A plazmamembrán típusú Ca 2+ ATPáz intramolekuláris kölcsönhatásainak vizsgálata

Átírás

1 A plazmamembrán típusú Ca 2+ ATPáz intramolekuláris kölcsönhatásainak vizsgálata Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Padányi Rita Témavezetok: Dr. Enyedi Ágnes Dr. Sarkadi Balázs Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola Pathobiokémia program Készült az Ors zágos Gyógyintézeti Központ Hematológiai és Immunológiai Intézetének Molekuláris Sejtbiológia Osztályán. Budapest, 2003.

2 A doktori (Ph.D.) értekezés alapjául szolgáló kísérletek 1998 és 2002 között az Országos Gyógyintézeti Központ Haematológiai és Immunológiai Intézet, Dr. Sarkadi Balázs egyetemi tanár vezette Molekuláris Sejtbiológia Osztályán készültek, Dr. Enyedi Ágnes tudományos fomunkatárs közvetlen irányítása alatt.

3 7. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK 1. ÖSSZEFOGLALÁS A dolgozat alapjául szolgáló közlemények: Padányi R., Pászty K., Penheiter,A.R., Filoteo,A.G., Penniston,J.T., Enyedi Á.: Intramolecular interactions of the regulatory region with the catalytic core in the plasma membrane calcium pump. Journal of Biological Chemistry, 2003, Vol. 278, No. 37, Issue of September 12, pp Pászty K., Penheiter,A.R., Verma,A.K., Padányi R., Filoteo,A.G., Penniston,J.T., Enyedi Á.: Asp 1080 upstream of the calmodulin-binding domain is critical for autoinhibition of hpmca4b. Journal of Biological Chemistry, 2002, Vol. 277, No. 39, Issue of September 27, pp Egyéb közlemények: Pászty K., Verma,A.K., Padányi R., Filoteo,A.G., Penniston,J.T., Enyedi Á.: Plasma membrane Ca 2+ ATPase isoform 4b is cleaved and activated by caspase-3 during the early phase of apoptosis. Journal of Biological Chemistry 2002, Vol. 277, No. 9, Issue of March 1, pp Eloadások: Padányi R., Pászty K., Lór K., Verma,A.K., Penniston,J.T., Enyedi Á.: Phosphorylation of the plasma membrane calcium pump isoform 4b with PKC prevents proteolysis by calpain, European Calcium Society VI. European Symposium, Franciaország, Párizs, absztrakt 51.o.(2000) Élo sejtek számára létfontosságú az alacsony intracelluláris Ca 2+ koncentráció biztosítása. Ebben játszik kulcsszerepet a plazmamembrán típusú Ca 2+ ATPáz (PMCA), amely ATP hidrolízis energiájának terhére Ca 2+ ionokat pumpál a citoszolból az extracelluláris térbe. A PMCA C-terminális regulátor régiója tartalmaz egy kalmodulin-köto szekvenciát, amely nyugvó sejtben kölcsönhatásba lép az enzim katalitikus centrumával, és gátolja az enzim aktivitását. Aktivált sejtben a Ca 2+ -kalmodulin komplex kötodik a kalmodulin-köto szekvenciához, aminek hatására a katalitikus régió felszabadul a belso gátlás alól, a pumpa aktiválódik. Az aktiválódás során bekövetkezo szerkezeti változásokon kívül, az enzimciklus közben is folyamatosan változik a pumpa konformációja a nagy Ca 2+ -affinitású (E1) és a kis Ca 2+ -affinitású (E2) állapotok között. Limitált proteolízissel és pontmutációk segítségével tanulmányoztuk a PMCA4b C-terminális régiójának és katalitikus centrumának kölcsönhatásait. Három különbözo proteázt választottunk, amelyek a C- terminális régióban a kalmodulin-köto szekvenciától N-terminális (kaszpáz- 3) illetve C-terminális (kimotripszin, kalpain) irányban hasítják a pumpát. Mindhárom proteáz esetében azt tapasztaltuk, hogy a fehérje konformációjától függoen változott a fragmentképzodés intenzitása. Inaktív fehérje esetében, amennyiben az enzim konformációja E2 állapot felé tolódik (Ca 2+ hiányában), alig képzodött fragment, mivel a szoros intramolekuláris kölcsönhatás miatt a proteázok kevéssé férnek hozzá a hasítási helyekhez. Inaktív szerkezetu, de E1 konformációjú fehérje esetében (Ca 2+ jelenlétében) valamivel nagyobb mértéku fragmentációt detektáltunk. Ez arra utal, hogy ebben az esetben a C-terminális régió lazábban kapcsolódik a katalitikus centrumhoz. A leggyengébb intramolekuláris kölcsönhatást bizonyító,

4 legintenzívebb degradációt a Ca 2+ -kalmodulin komplexet kötött, aktív szerkezetu fehérje esetében figyeltünk meg. Kísérleteink alapján a C- terminális régió szerkezeti változásai a kalmodulin-köto szekvenciától N- terminális és C-terminális irányba is kiterjednek a pumpa muködése során. Ezzel ellentétben, amennyiben az triptofánt (Trp 1093, a kalmodulin-köto szekvencia egyik fontos eleme) alaninra cseréltük, csak a kalmodulin-köto szekvencián belül található hasítási helyek lettek hozzáférhetobbek a proteázok számára. Kimutattuk továbbá, hogy az aszparaginsav (Asp 1080, emellett hasít a kaszpáz-3), bár a kalmodulin-köto szekvencián kívül helyezkedik el, jelentosen hozzájárul az inaktív szerkezet stabilizálásához. 6. EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA Különbözo konformációs állapotokban vizsgáltuk a hpmca4b izoforma intramolekuláris kölcsönhatásait a fehérje C-terminális régiójában ható proteázok (kalpain, kimotripszin, kaszpáz-3) segítségével. Eredményeink szerint Ca 2+ és kalmodulin hiányában (inaktív szerkezet, a katalitikus centrum E2 konformációjú) az intramolekuláris kölcsönhatások erosek, fragmentációt alig vagy egyáltalán nem észleltünk. Ca 2+ jelenlétében (inaktív szerkezet, katalitikus centrum E1 konformációjú) a fragmentáció kifejezetebb, ami azt mutatja, hogy E1 állapotban az intramolekuláris kölcsönhatások gyengébbek. Ca 2+ -kalmodulin komplex kötodése a kalmodulin-köto szekvenciához jelentos konformációs változásokat indukál a fehérje szerkezetében (aktív szerkezet), és ennek hatására a hasítási helyek könnyen hozzáférhetové válnak a proteázok számára. Ez a konformációs változás a csukló régiótól egészen a másodlagos autoinhibítor régióig terjed. Eredményeink megerosítik, hogy a Trp 1093 kitüntetett szerepet játszik a kalmodulin-köto szekvencia és a katalitikus centrum kölcsönhatásában, mivel a Trp 1093 mutációjának hatására egyébként elérhetetlen hasítási helyek hozzáférhetové válnak bizonyos proteázok számára. Ez a hatás azonban a kalmodulin globális hatásával szemben csak a kalmodulin-köto szekvencián belül figyelheto meg. Bizonyítottuk, hogy a kalmodulin-köto szekvenciától N-terminális irányba eso, ún. csukló régió is fontos szerepet játszik a belso gátlás kialakításában, valószínuleg azáltal, hogy stabilizálja a kalmodulin-köto szekvencia és a katalitikus centrum kapcsolatát. Az ebben a régióban található aszparaginsav mutációja jelentosen növeli a kalmodulin nélkül mért aktivitást. Ezenkívül a mutáns fehérje aktiválódása kalmodulinnal gyorsabb, mint a vad típusú fehérje esetében. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a mutáns fehérjében az intramolekuláris kölcsönhatások gyengébbek, és a kalmodulin-köto szekvencia könnyebben hozzáférheto a Ca 2+ -kalmodulin komplex számára. A mutáció hatása ebben az esetben is lokális, a változás nem terjed a csukló régión kívülre.

5 gyengébb a C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatása, és így a Ca 2+ -kalmodulin komplex számára jobban hozzáférheto a kalmodulin-köto régió (? nagyobb aktiválódási sebesség). Limitált proteolízissel kimutattuk, hogy az Asp 1080 mutációja lokális változást idéz elo a C-terminális régió és a katalitikus centrum struktúrális kapcsolatában, és hatása nem terjed a csukló régión kívülre. 2. BEVEZETÉS A sejt jelátviteli folyamatainak egyik kulcsszereploje a Ca 2+ ion. A sejt nyugalmi állapotában az intracelluláris Ca 2+ koncentráció igen alacsony (kb. 0,1?M), öt nagyságrenddel kisebb, mint az extracelluláris térben. A sejtet éro szignálok hatására az intracelluláris Ca 2+ koncentráció átmenetileg megemelkedik (kb 0,5-1?M értékre), ami számos, sejttípustól és stimulustól függo sejtválaszt indíthat el (pl. izomkontrakció, szekréció, neurotranszmitter-felszabadulás). A sejtaktivációt követoen a Ca 2+ transzportrendszerek plazmamembrán típusú Ca 2+ ATPáz (PMCA), szarko/endoplazmás retikulum típusú Ca 2+ ATPáz (SERCA), Na + -Ca 2+ cseretranszporter eltávolítják a Ca 2+ -t a citoszolból, és visszaállítják a nyugalmi Ca 2+ szintet. A sejt egyik általánosan elterjedt, nagy affinitású Ca 2+ transzportrendszere a plazmamembrán típusú Ca 2+ ATPáz, amely a Ca 2+ -t a citoszolból az extracelluláris térbe távolítja el. A PMCA a Ca 2+ transzlokációjához szükséges energiát ATP hidrolízisébol nyeri. A többi P- típusú ATPázhoz hasonlóan az iontranszporttal párhuzamosan foszforilálódik, és egy nagy energiájú foszforilált intermediert képez. Az enzimciklus során a Ca 2+ ionok kötése és a foszforiláció váltakozik a Ca 2+ transzporttal és az ATP hidrolízissel. A folyamatot a fehérje konformációváltozása kíséri, aminek következtében a Ca 2+ köto helyek Ca 2+ iránti affinitása megváltozik. Az E1 konformációjú szerkezet nagy affinitással, míg az E2 forma kis affinitással köti a Ca 2+ -ot. A PMCA topológiája hasonlít a többi P-típusú ATPázhoz: 10 transzmembrán hélix és két nagyobb citoplazmatikus hurok alkotja. A transzmembrán régióban találhatóak azok az aminosavak, amelyek a Ca 2+ kötésében vesznek részt. A 4. és az 5. transzmembrán hélixeket összeköto

6 ún. nagy hurok tartalmazza a fo katalitikus doméneket: ATP-köto hely, az enzimciklus során foszforilálódó aszparaginsav. A többi P-típusú ATPáztól eltéroen a PMCA rendelkezik egy hosszú C-terminális szabályozó régióval, amely tarlamaz egy nagy affinitású kalmodulin-köto szekvenciát. Az enzim inaktív állapotában a kalmodulin-köto szekvencia kölcsönhatásba lép a katalitikus centrummal, és gátolja a pumpa aktivitását. A Ca 2+ szint emelkedését követoen, a kialakult Ca 2+ -kalmodulin komplex kötodik a C- terminális régióban található kalmodulin-köto szekvenciához. Ennek hatására a katalitikus centrum felszabadul a belso gátlás alól, a pumpa aktiválódik. A PMCA-t 4 gén kódolja (PMCA1-4). E négy génrol átíródott premrns-rol, az alternatív splicing során több mint 20 különbözo izoforma keletkezhet. A PMCA1 és 4 izoformák szinte minden szövetféleségben elofordulnak, míg a PMCA2 és PMCA3 gén termékei foként ideg-, váz- és szívizomsejtekben expresszálódnak. Az egyes PMCA izoformák szabályozása alapaktivitásuk, kalmodulin iránti affinitásuk, aktiválódásuk és inaktiválódásuk sebessége nagyon eltéro. Az izoformák közül a PMCA4b izoforma rendelkezik a legalacsonyabb alapaktivitással, és ez a variáns stimulálható a legnagyobb mértékben kalmodulinnal. A PMCA4b alacsony alapaktivitása arra utal, hogy a C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatása szoros. A PMCA4b izoforma belso gátlásáért nem csak a kalmodulin-köto szekvencia, hanem kisebb részben, ettol a szekvenciától C-terminálisan található másodlagos autoinhibítor régió is felelos. A kalmodulin-köto szekvenciától távolabb (mind N-, mind C-terminális irányban) lévo hasítási helyeken bekövetkezo fragmentációt a mutáció azonban nem befolyásolja. Ez arra utal, hogy az aminosavcsere hatása lokális és specifikus: bár a mutáció közvetlen környezete lazábban kötodik a katalitikus centrumhoz, ez a hatás nem terjed ki a kalmodulin-köto szekvencián kívülre. Eredményeink szerint a Trp 1093 aminosavnak kitüntetett szerepe van kalmodulin-köto szekvencia és a katalitik us centrum kölcsönhatásában Az autoinhibítor régiótól N-terminálisan található aszparaginsav (Asp 1080 ) szerepe a hpmca4b izoforma belso gátlásában A 10. transzmembrán hélixet a kalmodulin-köto szekvenciával összeköto, ún. csukló régióban található az az aszparaginsav (Asp 1080 ), ahol a kaszpáz-3 enzim hasítja a PMCA4b izoformát. Az 5.1. fejezetben leírtuk, hogy a kaszpáz-3 proteázzal vizsgált csukló régió fragmentációja jelentosen függ az intramolekuláris kölcsönhatás erosségétol. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a csukló régiónak is szerepe lehet az enzim inaktív szerkezetének kialakításában. Ezért vizsgáltuk, hogy az Asp 1080 mutációja (Asp 1080? Ala, Asp 1080? Lys Asp 1080? Asn mutánsok) milyen hatással van az enzim transzportaktivitására és a kalmodulinnal történo aktiválhatóságára. Kimutattuk, hogy mindhárom aminosavcsere jelentosen megemeli az enzim kalmodulin nélküli alapaktivitását. Ezenkívül a vad típusú enzimhez viszonyítva nagyobb az Asp 1080 mutánsok kalmodulin iránti affinitása, aminek hátterében az áll, hogy a mutáns enzimek nagyobb sebességgel aktiválódnak. Ezeknek a változásoknak valószínuleg az az oka, hogy a mutáció következtében a Ca 2+ ATPáz nyitottabb szerkezetet vesz fel (? nagyobb alapaktivitás),

7 Ca 2+ -affinitású, E1 állapotnak kedvez. Azt tapasztaltuk, hogy Ca 2+ hiányában alig degradálódik a pumpa, míg a Ca 2+ -t kötött fehérje esetében a C- terminális régió elérhetobb a proteázok számára. Ezek az adatok azt mutatják, hogy E2 állapotban a C-terminális autoinhibítor régió szorosan kapcsolódik a katalitikus centrumhoz. A SERCA háromdimenziós szerkezete alapján feltételeztük, hogy E1 állapotban a katalitikus centrum doménjei jobban elkülönülnek egymástól, ezért ez a szerkezeti egység nem képes olyan szorosan lefedni a C-terminális régiót, mint E2 formában. Kísérleteink azt mutatták, hogy ilyenkor a hasítási helyek valóban elérhetobbek a proteázok számára. Maximális fragmentképzodést mindhárom proteázzal a kalmodulin-kötött, aktív szerkezetu Ca 2+ ATPáz esetében figyeltünk meg. Eredményeink megerosítik korábbi elképzeléseinket, miszerint a Ca 2+ - kalmodulin komplex kötodése a kalmodulin-köto szekvenciához jelentos konformációs változásokat indukál a C-terminális régió és a katalitikus centrum kapcsolatában A kalmodulin-köto szekvenciában található Trp 1093 mutációjának hatása a hpmca4b intramolekuláris kölcsönhatásaira A kalmodulin-köto szekvenciában található triptofán (Trp 1093 ) mutációjának hatására (Trp 1093? Ala mutáns) megemelkedik a pumpa alapaktivitása, az enzim gyorsabban aktiválódik kalmodulin nal, ami arra utal, hogy az intramolekuláris kölcsönhatások a mutáns esetében gyengébbek. Kimutattuk, hogy a Trp 1093? Ala mutáns esetében a kalmodulin-köto szekvencián belül egyébként elérhetetlen hasítási helyek hozzáférhetové válnak a vizsgált protázok számára. Ez azt bizonyítja, hogy a mutánsnál a kalmodulin-köto szekvencia kapcsolata a katalitikus centrummal gyengébb, mint a vad típusú enzim esetében. 3. CÉLKITUZÉSEK A PMCA sokrétu szabályozhatóságának szerkezeti alapját a katalitikus centrum és a C-terminális régió kölcsönhatása képezi. Kísérleteinkben a humán PMCA4b izoforma (hpmca4b) intramolekuláris kölcsönhatásait vizsgáltuk limitált proteolízissel. A katalitikus centrum és a C-terminális régió közötti kölcsönhatás erosségétol függoen változhat egy adott hasítási hely elérhetosége egy C-terminális régióban hasító proteáz számára. Így a fragmentképzodés intenzitásából következtethetünk az intramolekuláris kölcsönhatások erosségére. Vizsgálni kívántuk továbbá, hogy a kalmodulinköto szekvenciától N-terminális irányban létrehozott mutációk hogyan befolyásolják a pumpa aktivitását. Kísérleteink során a következo célok illetve kérdések merültek fel:? A hpmca4b C-terminális autoinhibítor régiójában hasító proteázok (kalpain, kimotripszin, kaszpáz-3) hasítási helyeinek meghatározása in situ a membránban.? Vizsgálni kívántuk a hpmca4b izoforma fragmentációját különbözo konformációs állapotokban.? Limitált proteolízis segítségével tanulmányozni kívántuk, hogy a hpmca4b kalmodulin-köto szekvenciájában található triptofán (Trp 1093 ) mutációjának milyen hatása van a fehérje intramolekuláris kölcsönhatásaira.? Vizsgálni kívántuk, hogy a kalmodulin-köto szekvenciától N- terminálisan elhelyezkedo, ún. csukló régióban található aszparginsav (Asp 1080 ) mutációja milyen hatással van az enzim aktivitására.

8 4. MÓDSZEREK Sejtkultúra, transzfekció és membránpreparálás: A PMCA fehérjéket majomvese eredetu COS-7 sejtekben Lipofectamin reagens segítségével expresszáltuk. A tranziens expressziót követoen a sejtekbol mikroszómá lis membránpreparátumot készítettünk. Emésztés kalpainnal, kimotripszinnel és kaszpáz-3-mal: A PMCA-val transzfektált COS-7 sejtekbol preparált mikroszómális membránt in vitro 37 o C-on emésztettük az egyes proteázokkal. A fragmentek képzodését immunfestéssel követtük nyomon. Gélelektroforézis és elektrotranszfer: A mintákat SDS-poliakrilamid gélen futtattuk, PVDF membránra blottoltuk, majd immunfestéssel (5F10: anti- PMCA és JA9: anti-pmca4b ellenanyagokkal) és ECL (Enhanced Chemiluminescence) technika segítségével tettük láthatóvá. A fehérjék mennyiségi megoszlását a BioRad Chemiluminescence Imaging System segítségével határoztuk meg, majd a Molecular Analyst és a GraphPad Prism programokkal értékeltük ki. Ca 2+ transzport mérés: Ca 2+ transzport mérés során a membránvezikulák 45 Ca 2+ izotóppal jelzett Ca 2+ -felvételét mértük meg. A PMCA aktiválódásának és inaktiválódásának kinetikai analízise: A tisztított PMCA fehérje aktiválódásának illetve inaktiválódásának sebességét az enzim ATPáz aktivitásának mérésével, kapcsolt enzimreakción (2-amino- 6-merkapto-7-metil-purin ribonukleozidot (MESG) foszforolízise) keresztül határoztuk meg. Az adatokat a GraphPad Prism program segítségével értékeltük ki. A PMCA4b szerkezeti modellje: A PMCA4b szekvenciáját a SERCA1a fehérje szekvenciájával hasonlítottuk össze, majd a MODELLER 6v2 programmal a SERCA1a szerkezeti adatait (1EUL.pdb, 1IWO.pdb) felhasználva elkészítettük a PMCA4b fehérje homológia modelljét. 5. EREDMÉNYEK 5.1. A hpmca4b izoforma intramolekuláris kölcsönhatásainak vizsgálata limitált proteolízissel A PMCA Ca 2+ transzport aktivitását a C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatása szabályozza. Kísérleteinkben a hpmca4b izoforma intramolekuláris kölcsönhatásait a fehérje C-terminális régiójában hasító proteázok segítségével vizsgáltuk Hasítási helyek meghatározása Vizsgálatainkhoz három olyan eltéro szubsztrát specificitású proteázt választottunk, amelyek a PMCA4b izoforma C-terminális régiójában hasítanak elsodlegesen (kalpain, kimotrips zin, kaszpáz-3). A PMCA4b DNSsel transzfektált COS-7 sejtekbol membránt preparáltunk, és a hasítást in situ a membránban enzim természetes állapotához közel álló rendszerben tanulmányoztuk. A keletkezett fragmentek és az ismert molekulatömegu ép PMCA4b illetve csonkolt PMCA4b mutánsok elektroforetikus vándorlása alapján határoztuk meg a hasítási helyeket. Kísérleti rendszerünkben a kalpainnak és a kimotripszinnek a kalmodulin-köto szekvencián kívül, attól C-terminális irányban (a másodlagos autoinhibítor régióban) egy-egy domináns hasítási helye volt. Ezzel ellentétében a kaszpáz-3 a kalmodulinköto szekvenciától N-terminálisan az aszparaginsav mellett hasítja a fehérjét A hpmca4b degradációja különbözo konformációs állapotokban Az inaktív szerkezetu fehérje fragmentációját vizsgáltuk egyrészt Ca 2+ hiányában, amikor a katalitikus centrum konformációja a kis Ca 2+ -affinitású, E2 állapot felé tolódik, másrészt Ca 2+ jelenlétében, ami a