Kiterjedt-spektrumú -laktamázt (ESBL) termelő Enterobacteriaceae törzsek genetikai vizsgálata

Átírás

1 Kiterjedt-spektrumú -laktamázt (ESBL) termelő Enterobacteriaceae törzsek genetikai vizsgálata Doktori (Ph.D.) értekezés Tóth Ákos Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Füzi Miklós, Dokt. Habil., egyetemi docens Hivatalos bírálók: Dr. Borsodi Andrea, egyetemi docens, Ph.D. Dr. Ongrádi József, egyetemi docens, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Ludwig Endre, egyetemi tanár, Ph.D. Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Rókusz László, osztályvezető főorvos, Ph.D. Prof. Dr. Pénzes István, egyetemi tanár, MTA doktora Budapest 2010

2 1. TARTALOMJEGYZÉK 1. TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BEVEZETÉS Történeti áttekintés laktám antibiotikumok Szerkezeti felépítés laktám anitbiotikumok hatásmechanizmusa laktám antibiotikumokkal szembeni rezisztencia mechanizmusok laktamázok laktamázok osztályozása Szerin-típusú -laktamázok előfordulása Enterobacteriaceae törzsekben AmpC-típusú -laktamázok OXA -laktamázok Kiterjedt-spektrumú -laktamázok (ESBL) Kiterjedt-spektrumú -laktamázok definíciója SHV-típusú ESBL-k TEM-típusú ESBL-k CTX-M-típusú ESBL-k Ritka ESBL-ek Kiterjedt-spektrumú -laktamáz termelésének kimutatása ESBL-termelés kimutatása fenotípusos módszerekkel ESBL-kódoló gének kimutatása molekuláris módszerekkel ESBL-termelő Enterobacteriaceae törzsek első hazai leírásai ESBL-termelő törzsek más antibiotikum csoportokkal szembeni rezisztenciája Fluorokinolonokkal szembeni rezisztencia Aminoglikozidokkal szembeni rezisztencia CÉLKITŰZÉSEK ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Baktérium törzsek Baktériumtörzsek fenotípusos vizsgálata

3 Törzsek identifikálása és szerotípus meghatározás Antibiotikum rezisztencia vizsgálatok Szűrő vizsgálatok Korongdiffúziós vizsgálatok Minimális inhibitor koncentráció (MIC) meghatározása Molekuláris vizsgálatok Polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction PCR) PCR-RFLP (Restrikciós fragment hossz polimorfizmus) vizsgálat Escherichia coli törzsek filogenetikai csoportjának meghatározása multiplex PCR-el ESBL-termelő Escherichia coli ST131 törzsek kimutatása multiplex PCR-el CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek kinolon rezisztenciát meghatározó régióinak (QRDR) vizsgálata Enterobacteriaceae törzsek makrorestrikciós profiljának meghatározása PFGE módszerrel CTX-M-termelő Klebsiella pneumoniae törzsek szekvencia típus meghatározása MLST módszerrel Plazmid profil analízis, konjugációs és elektroporációs kísérletek EREDMÉNYEK SHV-típusú kiterjedt-spektrumú -laktamázok elterjedtsége és földrajzi megoszlása Magyarországon, Perinatális intenzív centrumokban járványokat okozó SHV-típusú ESBL-termelő Klebsiella spp. törzsek vizsgálata CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek vizsgálata ESBL-termelő Salmonella enterica törzsek vizsgálata, ben humán és állati mintákból izolált ESBL-termelő Escherichia coli törzsek molekuláris epidemiológiai jellemzése ESBL-termelő Gram-negatív baktériumok okozta nozokómiális járvány kivizsgálása koraszülött osztályon epidemiológiai és mikrobiológiai módszerekkel MEGBESZÉLÉS SHV-típusú ESBL-gének előfordulása Magyarországon SHV-típusú ESBL-termelő Klebsiella spp. okozta járványok vizsgálata

4 7.2. CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek vizsgálata ESBL-termelő Salmonella enterica törzsek vizsgálata, ESBL-termelő Escherichia coli törzsek vizsgálata, Molekuláris genetikai módszerek alkalmazása egy járvány epidemiológiai kivizsgálásában ZÁRÓKÖVETKEZTÉSEK, ÚJ EREDMÉNYEK SHV-típusú ESBL gének előfordulása Magyarországon, ESBL-termelő Klebsiella spp. okozta járványok jellemzése ESBL-termelő S. enterica törzsek vizsgálata, ESBL-termelő E. coli törzsek vizsgálata, ÖSSZEFOGLALÁS SUMMARY IRODALOMJEGYZÉK SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE A disszertációval kapcsolatos publikációk jegyzéke A disszertáció témájához kapcsolodó előadások jegyzéke A disszertáció témájához nem kapcsolodó publikációk jegyzéke A disszertáció témájához nem kapcsolodó előadások jegyzéke KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS

5 2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AAC ANT APH AP-PCR bp CDM CLSI DDST DPS EARSS EDTA ESBL ESBL-NRL EP HEC IR-L IR-R ITO MALDI MBL Mda MLST NAG NAM NBS NCCLS OEK Omp ORF Aminoglikozid-acil-transzferáz Aminoglikozid nukleitidil-transzferáz Aminoglikozid foszfotranszferáz Arbitrary primed PCR (Tetszőleges primerrel végzett PCR) Bázispár Combined disk method (Kombinált korong módszer) Clinical and Laboratory Standards Institute Double disk synergy test (Kétkorong szinergizmus teszt) Dipikolinsav European Antimicrobial Resistance Surveillance System (Európai Antibiotikum Rezisztencia Surveillance Rendszer) Etilén-diamin-tetraecetsav Extended-spectrum -lactamase (Kiterjedt-spektrumú -laktamáz) ESBL-termelő Gram-negatív kórokozók Nemzeti Referencia Laboratóriuma Elektroporáns törzs Hungarian Epidemic Clone (Magyar epidémiás klón) Inverted Repeat - Left Inverted Repeat - Right Intenzív Terápiás Osztály Matrix assisted laser desorption ionization (Mátrixasszisztált lézerdeszorpció-ionizációs - tömegspektrométer Metallo- -laktamáz Megadalton Multi-lókusz szekvencia tipizálás N-acetil-glukózamin N-acetil-muraminsav Nemzeti Bakteriológiai Surveillance National Committee for Clinical Laboratory Standards Országos Epidemiológiai Központ Outer membrane protein (külső membrán protein) Open Reading Frame (nyitott leolvasási keret) 5

6 PBP PCR PFGE PIC PT QRDR RFLP SSCP ST tnpa UPGMA Penicillin binding protein (Penicillin-kötő fehérje) Polimerase chain reaction (Polimeráz láncreakció) Pulsed field gel electrophoresis (pulzáltatott mezejű gélelektroforézis) Perinatális Intenzív Centrum Pulzotípus Quinolone resistance determining region (kinolon rezisztenciát meghatározó régió) Restriction fragment length polymorphism (restrikciós fragmenthossz polimorfizmus) Single strand conformation polymorphism (egyszálú konformációs polimorfizmus) Szekvencia típus Transzpozáz gén Unweighted pair group method with arithmetic averages -laktamázok: BEL BES BIL CMY CTX-M GES KLUA KLUC KLUG LAT MIR OXA PER SFO SHV TEM TLA VEB Belgium ESBL Brazil ESBL Bilal nevű betegről Cefamicinnel szemben aktív Cefotaximáz-München (első izolálás) Guyana ESBL Kluyvera ascorbata -laktamáz Kluyvera cryocrescens -laktamáz Kluyvera georgiana -laktamáz Beteg neve után Miriam kórházban írták le Oxacillinnel szemben aktív Pseudomonas Extended Resistant Serratia fonticola -laktamáz Sulphydryl Reagent Variable Temoniera beteg neve után Tlahuicas (Indiai törzs neve) Vietnam ESBL 6

7 Aminosavak rövidítése: Ala alanin Arg arginin Asn aszparagin Asp aszparaginsav Cys cisztein Gln glutamin Glu glutaminsav Gly glicin His hisztidin Ile izoleucin Leu leucin Lys lizin Met metionin Phe fenilalanin Pro prolin Ser szerin Thr treonin Trp triptofán Tyr tirozin Val valin 7

8 3. BEVEZETÉS 3.1. Történeti áttekintés A penicillin felfedezése Sir Alexander Fleming nevéhez kötődik, aki 1928-ban mutatta ki, hogy a Penicillium notatum penészgombából származó anyag in vitro gátolja számos baktérium növekedését, és egerekre, nyulakra nézve nincs toxikus hatása (Fleming 1929). Mivel terápiás szerepét nem vizsgálta állatkísérletekben, az in vivo kísérletek hiányában a felfedezés nem kapott nagy visszhangot, köszönhetően annak is, hogy nagyobb mennyiségben még nem tudták előállítani (Rolinson 1998) ben azonban Florey és Chaid sikeresen bizonyították az antibiotikum terápiás hatékonyságát, mikor egereknél az addig egyébként halálos streptococcus fertőzést a bőr alá injekciózott penicillinnel meggyógyították (Chaid és mtsai 1940). Ez a felfedezés, valamint a penicillin bevezetése a humán medicinába hatalmas lökést adott a további antibiotikumok utáni kutatásoknak. A -laktám antibiotikumok számának növekedése csak a 1960-s évek elején indult meg a félszintetikus penicillinek kifejlesztésével, amit a félszintetikus cefalosporinok és más -laktám antibiotikumok követtek (Rolinson 1998). A -laktám antibiotikumok manapság nemcsak a leggyakrabban alkalmazott, hanem a legsokoldalúbb antibiotikum csoport is tekintve változatos kémiai tulajdonságait és széles antibakteriális hatásukat (Cornaglia és mtsai 2008). Előnyei közé tartozik, hogy viszonylag alacsony költségűek, nagy mennyiségben állnak rendelkezésre és kevés mellékhatásuk van, ami a széleskörű és kontrollálatlan túlhasználatukhoz vezetett az elmúlt 60 évben. A -laktámok különböző generációinak széles körű felhasználása azonban a rezisztens baktériumok megjelenéséhez és elterjedéséhez vezetett (Walsh és Wright 2005). 8

9 3.2. -laktám antibiotikumok Szerkezeti felépítés A -laktám antibiotikumokat négy nagy csoportra oszthatjuk: i, penicillinek; ii, cefalosporinok; iii, monobaktámok; iv, karbapenemek. Ezen belül is az egyes csoportok különböző generációkba, alcsoportokba sorolhatók a felfedezés ideje, és a molekulaszerkezeti sajátosságok alapján. A -laktámok egy 4 tagú -laktám (2- azetidinon) gyűrűt tartalmaznak, és a monobaktámok kivételével biciklusos vegyületek (1. ábra). Az egyes csoportok antibakteriális spektruma általában különbözik, és a generációk előrehaladtával szélesedik: pl. a cefalosporinok között az 1. generációs cefalosporinok (pl. cefazolin) elsősorban Gram-pozitív baktériumok ellen hatékonyak (staphylococcusok és streptococcusok); a 2. generációs cefalosporinok (pl. cefuroxim) már jól hatnak a legtöbb Enterobacteriaceae törzsre is; a 3. generációs cefalosporinok (pl. ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon) elsősorban a Gram-negatív baktériumok ellen hatékonyak, de még használhatóak egyes Gram-pozitívok által okozott fertőzések terápiájában is. A ceftazidimet ki kell emelni, mivel az egyetlen 3. generációs cefalosporin, amely jól hat a Pseudomonas spp. és Acinetobacter spp. törzsekre is. A 4. generációs cefalosporinok (pl. cefepim) spektruma és farmakokinetikája a ceftazidimhez hasonló. A 3. és 4. generációs cefalosporinokat széles-spektrumú cefalosporinoknak is nevezik. 9

10 -laktám gyűrű thiazolidin gyűrű dihidrotiazin gyűrű Penicillinek Cefalosporinok Monobaktámok Karbapenemek 1. ábra. -laktám antibiotikumok kémiai szerkezete A R-csoportok megváltoztatása módosítja a különböző -laktám antibiotikumok antibakteriális hatásspektrumát, illetve farmakokinetikáját. A -laktamáz inhibitorok (klavulánsav, tazobaktám, sulbaktám) szintén rendelkeznek -laktám gyűrűvel, azonban nincs antibakteriális hatásuk laktám anitbiotikumok hatásmechanizmusa A -laktám antibiotikumok gátolják a bakteriális sejtfal felépítésében szerepet játszó, citoplazma membránhoz kötött enzimek működését. A Gram-pozitív és Gramnegatív baktériumok sejtfalszerkezete alapvetően eltér egymástól: a Gram-pozitívaknál a citoplazmamembránt egy vastagabb peptidoglikán réteg (20-80 nm), míg a Gramnegatívoknál egy vékonyabb peptidoglikán réteg (7-8 nm) veszi körül, és ez utóbbiaknál ezen kívül még egy külső membrán is található. A két membrán közötti teret periplazmatikus térnek nevezik. 10

11 A peptidoglikán szénhidrát részének alapvető komponensei az N-acetilglukózamin (NAG) és az N-acetil-muraminsav (NAM). A NAG és a NAM β(1 4) kötéssel kapcsolódnak diszachariddá, és ezek az egységek ugyancsak β(1 4) glikozidos kötéssel poliszacharid láncot alkotnak. A peptidoglikán úgy alakul ki, hogy a muraminsavhoz kötődő tejsav szabad karboxilcsoportja rövid oligopeptidet köt meg. A peptid oldalláncok aminosavai közül egyesek nem természetben szokásos L, hanem D konfigurációjúak, ami a prokarióták kizárólagos tulajdonsága. E pentapeptid általános összetétele az alábbi: L-alanin - D-glutaminsav - diaminosav - D-alanin - D-alanin. Gram-negatív baktériumokban általánosan egy hét szénatomos diaminosav, a mezodiamino-pimelinsav fordul elő. A NAM-ról lelógó peptidnek szabad karboxil vége más láncok diaminosavával peptidkötést tud kialakítani, és ezzel háromdimenziós hálózatot képes létrehozni (Tipper és Strominger 1965). Ennek a térhálós rétegnek a kialakulása elengedhetetlen a baktériumok életben maradásához. A sejtfalszintézis kezdeti lépéseiben NAG-NAM-pentapeptid prekurzorok képződnek, melyek a már meglévő mureinláncokhoz kapcsolódnak a transzglikozilációs lépés során. A kialakuló láncok között a transzpeptidációs lépés során alakulnak ki a pentapeptid hidak. Utóbbi két reakciót az úgynevezett penicillin-kötő fehérjék (Penicillin Binding Protein - PBP) katalizálják. Mint nevükből is kiderül, ezek a PBP enzimek - transzpeptidázok és karboxipeptidázok - a -laktám antibiotikumok célpontjai. A PBP-k a peptid oldalláncok acil-d-alanil-d-alanin végéhez kapcsolódnak, és a terminális D-alanin lehasítása közben egy acil-d-alanil-enzim komplexet képeznek, és katalizálják a diaminosavval történő peptidkötés kialakulását. A -laktám antibiotikumok szerkezeti analógként működnek, és egy igen stabil -laktám-enzim komplex képződik, ami a PBP további működését gátolja (2. ábra)(ghuysen 1988). Ezzel a -laktám antibiotikumok gátolják a sejtfalszintézis befejező lépését, a térhálós szerkezet kialakítását, ami végül a sejt pusztulásához vezet. A különböző baktérium fajokban eltérő PBP-k fordulnak elő, mely polipeptidek molekulasúlya kda lehet. A különböző fajokból származó, de azonos számmal (ill. betűvel) jelölt molekulák nem jelentik azt, hogy a PBP-k között hasonlóság lenne. Általában az Enterobacteriaceae fajokban a PBP-típusok száma 6-8, az Escherichia coli esetében ezek száma hét, a Klebsiella. pneumoniae esetében hat (Georgopapadakou és Lin 1980). A PBP-k lehetnek ún. nagy molekulasúlyúak és kis molekulasúlyúak, 11

12 előbbiek általában bifunkcionálisak, (transzglikoziláz és transzpeptidáz) míg utóbbiak általában csak karboxipeptidáz funkcióval rendelkeznek. A kis molekulasúlyú PBP-k inaktiválása nem letális a baktériumokra nézve. Az E. coli PBP1A, PBP1B, PBP2-6 penicillin-kötő fehérjékkel rendelkezik, és ezek közül a nagy molekulatömegű formák (PBP1A, PBP1B, PBP2 és a PBP3) bifunkcionálisak és a -laktám antibiotikumok elsődleges célpontjai (Spratt 1983). 2. Ábra: -laktám antibiotikum hatásmechanizmusa TPase: transzpeptidáz alegység, TGase: Transzglikozidáz alegység A PBP-khez hasonlóan a -laktamázok egyes csoportjainál (az ún. szerin-típusú -laktamázoknál) szintén szerin található az aktív centrumban, mely a kötésért felelős (Ambler 1980, Majiduddin és mtsai 2002). Azonban a -laktamázok és a kis molekulasúlyú PBP-knél a szerin-tartalmú aktív hely az N-terminális vég közelében található, míg a nagy molekulasúlyú PBP-k esetében a fehérje középső területén, és ez a szerkezeti különbség jelentős szerepet játszik a -laktám enzim kölcsönhatásban (Ghuysen 1988) laktám antibiotikumokkal szembeni rezisztencia mechanizmusok A -laktám antibiotikumokkal szembeni rezisztencia az antibiotikumok bevezetése óta növekvő problémát jelent. A penicillin klinikai használatra való bevezetésekor már leírták az első penicillináz termelő baktériumot (Abraham és Chain 1988). A félszintetikus penicillineket as években, a félszintetikus 12

13 cefalosporinokat és más -laktám antibiotikumokat az as években vezették be, hogy szélesítsék az antibiotikumok hatásspektrumát, illetve megoldást találjanak a terjedő antibiotikum rezisztenciára. Az addig érzékeny baktériumok folyamatosan alkalmazkodtak az újabb, szélesebb hatásspektrumú antibiotikumokhoz mutációk kialakulásával, genetikai információk cseréjével és természetes szelekció segítségével (Jacoby és Archer 1991). Ezek a konvergens evolúciós folyamatok vezettek ahhoz, hogy jelenleg négy eltérő -laktámokkal szembeni rezisztencia mechanizmus is ismert, melyek azonban együttesen is megjelenhetnek. Az első mechanizmus a célpont molekula megváltozásán alapul, mely általában alacsony szintű rezisztenciát okoz. A második a külső membrán permeábilitásának megváltozásán alapul, és mérsékelt rezisztenciát tud általában kialakítani. A harmadik mechanizmus efflux pumpák termelésén alapul, melynek során a sejt a periplazmatikus térből a környezetébe pumpálja az antibiotikumot. Ez is mérsékelt szintű rezisztenciát okoz. A negyedik mechanizmus pedig az antibiotikum enzimatikus módosításán alapszik, mely a leghatékonyabb és legmagasabb szintű rezisztenciát alakítja ki PBP módosulása A PBP módosulásán alapuló rezisztenciát mind Gram-pozitív, mind Gramnegatív baktériumoknál leírták, azonban az előbbi csoportnál sokkal elterjedtebb. A PBP módosuláson alapuló rezisztenciák különböző típusai egy-egy Gram-pozitív baktériumcsoporton keresztül kerülnek bemutatásra. A vad típusú staphylococcusok négy PBP-vel (PBP1, PBP2, PBP3 és PBP4) rendelkeznek, melyből az első három, nagy molekulatömegű PBP esszenciális a sejtfal felépítéséhez, és ezek a -laktámok támadásának célpontjai is. A magas szintű -laktám rezisztenciát egy ötödik, szerzett PBP, a PBP2a (vagy PBP2 ) okozza. Az összes - laktám antibiotikum alacsony affinitással kötődik a PBP2a-hoz, ezért termelése rezisztenciát biztosít mindegyikkel szemben. A PBP2a-t kódoló meca gén csak a methicillin rezisztens staphylococcusokban található meg, és az ún. staphylococcal chromosome mec (SCCmec) mobilis genetikai elemen helyezkedik el, mely 13

14 valószínűleg a Staphylococcus sciuri-ból került át a többi fajba (Alekshun és Levy 2007, Woodford 2005). A Streptococcus pneumoniae esetében a -laktám rezisztencia kialakulása egy komplex folyamat, amelyben több PBP-jének többféle aminosav változása is szerepet játszik. Az S. pneumoniae hatféle PBP-vel rendelkezik: három a nagy molekulatömegű PBP-k A osztályába (PBP1a, PBP1b, PBP2a), kettő a B osztályába (PBP2x és PBP2b), illetve egy a kis molekulatömegű PBP-khez (PBP3) tartozik. A rezisztencia kialakulásában mind a hat PBP érintett, azonban csak a nagy molekulatömegű PBP-k a -laktámok elsődleges célpontjai. Magas szintű -laktám rezisztencia eléréséhez általában több PBP változására is szükség van. A klinikai mintákból izolált penicillin nem-érzékeny törzsek vizsgálatai azt mutatták, hogy a mutációkat hordozó PBP gének mozaikos felépítésűek. Ez azt jelenti, hogy a megváltozott PBP-t kódoló gének mutációt hordozó részei más streptococcus fajoktól származnak (pl. S. mitis), és ezek a génszakaszok transzformációval kerültek felvételre a sejtekbe, majd homológ rekombinációval épültek be a kromoszómába (Alekshun és Levy 2007, Woodford 2005). A enterococcusok természetes módon alacsony szintű érzékenységet mutatnak a -laktám antibiotikumokkal szemben, mivel az általuk termelt PBP-k alacsony affinitással kötődnek a -laktámokhoz. Az Enterococcus faecium esetében a PBP5 túltermelése magas szintű rezisztenciát eredményez minden -laktám antibiotikummal szemben (Alekshun és Levy 2007, Woodford 2005). Egyes Gram-negatív baktériumok esetében is leírtak PBP változáson alapuló rezisztenciát. Így például a Haemophilus influenzae esetében az ampicillin rezisztens törzsek 1-5%-ánál nem -laktamáz termelése, hanem PBP-k (elsősorban a ftsi gén kódolta PBP3) módosulása áll a rezisztencia hátterében (BLNAR törzsek -laktamáz negatív ampicillin rezisztens). A -laktamáz termelő törzsekkel szemben, ezek a törzsek már a -laktám inhibitoros kombinációkra és akár 2. generációs cefalosporinokra is rezisztensek lehetnek (Alekshun és Levy 2007, Lambert 2005) Sejtfal permeabilitás változáson alapuló rezisztencia 14

15 Az antibiotikum rezisztenciában fontos szerepet betöltő porinok külső membrán proteinek (Outer Mebrane Protein Omp), melyek hidrofil csatornákat képeznek a Gram negatív baktériumokban a külső membránon keresztül, és keresztülengedik a kisebb poláris molekulákat (pl. -laktám antibiotikumokat), aminosavakat és tápanyagokat. Egyes porinok elvesztése megakadályozza a -laktám antibiotikumok periplazmatikus térbe jutását, és ezzel csökkent érzékenység vagy rezisztencia alakul ki. A -laktám rezisztenciában főszerepet játszó porinok az E. coli, és az Enterobacter cloacae esetében OmpC és OmpF, a K. pneumoniae, és az Enterobacter aerogenes törzsekben Omp35 és Omp36. Az E. coli és a K. pneumoniae törzsekben ezeknek a porinoknak az elvesztése elsősorban cefoxitin (2. generációs, cefamicinekhez tartozó, sok -laktamázzal szemben ellenálló antibiotikum) rezisztenciát okoz. Az E. coli, a K. pneumoniae, az E. cloacae és az E. aerogenes esetében ezeknek a porinoknak az elvesztése -laktamáz (ESBL, AmpC) termeléssel kombinálódva különböző szintű karbapenem rezisztenciát tud kialakítani (Alekshun és Levy 2007) Efflux pumpák termelésén alapuló rezisztencia Az efflux rendszerek a baktériumokban az oldott anyagok kipumpálására szolgálnak. Az efflux pumpák génjei, ill. fehérjéi jelen vannak mind az antibiotikum érzékeny, mind a rezisztens törzsekben. Az antibiotikum rezisztencia az efflux pumpa mutáns törzsekben kétféle úton jöhet létre: i, az efflux pumpa fehérjéinek túltermelése, ii, a fehérjében egy vagy néhány aminosav cseréje miatt hatékonyabban működő export következtében. Az efflux hatására a sejten belül az adott antibiotikum koncentrációja csökken, és ezzel csökken a sejt érzékenysége is. Az efflux pumpák lehetnek specifikusak egy szubsztrátra, de szállíthatják eltérő szerkezetű molekulák széles skáláját is (pl. többféle antibiotikum csoportot), ez utóbbi pumpák a multirezisztencia kialakításában vehetnek részt. Az efflux pumpa közvetítette, általában alacsony szintű rezisztencia elősegítheti a baktérium hosszabb túlélését antibiotikum tartalmú környezetben, és ennek során egyéb más, magasabb szintű rezisztenciát biztosító mechanizmusok kialakulására, ill. beszerzésére ad lehetőséget. A Pseudomonas aeruginosa számos természetes és szerzett rezisztencia mechanizmussal rendelkezik sokféle szerkezetileg és hatásmechanizmusban eltérő 15

16 antibiotikummal szemben. A multirezisztencia fenotípust főleg a külső membrán alacsony permeábilitása és efflux pumpák termelése okozza. Háromféle efflux pumpát írtak le a P. aeruginosa-ban: MexAB-OprM, MexCD-OprJ éa MexEF-OprN pumpák. A vad típusú törzs csak a MexAB-OprM pumpát expresszálja állandó szinten, a másik kettő indukálható. Utóbbiak kinolonok, tetraciklinek és bizonyos -laktámok mellett szerves oldószereket, ethidium-bromidot is kipumpálnak. A MexAB-OprM pumpa defektusa számos antibiotikummal szemben teszi túlérzékennyé a baktériumot. Az E. coli-ban leírt AcrAB-TolC rendszer nagyfokú homológiát mutat a P. aeruginosa MexAB-OprM pumpájával, és hasonló multirezisztencia kialakításában van szerepe (Alekshun és Levy 2007, Butaye és mtsai 2003, Piddock 2006) Enzimatikus módosítás A negyedik és legfontosabb rezisztencia mechanizmus a -laktám antibiotikumokat szerkezetileg módosító enzimek termelésén alapul. Ezek az enzimek három fő csoportba sorolhatók: az észterázok, melyek a cefalosporinok dihidrotiazin gyűrűjének egyik acetilcsoportját hidrolizálják, és így csökkent aktivitású antibiotikum molekulát alakítanak ki; az acilázok, melyek a penicillinek és cefalosporinok amid kötését módosítják. Azonban a félszintetikus penicillinek alkalmazása óta ez utóbbiak in vivo szerepe már nem jelentős (Sykes és Matthew 1976); a harmadik csoportot a - laktamázok alkotják, melyek irreverzibilisen módosítják a -laktámokat úgy, hogy hidrolizálják a -laktám gyűrű amid kötését. A -laktamáz termelés a legfontosabb - laktám antibiotikumokkal szembeni rezisztencia mechanizmus (Livermore 1995) laktamázok 16

17 Az első -laktamázt termelő baktériumot 1940-ben írták le, még a penicillin terápiában való széleskörű bevezetése előtt. Ezzel világossá vált, hogy a baktériumokban már régóta jelen van ez a rezisztencia mechanizmus (Abraham és Chain 1988) ben írták le az első mobilis genetikai elemen elhelyezkedő - laktamázt, melyet az esethez kapcsolódó beteg neve után (Temoniera) TEM-nek neveztek el (Livermore 1995) laktamázok osztályozása Az első átfogó csoportosítást Bush készítette el 1989-ben, melyben megpróbálta egyesíteni a szubsztrát és inhibitor alapú csoportosítást a molekuláris szerkezeten alapuló osztályozással (Bush 1989a, Bush 1989b, Bush 1989c). A -laktamázok jelenleg is használt csoportosítását 1995-ben publikálták Bush és mtsai, melyben az ún. Bush-Jacoby-Medeiros féle funkcionális osztályozást egyesítik az Ambler-féle szerkezeti felépítésen alapuló csoportosítással. A funkcionális és molekuláris tulajdonságokat is magába foglaló rendszer négy csoportba foglalta az akkor ismert - laktamázokat (Bush és mtsai 1995) (1. táblázat): - Csoport 1: Ambler-féle C molekuláris osztályba tartozó kromoszómálisan kódolt cefalosporinázok, melyek általában nem gátolhatók klavulánsavval. Az utóbbi évtizedben plazmidon kódolt változatai is egyre inkább terjednek. Leggyakrabban AmpC-típusú -laktamázoknak hívják a csoport tagjait (Bush és mtsai 1995, Jacoby 2009, Livermore 1995). - Csoport 2: Ambler-féle A és D molekuláris osztályba tartozó -laktamázok különböző szubsztrát specifitással. Általában gátolhatók -laktamáz inhibitorokkal. - Csoport 3: Metallo- -laktamázok, melyek hidrolizálják a penicillineket, cefalosporinokat és karbapenemeket is. Az aktív centrumban kétértékű kationt tartalmaznak (pl. Zn 2+ ), és működésüket kelátképző vegyületekkel lehet gátolni (EDTA, dipikolinsav) (Shin és mtsai 2008, Yong és mtsai 2002) - Csoport 4: penicillinázok, melyek nem gátolhatók klavulánsavval. 17

18 A -laktamázokat lehet az aktív centrumukban található, a hidrolízist katalizáló molekula alapján is osztályozni. Ennek alapján elkülöníthetőek szerin-típusú - laktamázok (A, C és D molekuláris osztály), ahol a -laktám gyűrű hidrolíziséért egy szerin-csoport felelős az enzim aktív centrumában, míg a MBL-knál (B molekuláris osztály) cink vagy más nehézfém-ion katalizálja a folyamatot (Livermore 1995). 18

19 Bush-Jacoby- Medeiros csoportok 1. táblázat: Bakteriális -laktamázok osztályozása (Forrás: Bush és mtsai 1995, Livermore 1995) Molekuláris osztály Elsődleges szubsztrát Gátlószerek b Klavulánsav EDTA Jellegzetes enzimek a csoportban 1 C cefalosporinok Gram-negatív baktériumok AmpC-típusú - - -laktamázai 2a A penicillinek + - Gram-pozitív baktériumok penicillinázai 2b A penicillinek, cefalosporinok + - Széles-spektrumú -laktamázok: SHV-1, 2be A penicillinek, szűk spektrumú és széles-spektrumú cefalosporinok, monobaktámok 2br A penicillinek + - ± - TEM-1, TEM-2 Kiterjedt spektrumú -laktamázok: TEM-3-181, SHV-2-134, CTX-M csoport (96 féle), K. oxytoca K1 Inhibitor rezisztens TEM (IRT) (TEM-31-36), inhibitor rezisztens SHV (IRS) (SHV- 10, SHV-26, SHV-49) 2c A penicillinek, carbenicillin ± - PSE-típusok 2d D penicillinek, cloxacillin ± - OXA-típusok 2e A cefalosporinok Proteus vulgaris indukálható + - cefalosporináza 2f A penicillinek, cefalosporinok, NMC (E. cloacae), Sme-1 (Serratia + - karbapenemek marcescens) 3a B legtöbb -laktám antibiotikum IMP, VIM metallo- -laktamázok 3b B (kivéve monobaktámok) - + Stenotrophomonas maltophilia L1 - laktamázam, Bacteroides fragilis CcrA 3c B 4 NM a penicillinek -? Burkholderia cepacia penicilllináza a NM: nincs meghatározva. b +: jó gátlószer; ±: a csoport egyes tagjai gátolhatóak, más tagjai nem; -: a csoport nem gátolható az adott gátlószerrel 19

20 Szerin-típusú -laktamázok előfordulása Enterobacteriaceae törzsekben A -laktamázok génjei előfordulhatnak kromoszómálisan, plazmidon illetve transzpozonon kódolva. Expressziójuk lehet állandó szintű vagy indukálható (Livermore 1995). Az Enterobacteriaceae fajokban a Salmonella genus kivételével- a kromoszómális -laktamázok általánosan elterjedtek. Az egyes kromoszómálisan kódolt - laktamázok antibiotikumokkal szembeni rezisztenciájának mértékét befolyásolja, hogy a sejt milyen mennyiségben állítja azokat elő (2. táblázat). A kromoszómálisan kódolt - laktamázok átkerülhetnek különböző mobilis genetikai elemekre (pl. plazmid, transzpozon), és így terjedhetnek nemcsak klonálisan, hanem horizontálisan is. A jelenleg elterjedt széles-spektrumú -laktámokat bontó enzimek (pl. ESBL-k, plazmidon kódolt AmpC) elsősorban mobilis genetikai elemeken találhatóak, és többségük valamely kromoszómálisan kódolt enzimből származtatható. Egyes géntípusok mobilizációjával összefüggésbe hoznak jellemző inszerciós szekvenciákat: pl. SHV-típusú ESBL-k esetében az IS26 elem általánosan megtalálható a gén upstream régiójában (Jones és mtsai 2005), CTX-M-típusú ESBL-k esetében pedig mind upstream, mind downstream irányban lehetnek jellemző inszerciós szekvenciák (Bonnet 2004). 20

21 2. táblázat. Kromoszómális -laktamázok és expressziójuk Enterobacteriaceae fajokban Baktérium - laktamáz neve Molekuláris osztály (Forrás: Livermore 1995) Bush csoport Indukálható Enzimtermelés módja a Konstitutív Alacsony Közepes Magas E. coli AmpC C 1 - Gy - R Shigellák AmpC C 1 - Gy - R Enterobacter spp. AmpC C 1 Gy R - Á Citrobacter freundii AmpC C 1 Gy R - Á Morganella morganii AmpC C 1 Gy - - Á Providencia spp. AmpC C 1 Gy R - R Serratia spp. AmpC C 1 Gy - - Á K. pneumoniae SHV-1 A 2b - - Gy R b Klebsiella oxytoca K1 A 2be - - Gy Á Citrobacter diversus A 2e Gy - - R Proteus vulgaris CXáz A 2e Gy - - R Proteus penneri CXáz c A 2e Gy - - R Proteus?? - Gy - - mirabilis a Gy, A species-re jellemző, vad típusú törzsben fordul elő; Á, Országonként és kórházanként eltérő mértékben fordul elő, általában a törzsek 10-50%-ban alakul ki; R, ritkán alakul ki, a törzsek kevesebb, mint 10%-ában; -, Esetlegesen előfordul vagy nem ismert. Alacsony szintű termelés esetében az enzim detektálható, de nem okoz szignifikáns rezisztenciát; közepes szintű termelés esetében az enzim rezisztenciát biztosít a jó szubsztrátokkal szemben; magas szintű termelés esetében a teljes sejtfehérje tartalom akár 3%-a is lehet, gyenge szubsztrátokkal szemben is rezisztenciát biztosít. b Plazmid-kódolta SHV-1 esetében gyakori. c CXáz, cefuroximáz Bush féle 2e csoportba tartoznak (Bush és mtsai 1995). 21

22 AmpC-típusú -laktamázok A Ambler-féle C molekuláris osztályba tartozó, ún. AmpC-típusú kromoszómális -laktamázok a legelterjedtebbek az Enterobacteriaceae család tagjainál. (Bush és mtsai 1995, Livermore 1995). Az E. coli és a Shigella spp. törzsek vad típusai nem indukálható AmpC-típusú -laktamázzal rendelkeznek, melyek olyan alacsony szinten termelődnek, hogy ampicillinnel és szűk spektrumú cefalosporinokkal szemben is érzékenyek maradnak a törzsek. Ritkán az E. coli esetében kialakulhatnak olyan AmpC-túltermelő mutánsok, melyek számos -laktámmal szemben (kivéve karbapenemek) mutatnak emelkedett rezisztenciát (Livermore 1995). Az Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Serratia spp., Morganella morganii, Providenica stuartii és P. rettgeri fajok szintén kromoszómálisan kódolt AmpC-típusú - laktamázzal rendelkeznek, amelynek expressziója indukálható. Az ampicillin és a szűkspektrumú cefalosporinok jó indukálószerei ezeknek a -laktamázoknak, de hatásukkal szemben labilisak. A 3. generációs cefalosporinok, ureidopenicillinek és karboxipenicillinek szintén labilisak az enzimmel szemben, viszont csak gyenge indukálószerek. Ezért utóbbiakkal szemben a vad típusú törzsek nem mutatnak in vitro rezisztenciát. A derepresszált mutáns, konstitutív AmpC-termelő törzsek azonban már magas szintű rezisztenciával rendelkeznek ezekkel az antibiotikumokkal szemben is. A karbapenemek kitűnő indukálószerek, az enzimmel szemben viszont stabilak. A 4. generációs cefalosporinok is stabilak, és ez a tulajdonság használható a derepresszált AmpC mutánsok kiterjedt-spektrumú -laktamáz termelő törzsektől való elkülönítésére. Az első plazmidon kódolt AmpC-típusú -laktamázt 1989-ben írták le. Jelenleg az aminosav változatosság alapján hét enzimcsaládot különbözetnek meg. Eddig 43 CMY allélt, 7 FOX allélt, 4 ACC, LAT és MIR allélt, 3 ACT és MOX, illetve 2 DHA allélt írtak le. Néhány típust kromoszómálisan kódolt génként is leírtak, és az érintett fajokból származhatnak a plazmidon kódolt változatok (pl. CMY-1 Aeromonas hydrophila-ból, vagy a MIR-1 Enterobacter cloacae-ból). A plazmidon kódolt AmpC enzimek általában konstitutívan termelődnek (ritkán indukálhatóak pl. ACT-1, DHA-1, DHA-2), általában 22

23 rezisztenciát biztosítanak penicillinekkel, széles-spektrumú cefalosporinokkal, cefamicinekkel, és változóan aztreonammal szemben, de a törzsek érzékenyek maradnak cefepimre és karbapenemekre. A plazmidon kódolt AmpC-típusú -laktamázok gyakran együtt kódolódnak aminoglikoziddal, kloramfenikollal, kinolonnal, szulfonamiddal, tetraciklinnel, és trimethoprimmel szemben rezisztenciát biztosító génekkel, ill. számos más -laktamázzal (pl. TEM-1, PSE-1, CTX-M-k, SHV-k, és VIM-1). Világszerte elterjedt enzimek, bár jóval kevésbé gyakoriak, mint az ESBL-k. A CMY-2 a legszélesebb földrajzi elterjedtségű plazmidon kódolt AmpC, és a nem-tifoid salmonella törzsekben a - laktám rezisztencia egyik fontos okozója (Jacoby 2009, Livermore 1995) OXA -laktamázok A D molekuláris osztályba tartozó OXA (oxacillin-hidrolizáló) ß-laktamázok, az A és C osztályba tartozó ß-laktamázokhoz hasonlóan, szerin csoportot tartalmaznak az aktív centrumukban. Általában rezisztenciát biztosítanak az amino- és ureidopenicillinekkel szemben. Nagyfokú hidrolitikus aktivitással bírnak a cloxacillinnel, az oxacillinnel és a methicillinnel szemben, az aktivitásukat gyengén gátolja a klavulánsav (Bush és mtsai 1995). Általánosságban véve az OXA-típusú enzimeken belül az aminosav egyezés csak %-os, így az OXA család inkább jelent egy funkcionális csoportot, mint egy enzimcsaládot. Az oxacillináz gének többsége plazmidon, transzpozonon vagy integronon lokalizálódik. Főleg a Pseudomonas aeruginosa-ra és Acinetobacter spp. jellemzőek, de az Enterobacteriaceae családban is előfordulnak. Jelenleg több mint 160 típusát írták le, azonban csak 18 típus képes hatékonyan bontani a széles-spektrumú cefalosporinokat (Paterson és Bonomo 2005). 23

24 3.4. Kiterjedt-spektrumú -laktamázok (ESBL) Kiterjedt-spektrumú -laktamázok definíciója A kiterjedt spektrumú -laktamáz kifejezést először 1988-ban használták plazmidon kódolt, széles-spektrumú cefalosporinokat bontó -laktamázok megnevezésére (Jarlier és mtsai 1988, Philippon és mtsai 1989). Az 1980-s évek végén ez a definíció megfelelő volt az akkor ismert SHV és TEM-típusú ESBL-ek jellemzésére (Philippon és mtsai 1989). Az eltelt két évtized során azonban számos újfajta széles-spektrumú cefalosporint bontó -laktamázt írtak le, ezért a meghatározást többször változtatták, és ma sincs egységes meghatározása. A legelterjedtebb definíció szerint az ESBL enzimek hidrolizálják az oxyimino-cefalosporinokat (ceftazidim, ceftriaxon, cefotaxim, cefepim), monobaktámokat (aztreonam) és a széles-spektrumú penicilleneket (ampicillin, amoxicillin), nem képesek hidrolizálni a karbapenemeket (imipenem, meropenem) és a cefamicineket (cefoxitin és cefotetan). A -laktamáz inhibitorok (klavulánsav, szulbaktám, tazobaktám) általában gátolják az enzim működését (Paterson és Bonom 2005, Stürenburg és Mack 2003). Livermore 2008-ban a definíció és a nevezéktan átalakítását javasolta. Egyik ajánlott lehetőség, hogy minden az oxyimino-cefalosporinokat jól hidrolizáló, vagy ezeket az adott enzimcsalád klasszikus tagjainál jobban bontó enzimet idesorolnak, és a jobb érthetőségért az ESBL megnevezést kiegészítik az enzimcsalád nevével: pl. TEM ESBL, SHV ESBL, OXA ESBL, CTX-M ESBL, széles-spektrumú AmpC. A másik felvetett megoldás, hogy az ESBL-ek megnevezést csak a Bush-Jacoby-Medeiros féle 2be csoportba tartozó enzimekre alkalmazzák (TEM, SHV, CTX-M, VEB-típusú ESBL-k). (Livermore 2008). A klasszikus definíció szerinti ESBL enzimeknél leírt csoportok a 3. táblázatban láthatóak. A klasszikus SHV, TEM és OXA-típusú ESBL-k mellé az utóbbi évtizedben elterjedtségben felzárkózott, sőt dominánssá vált a CTX-M-típus (Canton és mtsai 2008). 24

25 3. táblázat. Különböző kiterjedt-spektrumú -laktamáz családok, típusok, és első előfordulásuk (Forrás: Canton és mtsai 2008) ESBL-típus -laktamáz progenitor Első előfordulás Baktérium csoport, amelyikben először írták le az adott enzimet Magas prevalencia SHV SHV-1 LEN (>90%) a Németország (1983) b Enterobacteriaceae TEM TEM-1, -2 (>90%) a Franciaország (1985) b Enterobacteriaceae CTX-M-1 csoport KLUC Kluyvera cryocrescens (85%) a Németország (1989) c E. coli KLUA Kluyvera ascorbata Japán (1986) CTX-M-2 csoport c Argentina (80 100%) a c (1989) E. coli, Salmonella spp Citrobacter KLUG Kluyvera georgiana CTX-M-8 csoport (95%) a Brazília ( ) c amalonaticus, Enterobacter spp. CTX-M-9 csoport KLUG K. georgiana (80%) a Spanyolország (1994) c E. coli CTX-M-25 csoport NM Kanada (2000) c E. coli OXA OXA-10 (PSE-2) (>90%) a Törökország (1991) c P. aeruginosa PER Franciaország (1991) c P. aeruginosa VEB PER (39%) a Franciaország (Vietnam d ) (1996) c E. coli Alacsony prevalencia SFO AmpA Serratia fonticola (96%) a Japán (1988) c Enterobacter cloacae TLA CME-1 (50%) a Chryseobacterium meningosepticum Mexikó (1991) c E. coli BES YENT (51%) a Yersinia enterocolitica Brazília (1996) c Serratia marcescens GES-1 YENT (36%) a Y. enterocolitica Franciaország (Francia Guyana d ) (1998) c K. pneumoniae IBC YENT (40%) a Y. enterocolitica Görögország (1999) c E. cloacae BEL GES-1 (50%) a Belgium (2004) c P. aeruginosa NM, nincs meghatározva., a Aminosav szekvencia homológia (%). b Publikálás dátuma, c Izolálás dátuma; d A beteg származása, akiből az adott enzimet hordozó törzset izolálták 25

26 SHV-típusú ESBL-k Az SHV-típusú (SulpHydryl reagent Variable) -laktamázok a Bush-Jacoby Medeiros osztályozás szerint a 2b és 2be csoportba (előbbiek a penicillinázok, míg utóbbiak az ESBL enzimek), az Ambler-féle osztályozás szerint az A molekuláris osztályba tartoznak. Az SHV-típusú -laktamázok megtalálhatóak a K. pneumoniae törzsek legnagyobb részében, mint kromoszómálisan kódolt, konstitutívan termelődő enzimek (Livermore 1995). A leggyakoribb kromoszómális allél variánsok a nem- ESBL-t kódoló bla SHV-1 és bla SHV-11 (Lee és mtsai 2006). A plazmidon kódolt bla SHV gének valószínűleg ebből a genomból kerültek plazmidokra az IS26 elem közvetítésével (Ford és Avison 2004). Több tanulmányban is leírták az IS26 elem inszercióját különböző plazmidon kódolt SHV-típusoknál (pl. SHV-2a, SHV5, SHV-11, SHV-12) (Gutmann és mtsai 1995, Nüesch-Inderbinen és mtsai 1997, Podbieski és mtsai 1991b). Feltételezik, hogy az IS26 nemcsak a mobilizációban játszik szerepet, hanem megnöveli a promoter erősségét is (Podbieski és mtsai 1991a). Az SHV-típusú -laktamázok esetében a szubsztrát specificitás kiszélesedését néhány kulcsfontosságú pozícióban lévő aminosav szubsztitúció okozza: Asp179, Gly238 és Glu240. A Gly238 és Glu240 pozíciókban bekövetkező változások jelentős szerepet játszanak a széles-spektrumú cefalosporinokkal szembeni rezisztencia kialakulásában. Az SHV-2, SHV-2a és SHV-3 enzimek, amelyekben a Gly238Ser szubsztitúció önmagában van jelen, magasabb szintű rezisztenciát mutatnak cefotaximmal, mint ceftazidimmel szemben (Bradford 2001, Podbieski és mtsai 1991b). A Gly240 pozícióban bekövetkező mutációk az enzim ceftazidimmel szembeni hidrolitikus aktivitását emelik. Pl. SHV-5 és SHV-12 enzimeket -ahol a Gly238Ser mellett Glu240Lys mutáció is jelen van- hordozó törzsek ceftazidimmel szemben is emelkedett szintű rezisztenciát mutatnak (Gutmann és mtsai 1995, Nüesch-Inderbinen és mtsai 1997). Eddig 134 SHV-típust írtak le, azonban csak 44 típus tartozik az ESBL enzimek közé ( Az SHV-típusú ESBL enzimek világszerte előfordulnak, leggyakrabban az SHV-2, SHV-2a, SHV-5 és SHV-12 típusokat írták le Enterobacteriaceae és Pseudomonas spp. törzsekben. Ilyen törzseket nemcsak kórházi, és területi fertőzésekből izoláltak, hanem különböző állati és ételmintákból is (Paterson 26

27 és Bonomo 2005). Jelenleg a legelterjedtebb SHV-típus az SHV-12, melyet elsősorban K. pneumoniae törzsekből, valamint egyre gyakrabban területen szerzett húgyúti fertőzésekből izolált E. coli törzsekből mutattak ki. Többször leírták az SHV-12 együttes megjelenését más ESBL enzimekkel (pl. TEM, CTX-M vagy GES típusok) (Canton és mtsai 2008) TEM-típusú ESBL-k A TEM család a -laktamázok legváltozatosabb családja. Filogenetikai vizsgálatok arra utalnak, hogy a TEM és SHV enzimek rokon típusok, és mintegy millió évvel ezelőtt váltak el egymástól (Hall és Barlow 2004). Jelenleg 182 típusát írták le, és ebből 92 típus ESBL ( melyek az eredeti TEM-1 és TEM-2 nem-esbl -laktamázokból alakultak ki. Jellegzetes aminosav szubsztitúciók találhatók az Asp104, Arg164, Ala237, Gly238 és Glu240 pozíciókban. Hasonlóan az SHV-típusú ESBL-enzimekhez az Gly238Ser szubsztitúció a cefotaxim hidrolízisért, a Glu240Lys szubsztitúció a ceftazidim hidrolízisért felelős (Paterson és Bonomo 2005). A legáltalánosabb szubsztitúció az Arg164 pozíciót érinti a TEM enzimeknél. Szerin vagy hisztidin csoportra való aminosavcsere nagyobb flexibilitást ad az enzimnek, és ennek eredményeként a nagyobb cefalosporin molekulák is beférnek az aktív centrumba (Sowek és mtsai 1991). A különböző típusú TEM ESBL-enzimek jellemző geográfiai elterjedtséget mutattak. A TEM-10 ESBL-enzimet termelő törzsek évekig csak az Egyesült Államokban okoztak kórházi járványokat, később Európában is elterjedtek. A TEM-3 ESBL-enzim Franciaországban volt gyakori, míg a TEM-12 és TEM-26 enzimet termelő törzsek Nagy-Britanniában okoztak járványokat s évek végén TEM-24 enzimet termelő törzsek okoztak járványt Lengyelországban, míg Koreában TEM-52 enzimet termelő törzsek terjedtek el (Bradford 2001). A TEM-52 Európában is elterjedt és főleg Salmonella törzseknél, illetve húgyúti infekciókból izolált E. coli törzseknél fordult elő (Canton és mtsai 2008). 27

28 CTX-M-típusú ESBL-k A CTX-M (CefoTaXimáz-München) családba tartozó enzimek az utóbbi évtizedben a legelterjedtebb ESBL-típussá váltak, mind a nozokómiális, mind a közösségi fertőzések esetében (Canton és Coque 2006). Az 1980-as évek második felében írták le az első CTX-M-típusokat, és 1995-től kezdődően elterjedtségük a világ számos részén drámaian megnőtt. A CTX-M-családban eddig leírt enzimtípusok száma meghaladja a 90-et, és mindegyik ESBL-típusú ( Szekvencia homológia alapján a CTX-M-típusú -laktamázokat 5 fő csoportba lehet osztani: a CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 és CTX-M-25 csoport (4. táblázat). A csoporton belül a szekvencia homológia több mint 94%, az egyes csoportok között kevesebb, mint 90% (Bonnet 2004). A CTX-M-1 csoportba (pl. CTX-M-1, CTX-M-3, CTX-M-15), valamint a CTX- M-9 csoportba (pl. CTX-M-9, CTX 14) tartoznak a legelterjedtebb enzimtípusok, míg a CTX-M-2 csoport tagjai (pl. CTX-M-2, CTX-M-4 és CTX-M-6) kevésbé elterjedtek (Canton és Coque 2006). A nagyfokú aminosav homológia alapján valószínű, hogy a CTX-M-1 és CTX-M-2 csoport tagjai a Kluyvera cryocrescens kromoszómális bla KLUC, illetve a K. ascorbata kromoszómális bla KLUA génjéből származnak, más tanulmányok pedig a CTX-M-8 és CTX-M-9 csoportot a K. georgiana kromoszómálisan kódolt bla KLUG génjéből származtatják (Canton és mtsai 2008, Olson és mtsai 2005, Rodriguez és mtsa 2004). A CTX-M enzimet kódoló plazmidok konjugációs kísérletekben általában jól átvihetők recipiens sejtekbe, és ez a képességük magyarázhatja a bla CTX-M hordozó plazmidok gyors terjedését (Baraniak és mtsai 2002b). Abban az esetben, ha a bla CTX-M gén nem átvihető plazmidon helyezkedik el, a plazmid átadása megtörténhet transzformációval vagy a sejtbe jelen lévő másik konjugatív plazmid segítségével (Tassios 1999). A CTX-M-típusú enzimekre jellemző, hogy jóval nagyobb aktivitást mutatnak cefotaximmal és ceftriaxonnal, mint ceftazidimmel szemben. Azonban néhány pontmutáció, ill. az ennek következtében kialakuló aminosavcsere megnöveli a ceftazidimmel szembeni aktivitás mértékét is. Pl. CTX-M-15 a CTX-M-3-tól, valamint a CTX-M-32 a CTX-M-1-től egy aminosavban tér el (Asp240Gly). Azonban ezzel a CTX-M-15 és a CTX-M-32 százszor nagyobb aktivitást mutat ceftazidimmel szemben, mint a CTX-M-3 és a CTX-M-1 (Cartelle és mtsai 2004, Poirel és mtsai 2002). CTX- 28

29 M-9 és CTX-M-14 esetében ugyanez az aminosav szubsztitúció alakította ki a CTX-M- 27 és CTX-M-16 típusokat, és eredményezett hasonló aktivitás növekedést ceftazidimmal szemben (Bonnet és mtsai 2001, Bonnet és mtsai 2003). A CTX-M gének és azok genetikai környezetének nagyfokú hasonlósága egyes Kluyvera sp. kromoszómális -laktamázaihoz, feltételezte, hogy a gén valamilyen mobilizációs folyamattal került a kromoszómáról plazmidra. Poirel és mtsainak in vitro kísérletei bizonyították, hogy K. ascorbata kromoszómális -laktamáza inszerciós szekvencia segítségével átkerülhet plazmidra, majd ezután konjugációval más fajokba (Lartigue és mtsai 2006). A bla CTX-M gének mobilizációjában szerepet játszó genetikai elemek közül leggyakrabban különböző inszerciós elemeket (IS, pl. ISEcp1, ISEcp1- like, ISCR1) mutattak ki a bla CTX-M gének ORF-jétől 5 és 3 irányban (Lartigue és mtsai 2004, Perez és mtsai 2007, Poirel és mtsai 2008) (4. ábra). ISEcp1 nemcsak a mobilizációban játszik fontos szerepet, hanem erős promótert is biztosít a gén expressziójához. Kluyvera spp. törzsekben a kromoszómális CTX-M alacsony szinten, míg a plazmidon kódolt gének magas szinten expresszálódnak (Poirel és mtsai 2008). Más CTX-M kódoló gének (pl. bla CTX-M-2 ) 1. osztályú integronon helyezkedhetnek el (Arduino és mtsai 2002), illetve különböző mobilis genetikai elemeket is leírtak a környezetükben: IS10 (bla CTX-M-8 ) és IS26 (bla CTX-M-1 ) upstream irányban (Bonnet és mtsai 2000), vagy IS903-like elemet a CTX-M géntől (bla CTX-M-14, bla CTX-M-17 ) downstream irányban (Cao és mtsai 2002, Saladin és mtsai 2002). A CTX-M enzimek az egész világon elterjedtek, elsősorban CTX-M-15, CTX- M-14, CTX-M-3, CTX-M-2 és CTX-M-9 (3. ábra). Dél-Amerikában elsősorban a CTX- M-2, a CTX-M-9 és a CTX-M-15 (Bonnet 2004, Pallechi és mtsai 2007) típusok elterjedtek. Távol-Keleten készült felmérések alapján Japánban a CTX-M-2 és a CTX- M-3, míg Kínában a CTX-M-3, a CTX-M-13 és a CTX-M-14 enzimek a domináns típusok (Chanawong és mtsai 2002, Yagi és mtsai 2000, Yamasaki és mtsai 2003). Európa nagy részében a CTX-M-15 a domináns típus, míg progenitor típusa a CTX-M- 3 csak a kelet-európai országokra jellemző. A szintén a CTX-M-1 csoportba tartozó CTX-M-1 és CTX-M-32 eleinte a mediterrán területeken volt elterjedtek, de mára már szinte minden európai országban megjelentek. Franciaországban, Spanyolországban és Angliában emellett a CTX-M-9 csoport tagjai (CTX-M-9 és CTX-M-14) is előfordulnak (Canton és Coque 2006, Canton és mtsai 2008). 29

30 Európában a CTX-M-15 termelő ST131 E. coli törzs nemzetközi szintű klonális terjedését írták le - elsősorban területen szerzett húgyúti infekcióknál (Coque és mtsai 2008a). A haszonállatokból CTX-M-termelő baktériumok (elsősorban Salmonella enterica és E. coli) izolálása feltételezi, hogy a rezisztens baktériumok rezervoárjaként az állati eredetű termékek a területi fertőzések kiindulópontjai lehetnek (Caratolli 2008, Duan és mtsai 2006, Meunier és mtsai 2006). endémiás sporadikus nincs adat 3. ábra. Domináns és gyakori CTX-M -laktamáz típusok különböző földrajzi régiókban (Forrás: Canton és Coque 2006) 30

31 4. táblázat. Különböző CTX-M csoportok és bla CTX-M gének eredete (Forrás: Canton és mtsai 2008) CTX-M csoport CTX-M-1 CTX-M-2 CTX-M-8 CTX-M-9 CTX-M-25 Év (enzim, ország) a 1989 (CTX-M-1, Németország) 1986 (FEC-1, Japán) 1996 (CTX- M-8, Brazília) 1994 (CTX-M- 9, Spanyolország) 2000 (CTX-M- 25, Kanada) Enzimek CTX-M-1, -3, -10, -11, -12, -15, -22, , -30, -32, - 33, -28, -36, -54, UOE-1 CTX-M-2, -4, - 5, -6, -7, -20, - 31, -44 (korábban TOHO-1), FEC-1 CTX-M-8, CTX-M-40 CTX-M-9, -13, - 14, -16, -17, -18, -19, -24, -27, - 45 (korábban TOHO-2), -46, - 47, -48, -49, -50, CTX-M, -26, - 25, -39, -41 Eredeti species K. ascorbata K. ascorbata K. georgiana K. georgiana NM b a Az első izolálás, vagy leírás éve (elsőként leírt enzim és az ország, ahol izolálták); CTX-M-14 és CTX-M-18 azonos enzim; b NM: nem meghatározott. 4. ábra. Enterobacteriacae törzsekben kimutatott bla CTX-M gének, valamint a Kluyvera cryocrescens bla KLUC kromoszómális gén genetikai környezetének sematikus ábrái (Forrás: Lartigue és mtsai 2004) 31

32 Ritka ESBL-ek Az elterjedt ESBL-típusok mellett (SHV, TEM, CTX-M, OXA) további ESBL fenotípust mutató, ritkán előforduló -laktamázok is ismertek (pl. BES, VEB, PER, SFO, GES, TLA). Elsősorban egy-egy földrajzi területre jellemzőek (Bradford 2001). A PER enzimek 25-27% hasonlóságot mutatnak a TEM és SHV-típusú enzimekkel (Paterson és Bonomo 2005). A PER-1 enzim, melyet 1991-ben mutatták ki P. aeruginosa törzsből, hatékonyan hidrolizálja a penicillineket és a cefalosporinokat, és a -laktamáz inhibitorok gátolják működését. A PER-1 elsősorban Törökországban és Koreában, míg a PER-2 Dél-Amerikában elterjedt (Naas és mtsai 2008). A VEB-típusú enzimek szintén magas szintű rezisztenciát biztosítanak cefalosporinokkal szemben, és a klavulánsav gátolja működésüket. Első képviselőjüket (VEB-1) 1996-ban mutatták ki egy vietnámi beteg mintájából izolált E. coli törzsből. További VEB-típusokat írtak le Kuwaitban és Kínában (Paterson és Bonomo 2005). A GES-típusú enzimek elsősorban integronban fordulnak elő. Franciaországban írták le először, de néhány országban járványos előfordulásról is beszámoltak: pl Korea, Görögország és Hollandia. A csoport egyes tagjai nemcsak cefalosporinokat, hanem karbapenemeket is képesek hidrolizálni (Naas és mtsai 2008). Az SFO, BEL, TLA, BES enzimek sporadikusan, egy-egy leírásban fordulnak csak elő (Naas és mtsai 2008) 3.5. Kiterjedt-spektrumú -laktamáz termelésének kimutatása A klinikai bakteriológiai diagnosztikában nemcsak a kórokozó identifikálása kulcsfontosságú, hanem antibiotikum rezisztenciájának és rezisztencia mechanizmusainak meghatározása is. Az antibiotikum terápia sikerességét döntően befolyásolja a kórokozó rezisztenciájának lehető leggyorsabb meghatározása, mely alapján az esetleges hatástalan empirikus terápia kiegészíthető vagy módosítható, illetve a szükséges kórházhigiénés intézkedések is elrendelhetőek (Paterson és mtsai 2001, Song és mtsai 2005). Az ESBL-termelő törzsek esetében általában igen beszűkül a terápiásan választható antibiotikumok köre, és az gyakran csak karbapenemekre korlátozódik (Paterson és Bonomo 2005). Számos tanulmányban beszámoltak arról, 32

33 hogy a nem megfelelően vagy késve kezdett antibiotikum terápia esetében az ESBLtermelő törzsek okozta fertőzések nagyobb mortalitással, hosszabb ápolási idővel és magasabb terápiás költséggel járnak (Melzer és Petersen 2007, Schwaber és mtsai 2006, Schwaber és Carmeli 2007). A klinikai és gazdasági vonatkozások mellett az ESBLtermelés kimutatása számos infekciókontroll és kórházhigiénés intézkedést von maga után: a legalapvetőbb, hogy az érintett betegeket el kell különíteni a többi betegtől a törzs továbbterjedésének megakadályozása érdekében. Az ESBL-termelés gyors és egyértelmű meghatározására, más mechanizmusoktól való elkülönítésére szolgáló módszerek igen nagy jelentőségűek, mivel egyrészt az alkalmazható antibiotikumokról adnak felvilágosítást, másrészt adatot szolgáltatnak az epidemiológiai, infekciókontroll és kórházhigiénés kivizsgálásokhoz is ESBL-termelés kimutatása fenotípusos módszerekkel Az ESBL-termelő kórokozók -laktámokkal szembeni rezisztenciájának fenotípusos jellemzői a következők: i, rezisztensek az amino-, és karboxipenicillinekkel, valamint a 3. és 4. generációs cefalosporinokkal, és aztreonammal szemben; ii, a - laktamáz inhibitorok (pl. klavulánsav) gátolják működésüket (Bradford 2001, Drieux és mtsai 2008, Paterson és Bonomo 2005, Stürenburg és Mack 2003). A baktériumok antibiotikum érzékenységének fenotípusos meghatározására többféle módszer alkalmazható. Magyarországon óta az antibiotikum rezisztencia vizsgálatok standardizált kivitelezését és kiértékelését a CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute) (korábban NCCLS-the National Committee for Clinical Laboratory Standards) ajánlása alapján végzik. Az ajánlott gold standard módszer a minimális gátló koncentráció meghatározása (MIC, az a legkisebb antibiotikum koncentráció), mely gátolja a baktérium növekedését). A MIC érték ismeretében a klinikus vagy az infektológus dönthet az adott antibiotikum terápiás alkalmazhatóságáról figyelembe véve annak farmakodinámiás és farmakokinetikai jellemzőit. A MIC érték meghatározására a CLSI agarhigításos, vagy leveshigításos módszert ajánl. Ennek során meghatározott mennyiségű baktérium növekedésének gátlását vizsgálják az antibiotikum felező hígítási sorát tartalmazó szilárd vagy folyékony táptalajoknál. A MIC meghatározás 33

34 másik formája az ún. E-teszt módszer. Az E-teszt egy tesztcsík, mely az adott antibiotikum koncentráció gradiensével van átitatva. Ez a tesztcsík a hagyományos MIC módszer 15 kettős léptékű hígításának megfelelő koncentráció tartományt biztosít. A másik módszer a korongdiffúziós módszer, melynek során az ajánlásban meghatározott mennyiségű antibitiotikumot tartalmazó korongot helyeznek a felületén egyenletes baktérium-szuszpenzióval bekent táptalajra. A korongból egyenletesen kidiffundáló antibiotikum gátolja az érzékeny baktérium növekedését. A kialakuló gátlási zóna nagyságából lehet az érzékenység mértékére következtetni. A CLSI ajánlásai a lehetséges baktérium és antibiotikum kombinációkra megadja az érzékeny/mérésékelt/ rezisztens határértékeket mind a MIC értékeknél, mind a korongdiffúziós vizsgálatnál. Az ESBL-termelés szűrésére használható a 3. generációs cefalosporin érzékenység: rezisztencia illetve csökkent érzékenység megjelenésekor felmerül az ESBL-termelés gyanúja (5. táblázat). Azonban az ESBL-termelő törzsek esetében a standard módszerekkel végzett és értékelt vizsgálatok egyes esetekben nem mutatnak in vitro rezisztenciát 3. generációs cefalosporinokkal szemben. Ettől függetlenül az ESBL rezisztencia mechanizmussal rendelkező törzseket 3. és 4. generációs cefalosporinok mindegyikére rezisztensnek kell tekinteni (CLSI ). A CLSI ajánlásában ezért az ESBL-termelés szűrésére külön határértékeket határoztak meg E. coli, K. pneumoniae és K. oxytoca és P. mirabilis esetében (6. táblázat). A szűrési határértéket meghaladó törzseket lehetséges ESBL-termelőknek kell tekinteni, és további megerősítő vizsgálatokat kell végezni. Az eltérő szubsztrátspecificitású ESBL-enzimtípusok miatt többféle 3. generációs cefalosporin érzékenységét kell vizsgálni egyidejűleg. ESBL-termelés szűrésekor a legjobban alkalmazható -laktám a cefpodoxim, mivel a gátlási zóna alapján az ESBL-termelők és nem termelők egyértelműen elkülöníthetőek, azonban gyakran álpozitív eredményt ad. Mivel egyes típusok a ceftazidimet (pl. SHV-5), más típusok a cefotaximot (SHV-2a) bontják jobban, ezért ajánlott a ceftazidimet és cefotaximot egyszerre vizsgálni (Paterson és Bonomo 2005, Stürenburg és Mack 2003). 34

35 5. táblázat. Cefalosporinok érzékenységi határértékei Enterobacteriaceae törzsek Antibiotikum Antibiotiku m tartalom ( g) esetében (CLSI ) Zónaátmérő határérték (mm) MIC határérték (mg/l) Mérsékel Mérsékel Érzékeny t Rezisztens Érzékeny t Rezisztens cefotaxim ceftriaxon ceftazidim cefpodoxim táblázat. ESBL-termelés szűrésére alkalmazott antibiotikum érzékenységi értékek Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, E. coli és P. mirabilis esetében. Antibiotikum Antibiotikum tartalom ( g) Zónaátmérő határérték (mm) K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli MIC határérték (mg/l) cefotaxim >1 ceftriaxon >1 ceftazidim >1 cefpodoxim >4 P. mirabilis cefotaxim >1 ceftazidim >1 cefpodoxim >1 Bármelyik cefalosporin esetében korongdiffúziós határérték alatti, illetve a MIC határérték feletti értékek esetében ESBL megerősítő vizsgálatok elvégzése szükséges (CLSI ) Más Enterobacteriaceae fajok olyan kromoszómális -laktamázokat termelnek, melyek szintén 3. generációs cefalosporinokkal szembeni rezisztenciát okozhatnak (Pl. AmpC-típus). Ezeknél a specieseknél az ESBL-termelés szűrése nehezebb és a mechanizmus meghatározása bonyolultabb. Az ESBL-termelésre gyanús törzsek fenotípusos megerősítésére többféle módszert dolgoztak ki. Mindegyik alapelve, hogy a -laktamáz inhibitorok és a 3. generációs cefalosporinok között szinergizmus mutatható ki. Az elsőnek leírt megerősítő módszer a kétkorong szinergizmus teszt volt (double disk synergy test DDST) (Jarlier és mtsai 1988). Ennek során a Mueller-Hinton táptalajra kent baktérium szuszpenzióra amoxicillin/klavulánsav tartalmú korongot helyeznek és ettől 30 mm-re 35

36 (középpontoktól számítva) cefotaxim (30 g) tartalmú korongot. ESBL-termelés esetében a cefalosporin körüli gátlási zóna a klavulánsav tartalmú korong felé torzul, mivel ez utóbbi gátolja az ESBL-enzim működését, és így a cefalosporin képes kifejteni hatását. Jobb érzékenység érhető el, ha többféle cefalosporint is alkalmaznak (pl. ceftazidimet), illetve ha a korongok távolságát 20 mm-re csökkentik (Paterson és Bonomo 2005, Stürenburg és Mack 2003). A módszer továbbfejlesztésével AmpCtermelő törzseknél is vizsgálható az ESBL-termelés (módosított DDST). Ebben az esetben cefepimmel (30 g) egészítik ki a vizsgálatot, amit az AmpC-típusú enzimek nem képesek bontani, azonban az ESBL enzimek igen (Pitout és mtsai 2003) (5. ábra/a) A B C 5. Ábra ESBL-termelést megerősítő fenotípusos módszerek. A: pozitív módosított DDST, B: pozitív kombinált korong teszt, C: pozitív ESBL E- teszt Az AmpC-típusú enzimek hatása specifikus gátlószerekkel (cloxacillin, bórsav származékok) felfüggeszthető, és ekkor már alkalmazhatóak a korábban említett ESBLtermelést megerősítő fenotípusos módszerek (Drieux és mtsai 2008, Coudron 2005). A másik fenotípusos megerősítő módszer az ún. kombinált korong teszt módszer (combined disk method- CDM), amilyen teszek kereskedelmi forgalomban is kaphatóak. K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli és P. mirabilis esetében a CLSI is ajánlja az ESBL-termelés megerősítésére (CLSI ). A módszer elve, hogy a cefalosporin tartalmú korongokkal (ceftazidim, cefotaxim és egyes kereskedelmi teszteknél cefpodoxim is) szembeni érzékenységet önmagukban és klavulánsavval 36

37 kiegészítve is vizsgálják. Ha bármely klavulánsav tartalmú korongnál mért gátlási zóna átmérő 5 mm-el nagyobb, mint a klavulánsav mentes cefalosporin esetében, akkor a teszt eredménye pozitív. Kromoszómális AmpC-túltermelő törzseknél a módszer általában nem működik, mivel ezek a törzsek az AmpC miatt is rezisztensek a 3. generációs cefalosporinokkal szemben, és nem megállapítható, hogy emellett termel-e a törzs ESBL enzimet vagy nem. Bár terápiás szempontból nincs lényeges különbség a kromoszómális AmpC-túltermelő illetve az ESBL-termelő törzsek között, azonban infekciókontroll és járványügyi szempontból jelentős az eltérés, mivel az előbbinél klonális terjedés várható, míg utóbbinál ez horizontális terjedéssel is együtt járhat, és az ESBL- géneket hordozó plazmidok általában többféle, más antibiotikummal szembeni rezisztenciát is kódolnak (Paterson és Bonomo 2005, Stürenburg és Mack 2003). A harmadik, szintén kereskedelmi forgalomban is kapható módszer az ESBL E- teszt. Hasonlóan a hagyományos E-teszt módszeren alapuló MIC érték meghatározáshoz a tesztcsíkra ebben az esetben is antibiotikum koncentráció gradiens vittek fel. Azonban itt a tesztcsík két részre van osztva: egyik fele cefalosporint (cefotaxim vagy ceftazidim) magában, míg a másik fele cefalosporint klavulánsavval kiegészítve tartalmaz. Pozitív esetben a cefalosporint tartalmazó oldalon kapott MIC érték és a klavulánsav tartalmú oldalon kapott MIC érték hányadosának legalább 8-nak kell lennie, ami azt jelenti, hogy az inhibitor legalább három hígítási fokkal csökkentette a MIC értéket. A módszer nagyon jól alkalmazható a CLSI ajánlásában is tárgyalt fajoknál, azonban, mivel a klavulánsav jó indukálószere az AmpC-típusú enzimeknek, általában már a kromoszómálisan kódolt, vad-típusú AmpC-t termelő törzseknél sem működik megfelelően. A kereskedelmi forgalomban van már olyan ESBL E-teszt is, mely 4. generációs cefalopsorint tartalmaz (cefepim), és ez már használható AmpCtermelő törzsek esetében is, azonban érzékenysége elmarad a 3. generációs cefalosporinokat tartalmazó ESBL E-teszt-ektől. A klinikai mikrobiológiában az antibiotikum vizsgálatokhoz egyre több helyen alkalmaznak különböző automata rendszereket (pl. Phoenix, VITEK 1 és 2, MicroScan). Ezek az automaták is képesek az ESBL-termelés vizsgálatára és a szakértői programjuk segítségével azok interpretálására. Összehasonlítva a DDST, CDM és ESBL E-teszt módszerekkel az automata rendszerek érzékenysége eléri azokat, azonban specificitásuk általában rosszabb (Drieux és mtsai 2008). 37

38 Az utóbbi években az ESBL-enzimek mellett egyre nagyobb arányban jelennek meg más, cefalopsorin rezisztenciát okozó, szerzett -laktamázt termelő Enterobacteriaceae törzsek (pl. plazmidon kódolt AmpC, MBL-k, szerin-típusú karbapenemázok). A fenotípusos módszerek ezért egyre bonyolultabbak és összetettebbé válnak. Doi és munkatársai ajánlásukban összefoglalták a legfontosabb - laktamázok kimutatásának fenotípusos lehetőségeit azoknál a törzseknél, melyeknél a CLSI ajánlása alapján felmerül az ESBL-termelés lehetősége (Doi és Paterson 2007) (6. ábra). ESBL-termelés szűrése CLSI ajánlása alapján (cefpodoxim, ceftazidim, aztreonam, cefotaxim, ceftriaxon) pozitív negatív Nincs széles-spektrumú -laktamáz termelés Fenotípusos megerősítő tesztek (CLSI ajánlása alapján) pozitív A osztályú ESBL-termelés negatív Karbepenem nem-érzékeny a törzs? igen B osztályú MBL-termelés megerősítése (kelátképző vegyületek: DPS, EDTA) B osztályú MBL termelő igen nem nem C osztályú -laktamáz termelés megerősítése (bórsav-alapú, cloxacillin-alapú vagy AmpC korong tesztek) pozitív C osztályú -laktamáz termelés negatív Más rezisztencia mechanizmus: - D osztályú -laktamáz termelés (OXA) -porin változás 6. ábra. Különböző 3. generációs cefalosporin rezisztenciát okozó -laktamázok kimutatásának fenotípusos lehetőségei (Forrás: Doi és Paterson 2007) 38

39 ESBL-kódoló gének kimutatása molekuláris módszerekkel A ESBL-termelésre gyanús törzsek antibiotikum rezisztencia génjeinek molekuláris biológiai módszerekkel való vizsgálata a klasszikus fenotípusos rezisztencia vizsgálat egyik alternatívája. Egyrészt lehetőséget nyújt a tenyésztéses módszereknél gyorsabb eredmény kiadására, ami terápiás szempontból jelentős. Másrészt az ESBL-típusok pontos meghatározása az epidemiológiai vizsgálatokhoz is fontos segítséget nyújt. Az ESBL-gének molekuláris kimutatásával kiküszöbölhető a klasszikus fenotípusos vizsgálatok számos problémája: pl. az ESBL enzimek eltérő szubsztrát specifitása, az enzimek különböző szintű expressziója, számos egyéb zavaró faktor (pl. inokulum hatás, további -laktamázok együttes termelése, mely az inhibitorok szinergista hatását elfedheti). A molekuláris módszerek hátránya viszont, hogy a rendkívül nagy változatosságot mutató ESBL-gének rutinszerű molekuláris genetikai meghatározása nagy laboratóriumi felkészültséget igényel. Szemben pl. a methicillin rezisztens Staphylococcus aureus molekuláris módszerekkel történő kimutatásával, ahol a rezisztencia az esetek túlnyomó többségében meca gén közvetítette, ezért a rezisztencia molekuláris módszerekkel történő kimutatása egyszerű, a több száz ESBL-típus gyors kimutatása és megkülönböztetése már bonyolultabb módszereket és költséges eszközparkot igényel. Másik hátránya, hogy a molekuláris módszerek legnagyobb hányadával csak a korábban leírt gének és típusok mutathatók ki rutinszerűen, és az újonnan megjelenő rezisztenciagének így rejtve maradhatnak. Emellett az egyes enzimcsaládokon belül megtalálhatóak szűk-spektrumú, szélesspektrumú és kiterjedt-spektrumú -laktamáz változatok is (pl. SHV-1 szélesspektrumú, míg az SHV-2 ESBL-típus), melyek elkülönítése szintén további kiegészítő molekuláris módszerek elvégzését igényli. Az izoelektromos pont fókuszálás (IEF), mely régóta széles körben alkalmazott módszer a fehérjék szeparálására és meghatározására, korlátozott mértékben alkalmas az ESBL-enzimek jellemzésére is. Lényege, hogy a mintában meglévő fehérjék az elektroforézis során egy ph gradiens mentén vándorolnak az anód vagy a katód felé. A fehérjék az izoelektromos pontjuk (pi) eléréséig vándorolnak a gélben, és a - laktamázok specifikusan festhetők (pl. nitrocefinnel, melyet színváltozás kíséretében képesek a -laktamázok hidrolizálni) (Stürenburg és Mack 2003) Az SHV-enzimek 39

40 izoelektromos pontja 7,0-8,2 között, a TEM-enzimek izoelektromos pontja 5,2-6,5 között, míg a CTX-M-enzimek izoelektromos pontja 7,6-9,0 között változik ( A nagyszámú -laktamáz típust korlátozott mértékben képes elkülöníteni, ezért e módszer jelentősége csökkent az utóbbi időben. Az ESBL-gének típusának DNS szintű meghatározásában a gold standard módszer mindenképpen a gének specifikus amplifikációja PCR módszerrel, majd a termék nukleotid sorrendjének meghatározása szekvenálással (Cockerill 1999). Az ESBL-típusok kimutatására és tipizálására számos további módszert dolgoztak ki, melyek lehetnek gyorsabbak és/vagy költségtakarékosabbak, azonban a DNS-szekvenáláson alapuló módszer felbontóképességét jelenleg még nem érik el ESBL-termelő Enterobacteriaceae törzsek első hazai leírásai Az első hazai vizsgálatokat 1996-ban végezték, melynek során 170 K. pneumoniae (114 Szegedről, 27 észak-, 10 észak-nyugat-, 8 nyugat-magyarországi régióból és 11 Budapestről származott), valamint 82 E. cloacae és 15 S: marcescens törzset gyűjtöttek össze és vizsgáltak meg ESBL-termelés irányában. Ezek közül 15 K. pneumoniae (9 szegedi, 3 budapesti és 2 észak-magyarországi) és egy S. marcescens törzs bizonyult SHV-típusú ESBL-termelőnek. PCR-RFLP-SSCP módszerrel határozták meg az alléltípusokat, melynek alapján 12 K. pneumoniae és a S. marcescens törzs SHV-2, míg 3 K. pneumoniae SHV-5 termelőnek bizonyult. A SHV-2 termelő törzsek többsége gentamicinnel szemben, egy pedig ciprofloxacinnal szemben bizonyult rezisztensnek. Az SHV-2 termelő S. marcescens esetében in vivo horizontális génátvitelt feltételeztek a szerzők, mivel ugyanabban az időben ugyanabból a betegnek a mintájából izoláltak egy SHV-2-pozitív K. pneumoniae törzset is (Nagy és mtsai 1998, Prágai és mtsai 1998). Az első ESBL-pozitív K. pneumoniae törzs okozta nozokómiális járványt Magyarországon Szabó és mtsai írták le 1999-ben. A szolnoki Hetényi Géza Megyei Kórház PIC részlegén június 1. és november 30. között 15 betegtől összesen 21 SHV-5-típusú ESBL-termelő K. pneumoniae ill. egy SHV-5 pozitív S. marcescens törzset izoláltak. A környezeti (n=143) és a dolgozói (n=22) szűrések során pedig egy fürdető szappanból származó mintából tenyészett ki SHV-5-termelő K. pneumoniae törzs. Mindegyik törzs rezisztens volt gentamicinnel szemben, és érzékeny volt 40

41 amikacinra és ciprofloxacinra. Az ESBL-típusokat ebben az esetben is PCR-RFLP- SSCP módszerrel azonosították. Egy kivételével a K. pneumoniae klinikai izolátumok, a környezeti mintából izolált K. pneumoniae, ill. a S. marcescens törzs egy nagyon hasonló restrikciós képet mutató, nagyméretű plazmidot hordoztak. Emellett a 15 K. pneumoniae törzs közül 14 valamint a környezeti szűrésből származó törzs klonális rokonságot mutatott AP-PCR módszerrel. Ez bizonyította a törzsek genetikai rokonságát, valamint a S. marcescens esetében a bla SHV-2 gén in vivo horizontális átadását. A hatékony infekciókontroll intézkedéseknek köszönhetően további törzseket nem izoláltak az osztályról (Szabó és mtsai 1999). Magyarországon izolált ESBL-termelő Salmonella Typhimurium törzsek sporadikus előfordulásáról két publikáció jelent meg. Első esetben 1998-ban egy 1 éves jugoszláv beteget kezeltek az Országos Kardiológiai Intézetben Budapesten, akinek székletéből és trachea váladékából is TEM-52-típusú ESBL-termelő S. Typhimurium izolátumokat tenyésztettek ki. A törzsek kétféle antibiotikum rezisztenciával rendelkeztek, és a ribotipizálás eredménye alapján is eltérő klónokhoz tartoztak. A bla TEM-52 -hordozó plazmidokkal végzett vizsgálatok a gén in vivo horizontális átvitelét feltételezték a két törzs között. A kórokozókat imipenem és amikacin kombinált terápia hatására sikeresen eradikálták (Vahaboglu és mtsai 2000). Szintén 1998-ban izoláltak Budapesten három, sporadikus esetből származó ESBL-termelő S. Typhimurium törzset, melyek bla CTX-M-4 gént hordoztak. Ezeket a törzseket összehasonlították oroszországi (1 törzs 1996-ban, 6 törzs 1997-ben lezajlott szentpétervári járványokból származott) és görög törzsekkel (2 klonálisan független törzs). A vizsgálatok azt mutatták, hogy az oroszországi és a magyar törzsek egyaránt egy 12 kb nagyságú, bla CTX-M-4 gént hordozó plazmiddal rendelkeztek, bár a restrikciós emésztéses vizsgálatok alapján a magyar törzsek plazmidjából hiányzott egy 0,6 kb nagyságú szakasz. A PFGE vizsgálat eredménye az oroszországi és a magyarországi törzsek klonális rokonságát mutatta (Tassios és mtsai 1999). 41

42 3.7. ESBL-termelő törzsek más antibiotikum csoportokkal szembeni rezisztenciája Az ESBL-termelő törzsek általában korezisztenciát mutatnak több más antibiotikum család tagjaival szemben is: pl. fluorokinolonok, aminoglikozidok és trimethoprim/sulfamethoxazol, ami hozzájárul a multirezisztens ESBL-termelő törzsek és a géneket hordozó plazmidok szelekciójához és fennmaradásához mind a kórházi környezetben, mind a területen (Canton és mtsai 2008, Coque és mtsai 2008a). A fluorokinolon rezisztens, ESBL-termelő törzsek aránya fokozatosan emelkedik, kezdetekben K. pneumoniae, majd később E. coli törzseknél is (Coque és mtsai 2008a) Fluorokinolonokkal szembeni rezisztencia A fluorokinolonoknak igen jó az Enterobacteriaceae családba tartozó baktériumokkal szembeni aktivitása. Baktericid hatásukat a bakteriális DNS-giráz és topoizomeráz gátlása útján érik el. Az 1980-s években vezették be a klinikai használatba, és azóta széleskörűen alkalmazzák a bakteriális fertőzések kezelésében (Robicsek és mtsai 2006a). Az utóbbi két évtizedben azonban a fluorokinolonokkal szembeni rezisztencia általánossá vált az Enterobacteriaceae törzsek körében, és egyes tanulmányokban már 50% feletti rezisztencia arányt is leírnak (Robicsek és mtsai 2006a, Robicsek és mtsai 2006b). Az Enterobacteriaceae családban két rezisztenciamechanizmus fordul elő leggyakrabban. A DNS topoizomeráz II-t (DNS-girázt) kódoló gyra és gyrb, illetve a topoizomeráz IV-t kódoló parc génekben bekövetkező mutációk általában magasszintű rezisztenciát eredményeznek. A rezisztenciáért felelős mutációk a gének bizonyos területeire lokalizálódnak, melyeket kinolon rezisztenciát meghatározó régióknak (QRDRs - quinolone resistance determining regions) neveznek. A másik gyakori mechanizmus az antibiotikum intracelluláris szintjének csökkentése, melyet efflux pumpák (pl. AcrAB-TolC Escherichia coli-ban) expressziójával és/vagy az Ompk csökkent termelésével érnek el (Jacoby 2005, Robicsek és mtsai 2006a, Huang 1996). Ezek általában alacsonyabb szintű rezisztenciát eredményeznek magukban, azonban többféle mechanizmus kombinálódása már magas szintű rezisztenciát okozhat. Az utóbbi években két új, átvihető, szerzett kinolon-rezisztencia determinánst írtak le (Robicsek és mtsai 2006a, Robicsek és mtsai 2006b, Tran és Jacoby 2002). Mindkettő 42

43 elsősorban kiegészítő, támogató szerepet játszik a rezisztencia kialakításában. Az első rezisztenciát qnr gének közvetítik, melynek terméke a topoizomerázhoz kötődve véd a fluorokinolonok hatásától. Eddig három ilyen gént írtak le: qnra, qnrb, qnrs. Ezek a rezisztencia determinánsok világszerte elterjedtek az Enterobacteriaceae törzsek között, és gyakran megtalálhatóak kiterjedt-spektrumú -laktamázt termelő törzsekben (Robicsek és mtsai 2006a, Tran és Jacoby 2002). A másik mechanizmus a fluorokinolonok inaktiválásán alapul. Az aac(6 )-Ib aminoglikozid acetiltranszferáz egyik változata, az aac(6 )-Ib-cr kódolta fehérje nemcsak az aminoglikozidokat, hanem egyes fluorokinolonokat (pl. ciprofloxacin, norfloxacin) is képes módosítani, és így inaktiválni (Robicsek és mtsai 2006a, Robicsek és mtsai 2006b). E két utóbbi mechanizmust kódoló gének gyakran olyan plazmidokon helyezkednek el, melyek további jelentős rezisztencia determinánsokat hordoznak (pl. ESBL és AmpC-típusú - laktamázok, aminoglikozid rezisztencia gének) (Robicsek és mtsai 2006a) Aminoglikozidokkal szembeni rezisztencia Az aminoglikozidok baktericid antibiotikumok, melyek a bakteriális riboszóma 30S alegységéhez kötődve, a fehérjeszintézis gátlása útján érik el baktériumölő hatásukat. A klinikailag jelentős Gram-negatív baktériumokkal (Enterobacteriaceae fajok, Acinetobacter spp., Pseudomonas spp.) szemben igen jó az in vitro aktivitásuk. Annak ellenére, hogy nefrotoxikus és ototoxikus mellékhatásuk lehet, valamint az aminoglikozid rezisztens törzsek száma is növekszik, az aminoglikozidok értékes és néha elengedhetetlen részét képezik számos fertőzés kezelésének, és egyes esetekben a profilaxisnak. Többféle rezisztencia mechanizmust is leírtak már az aminoglikozidokkal szemben: i, az antibiotikum csökkent felvétele, illetve az intracelluláris szint csökkentése efflux pumpákkal; ii, a célpont molekula (riboszóma) módosítása; iii, az aminoglikozidok enzimatikus módosítása. A Gram-negatív baktériumok esetében az aminoglikozidokat módosító enzimek termelése a rezisztencia fő mechanizmusa. Három enzimcsaládot lehet megkülönböztetni: i, aminoglikozid foszfotranszferázok (APH), ii, aminoglikozid acetiltranszferázok (AAC), iii, aminoglikozid nukleitidil-transzferázok (ANT). Az egyes enzim típusok és azon belül az altípusok különböző specifitással képesek bontani az egyes aminoglikozidok antibiotikumokat. Klinikai izolátumok 43

44 aminglikozidokkal szembeni rezisztenciája igen változatos, függően a vizsgált antibiotikumtól, az adott kórokozótól, a szerzett rezisztencia mechanizmusoktól. Az aminoglikozid rezisztencia epidemiológiája részben a sokféle aminoglikozid-módosító enzim miatt, melyek különbözőképpen kombinálódhatnak egy-egy törzsben, részben további kiegészítő rezisztencia mechanizmusok megjelenése miatt mára egyre komplexebbé vált. Mivel az aminoglikozid módosító enzimeket kódoló gének gyakran mobilis elemeken helyezkednek el (pl. plazmidok, transzpozonok) más antibiotikum rezisztenciát kódoló génekkel együtt, ezért a nem-aminoglikozid antibiotikumok alkalmazása is jelentősen befolyásolhatja ezek epidemiológiáját. Számos tanulmányban leírták, hogy az aminoglikozid rezisztencia spektruma szélesedik azokban az országokban és kórházakban, ahol ezeket az antibiotikumokat (pl gentamicin, tobramycin, amikacin, netilmicin) széles körben alkalmazzák. Belgiumban, Franciaországban és Görögországban, ahol az amikacin használat elterjedtebb, mint más európai országokban az AAC(6 )-I enzim mely amikacin rezisztenciát okozelőfordulása jóval magasabb. Ezzel szemben Németországban az aminoglikozid felhasználás 80%-át a gentamicin teszi ki, a fő rezisztencia gének az ANT(2 )-I, valamint AAC(3)-IV, melyek a gentamicinnel szemben biztosítanak rezisztenciát. Annak ellenére, hogy már több mint 50-féle aminoglikozid módosító enzimet írtak le, csak néhány terjedt el ezek közül a Gram-negatív baktériumok körében: (ANT(2 )-I, AAC(6 )-I, valamint AAC(3)-I, AAC(3)-II, AAC(3)-III, AAC(3)-IV és AAC(3)-VI (Vakulenko és Mobashery 2003). Az ESBL-termelő törzsek általában különböző aminoglikozidokkal szemben is rezisztensek (Paterson és Bonomo 2005, Coque és mtsai 2008a). ESBL-termelő K. pneumoniae és E. coli törzsekben leggyakrabban az AAC(3)-II (rezisztenciát biztosít gentamicinnel és tobramycinnel szemben) és AAC(6 )-I ( amikacin és tobramycin rezisztenciát okoz) enzimeket kódoló géneket mutattak ki (Coque és mtsai 2008b, Hawkey és Jones 2009, Karisik és mtsai 2006, Shanonn és mtsai 1998, Seo és mtsai 2010). 44

45 4. CÉLKITŰZÉSEK Az Országos Epidemiológiai Központban szeptember 6-án kezdte meg működését az ESBL-termelő Gram-negatív kórokozók Nemzeti Referencia Laboratóriuma (ESBL-NRL) dr. Füzi Miklós vezetésével. A referencia laboratórium létrehozásának célja volt, hogy az akkor Magyarországon megjelenő és egyre több járványt okozó ESBL-termelő törzsek genetikai hátterét, hazai elterjedtségét vizsgáljuk, bővítsük ismereteinket a leggyakoribb ESBL-típusokról, és jellemezzük a géneket hordozó mobilis genetikai elemeket. Az évek során a hazai klinikai mikrobiológiai laboratóriumok a Referencia Laboratóriumba küldték nemcsak a halmozódásokból, járványokból származó ESBL-termelő, hanem a nehezen meghatározható rezisztencia mechanizmussal rendelkező izolátumokat is, megerősítésre és további vizsgálatokra. Az ESBL-NRL célja továbbá, hogy a megszerzett ismeretekről, eredményekről, illetve a nemzetközi trendekről minél több fórumon tájékoztassa a hazai szakembereket. Reményeink szerint az eredményeink hozzájárulhatnak a hazai antibiotikum rezisztencia helyzet alaposabb ismeretéhez, és elvezethetnek azokhoz az intézkedésekhez, melyek javítják a hazai helyzetet. A rutinszerűen végzett megerősítő és tipizáló vizsgálatokon kívül elsősorban nozokómiális fertőzésekben előforduló, járványokat okozó törzseken végeztünk további fenotípusos és molekuláris genetikai vizsgálatokat. Dolgozatom célkitűzései egyben az ESBL-NRL végzett munkám célkitűzéseit is tartalmazzák: 1. A DNS-szekvenálás bevezetése a hazai ESBL-gének jellemzésére, és a módszer segítségével a között Magyarországon elterjedt ESBL-típusok felmérése, azok földrajzi megoszlásának meghatározása és az eredményeket összevetése a szomszédos országok adataival. 2. A ban Perinatális Intenzív Centrumokban (PIC) járványokat, illetve halmozódásokat okozó ESBL-termelő Klebsiella spp. törzsek genetikai rokonságának meghatározása és az általuk hordozott ESBL-gének jellemzése, és összehasonlítása egy 1998-ban hazánkban lezajlott ESBL-termelő K. pneumoniae járvány törzseivel. Ezzel kapcsolatosan egy 1998-ban gyűjtött 3. generációs cefalosporin rezisztens E. cloacae törzsgyűjteményben 45

46 megvizsgáltuk az ESBL-hordozás gyakoriságát és lehetséges kapcsolatát a Klebsiella spp. törzsekkel. 3. A hazánkban 2003-ban megjelent CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek jellemzése. A CTX-M-termelő törzsek terjedésének további monitorozása, és összehasonlítása a 2003-ban izolált törzsekkel. 4. ESBL-termelés gyakoriságának vizsgálata nem-tifoid Salmonella enterica törzsek körében, melyeket az Országos Epidemiológiai Központban gyűjtöttek között. Az ESBL-termelő törzsek jellemzése, és összehasonlítása a korábban hazánkban leírt ESBL-típusokkal között gyűjtött ESBL-termelő, humán és állati eredetű E. coli törzsek genetikai hátterének vizsgálata, és a két törzsgyűjtemény összehasonlítása. 6. Az évek során szerzett ismeretanyag alkalmazása járványok prospektív vizsgálatánál, melyet egy budapesti kórházban 2008-ban lezajlott járvány kivizsgálásának példáján mutatunk be. 46

47 5. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 5.1. Baktérium törzsek Az Országos Epidemiológiai Központba óta küldik a hazai klinikai mikrobiológiai laboratóriumok az ESBL-termelésre gyanús izolátumokat (7. táblázat). A beküldött törzsek száma 2005-ig folyamatosan emelkedett ban az egészségügyi és az ÁNTSZ hálózat átalakításával a beküldött izolátumok száma csökkent, főleg járványokból izoláltak kerültek beküldésre. 7. táblázat között az ESBL-NRL-be küldött ESBL-termelő törzsek faj szerinti megoszlása A törzs beérkezésének ideje (év) Faj ESBL-termelő törzsek száma (db) Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Klebsiella oxytoca Enterobacter cloacae Egyéb Összes beküldött ESBL-termelő törzs A beküldött izolátumokhoz mellékelt beküldőlapok tartalmazzák a legfontosabb epidemiológiai adatokat (beteg adatai, mintatípus, izolálás helye, ideje, laboratóriumi vizsgálati eredmények), ami lehetővé teszik a későbbi retrospektív vizsgálatok elvégzését. Az ESBL-gének hazai megoszlásának vizsgálata: 35 reprezentatív izolátumot választottunk ki a január és augusztusa között 25 hazai mikrobiológiai laboratóriumból küldött 252 ESBL-termelő Enterobacteriaceae izolátumból. Az izolátumok kiválasztásakor a szempontjaink voltak: i, a legjelentősebb fajokat vizsgáljunk; ii, az ország minél több megyéjét reprezentáljuk; iii, ebben az időszakban bejelentett járványokból csak 1-1 izolátum szerepeljen a vizsgálatban. 47

48 SHV-termelő Klebsiella spp. járványtörzsek vizsgálata: 1998-ban, valamint között 126 olyan ESBL-termelő Klebsiella spp. izolátumot küldtek be az ESBL-NRL-be további vizsgálatra, melyeket 5 megyei illetve oktató kórház PIC osztályán lezajlott járványokból izoláltak. A bejelentett járványok a következőek voltak: i, PIC 1 (Fejér megye): 2002-ben egy elhúzódó járvány után (izolátumok n=35) egy évvel később egy újabb járvány ugyanazon az osztályon (n=26); ii, PIC 2 (Bács-Kiskun megye): két járvány négy év különbséggel (n=24 (1998), n=9 (2002); iii, PIC 3 (Csongrád megye): 2002-ben két hónapig tartó járvány (n=12); iv, PIC 4(Vas megye): K. oxytoca járvány (n=10); v, PIC 5 (Baranya megye): széklet hordozás halmozódása (n=8). A vizsgálatban résztvevő izolátumok 86 beteg klinikai mintáiból származtak: vér (n=17), felső légúti váladék (n=55), alsó légúti váladék (n=3), vizelet (n=18), szemváladék (n=1), fülváladék (n=1), széklet (n=18), sebváladék (n=1), katéter (n=1), köldök (n=1), endotracheális tubus (n=12). Ehhez kapcsolódóan 1998-ban PIC osztályokon izolált 142 db 3. generációs cefalosporin rezisztens E. cloacae törzset vizsgáltunk meg ESBL-termelés irányában, és hasonlítottunk össze a járványokat okozó ESBL-termelő Klebsiella spp. törzsekkel. CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek vizsgálata: 2003-ban az ESBL-NRL-be beküldött ESBL-termelő K. pneumoniae izolátumok közül 17 mutatott addig nem tapasztalt magas szintű ciprofloxacin rezisztenciát, valamint ceftazidimnél magasabb szintű cefotaxim rezisztenciát. Az izolátumok öt megye nyolc különböző kórházának felnőtt beteg ellátó osztályairól (sebészet, urológia, belgyógyászat, nefrológia) származtak, melyeket elsősorban műtéti sebváladékokból (10/17) és vizeletből (3/17) izolálták. Ezek a törzsek voltak az első CTX-M-típusú -laktamáz termelő izolátumok Magyarországon. A 2004-ben beküldött izolátumok között csak 4 volt CTX-M-termelő. Azonban a 2005-ben beérkezett 281 ESBL-termelő K. pneumoniae izolátum közül már 196 volt CTX-M-termelő és magas szinten ciprofloxacin rezisztens. Ezek az izolátumok 13 megye 35 kórházából érkeztek be az ESBL-NRL-be, és hat járványból (n=137) valamint sporadikus esetekből származtak. Elsősorban intenzív terápiás (n=82), belgyógyászati (n=34), traumatológiai (n=18), sebészeti (n=18) és urológiai (n=18) 48

49 osztályokról izolálták. Az izolátumok 36%-a vizeletből, 18%-a vérből, 15%-a sebből és 9%-a alsólégúti váladékból származott. ESBL-termelő Salmonella enterica törzsek vizsgálata: Az OEK Fágtipizálási és Molekuláris Epidemiológiai Osztályára között nem-tifoid S. enterica törzset küldtek be fágtipizálásra. Az osztályon rutinszerűen végzett korongdiffúziós antibiotikum rezisztencia vizsgálatok alapján 1690 törzs volt ampicillin rezisztens. Az ESBL-termelés további vizsgálatára ezeket a törzseket választottuk ki. ESBL-termelő E. coli törzsek vizsgálata: között 113 humán klinikai mintából izolált ESBL-termelő törzset küldtek be az ESBL-NRL-be további vizsgálatra. Ebben az időszakban nem jelentettek be ESBL-termelő E. coli okozta járványt, ezért az izolátumok sporadikus esetekből származtak. Ezek közül 21 egészségügyi intézetből származó 45 reprezentatív törzs genetikai hátterét vizsgáltuk meg. Az Országos Állategészségügyi Intézetben között diagnosztikus állati mintákból összesen 2366 E. coli törzset izoláltak, melyből 18 bizonyult ESBLtermelőnek. Ezeknek a törzseknek a genetikai hátterét hasonlítottuk össze a humán mintákból izolált törzsekkel. ESBL-termelő Enterobacteriaceae törzsek okozta járvány kivizsgálása: május 30-án és 31-én egy hazai kórház koraszülött osztályán több ápoltnál véráramfertőzésre utaló szisztémás tünetek jelentkeztek. Ennek kapcsán folytatott mikrobiológiai és epidemiológiai vizsgálatok során 8 hemokultúra és 202 szűrő és környezeti minta került feldolgozásra. A kitenyésztett 68 Enterobacteriaceae törzs további genetikai vizsgálatát végeztük el Baktériumtörzsek fenotípusos vizsgálata Törzsek identifikálása és szerotípus meghatározás A törzsek identifikálását különböző félautomata identifikáló rendszerekkel végeztük: API20E, ATB ID32E (biomerieux, Marcy l Étoile, Franciaország), Micronaut E (Genzyme Virotech GmbH, Ruesselsheim, Németország). Az E. coli törzsek szerotipizálása Orskov és Orskov módszere (Orskov és Orskov 1984), míg a S. enterica szerotipizálása a Kauffman-White séma szerinti standard módszerekkel történt 49

50 az OEK Bakteriológiai II. osztályán az OEK Savó-és Diagnosztikum Termelő Egységében előállított savókkal Antibiotikum rezisztencia vizsgálatok Szűrő vizsgálatok Az ampicillin rezisztens Salmonella enterica törzsek esetében 2 mg/l ceftazidim és 2 mg/l cefotaxim tartalmú Mueller-Hinton agaron vizsgáltuk a 3. generációs cefalosporinokkal szembeni csökkent érzékenységet. A évi kórházi járvány kivizsgálásakor a környezeti mintákból az ESBLtermelésre gyanús törzsek kitenyésztéséhez 2 mg/l cefotaxim tartalmú Mueller-Hinton agart használtunk Korongdiffúziós vizsgálatok Az antibiotikum érzékenységi vizsgálatok egy részét korongdiffúziós módszerrel végeztük a CLSI ajánlása alapján. Az ESBL-termelés megerősítésére a kromoszómálisan AmpC-t nem termelő Enterobacteriaceae törzseknél a CDM elvén alapuló ESBL SET (MAST Diagnostics, Reinfeld, Németország) kereskedelmi tesztet alkalmaztuk. A vizsgálat során ceftazidim (30μg) ceftazidim (30μg)/ klavulánsav (10μg); cefotaxim (30μg) cefotaxim (30μg)/ klavulánsav (10μg) és cefpodoxim (30μg) cefpodoxim (30μg)/ klavulánsav (10μg) tartalmú korongokat használtunk. A kromoszómális AmpC-termelő törzsek esetében (pl. E. cloacae és S. marcescens) a megerősítést módosított DDST vizsgálattal végeztük (Pitout és mtsai 2003): ennél a vizsgálatnál a Mueller-Hinton lemez közepére helyezett amoxicillin/klavulánsav (20 g/10 g) korongtól mm-re helyezzük el a ceftazidim (30 g), cefotaxim (30 g), cefepim (30 g) és aztreonam (30 g) korongokat (5. ábra/a). Ceftazidim és cefotaxim együttes alkalmazásával a különböző szubsztrát specifitású ESBL enzimek detektálása nagyobb érzékenységgel lehetséges, a cefepim használatával a módszer alkalmas a konstitutív AmpC-termelő törzsek vizsgálatára is. Pozitív esetben a cefalosporinok, illetve a monobaktám körüli gátlási zóna az amoxicillin/klavulánsav 50

51 korong felé torzul. A jobb érzékenység eléréséhez cloxacillint vagy 3-amino-fenilbórsavat is használtunk (Drieux és mtsai 2008, Coudron 2005) Minimális inhibitor koncentráció (MIC) meghatározása Az ESBL-termelő E. coli törzsek vizsgálatánál a CLSI ajánlása szerint végzett agarhigításos módszerrel határoztuk meg a törzsek ceftazidim, cefotaxim, ciprofloxacin, gentamicin és amikacin MIC értékeit. A további vizsgálatokban kiválasztott törzsek antibiotikum érzékenységi vizsgálatánál a MIC értékek meghatározását E-teszt (AB Biodisk, Solna, Svédország) módszerrel végeztük. A következő antibiotikumokat alkalmaztuk: ceftazidim ( mg/l), cefotaxim ( mg/l), cefepim ( mg/l), gentamicin ( mg/l), tobramycin, ( mg/l), amikacin ( mg/l), netilmicin ( mg/l), ciprofloxacin ( mg/l), tetraciklin ( mg/l), trimethoprim/ sulfamethoxazol ( mg/l), imipenem ( mg/l) és cefoxitin ( mg/l). Egyes vizsgálatoknál ennél kevesebb antibiotikum csoport MIC értékét határoztuk meg. ESBL-termelés megerősítéséhez ESBL E-teszt-t (cefotaxim, ceftazidim és cefepim tartalmú tesztcsíkok) is alkalmaztunk (AB Biodisk). Minden antibiotikum érzékenységi vizsgálatnál az E. coli ATCC 25922, illetve az ESBL-termelő K. pneumoniae ATCC törzset használtuk kontrollként Molekuláris vizsgálatok A leírt molekuláris genetikai vizsgálatokat általánosan használjuk az ESBL- NRL-be küldött törzsek esetében. A dolgozatban tárgyalt tanulmányoknál nem minden esetben használtuk az összes módszert Polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction PCR) Az ESBL-NRL-ben általánosan használt módszer a különböző antibiotikum rezisztencia gének kimutatására, a szekvenálni kívánt DNS szakaszok specifikus felszaporítására. A különböző antibiotikum rezisztencia gének kimutatására használt primerek listáját a 8. táblázat, az alkalmazott PCR hőprofilokat a 9. táblázat tartalmazza. 51

52 A PCR vizsgálathoz a baktériumsejtekből a DNS feltárást alkalikus lízissel végeztük. Ennek során órás tenyészetből vett 2-3 telepet szuszpendáltunk el 25 l 0,5M NaOH (Merck, Darmstadt, Németország) oldatban, majd 15 perc szobahőmérsékleten történt inkubáció után hozzáadtunk 25 ml 1M Tris-HCl (ph 8,3) (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) oldatot, és 200 l PCR tisztaságú vizet (GIBCO, Invitrogen, CA, USA). A mintát további felhasználásig -20 C-on tartottuk. A PCR reakciók összetétele, 25 l végtérfogatra számolva, a következő volt: 12,5 l 2x koncentrációjú ThermoPrime Master Mix (1,5 mm Mg 2 Cl) (Thermo Scientific, Epsom, Egyesült Királyság), 3 l DNS minta, 0,5 M végkoncentrációjú primerek (IDT Inc., Coralville, USA) (8. táblázat szerint). A PCR-t követően a termékeket 2% agaróz gélben (Agarose, Type II, Sigma) detektáltuk, és ethidium-bromiddal festettük. A gélelektroforézist 45 percig végeztük, az alábbi képlet alapján számított feszültségen: az anód és katód között mért távolság (cm) x 5 V/cm. Molekulasúly markerként 100bp-as markert (Superladder-Low 100bp Ladder, Thermo Scientific), vagy 500bp-as markert (Superladder-MID 500bp Ladder, Thermo Scientific) használtunk. Az inszerciós elemek (IS26 és ISEcp1) elhelyezkedését PCR-mapping módszerrel vizsgáltuk, melynek során az IS elemekre specifikus primereket kombináltuk a -laktamáz génekre tervezett primerekkel. Az ESBL géntípusok meghatározását, és a további antibiotikum rezisztencia gének PCR-val kapott termékeinek vizsgálatát DNS-szekvenálással végeztük el. Ehhez a legtöbb vizsgálatnál az amplifikáló primereket használtuk, a CTX-M gének kivételével. A CTX-M-I és CTX-M-II csoportba tartozó géneknél külön szekvenáló primert alkalmaztunk (8. táblázat). A szekvenciák értékeléséhez a Chromas, a ClustalX és a BioEdit Sequence Alignment Editor freeware programokat használtuk, és BLAST program ( segítségével hasonlítottuk össze a GenBank adatbázisában található szekvenciákkal. Egy CTX-M-15-termelő K. pneumoniae és egy CTX-M-5-termelő Salmonella Typhimurium esetében elvégeztük a gén genetikai környezetének vizsgálatát is. A vizsgálat során az ismert ESBL-gén szekvenciára tervezett primerekkel végeztünk direkt DNS-szekvenálást a géntől 5 és 3 irányban. 52

53 8. táblázat. A PCR vizsgálatok során használt primerpárok szekvenciái és a referenciái bla SHV Funkció Primer Oligonukleotid szekvencia (5'-3') a Referencia SHV-F 5'-CGCCGGGTTATTCTTATTTGTCGC-3' Bedenic és mtsai -laktamáz SHV-R 5'-TCTTTCCGATGCCGCCGCCAGTCA-3' (2001) bla TEM bla CTX-M CTX-M-I csoport CTX-M-II csoport I. osztályú integron ISEcp1 IS26 Ma1 aac-(6')-ib aac(3)-ii Célszekvencia OXA-1- like tet(a) tet(b) tet(c) qnra qnrb qnrs gyra parc -laktamáz -laktamáz -laktamáz -laktamáz mobilis genetikai elem inszerciós szekvencia inszerciós szekvencia CTX-M reverse általános aminoglikozid rezisztencia aminoglikozid rezisztencia -laktamáz tetraciklin rezisztencia tetraciklin rezisztencia tetraciklin rezisztencia kinolon rezisztencia kinolon rezisztencia kinolon rezisztencia topoizomeráz II topoizomeráz IV TEM-F 5'-ATGAGTATTCAACATTTCCGTG-3' Vahaboglu és mtsai TEM-R 5'-TTACCAATGCTTAATCAGTGAG-3' (2001) CTX-Mált-F 5'-TTTGCGATGTGCAGTACCAGTAA-3' Edelstein és mtsai CTX-Mált-R 5'-CGATATCGTTGGTGGTGCCATA-3' (2003) CTX-M-I-F 5'-ATGGTTAAAAAATCACTGCG-3' Baraniak és mtsai CTX-M-I-R 5'-CAGCGCTTTTGCCGTCTAAG-3' (2002a) CTX-M-II-F 5'-ATGATGACTCAGAGCATTCG-3' Chmelnitsky és CTX-M-II-R 5'-TTATTGCATCAGAAACCGTG-3' mtsai (2005) 5'CS 5'-GGCATCCAAGCAGCTTTGAC-3' Daly és Fanning 3'CS 5'-AAGCAGACTTGACCTGA-3' (2000) ISEcp1 F 5'-GCAGGTCTTTTTCTGCTCC-3' Karim és mtsai ISEcp1 R 5'-ATTTCCGCAGCACCGTTTGC-3' (2001) IS26 F 5'-AGCGGTAAATCGTGGAGTGA-3' Eckert és mtsai (2004) Ma1 5'-ACYTTACTGGTRCTGCACAT-3' Eckert és mtsai (2004) aac-(6')-ib-f 5'-CATGACTGAGCATGACCTT-3' Leflon-Guibout és aac-(6')-ib-r 5'-GAAGGGTTAGGCATCACT-3' mtsai (2004) aac(3)-ii-f 5'-CAATAACGGAGGCAATTCG-3' Leflon-Guibout és aac(3)-ii-r 5'-GATTATCATTGTCGACGG-3' mtsai (2004) OXA-1-like-F 5'-GGATAAAACCCCCAAAGGAA-3' Karisik és mtsai OXA-1-like-R 5'-TGCACCAGTTTTCCCATACA-3' (2006) tet(a)-f 5'-GTAATTCTGAGCACTGTCGC-3' Guardabassi és tet(a)-r 5'-CTGCCTGGACAACATTGCTT-3' mtsai (2000) tet(b)-f 5'-CTCAGTATTCCAAGCCTTTG-3' Guardabassi és tet(b)-r 5'-CTAAGCACTTGTCTCCTGTT-3' mtsai (2000) tet(c) -F 5'-TCTAACAATGCGCTCATCGT-3' Guardabassi és tet(c )-R 5'-GGTTGAAGGCTCTCAAGGGC-3' mtsai (2000) qnra-f 5'-TCAGCAAGAGGATTTCTCA-3' Kehrenberg és qnra-r 5'-GGCAGCACTATGACTCCCA-3' mtsai (2006) qnrb-f 5'-TCGGCTGTCAGTTCTATGATCG-3' Kehrenberg és qnrb-r 5'-TCCATGAGCAACGATGCCT-3' mtsai (2006) qnrs-f 5'-TGATCTCACCTTCACCGCTTG-3' Kehrenberg és qnrs-r 5'-GAATCAGTTCTTGCTGCCAGG-3' mtsai (2006) gyra-f 5'-CGACCTTGCGAGAGAAAT-3' Weigel és mtsai gyra-r 5'-GTTCCATCAGCCCTTCAA-3' (1998) parc-f 5'-AATGCCAGCGCCAAATTCAAAAAG-3' Gruteke és mtsai parc-r 5'-CCCCCAGTTTCCCTGACCATCC-3' (2003) a Kevert bázisok kódjai: M=A+C, R=A+G, W=A+T, S=G+C, Y=C+T, V=A+G+C, H=A+C+T, D=A+G+T, B=G+T+C, N=A+G+C+T, K=G+T 53

54 Primerek Kezdő denaturáció 9. táblázat. A PCR reakciók hőprofilja Ciklusok száma Denaturáció Anneláció Elongáció Végső elongáció Hűtés SHV-F 95 C 95 C 65 C 72 C 72 C 4 C 28 SHV-R 150 s 30 s 30 s 90 s 300 s TEM-F 95 C 95 C 50 C 72 C 72 C 4 C 28 TEM-R 150 s 30 s 30 s 90 s 300 s CTX-Mált-F 95 C 95 C 65 C 72 C 72 C 4 C 28 CTX-Mált-R 150 s 30 s 30 s 90 s 300 s CTX-M-I-F 95 C 95 C 60 C 72 C 72 C 4 C 28 CTX-M-I-R 150 s 30 s 30 s 90 s 300 s CTX-M-II-F 95 C 95 C 60 C 72 C 72 C 4 C 28 CTX-M-II-R 150 s 30 s 30 s 90 s 300 s 5'CS 95 C 95 C 55 C 72 C 72 C 4 C 28 3'CS 150 s 60 s 60 s 420 s 600 s ISEcp1 F 95 C 95 C 55 C 72 C 72 C 4 C 28 ISEcp1 R 150 s 30 s 30 s 90 s 300 s aac-(6')-ib-f 95 C 95 C 55 C 72 C 72 C 4 C 28 aac-(6')-ib-r 150 s 30 s 30 s 90 s 300 s aac(3)-ii-f 95 C 95 C 55 C 72 C 72 C 4 C 28 aac(3)-ii-r 150 s 30 s 30 s 90 s 300 s OXA-1-like-F 95 C 95 C 55 C 72 C 72 C 4 C 28 OXA-1-like-R 150 s 30 s 30 s 90 s 300 s tet(a)-f 95 C 95 C 55 C 72 C 72 C 4 C 28 tet(a)-r 150 s 30 s 30 s 90 s 300 s tet(b)-f 95 C 95 C 55 C 72 C 72 C 4 C 28 tet(b)-r 150 s 30 s 30 s 90 s 300 s tet(c) -F 95 C 95 C 55 C 72 C 72 C 4 C 28 tet(c )-R 150 s 30 s 30 s 90 s 300 s qnra-f 95 C 95 C 55 C 72 C 72 C 4 C 28 qnra-r 150 s 30 s 30 s 90 s 300 s qnrb-f 95 C 95 C 55 C 72 C 72 C 4 C 28 qnrb-r 150 s 30 s 30 s 90 s 300 s qnrs-f 95 C 95 C 55 C 72 C 72 C 4 C 28 qnrs-r 150 s 30 s 30 s 90 s 300 s gyra-f 95 C 95 C 55 C 72 C 72 C 4 C 30 gyra-r 240 s 30 s 30 s 45 s 300 s parc-f 95 C 95 C 52 C 72 C 72 C 4 C 30 parc-r 180 s 30 s 60 s 60 s 480 s 54

55 PCR-RFLP (Restrikciós fragment hossz polimorfizmus) vizsgálat A PCR-RFLP módszer során a kiválasztott DNS szakaszt amplifikáltuk PCR módszerrel, majd a kapott termékeket specifikus hasítóhellyel rendelkező restrikciós endonukleázokkal emésztettük. Az emésztett termékeket agaróz gélelektroforézissel detektáltuk a PCR-nél leírt paraméterek mellett. Gly238 Ser mutáció kimutatása SHV-típusú -laktamáz génben: A legtöbb és a legelterjedtebb SHV-típusú ESBL-génekben a 238. pozícióban a glicin helyén szerin található, melyet egy guanin adenin szubsztitúció okoz. A nukleotid szubsztitúció hatására a génben NheI restrikciós endonukleáz hasító hely keletkezik (7. ábra) (Nüesch-Inderbinen és mtsai 1996). PCR-RFLP módszerrel így elkülöníthetők a legelterjedtebb SHV-típusú ESBL gének a nem-esbl bla SHV génektől. 7. ábra NheI restrikciós endonukleáz felismerő helye és az SHV-génben található nukleotid szubsztitúciós hely Ezt a vizsgálatot rutinszerűen végeztük az ESBL-NRL-ben. A PCR termék tisztításához a Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, CA, USA) kitet használtuk. A restrikciós hasítást NheI (New England Biolabs, MA, USA) restrikciós endonukleázzal végeztük a gyártó ajánlása szerint. CTX-M-csoportok elkülönítése PCR-RFLP módszerrel: A CTX-M-típusú ESBL-gének kimutatására használt általános PCR mindegyik csoportot kimutatja (8. táblázat). Az egyes csoportokat RFLP módszerrel különítettük el, melyhez PstI (New England Biolabs) és PvuII (New England Biolabs) restrikciós endonukleázokat használtunk. Az öt CTX-M-csoport eltérő mintázatot mutat a CTX-M általános PCR termék két enzimmel történő emésztése után (Edelstein és mtsai 2003). 55

56 Escherichia coli törzsek filogenetikai csoportjának meghatározása multiplex PCR-el Az E. coli a legtöbb állat és az ember normál bélflórájának tagja. Egyes jellegzetes E. coli törzsek többféle intesztinális és extra-intesztinális fertőzést okozhatnak, mint hasmenés, húgyúti fertőzések, véráramfertőzések, újszülöttek meningitise (Orskov és Orskov 1992). Filogenetikai vizsgálatok azt mutatták, hogy az E. coli törzsek négy filogenetikai csoportba sorolhatóak (A, B1, B2, D) (Clermont és mtsai 2000). A virulens extraintesztinális kórokozó törzsek a B2 és D csoportba, míg a kommenzalista törzsek az A és B1 csoportba tartoznak (Clermont és mtsai 2000, Picard és mtsai 1999). Az ESBL-termelő E. coli törzsek filogenetikai besorolását multiplex PCR-el végeztük el (10. táblázat). A PCR reakció összeállítását Clermont és mtsai publikációja alapján végeztük (Clermont és mtsai 2000). 10. táblázat E. coli filogenetikai csoport multiplex PCR primerei Primer Oligonukleotid szekvencia (5'-3') Referencia ChuA.1 5'-GACGAACCAACGGTCAGGAT-3' ChuA.2 5'-TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3' YjaA.1 5'-TGAAGTGTCAGGAGACGCTG-3' Clermont és mtsai YjaA.2 5'-ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3' (2000) TspE4C2.1 5'-GAGTAATGTCGGGGCATTCA-3' TspE4C2.2 5'-CGCGCCAACAAAGTATTACG-3' ESBL-termelő Escherichia coli ST131 törzsek kimutatása multiplex PCR-el Az utóbbi években számos publikációban beszámoltak a CTX-M-15-termelő E. coli törzsek nemzetközi szintű, klonális terjedéséről. Az ST131 szekvencia típusba tartozó, O25 szerotípusú törzsek magas virulenciájúak, és egyre nagyobb problémát jelentenek világszerte az egészségügyi ellátásban. (Clermont és mtsai 2008, Coque és mtsai 2008b, Lau és mtsai 2008, Nicolas-Chanoine és mtsai 2008). Clermont és mtsai kidolgoztak egy ST131 specifikus PCR módszert (11. táblázat), mellyel megvizsgáltuk a hazai, ESBL-termelő O25 szerotípusú E. coli törzseink klonális hovatartozását (Clermont és mtsai 2009). 56

57 11. táblázat E. coli ST131 multiplex PCR primerei Célszekvencia Funkció Primer Oligonukleotid szekvencia (5'-3') Referencia pabb trpa ST131 specifikus belső kontroll ST131 PCRhez O25pabBspe.F 5'-TCCAGCAGGTGCTGGATCGT-3' O25pabBspe.R 5'-GCGAAATTTTTCGCCGTACTGT-3' trpa.f trpa2.r 5'-GCTACGAATCTCTGTTTGCC-3' 5'-GCAACGCGGCCTGGCGGAAG-3' Clermont és mtsai (2009) CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek kinolon rezisztenciát meghatározó régióinak (QRDR) vizsgálata A CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek magas szintű ciprofloxacin rezisztenciáját a QRDR-k DNS-szekvenálásával vizsgáltuk. A gyra és parc QRDR-ban bekövetkezett változásokat 10 kiválasztott törzsön határoztuk meg. A szekvenáláshoz a PCR-nél használt (8. táblázat) primereket használtuk (Weigel és mtsai 1998, Gruteke és mtsai 2003). Az aminosav változásokat okozó nukleotid szubsztitúciókat korábbi publikációk alapján azonosítottuk (Weigel és mtsai 1998, Gruteke és mtsai 2003) Enterobacteriaceae törzsek makrorestrikciós profiljának meghatározása PFGE módszerrel A pulzáltatott-mezejű gélelektroforézissel (PFGE) vizsgáltuk a törzsek genetikai rokonságát. Enterobacteriaceae törzsek esetében a CDC (Centers for Disease Control and Prevention) strandardizált PFGE protokollját használtuk (CDC 2000), és a vizsgálatokat Chef-DR II rendszeren végeztük el (BioRad, Kalifornia, CA, USA). Ez alól csak a salmonella volt kivétel, ahol CDC PulseNet Salmonella protokollját alkalmaztuk (Swaminathan és mtsai 2001). A géleket Fingerprinting II Informatix Software (BioRad, Ventura, CA, USA) segítségével értékeltük ki. A PFGE mintázatok hasonlóságát Dice koefficienssel jellemeztük, a cluster analízis és a dendrogram UPGMA ( unweighted pair group method with arithmetic averages ) módszerrel készült. Egy pulzotípusba (PT) tartozónak tekintettük azokat a makrorestrikciós mintázatokat, melyek legalább 85%-s hasonlóságot mutattak. Az egyes PT-ket a Tenover kritériumok alapján jelöltük betűkkel (Tenover és mtsai 1995). Az azonos PTba való tartozás a törzsek genetikai rokonságát és valószínű klonális kapcsolatát jelenti. 57

58 A PFGE vizsgálatokat az OEK Fágtipizálási és Molekuláris Epidemiológiai Osztályán végezték CTX-M-termelő Klebsiella pneumoniae törzsek szekvencia típus meghatározása MLST módszerrel A multi-lókusz szekvencia tipizálás (MLST) során a K. pneumoniae 7 háztartási génjének specifikus szakaszát hasonlítják össze DNS-szekvenálással. A különböző allél variánsok együttesen ún. szekvencia típusokat (ST) határoznak meg (12. táblázat). Az MLST vizsgálatot Diancourt és mtsai publikációja alapján végeztük (Diancourt és mtsai 2005). 12. táblázat Klebsiella pneumoniae MLST-hez használt primerei Gén Funkció Primer Oligonukleotid szekvencia (5'-3') a Referencia rpob gapa mdh phoe tonb pgi infb RNS polimeráz B b-alegység Glicerinaldehid- 3-foszfát dehidrogenáz Foszforin E Periplazmatikus energia transzducer Almasavdehidrogenáz Foszfoglükózizomeráz Transzláció iniciáló faktor 2 rpob-f rpob-r gapa-f gapa-r mdh-f mdh-r phoe-f phoe-r tonb-1f tonb-2r pgi-f pgi-r infb-f infb-r 5'-GGCGAAATGGCWGAGAACCA-3' 5'-GAGTCTTCGAAGTTGTAACC-3' 5'-TGAAATATGACTCCACTCACGG-3' 5'-CTTCAGAAGCGGCTTTGATGGCTT-3' 5'-CCCAACTCGCTTCAGGTTCAG-3' 5'-CCGTTTTTCCCCAGCAGCAG-3' 5'-ACCTACCGCAACACCGACTTCTTCGG-3' 5'-TGATCAGAACTGGTAGGTGAT-3' 5'-CTTTATACCTCGGTACATCAGGTT-3' 5'-ATTCGCCGGCTGRGCRGAGAG-3' 5'-GAGAAAAACCTGCCTGTACTGCTGGC-3' 5'-CGCGCCACGCTTTATAGCGGTTAAT-3' 5'-CTCGCTGCTGGACTATATTCG-3' 5'-CGCTTTCAGCTCAAGAACTTC-3' Diancourt és mtsai (2005) a Kevert bázisok kódjai: M=A+C, R=A+G, W=A+T, S=G+C, Y=C+T, V=A+G+C, H=A+C+T, D=A+G+T, B=G+T+C, N=A+G+C+T, K=G+T Habár a PFGE vizsgálat jó eszköz a baktérium izolátumok epidemiológiai tipizálására, azonban általában nem alkalmas a térben és időben nem-összefüggő izolátumok összehasonlítására. Ezzel ellentétben, az MLST módszer, mely a háztartási gének genetikai változatosságán alapul, jól alkalmazható időben és térben hosszabb 58

59 távot felölelő epidemiológiai összehasonlító vizsgálatok elvégzésére (Maiden és mtsai 1998) Plazmid profil analízis, konjugációs és elektroporációs kísérletek A plazmid DNS kivonását és a vertikális gélelektroforézist Kado és Liu módszerével végezték az OEK Fágtipizálási és Molekuláris Epidemiológiai Osztályán (Kado és Liu 1981). Molekulasúly markerként az E. coli 517 törzset használták (Macrina és mtsai 1978). Az ESBL-gének átvihetőségét recipiens törzsbe konjugációs kísérletekkel vizsgáltuk. A vizsgálat során 4 ml táplevesben (OEK, Táptalajkészítő Egység) 0,5 McFarland sűrűségű szuszpenziót készítettünk az E. coli K12 J5-3 Rif törzsből. A donor törzsből is 0,5 McFarland sűrűségű szuszpenziót készítettünk 2 mg/l cefotaxim vagy ceftazidim tartalmú táplevesben. 37 C-on rázatva inkubáltuk, amíg a szuszpenziók sűrűsége elérte a 3 McFarlandot. Centrifugáltuk 3000 rpm-en 5 percig a recipiens teljes térfogatát, a donor szuszpenzióból pedig 1 ml-t. Majd átmértük a recipiens pelletét a donor pelletéhez, és szuszpendáltuk. Felengedtük 1 ml táplevessel és egy éjszakán át növesztettük C-on, rázatás nélkül. Másnap szelektív táptalajra (cefotaxim 4 mg/l és rifampicin 300 mg/l) kikentünk 50 µl-t, és a kinőtt telepeket vizsgáltuk tovább. Azoknál a donor törzseknél, amelyek rezisztensebbek voltak ceftazidimmel szemben, mint cefotaximmal szemben, ceftazidimet is használtunk antibiotikumként, az előzőekkel megegyező arányokban. Abban az esetben, ha egy vizsgált törzsnél a konjugációs kísérletek negatív eredménnyel zárultak, elektroporációval próbáltuk DH5- E. coli recipens törzsbe átvinni az ESBL-gént kódoló mobilis genetikai elemet. Az elektroporációt Gene Pulser Xcell elektroporátor rendszerrel (BioRad) végeztük. A recipiens sejtek előkészítését és a vizsgálatot a Gene Pusler Xcell E. coli-ra vonatkozó ajánlása szerint végeztük. Az elektroporánsokat cefotaxim 2 mg/l vagy ceftazidim 2 mg/l tartalmú táptalajon növesztettük. 59

60 Ha a konjugációs vagy elektroporációs kísérletek pozitív eredménnyel zárultak, akkor vizsgálatonként telepből plazmid profil analízist végeztük Kado és Liu módszerével. Azokat a transzkonjugánsokat (TK)/ elektroporánsokat (EP) vizsgáltuk tovább, melybe csak egy plazmid került át. A TK/EP törzsekből QIAprep Spin Miniprep Kit-tel (Qiagen, Hilden, Németország) nyertük ki a plazmid DNS-t. Ezután plazmid-rflp vizsgálatot végeztünk: PstI (New England BioLabs) enzimes emésztés után 0,7%-s agaróz gélben (SIGMA) futtattuk 5V/cm feszültségen 90 percig. A plazmid-rflp során kapott restrikciós mintázatokat szemmel értékeltük ki és hasonlítottuk össze. 60

61 T107 T111 T112 T823 T886 T890 T991 T1047 T107 T111 T112 T823 T886 T890 T991 T EREDMÉNYEK 6.1. SHV-típusú kiterjedt-spektrumú -laktamázok elterjedtsége és földrajzi megoszlása Magyarországon, január és augusztusa között 25 hazai mikrobiológiai laboratórium 252 ESBL-termelő Enterobacteriaceae izolátumot küldött be megerősítésre és további vizsgálatokra az ESBL-NRL-be. A beküldött törzsek túlnyomó többsége a Klebsiella genusba tartozott (K. pneumoniae (65,9%), K. oxytoca (12,7%). A törzskollekcióban megtalálható további fajok: E. coli (11,5%), E. cloacae (5,2%), S. marcescens (2,8%), C. freundii (1,2%), és 1-1 Serratia liquefaciens és E. aerogenes. Az izolátumok 92,1%- a hordozott olyan SHV-típusú géneket, melyeket az NheI restrikciós endonukleáz elhasított (8. ábra) M M 1000bp 900 bp 800bp 700 bp 600bp 500bp 400bp 300bp 200bp 100bp SHV PCR SHV RFLP 8. ábra SHV és SHV PCR-RFLP pozitív eredmények (M: molekulasúly marker, 100bp) Az SHV-típusú ESBL-géneket hordozó izolátumok közül 35-t választottunk ki további vizsgálatokhoz, melyek 14 megyéből és Budapestről származtak (megyénként 1-3 törzs). Két K. pneumoniae izolátum kivételével a vizsgálat idejében lezajlott minden járványból csak egy-egy törzset tartalmazott a kollekció. A kiválasztott izolátumok a következők voltak: K. pneumoniae (n=21), K. oxytoca (n=6), S. marcescens (n=3), E. coli (n=3) és E. cloacae (n=2). Mind a 35 törzs esetében meghatároztuk az SHV gén 61

62 típusát DNS-szekvenálással. A SHV-gének típusai, az izolátumok földrajzi megoszlása és a vizsgált antibiotikumok MIC értékei a 13. táblázatban és a 9. ábrán láthatóak. Két domináns ESBL-típust azonosítottunk: 28 törzsben a SHV-5 típust, 6 törzsben pedig a SHV-2a típust. Továbbá egy E. cloacae törzs SHV-12 gént hordozott. Mindegyik SHV-5-termelő és az SHV-12-termelő törzs ceftazidimmel szemben magasabb szintű rezisztenciát mutatott, mint cefotaximmal szemben, az SHV-2a termelő törzseknél ez fordítva volt. Korondiffúziós vizsgálat alapján minden törzs érzékeny volt ciprofloxacinra. 9. ábra SHV-típusú ESBL gének földrajzi megoszlása Magyarországon ban A kórház helyzete, ahol az ESBL-termelő korokozót izolálták 62

63 13. táblázat A 35 SHV-típusú ESBL-termelő törzs izolálásának helye, a minta típusa és Törzs száma antibiotikum érzékenysége Megye Faj Minta a Osztály ESBLtípus MIC (mg/l) b CAZ CTX AMC GEN NET AK 42 Bács K. pneumoniae HK Újszülött SHV Bács K. pneumoniae Seb Sebészet SHV-2a Bács K. pneumoniae FL PIC SHV-2a Baranya K. pneumoniae Széklet Gyermek SHV Borsod-Abaú j- K. pneumoniae HK Gyermek SHV-5 Zemplén Borsod-Abaú j- Zemplén K. oxytoca HK Gyermek SHV Budapest E. coli CSF Gyermek SHV-5 NM NM NM NM NM NM 201 Budapest K. pneumoniae HK Gyermek SHV Csongrád K. pneumoniae Vizelet Gyermek SHV-2a Csongrád K. pneumoniae Vizelet Gyermek SHV Csongrád K. pneumoniae Seb Újszülött SHV-2a Csongrád S. marcescens Egyéb Újszülött SHV Fejér K. pneumoniae FL PIC SHV Fejér K. pneumoniae FL PIC SHV Fejér K. pneumoniae FL PIC SHV Fejér K. pneumoniae FL PIC SHV Fejér K. pneumoniae FL PIC SHV Fejér K. pneumoniae HK PIC SHV Hajdú E. cloacae FL Sebészet SHV Heves K. pneumoniae Vizelet Újszülött SHV Heves K. oxytoca Egyéb Gyermek SHV Jász-Nagykun- S. marcescens Seb Sebészet SHV-5 Szolnok Jász-Nagykun- Szolnok 321 Jász-Nagykun- Szolnok K. oxytoca Seb ITO SHV-5 K. pneumoniae Vagina Gyermek SHV Komárom K. pneumoniae HK ITO SHV Pest K. oxytoca Vizelet Háziorvos SHV Somogy E. cloacae HK ITO SHV Somogy K. pneumoniae Vizelet Fertőző SHV Szabolcs- E. coli Vizelet Gyermek SHV-2a Szatmár-Bereg Szabolcs- Szatmár-Bereg K. pneumoniae Vizelet Fertőző SHV-2a Vas K. oxytoca AL PIC SHV Vas K. oxytoca Vizelet Újszülött SHV Vas K. pneumoniae AL ITO SHV Zala E. coli Vizelet PIC SHV Zala S. marcescens AL PIC SHV a HK, hemokultúra; CSF, cerebrospinális folyadék; FL, felsőlégúti; AL, alsólégúti; ITO, intenzív terápiás osztály; PIC, perinatális intenzív osztály; b CAZ, ceftazidim; CTX, cefotaxim; AMC, amoxicillin/klavulánsav; GEN, gentamicin; NET, netilmicin; AK, amikacin; NM, nincs meghatározva 63

64 6.2. Perinatális intenzív centrumokban járványokat okozó SHV-típusú ESBL-termelő Klebsiella spp. törzsek vizsgálata között a hazai PIC osztályokon a legtöbb járványt Klebsiella spp. okozta (19/25, OEK-be bejelentett járványok alapján). Ezek közül hétben ESBLtermelő törzsek voltak a kórokozók. Az érintett 5 PIC osztályról származó (10. ábra) 126 törzs fenotípusos és molekuláris vizsgálatait végeztük el (14. táblázat). Mindegyik törzs SHV-típusú ESBL-gént hordozott az NheI enzimmel történt PCR-RFLP vizsgálat alapján. Az összes izolátum rezisztens volt ceftazidimmel és cefotaximmal szemben, 74% netilmicinnel és 71% trimethoprim/sulfamethoxazollal szemben is rezisztensnek bizonyult, azonban ciprofloxacin rezisztens törzset nem izoláltak a járványok során. Az azonos PIC-okban azonos járványidőszakban izolált törzsek sem mutattak teljesen egyforma antibiotikum rezisztencia mintázatot (14. táblázat). 10. ábra ESBL-termelő Klebsiella spp. okozta járványok Magyarországon, (Az OEK-be bejelentett járványok). NICU=PIC 64

65 14. táblázat SHV-termelő Klebsiella spp. okozta járványok helye és időtartama, a résztvevő izolátumok plazmid profilja, antibiogramja és pulzotípusa Faj/származás Izolálás hónapja (járvány időtartama Plazmid profil (kb) (n) Antibiogram b CAZ CTX FEP NET SXT CIP Pulzotípus K. pneumoniae, PIC júniusjúlius 181, 94, 80 (9) a2 R R É R É É E (Fejér megye) 203, 94 (2) R R É R É É E 181, 94 (3) a2 R R É R É É E 181, 94, 50 (8) R R É R É É D 181, 94 (4) a1 R R É R É É D 203, 94 (3) R R É R É É D 112 (1) R R É É É É K 217, 58 (1) R R R R R É L november 181, 94 (4) a1 R R É R É É E 203, 94 (2) R R É R É É E július 94, 2.7 (26) a3 R R É R R É J K. pneumoniae, PIC 2 (Bács-Kiskun county) július 137, 94 (9) a3 R R É R R É F szeptember 94, 2.2 (24) a2 R R É É R É G K. pneumoniae, PIC 3 (Csongrád county) novemberdecember 162, 94 (3) a2 R R É É R É C 203, 94 (1) R R É R R É C1 94, 50, 5.4, 4.3, 3.7, 2.3 (1) R R É R R É B2 116, 18 (2) R R É É R É A 228, 94, 5.5 (1) 228, 94, 5.5, 5.2, 2.9 (2) R R É R R É B R R R R R É B 94, 5.5 (1) R R R É R É B1 228, 130, 94, 4.6 (1) R R R É É É C2 K. oxytoca, PIC április 94, 6.0 (10) a1 R R É R R É I (Vas megye) K. pneumoniae, PIC július 170, 94 (1) R R É R R É (Baranya county) 94 (7) R R É R R É CAZ, ceftazidim; CTX, cefotaxim; FEP, cefepim; NET, netilmicin; SXT, trimethoprim/sulfamethoxazol; CIP, ciprofloxacin. a1,2,3 Hemokultúrából származó törzsek száma b Antibiogram:Korongdiffúziós vizsgálat eredménye ( É, érzékeny; R, rezisztens) H 65

66 A PFGE vizsgálat alapján a 126 törzs 12 különböző PT-ba tartozott (14. táblázat, 11. ábra). A cluster analízis azt mutatta, hogy 5 különböző kórház PIC osztályán a hét járványt 10 különböző klón okozta. Izolátum Pulzotípus Származás Minta ESBL-típus PIC 1 PIC 1 PIC 1 PIC 3 PIC 1 PIC1 PIC 1 PIC 4 PIC 4 PIC 2 PIC 2 PIC 5 PIC 2 PIC 2 PIC 3 PIC 3 PIC 3 vér vér torok vizelet vér torok torok katéter vér vér vér széklet vér torok vér seb vizelet 11. ábra ESBL-termelő K. pneumoniae és K. oxytoca izolátumok makrorestrikciós profiljának cluster analízise A további vizsgálatokhoz 13 törzset választottunk ki további vizsgálatokra a faj, az antibiogram, a pulzotípus, a plazmid tartalom, az izolálás éve és a kórházi osztály figyelembevételével. Nyolc K. pneumoniae és 2 K. oxytoca törzs hordozott SHV-5 gént, három K. pneumoniae törzs hordozott SHV-2a-t, és mindegyik esetében a gén átvihető volt konjugációval a recipiens törzsbe. Mindegyik SHV géntől 5 irányban IS26 inszerciós elemet mutattunk ki PCR módszerrel. A TK-k cefalosporin és aminoglikozid MIC értékei legalább 5 hígítási fokkal a recipiens törzs MIC értékei felett voltak (15. táblázat). 10 K. pneumoniae és 2 K. oxytoca törzsnél a TK-okba egy kb. 90 kb nagyságú plazmid jutott át, egy K. pneumoniae törzsnél (K70/02) az átjutott plazmid mérete kb. 120 kb volt. Utóbbi törzs TK-ából a bla SHV gén mellett bla TEM-1 gént is kimutattunk. A plazmid RFLP vizsgálatot PstI enzimmel végeztük el. Nagyon hasonló vagy azonos emésztési mintázat volt látható az összes bla SHV-5 gént hordozó plazmidnál. Továbbá két bla SHV-2a plazmidot hordozó plazmid is (TK105/98, PIC2, 1998; TK75/02, PIC3, 2002) teljesen azonos emésztési mintázatot mutatott egymással (12. ábra). 66

67 M M 12. ábra Transzkonjugánsokból izolált plazmidok PstI emésztési mintázata. M, molekulasúly marker; Futtatási sorrend: 1. TK36/02 (pulzotípus D, SHV-5, PIC 1); 2. TK39/02 (pulzotípus E, SHV-5, PIC 1) 3. TK85/02 (pulzotípus E, SHV-5, PIC 1) 4. TK109/03 (pulzotípus J, SHV-5, PIC 1) 5. TK26/02 (pulzotípus F, SHV-5, PIC 2) 6. TK71/02 (pulzotípus B, SHV-5, PIC 3) 7. TK2/03 (pulzotípus I, SHV-5, PIC 4) 8. TK5/03 (pulzotípus I, SHV-5, PIC 4) 9. TK20/03 (pulzotípus H, SHV-5, PIC 5) 10. TC105/98 (pulzotípus G, SHV- 2a, PIC 2) 11. TC70/02 (pulzotípus A, SHV-2a, PIC 3) 12. TC75/02 (pulzotípus C, SHV-2a, PIC 3) Ehhez a tanulmányhoz kapcsolódóan vizsgáltunk meg egy 3. generációs cefalosporin rezisztens E. cloacae törzskollekciót (n=142). A kollekcióban lévő törzseket 1998-ban izolálták az ország különböző PIC osztályairól. A törzsek közül hét bizonyult SHV-típusú ESBL-termelőnek, melyeket április-májusban izoláltak egy PIC osztályról. Mindegyik törzs egy kb. 90 kb nagyságú konjugatív plazmidon hordozta a bla SHV-2a gént, és emésztési mintázatuk megegyezett az 1998-ban izolált bla SHV-2a - hordozó plazmidéval. A PFGE vizsgálat alapján a hét törzs azonos PT-ba tartozott. 67

68 15. táblázat Reprezentatív ESBL-termelő K. pneumoniae és K. oxytoca izolátumok és azok transzkonjugánsainak jellemzői Törzs száma/ Izolálás éve Származás/Minta a Plazmid profil (kb) Pulzotípus SHV-típus MIC (mg/l) CAZ CTX CRO FEP FOX IMP AMC GEN TOB NET AMK CIP K36/02 I/T 181, 94, 50 D SHV TK36/ NM NM K39/02 I/T 181, 94, 80 E SHV TK39/ NM NM K41/02 I/T 181, 94, 80 E SHV TK41/ NM NM K85/02 I/T 181, 94 E1 SHV TK85/ NM NM K109/03 I/HK 94, 2.7 J SHV TK109/ NM K26/02 II/HK 137, 94 F SHV TK26/ NM NM ,006 K105/98 II/T 94 G SHV-2a TK105/ NM NM K70/02 III/V 116, 18 A SHV-2a TK70/ NM NM K71/02 III/V 228, 94, B SHV , 5.2, 2.9 TK71/ NM NM K75/02 III/S 162, 94 C SHV-2a TK75/ NM NM K20/03 V/Sz 170, 94 H SHV TK20/ NM NM K2/03 IV/K 94, 6.0 I SHV TK2/ NM NM K5/03 IV/V 94, 6.0 I SHV TK5/ NM NM J ATCC SHV NM MIC, minimális inhibitor koncentráció; CAZ, ceftazidim; CTX, cefotaxim; CRO, ceftriaxon; FEP, cefepim; FOX, cefoxitin; IPM, imipenem; AMC, amoxicillin/klavulánsav; GEN, gentamicin; TOB, tobramycin; NET, netilmicin; AMK, amikacin; CIP, ciprofloxacin; NM, Nem vizsgált. a Származás: I = PIC 1; II = PIC 2; III = PIC 3; IV = PIC 4; V = PIC 5. Minta: T = torok; HK = hemokultúra; V = vizelet; S = seb; Sz = széklet; K = katéter. 68

69 6.3. CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek vizsgálata 2003-ban érkeztek be először az ESBL-NRL-be magas szinten ciprofloxacin rezisztens, ESBL-termelő K. pneumoniae izolátumok megerősítő vizsgálatra. Mind a 17 izolátum bla CTX-M-15 ESBL-gént hordozott. Az antibiotikum rezisztencia alapján a törzsek magas szintű cefotaxim, tetraciklin, ciprofloxacin és egy kivételével (K16/03) gentamicin rezisztenciát mutattak. Mérsékeltebb szintű volt a rezisztenciájuk ceftazidimmel, amoxicillin/klavulánsavval és cefepimmel szemben (16. táblázat). A TK-okba egy nagyméretű, kb. 140 kb nagyságú plazmid jutott át, mely hordozta a CTX- M-15 kódoló gént, valamint a gentamicin érzékeny törzs kivételével az aac(3)-iia aminoglikozid rezisztencia gént is. PstI enzimmel végzett plazmid RFLP nagyon hasonló mintázatot adott mindegyik plazmidnál. Az ISEcp1 inszerciós elem meglétét PCR mapping módszerrel vizsgáltuk, és mindegyik TK-nál negatív eredményt kaptunk. Ezért egy kiválasztott törzsnél meghatároztuk a bla CTX-M-15 gén genetikai környezetét a plazmid direkt szekvenálásával (13. ábra). A megszekvenált 3389 bázis hosszúságú plazmidrész a bla CTX-M-15 gén kódoló régiójától 5 irányban 924 bázis, és 3 irányban 1589 bázis nagyságú szakaszt foglalt magába. A bla CTX-M-15 géntől 5 irányban két különböző inszerciós elem szekvenciáit is megtaláltuk. Az IS26 elem transzpozázt kódoló génje után (tnpa IS26) az ISEcp1 3 nem-kódoló régiójára jellemző elemek következtek: a -35 és -10 szignálok a bla CTX-M-15 géntől 153 és 129 bázis távolságban, míg az ISEcp1 IR-R szekvenciája 76 bázis távolságban. A -35 és -10 szignálok az ISEcp1 biztosította promóter régiót, míg az IR-R a genetikai elem inszerciójának 3 felismerő helyét jelöli. A bla CTX-M-15 géntől 3 irányban egy ISEcp1 elem lehetséges IR- R szekvenciáját és egy valószínűsíthetően ISEcp1 transzpozáz gén részleges szekvenciáját azonosítottuk (tnpa). A PFGE vizsgálatok alapján a 17 törzs makrorestrikciós profiljai 89%-os hasonlósági szinten mutattak klonális kapcsolatot, és az N PT-ba tartoztak (HEC- Hungarian Epidemic Clone). Összehasonlít egyértelműen különböztek a korábban leírt SHV-típusú ESBL-termelő K. pneumoniae törzsektől. 69

70 IS26 IR-R ISEcp1 IR-R Lehetséges IR-R tnpa IS26 bla CTX-M-15 tnpa bp 13. ábra bla CTX-M-15 gén genetikai környezete K. pneumoniae HEC törzsben (GenBank: EU ) 70

71 16. táblázat CTX-M-15-termelő K. pneumoniae (K) izolátumok és a transzkonjugánsok (TK) jellemzői Izolátum Kórház elhelyezkedése Izolálás dátuma Kórházi osztály b Minta Pulzotípus MIC (mg/l) a CTX CAZ AMC FEP FOX IMP GEN AMK TET CIP K34/03 Pest megye ITO Hasűri váladék N TK34/ K46/03 Pest megye Sebészet Seb N1 K54/03 Pest megye Sebészet Seb N TK54/ K55/03 Pest megye Sebészet Seb N1 K83/03 Pest megye Sebészet Seb N1 K85/03 Nógrád megye Sebészet Seb N1 K86/03 Nógrád megye ITO Hasűri váladék N TK86/ K168/03 Nógrád megye Sebészet Seb N1 K171/03 Budapest I Urológia Vizelet N TK171/ K153/03 Budapest I Traumatológia Orrváladék N2 K154/03 Budapest I Nefrológia Vizelet N TK154/ K158/03 Budapest II Sebészet Seb N TK158/ K233/03 Tolna megye I Belgyógyászat Vizelet N TK233/ K152/03 Pest megye Sebészet Seb N1 K150/03 Budapest III Belgyógyászat Vér N TK150/ K165/03 Baranya megye Sebészet Seb N TK165/ K262/03 Tolna megye II Sebészet Seb N TK262/ J NM ATCC NM NM a CTX: cefotaxim, CAZ: ceftazidim, AMC: amoxicillin/klavulánsav, FEP: cefepim, FOX: cefoxitin, IMP: imipenem, GEN: gentamicin, AMK: amikacin, TET: Tetraciklin, CIP: ciprofloxacin. b ITO: intenzív terápiás osztály 71

72 A magas szintű multirezisztenciát mutató új klón megjelenése után folyamatosan figyeltük a CTX-M-termelő K. pneumoniae előfordulását az ESBL-NRL-be beküldött izolátumok között ben csak 4 ilyen izolátum érkezett megerősítésre, azonban 2005-ben a CTX-M-15 termelő, ciprofloxacin rezisztens K. pneumoniae izolátumok számának robbanásszerű növekedését tapasztaltuk. Köszönhető volt ez annak is, hogy ebben az évben 6 nozokómiális járványt okoztak. A beérkezett és megvizsgált 196 CTX-M-15 termelő, ciprofloxacin rezisztens K. pneumoniae izolátum 13 megye 35 kórházából származott (14. ábra). A 196 izolátum mindegyike hordozta a bla SHV, bla OXA és bla CTX-M géneket. 21 izolátum bla TEM pozitívnak is bizonyult. Az összes izolátum magas szintű rezisztenciát mutatott ceftazidimmel, cefotaximmal és ciprofloxacinnal szemben, valamint a törzsek 76%-a gentamicinnel, 72%-a tetraciklinnel szemben volt in vitro rezisztens. A PFGE vizsgálat 3 PT-ra különítette el a 196 izolátumot: az N PT-ba (HEC) 129 törzs, R PT-ba 46 törzs, míg az S PT-ba 21 törzs tartozott (15. ábra). A plazmid profil analízis alapján a törzsek 2 kb-230 kb közötti, különböző méretű és számú plazmidot hordoztak. Az N PT-ra (HEC) két különböző nagyméretű plazmid volt jellemző: az FJ2 centrumban lezajlott járványból származó 45 izolátum mindegyike egy kb. 140 kb nagyságú plazmidot hordozott, hasonlóan a 2003-ban izolált HEC törzshöz, míg a BP18 centrumból származó 15 izolátumra és a BR1-ből származó 10 izolátumra egy kb. 90 kb nagyságú plazmid volt jellemző. Az R PT-ba tartozó izolátumokra szintén egy kb. 90 kb nagyságú plazmid, míg az S PT-ba tartozó izolátumokra egy 50 kb nagyságú plazmid volt jellemző. 19 izolátumot választottunk ki további vizsgálatokra: 3 HEC izolátumot a 140 kb plazmiddal, 9 HEC izolátumot a 90 kb plazmiddal, 4 R PT-ú és 3 S PT-ú izolátumot. Az S PT izolátumokból származó 50 kb nagyságú plazmidon kívül mindegyik konjugálható volt E. coli J53 recipiens törzsbe. A negatív eredménnyel zárult konjugációs kísérlet után az 50kb plazmidot elektroporációval jutattuk be az E. coli DH5 recipiens törzsbe. Az egyes PT-ból származó plazmidok restrikciós mintázata azonos vagy nagyon hasonló volt egymáshoz a PT-n belül, azonban különböztek a többi PT-ba tartozó törzsek ESBL-gént hordozó plazmidjától (16. ábra). 72

73 A TK- és EP-okban a cefotaxim és a tetraciklin MIC értékek hasonlóak voltak, mint a donor törzsekben, a ciprofloxacin MIC értéke pedig enyhe emelkedést mutatott a recipiens törzsekhez képest (17. táblázat). Mind a három PT-ból származó plazmid hordozta a bla CTX-M-15, bla OXA-1, aac(6 )-Ib-cr és aac(3)-iia géneket. Utóbbi hiányzott a gentamicin érzékeny HEC izolátumokból létrehozott TK-knál. Kizárólag a S PT-hoz tartózó izolátumok 50 kb plazmidja hordozta a bla TEM-1 -laktamáz gént is és csak itt lehetett ISEcp1 elemet kimutatni a bla CTX-M-15 géntől 5 irányban. A HEC izolátumokból származó összes TK-ban kimutatható volt a tet(a) és a tet(c) tetraciklin rezisztenciát okozó gén is. A magas szintű kinolon rezisztencia vizsgálatához 10 kiválasztott eredeti izolátum gyra és parc QRDR-ét szekvenáltuk meg. A HEC és az S PT törzsek GyrA QRDR-ében két aminosav cserét (Ser83Phe és Asp87Ala), valamint a ParC-ben egy aminosavcserét (Ser80Ile) mutattunk ki. Az R PT-ba tartozó izolátumoknál mindkét génnél egy-egy aminosavszintű változást okozó mutációt határoztunk meg (GyrA Ser83Ile, ParC Ser80Ile). A kiegészítő kinolon rezisztenciát okozó gének közül qnr gének (qnra, qnrb és qnrs) nem voltak az izolátumokban, azonban az aac(6 )-Ib-cr mindegyik vizsgált plazmidon megtalálható volt. Az MLST vizsgálatokat 10 izolátumon és a 2003-ban izolált HEC törzs prototípusán végeztük el. Három különböző szekvencia típusba tartozott a három vizsgált PT: HEC (N PT) a ST15 (allélprofil: ), a S PT a ST11 (allél profil: ), a R PT pedig a ST147 (allél profil: ). 73

74 14. ábra A 35 érintett egészségügyi intézmény elhelyezkedése Magyarországon. Zárójelben az egyes centrumokban azonosított pulzotípusok. 74

75 15. ábra. A 35 centrumból származó 196 K. pneumoniae törzs makrorestrikciós profiljának cluster analízise. * HEC prototípusa 2003-ból. ** FJ2-ben lezajlott járványból származó törzsek (2005. április és október). *** B18 centrumban lezajlott járványból származó törzsek (2005. áprilisból ás augusztusból) Törzs szám Pulzotípus/ST Centrum/ izolátumok száma 75