölcsönhatása más sejtekkel Allogén CD4 + T-sejtek proliferációjának mérése 4. Dendritikus sejtek migrációja A kemokinek a DC-k kemotaxisát és endotélen keresztüli migrációját váltják ki. A migráció mértéke transwell plate-ben vizsgálható.

36 NF-κB magi transzlokációja LPS aktivált dendritikus sejtekben Konfokális lézer mikroszkópos vizsgálat Kontroll LPS aktivált Sejtmag NFkB

37 Opszonizált fagocitózis

38 Kemotaxis teszt - Kemotaktikumok kiváltják az immunsejtek migrációját - felső edényben sejtszuszpenzió, alsó edényben kemotaktikum, a kettő között filter - kemotaktikus inger hatására membránon átjutó sejtek számának meghatározása - standard alkalmazása transwell plate

39 Limfociták izolálása Sejtpopulációk elválasztása: 1. Sűrűség grádiensen történő centrifugálás (alvadásgátolt vér) 2. Monocita-granulocita eltávolítás: adherencia, fagocitózis 3. Limfocita: T, B (B-sejtek tapadása nylon-vattához, T-sejt bvvs kötődés - rozetta-képzés) 4. Panning technikák 5. Komplement-mediált lízis

40 Sűrűség grádiens centrifugálás VÉR B Plazma Ficoll Fajsúly: 1.077g/c m 3 T Gr Mo Centrifugálás: 500g, 30 min vvt PMNS: perifériás mononukleáris sejtek 80% T+B+Gr 10% Mo és B Mo Adherens sejtek (Mo) eltávolítása: adherencia (kitapasztás)

41 T sejtek izolálása rozetta képződés segítségével B T T T T sejtek T T T T T B sejtek Rozetta: emberi T sejteken: CD2 + birka vörösvértest Ficoll Ficoll T T T T sejtek T

42 További szeparálási módok: Panning (kipányvázás): Petri csésze felszín fedése ellenanyaggal, amely egy adott sejtfelszíni markerra specifikus A nem kötődő sejtek óvatos lemosása Ellenanyaggal fedett sejtek komplement függő lízis útján való eltávolítása: T/B limfocita szuszpenzió T sejtek + anti-cd3 + komplement forrás (nyúl savó) T sejtek lizálnak, B sejtek használhatók Nyugvó és aktivált B sejtek elkülönítése: Percoll gradiensen 55 %, 58 % 65 % Percoll oldat

43 Sejtszeparálás mágneses mikrogyöngyökkel Dynabead gyöngyök sejt marker specifikus ellenanyaggal fedve Gyors, egyszerű, hatékony elválasztás pozitív negatív szelekció Negatív sejtek 99% depléció Többféle ellenanyag keverve Sejtek érintetlenek Pozitív sejtek 99% tisztaság mágnes

44 A sejtszeparálás hatékonyságának ellenőrzése Folyadék áramlási citometriás méréssel Kontroll, 1 Izolálás Izolálás előtt előtt (T+B) (T+B) T sejtek eltávolítása komplementtel 2 T sejtek eltávolítása B sejtek eltávolítása panning-el 3 B sejtek eltávolítása B220: B sejt marker CD3: T sejt marker B220 CD3 T - T - B - B -

45 Funkcionális vizsgálatok Antigén: szolubilis, vagy antigénprezentáló sejt + peptid B sejt T sejt Mitogén:LPS, PWM, SpA, PHA, ConA, Anti-antigén receptor (BCR, TCR): anti-iggam, anti-könnyűlánc, anti-idiotípus ellenanyagok, vagy anti-cd3 Poliklonális aktiválás

46

47 Limfociták funkcionális vizsgálata

48 Ellenanyag termelés ELISA ELISPOT Plakk Citokin termelés ELISA FACS PCR Apoptózis DNS festés Citokróm-C felszabadulás Caspase aktivitás Annexin Proliferáció DNS festés (sejtciklus) CFSE festés Triciált (3-H) timidin beépülés

49 Primer és szekunder humorális válasz

50 Ellenanyag termelés ELISA ELISPOT Plakk Citokin termelés ELISA FACS PCR Apoptózis: DNS festés Citokróm c felszabadulás Caspase aktivitás Annexin Proliferáció DNS festés (sejtciklus) CFSE festés Triciált (3-H) timidin beépülés

51 IL - 10 Cytokin mérés ELISA-val OD492 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 y = 0,0087x - 0, citokin (pg/ml) IFN-gamma 0,6 Szendvics ELISA: Ellenanyag citokin ellenanyag* OD492 0,4 0,2 y = 0,0061x + 0, citokin (pg/ml) Eltérő epitópokra specifikus ellenanyagok 1 0,8 IL-4 Kanatitatív mérés: ismert koncentrációjú citokin hígítási sorral OD492 0,6 0,4 0,2 y = 0,0064x + 0, citokin (pg/ml)

52 Ellenanyagtermelő B sejtek kimutatása B sejtek tenyésztése antigénnel fedett edényben mosás Enzimmel konjugált anti-ig-vel való inkubálás mosás Kromogén hozzáadása Limfokintermelő T sejtek kimutatása A T sejtel tenyésztése a kérdéses limfokinre specifikus ellenanyaggal fedett edényben mosás A limfokinnek egy másik epitopját felismerő, enzimmel konjugált ellenanyaggal való inkubálás mosás Kromogén hozzáadása ELISPOT A citokint termelő Tsejtek, vagy az ellenanyagot termelő plazmasejtek gyakoriságának meghatározása pozitív sejtek megszámolása

53 Ellenanyag termelés ELISA ELISPOT Plakk Citokin termelés ELISA FACS PCR Apoptózis: DNS festés Citokróm c felszabadulás Caspase aktivitás Annexin Proliferáció DNS festés (sejtciklus) CFSE festés Triciált (3-H) timidin beépülés

54 Limfocita aktiváció lép LPS ConA Proliferáció (3H-timidin beépülés) + + tímusz LPS ConA - +

55 Proliferáció meghatározása CFSE osztódás: osztódás: CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) CFSE FL-1 Beépül az élő sejtekbe Észterázok hasítják az acetát csoportot A hasított molekula fluoreszcenssé alakul és a sejtben marad

56 Proliferáció meghatározása CFSE Az osztódó sejtek arány meghatározható