Matkovicsné Varga Andrea okleveles vegyész

Átírás

1 AZ ENZIM-SZUBSZTRÁT KÖLCSÖNHATÁSOK SZEREPE A 3-FOSZFOGLICERÁT KINÁZ DOMÉNZÁRÓDÁSÁBAN Doktori (Ph.D.) értekezés Matkovicsné Varga Andrea okleveles vegyész Témavezetők: Kazinczyné Vas Mária, tudományos tanácsadó, az MTA doktora Náray-Szabó Gábor, egyetemi tanár, az MTA rendes tagja Készült: Magyar Tudományos Akadémia SzBK Enzimológiai Intézetében és Eötvös Loránd Tudományegyetem Kémia Doktori Iskolájában Vezetője: Inzelt György, egyetemi tanár Szintetikus Kémia, Anyagtudomány, Biomolekuláris Kémia Doktori Program keretében Programvezető: Horváth István Tamás, egyetemi tanár Budapest, 2006

2

3 TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS 1 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS A FEHÉRJE SZERKEZETI DOMÉNEK FOGALMA ÉS JELENTŐSÉGÜK A FEHÉRJÉK MŰKÖDÉSÉBEN A PGK MINT A DOMÉNSZERKEZETŰ FEHÉRJÉK EGYSZERŰ MODELLJE A KATALIZÁLT ENZIMREAKCIÓ ÉS A PGK SZEREPE AZ ÉLŐ SZERVEZETBEN A SZUBSZTRÁTOK KÖTŐDÉSI MÓDJA A 3-PG kötőhely Az 1,3-BPG lehetséges kötődési módja A nukleotid kötőhely A Mg 2+ szerepe és feltételezett kötőhelye A SZUBSZTRÁTKÖTŐDÉS DISSZOCIÁCIÓS ÁLLANDÓI, KÖTŐDÉSI ANTAGONIZMUS A SZUBSZTRÁTOK HATÁSA AZ ENZIM KONFORMÁCIÓJÁRA Szubsztrátok védőhatása az enzim kémiai módosításával szemben NMR mérések a szubsztrátok enzimkonformáció-változtató hatásának vizsgálatára Fluoreszcencia illetve foszforeszcencia mérések A szubsztrátok enzimkonformáció-változtató hatásának összehasonlítása Az enzimet különböző konformációban tartalmazó kristályszerkezeti adatok összevetése A molekula alakját jellemző kisszögű röntgen-, illetve neutronszórási mérések A KINETIKAI REAKCIÓMECHANIZMUS ANIONOK AKTIVÁLÓ HATÁSA A PGK ÁLTAL KATALIZÁLT ENZIMREAKCIÓRA A MŰKÖDÉS SZERKEZETI ALAPJAI: MOLEKULÁRIS CSUKLÓK ELHELYEZKEDÉSE A PGK MOLEKULÁBAN A DOMÉNEK EGYÜTTMŰKÖDÉSE CÉLKITŰZÉS ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ANYAGOK MÓDSZEREK A fehérjeoldatok koncentrációjának meghatározása A szubsztrátok koncentrációjának meghatározása Az ADP koncentrációjának meghatározása Az ATP koncentrációjának meghatározása A 3-PG koncentrációjának meghatározása Az 1,3-BPG koncentrációjának meghatározása A PGK enzimaktivitásának meghatározása PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló enzimreakció ,3-BPG és MgADP szubsztrátokból kiinduló enzimreakció A PGK enzimkinetikai vizsgálata és az alkalmazott kinetikai egyenletek Az aktivitás szubsztrátkoncentráció-függésének meghatározása Anionok hatásának vizsgálata Két gátlószer együttes hatásának vizsgálata A PGK-ligandum kölcsönhatások egyensúlyi vizsgálata Izotermális titráló mikrokalorimetria (ITC) Kémiai módosítás közvetett módszere Az enzimszerkezet stabilitásának vizsgálata Differenciális pásztázó mikrokalorimetria (DSC) Fluorimetria CD-spektroszkópia Molekuláris grafikai analízis Atomi kölcsönhatások analízise Ligandumkötés modellezése EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉSÜK A MGADP ÉS MGATP ELTÉRŐ KÖTŐDŐDÉSI MÓDJA: A FÉMION SZEREPE Kettősgátlás kísérletek nukleotid analógokkal, adenozinnal és anionokkal A nukleotid kötődés jellemzése izotermális titráló kalorimetriás (ITC) kísérletekben 54 i

4 A fémion hatásának vizsgálata a PGK nukleotidkötésére pásztázó mikrokalorimetriás (DSC) módszerrel MgATP és ATP PGK-val való kölcsönhatási módjának röntgenkrisztallográfiás meghatározása AZ 1,3-BPG (INSTABIL SZUBSZTRÁT) LEHETSÉGES KÖTŐDÉSI MÓDJA: MOLEKULÁRIS MODELLEZÉS ANION-ENZIM KÖLCSÖNHATÁS JELLEMZÉSE, ANIONKÖTŐHELYEK AZONOSÍTÁSA Enzimkinetikai analízis aktiválás és gátlás jelensége Szubsztrátfelesleg aktiválás jelensége Az anionok kötődésének jellemzése Izotermális titráló kalorimetriás (ITC) módszerrel SH reaktivitás közvetett módszerét alkalmazva Anionok szerkezetstabilizáló hatásának vizsgálata DSC módszerrel A lehetséges anionkötőhelyek azonosítása molekuláris modellezéssel A MGATP-VEL, AZ 1,3-BPG-VEL, ILLETVE AZ AKTIVÁLÓ ANIONOKKAL KÖLCSÖNHATÓ OLDALLÁNCOK AZONOSÍTÁSA: HELYSPECIFIKUS MUTAGENEZIS A Lys 215 és az Arg 38 cseréje pontmutációval és a mutánsok fizikai-kémiai jellemzése A mutánsok enzimek működésének jellemzése Szubsztráttelítési görbék meghatározása A mutációk hatása az anionok által okozott aktiválás-gátlás jelenségre A DOMÉN-DOMÉN KÖLCSÖNHATÁSOK JELLEMZÉSE MIKROKALORIMETRIÁVAL Vad típusú enzim és a doménenként egyetlen triptofánt tartalmazó mutánsok vizsgálata A vad típusú disznóizom és élesztő PGK hődenaturációja: a domének nagyfokú együttműködése Az élesztő PGK mutánsainak eltérő hőstabilitása nem a domének együttműködésével áll összefüggésben Biner és terner enzim-szubsztrát komplexek eltérő stabilitása Doménzáródás a terner komplexben mehet végbe: inaktív CM-PGK-val végzett kísérletek A DOMÉNZÁRÓDÁS MOLEKULASZERKEZETI ALAPJAI AZ ISMERT KRISTÁLYSZERKEZETEK ÖSSZEHASONLÍTÓ ELEMZÉSE ALAPJÁN A PGK domének együttműködésének szerkezeti alapjai: a domének közötti régió vizsgálata A szubsztrátok stabilizáló hatásának szerkezeti alapjai a biner komplexekben A 3-PG stabilizáló hatásának molekuláris mechanizmusa A MgADP és a MgATP eltérő stabilizációs hatása eltérő kötődési módjuknak köszönhető A terner komplexek legnagyobb stabilitása a doménzáródásnak köszönhető ÖSSZEFOGLALÁS AZ ÉRTEKEZÉS TÉMAKÖRÉHEZ KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK IRODALMI HIVATKOZÁSOK 105 ii

5 Ábrák jegyzéke 1. ábra A PGK molekula térszerkezete 4 2. ábra A PGK domén mozgásai az enzim működése során 5 3. ábra A 3-PG kötőhelyének térszerkezete, valamint az 1,3-BPG lehetséges kötődési módja ábra A nukleotidok, illetve nukleotid analógok PGK-val való kölcsönhatása ábra A βl konformációváltozása (A), valamint a 13-as és 14-es hélix relatív pozíciójának változása (B) a doménzáródás során ábra Kettősgátláskísérletek különböző gátlószer-párokkal ábra 3-PG, az 1,3-BPG, illetve analógjaik képlete ábra Szerkezeti magyarázat a MgADP és az ATP analóg, MgAMP-PCP pirofoszfáttal szembeni különböző viselkedésére ábra Különböző nukleotidok PGK-val való kölcsönhatásának jellemzése ITC módszerrel ábra A nukleotidok hatása a PGK hődenaturációs folyamatára ábra A PGK konformációjának összehasonlítása a különböző nukleotid komplexekben ábra Az ATP (A ábra) és a MgATP (B ábra) kötődésének részletei ábra A MgATP foszfátlánca kötődési módjának összevetése az ismert nukleotid-analógok (MgAMP-PNP, MgAMP-PCP), illetve a MgADP kötődési módjával ábra Az 1-es, a 8-as, a 13-as, illetve a 14-es hélixek relatív pozíciójának megváltozása az enzimszerkezet záródása során ábra A modellezett 1,3-BPG kölcsönhatásai a zárt aktív centrumban ábra A pirofoszfát, a citrát és a foszfát ionok aktiváló és gátló hatása ábra A szubsztrát 3-PG (B), a foszfát (A), valamint a citrát (C) kölcsönhatásai a 3-PG kötőhely konzervatív oldalláncaival ábra A PGK aktivitásának szubsztrátkoncentráció függése ábra Anionok, illetve 3-PG analógok hatása a PGK DTNB-vel szembeni módosítás sebességére ábra A foszfát (A), illetve a 3-PG (B) modellezése a T. brucei PGK zárt konformációjú komplexébe ábra A mutáció hatása a PGK hődenaturációjára, illetve reaktív tiol-csoportjai módosítására ábra A Lys 215 és az Arg 38 mutációinak hatása a szubsztrátfeleslegaktiválásra a 3-PG és MgATP szubsztrátokból kiinduló reakcióban ábra Lys 215 és az Arg 38 mutációinak hatása az 1,3-BPG és MgADP szubsztrátokból kiinduló reakcióban ábra A pirofoszfát hatása az enzimaktivitásra a 3-PG és MgATP (A), illetve az 1,3-BPG és a MgADP (B) szubsztrátokból kiinduló enzimreakcióban ábra A szubsztrátok hatása a sertésizom PGK hődenaturációs folyamatára ábra A hődenaturációs görbék linearizálása ábra A vad típusú és mutáns élesztő PGK-k hődenaturációs görbéi ábra A domének közötti kölcsönhatások ábra A domének közötti régió bemutatása a PGK biner komplexekben ábra A βl, fő csukló működése a szubsztrátok egyidejű hatására 97 iii

6 Táblázatok jegyzéke 1. táblázat Az N-domén bázikus foltjá -n végzett pontmutációk hatása a szubsztrátok kötődésére, illetve az enzimaktivitásra 9 2. táblázat Az eddig közölt röntgenkrisztallográfiás PGK szerkezetek összefoglaló táblázata táblázat A nukleotid kötőhelyek számának meghatározása az irodalmi adatok tükrében táblázat A PGK szubsztrátjai, illetve szubsztrát-analógjainak enzimhez való kötődési állandói táblázat A helyspecifikus mutációk elvégzéséhez tervezett primerek táblázat A nukleotid kötődés disszociációs állandói és a kötődés termodinamikai paraméterei táblázat Az egyes PGK*Mg-nukleotid komplexekre jellemző olvadási hőmérsékletek táblázat A vizsgált anionok töltésviszonyai ph=7,5 ön táblázat A vizsgált anionok aktiváló és gátló hatását jellemző kinetikai paraméterek összefoglalása táblázat 3-PG, 1,3-BPG, analógjaik, illetve egyéb anionok tiol reaktivitás, illetve ITC titrálás módszerével meghatározott kötődési állandói (K d ) táblázat A vad típusú és a mutáns PGK-k kinetikai paramétereinek összefoglaló táblázata táblázat A disznóizom és az élesztő PGK hődenaturációjának átmeneti hőmérsékletei (T m ) és a kalorimetriás hő (Q t ) értékek táblázat A disznóizom és az élesztő PGK hődenaturációs folyamatának aktiválási paraméterei 87 Rövidítések jegyzéke PGK [EC ] 3-foszfoglicerát kináz GAPDH [EC ] glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz EDTA etilén-diamin-tetraecetsav DTT ditiotreitol CM-PGK karboxamidometilezett PGK hpgk humán PGK E. coli Escherichia coli T. brucei Trypanosoma brucei B. stearothermophilus Bacillus stearothermophilus T. maritima Thermotoga maritima 3-PG 3-foszfoglicerát 1,3-BPG 1,3-biszfoszfoglicerát 2,3-BPG 2,3-biszfoszfoglicerát G-3-P glicerol-3-foszfát 2-PG 2-foszfoglikolát 1,5-BPP 1,5-biszfoszfo-pentán AMP-PNP β,γ-imido-adenozin-5 -trifoszfát AMP-PCP β,γ-metilén-adenozin-5 -trifoszfát HK hexokináz G6PDH glükóz-6-foszfát dehidrogenáz PK piruvát kináz LDH tejsav dehidrogenáz DTNB 5,5 -ditiobis(2-nitrobenzoát) PEP foszfoenol-piruvát IPTG izopropil-β-d-tiogalaktopiranozid ANS 8-anilino-naftalin szulfonsav TNP-ATP 2 3 -O-(2,4,6-trinitrofenil)ATP DSC differenciális pásztázó mikrokalorimetria ITC izotermális titráló mikrokalorimetria GuHCl guanidin-hidroklorid G-6-P-L glükonsav-6-foszfát-lakton iv

7 Köszönetnyilvánítás Köszönetemet fejezem ki témavezetőmnek, Kazinczyné Dr. Vas Máriának a munkám során nyújtott sokrétű és önzetlen segítségéért, útmutatásaiért. Köszönöm másik témavezetőmnek, Dr. Náray-Szabó Gábornak, hogy tanácsaival támogatta és figyelemmel kísérte munkámat. Köszönet illeti Pollnerné Dr. Flachner Beátát a kísérleti munka során nyújtott segítségéért, továbbá a fehérje kifejezés és termelés módszerének kidolgozásáért. Köszönetemet fejezem ki Dr. Kovári Zoltánnak, a röntgendiffrakciós szerkezetek megoldásáért, Dr. Osváth Szabolcsnak az élesztő PGK mutánsok előállítását, továbbá Barna Lászlónak és Gyimesi Gergelynek a molekuláris modellezés kivitelezéséért. Köszönöm Gráczer Éva és Szabó Judit kollégáimnak segítségüket és támogatásukat. Hálás vagyok az Intézet igazgatójának, Friedrich Péter akadémikusnak, hogy lehetőséget biztosított számomra, hogy kutatómunkámat a Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központjának Enzimológiai Intézetében végezhettem. Köszönöm Závodszky Péter akadémikusnak, hogy lehetővé tette laboratóriumában a DNSszintű munkák kivitelezését és Hajdú István PhD hallgatónak e munkák során nyújtott sokoldalú segítségét. Köszönöm férjemnek, Matkovics Istvánnak a bátorítást, a türelmet és tanácsait. v

8

9 1. BEVEZETÉS A tudomány nagy előrelépést tett azzal, hogy 2000-ben meghatározta az emberi DNS teljes bázissorrendjét. Ennek ismeretében az egyes fehérjék génjei is meghatározhatóak. Számukat kb re várják. Ezek közül még igen sok az ismeretlen fehérje, azaz az ezeket kódoló gének jelentése még megfejtésre vár. A fehérjék azonosításában és működésének megértésében, illetve szerkezetének felderítésében ma egyre nagyobb szerep jut a különféle fizikai-kémiai és enzimológiai vizsgálatoknak. Szerkezet és működés kölcsönösen meghatározzák egymást. Adott szerkezetből következik a működés, és az adott funkció szabja meg a szükséges szerkezeti hátteret. A különböző in vitro enzimológiai vizsgálatok eredményeit tehát fontos kiegészíteni pl. a fehérjéről készült röntgenkrisztallográfiás felvételekből nyerhető információkkal, melyekkel együtt értelmezve teljesebb képet kaphatunk az enzimműködésről. Értekezésemben a fehérje doménszerkezet és az enzimműködés, valamint a szerkezeti stabilitás néhány kérdését, összefüggéseit vizsgáltam a glikolízis egyik enzimén, a 3-foszfoglicerát kinázon (PGK). Ez a két szerkezeti doménből felépülő tipikus kináz enzim már régen a kutatók érdeklődésének tárgya. Az élő szervezetben betöltött alapvető szerepén túlmenően széles körben modellként alkalmazzák a doménszerkezettel kapcsolatos kérdések vizsgálatára. A domének szerkezetének és együttműködésének egyre nyilvánvalóbb szerepe van az enzimműködésben. Röntgendiffrakciós adatokból tudjuk, hogy az enzimek aktív centruma általában a domének közötti mélyedésben helyezkedik el. A domének relatív elmozdulása, melyet a fehérjeszerkezet flexibilitása biztosít, ezen enzimek működésében alapvető jelentőségű. A doménzáródás során kerülhetnek a szubsztrátok reagáló csoportjai a katalízishez szükséges optimális környezetbe és megfelelő távolságra. Igen kevés információnk van azonban arról, hogy a domének közötti együttműködés molekuláris szinten pontosan hogyan is valósul meg, és hogyan vezet a katalízis által igényelt nagyléptékű doménmozgáshoz. Korábbi kutatások alapján feltételezhető, hogy a jól definiált szerkezettel bíró domének közötti régió biztosíthatja a domének együttműködését. Értekezésemben azt a kérdést vizsgáltam, hogy a PGK esetén az enzim-szubsztrát kapcsolódás (kötődés) milyen szereppel bír a katalízishez szükséges doménzáródás elősegítésében, pl. kitüntetett hatással van-e a domének közötti régióra? Választ kerestem továbbá arra a kérdésre is, hogy a PGK működését szabályozó anionos ligandumok kötődése és a domén-mozgások milyen összefüggésben vannak? 1

10 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A fehérje szerkezeti domének fogalma és jelentőségük a fehérjék működésében A domének fogalma az immunglobulinok elsődleges szerkezetének tanulmányozása során merült föl először. Kutatók azt találták, hogy a könnyű és nehéz láncok több funkcionális egységből állnak, s ezeket stabil fragmensként tudták izolálni limitált proteolízist követően (1). Ezzel egyidőben fehérje krisztallográfusok egy sor kis globuláris fehérje térszerkezetét meghatározták. A szerkezetek elemzése azt mutatta, hogy a polipeptidláncok két vagy több jól elkülöníthető régióra bonthatók, melyek önálló szerkezeti és működési egységeknek tekinthetők, hasonlóan az immunglobulin doménekhez (2). A domén fogalmát később alkalmazták 300 vagy több aminosavból felépülő fehérjék esetén is. A szerkezeti adatokkal összevetve fokozatosan elfogadottá vált, hogy a domének általában aminosavból álló szerkezeti és funkcionális működési egységei a globuláris fehérjéknek (3). Az enzimek aktív centrumai rendszerint a domének közötti mélyedésben helyezkednek el. Már az első röntgenkrisztallográfiás szerkezeti adatok ismeretében feltételezhető volt, hogy a reagáló szubsztrátok a domének összezáródása után kerülnek a reakció szempontjából optimális környezetbe, továbbá megfelelő térbeli közelségbe és orientációba. Erre ma már egy sor kísérleti példa is van (4-6). A domének záródása kizárja a vizet is az aktív centrumból, mely esetleg a szubsztrát (pl. kinázok esetén az ATP) hidrolízisét okozhatná. A domének relatív elmozdulásai tehát fontos szerepet játszanak az enzimműködésben. A doménhatárokon elhelyezkedő üregek elősegíthetik ezeket a mozgásokat, ezáltal a katalízis folyamatát (7). Azoknak a szerkezeti elveknek, ill. specifikus kölcsönhatásoknak a felkutatása is megkezdődött, melyek a doménzáródáshoz vezetnek (8-10). Már nagyon korán felismerték, hogy a doménzáródásnak gyorsnak kell lennie. Ez azt jelenti, hogy a nyitott és a zárt enzimforma között nem lehet magas energiagát. Éppen ezért a kutatók a doménmozgásokat az alacsony-energiájú konformációváltozások segítségével próbálták jellemezni (11, 12). Ezeket két csoportba osztották: elcsúszás (shear) és elfordulás (hinge). Az elcsúszó mozgást végző fehérjék általában szoros pakoltságúak, míg elfordulás olyan fehérjékben megy könnyen létre, melyekben a doméneket laza pakoltságú régiók 2

11 kötik össze. A csukló régiók megléte például nemcsak az elfordulásra jellemző, hisz az elcsúszás során is ilyen csukló részek kötik össze az egymáson elcsúszó rétegeket. Tulajdonképpen az különbözteti meg a két mozgást egymástól, hogy míg az elcsúszás során a határfelületek pakoltsága megmarad, elfordulás során a laza pakoltságú régiók szorosan pakolt határfelületté alakulnak. Már létezik egy adatbázis, mellyel molekuláris (domén)mozgások útját lehet szimulálni adott fehérjéről rendelkezésre álló (eltérő konformációs állapotú) krisztallográfiás szerkezetek segítségével (12). Ez a szerver képes kezelni nukleinsavakat és több láncból álló komplexeket is. Az adatbázis az utóbbi években tovább fejlődött és bővült (13-15). Jelenleg tehát képesek vagyunk a domén-mozgásokat szimulálni, azonban ezen mozgások részleteit nem tudjuk az oldallánc-kölcsönhatások szintjén leírni. Általános következtetések levonásához először egyedi esetekben kell tisztáznunk (pl. a jelen dolgozatban vizsgált PGK esetén) a domén-mozgások pontos mechanizmusát, a szubsztrátok hatását a doménmozgásokra, s a domének közötti régió szerkezetének szerepét a doménzáródásban A PGK mint a doménszerkezetű fehérjék egyszerű modellje A PGK viszonylag kis molekulatömegű (44,5 kda), monomer szerkezetű, két szerkezeti doménből felépülő enzim (16), ezért alkalmas, egyszerű modellként szolgál a doménszerkezettel kapcsolatos kérdések tanulmányozására. Szekvenciája igen konzervatív (emlősök körében kb. 96%, élesztőhöz viszonyítva is kb. 60%), ami a térszerkezeti hasonlóságában is megmutatkozik. A szubsztrátkötőhelyeket alkotó aminosav oldalláncok még az eltérő eredetű PGK-k esetén is majdnem teljesen konzervatívok (17, 18). Lóizomból izolált natív PGK-ról született az első röntgendiffrakciós szerkezet 1979-ben (16). Ennek alapján állapították meg, hogy az enzim molekula szerkezetében két kb. azonos méretű domén különíthető el: a C-terminális és az N-terminális. A továbbiakban a krisztallográfusok azt is leírták, hogy az N-terminális domén a 3-PG (19), míg a C-terminális domén a MgATP (16), illetve a MgADP (20) kötésében vesz részt (1. ábra). A szerkezeti analógia alapján valószínűnek látszik az is, hogy az instabil szubsztrát, az 1,3-BPG (melyre még nincs szerkezeti adat) szintén a 3-PG kötőhelyen, az N-doménen kötődik. 3

12 1. ábra A PGK molekula térszerkezete Az ábrán a disznóizom PGK 3-PG-vel és a MgATP analóg MnAMP-PNP-vel alkotott terner komplexe látható (21). Az α-hélixeket piros hengerek, a β-redőket sárga nyilak jelölik. Többféle kísérleti bizonyíték is van arra, hogy a nyitott konformációjú PGK doménjei mindkét szubsztrát jelenlétében elmozdulnak egymáshoz képest és záródnak. Tehát a katalizált foszfo-csoport átviteli reakció (ld fejezet) ebben a konformációban mehet végbe, ahol a szubsztrátok reagáló csoportjai megfelelő térbeli közelségbe kerülnek. Röntgenkrisztallográfiás adatokból ismert az enzimnek mind a nyitott (19, 20) mind pedig a zárt (22, 23) konformációja (2. ábra), bár az eltérő konformációjú szerkezeteket különböző eredetű PGK-k kristályosítása révén sikerült meghatározni. Kisszögű röntgenilletve neutronszórási mérések viszont ettől függetlenül bizonyították, hogy az oldatban működő enzim mindkét szubsztrát jelenlétében zárt konformációt vesz fel (4, 24) ( fejezet). Nem tisztázott azonban, hogy a doménzáródást mindkét vagy esetleg már az egyik szubsztrát kötődése is kiváltja, továbbá, hogy milyen molekuláris történéseken keresztül zajlik a folyamat. A PGK igen alkalmas fehérje térszerkezet kialakulási- (renaturációs), illetve a fehérjelánc kitekeredési (denaturációs) folyamatainak vizsgálatára is viszonylag egyszerű, két doménből felépülő szerkezete miatt. Számos kísérletben vizsgálták meg a domének relatív stabilitását, mind a molekulából izolálva, mind a molekulán belül. A denaturációs kísérletek azonban nem adtak egyértelmű eredményt a domének relatív stabilitási viszonyáról (27, 28) (2.10. fejezet). 4

13 2. ábra A PGK domén mozgásai az enzim működése során Az ábrán a disznóizom PGK nyitott konformációjú terner komplexe (25), valamint a T. brucei PGK zárt konformációjú terner komplexe (26) látható. Az enzim polipeptidláncát piros szalagdiagram jelzi, a szubsztrátokat kék szín jelöli. A domének relatív stabilitási viszonyában pedig a domének közötti együttműködés mértéke tükröződhet. Tisztázása tehát alkalmas lehet pl. olyan kérdések megválaszolására, hogy az egyik doménen kötődő szubsztrát stabilizálja-e a másik domén konformációját is. Ily módon képet kaphatunk a szubsztrátoknak a domének közötti együttműködésre gyakorolt hatásáról A katalizált enzimreakció és a PGK szerepe az élő szervezetben A PGK alapvető enzim minden élő sejt számára. Az univerzális energiatároló, az ATP keletkezésének folyamatát katalizálja az aerob szervezetek glikolízise, az anaerob szervezetek fermentációja során, továbbá nélkülözhetetlen a növények fotoszintéziséhez is. A glikolízisben a glükóz lebontásában vesz részt: az 1,3-biszfoszfoglicerát (1,3-BPG) savanhidrid kötésben lévő foszfo-csoportjának MgADP-re történő átvitelét katalizálja, melynek során 3-foszfoglicerát (3-PG) és MgATP keletkezik (1. egyenlet). (1,3-BPG) (3-PG) 1. egyenlet A PGK által katalizált reakió egyenlete 5

14 Az enzimreakció egyensúlyi állapotában (katalitikus enzimkoncentráció esetén) a szubsztrátos egyensúlyi elegyben a 3-PG és MgATP koncentrációja dominál (K eq =3*10-4 (29)), mert a reakciónak ez az iránya termodinamikailag sokkal kedvezőbb. A glikolízist aerob körülmények között a citrát-ciklus követi. Ez azt jelenti, hogy a piruvát bejut a mitokondriumba, s ott a piruvát dehidrogenáz enzim segítségével acetil-csoportja a koenzim-a-ra épül, majd az acetil-koenzim-a és az oxálacetát a citrát szintáz segítségével citráttá alakul, amit azután további, itt nem részletezett lépések követnek. A glikolízis és a hozzá csatlakozó citrátkör lényeges szerepét mutatja, hogy az utóbbihoz csatlakoznak az élő szervezet működéséhez szükséges további anyagcsereutak. Anaerob körülmények között azonban a piruvát nem lép be a citrát-körbe, hanem acetaldehiddé dekarboxileződik, majd etanollá redukálódik. Ez a folyamat a fermentáció. A növények fotoszintézisénél a sötétszakaszban jut szerephez a PGK. Itt nem lebontó folyamatról van szó, hanem a cukor felépítéséről. A ribulóz-1,5-biszfoszfátra egy CO 2 molekula addícionálódik. A reakció elsődleges terméke a 3-PG, melyből a következő lépésben ATP jelenlétében PGK katalízisével 1,3-biszfoszfo-glicerát képződik, az ATPből pedig ADP keletkezik. A glükogenezis során is jelen van a PGK enzim. A glükogenezis célját tekintve a glikolízis fordított folyamata, ugyanis a glükóz felépítéséről van szó a piruvátból kiindulva. A természet azonban okos, hisz az energiaigényes lépéseket más, kisebb energiát igénylő folyamatokra cseréli. A PGK által katalizált reakció ezen anyagcsere úton is változatlanul szerepel: az enzim 3-PG-t és MgATP-t alakít át 1,3-BPG-vé és MgADPvé. Ezek a legalapvetőbb anyagcsere-folyamatok, melyeket már évtizedek óta ismerünk. A PGK sejten belüli további szerepéről azonban újabb és újabb eredmények születnek. A PGK néhány további érdekes funkciójáról is szeretnék néhány dolgot említeni. A kation transzportban jelentős szerepe van: a Na + transzportjánál (30), valamint a Ca 2+ -pumpa (31) működése során. Az utóbbi munkában feltételezik, hogy a PGK - néhány további glikolitikus enzim mellett - kapcsolatban áll a szarkoplazmatikus retikulummal és ATP-t szolgáltat a pumpa működéséhez. A legújabb kutatási eredmények szerint a sejtmagban is megtalálható, ahol szerepet kap a DNS szintézisénél, transzkripciójánál, illetve javításánál (32). Figyelemre méltó, hogy a PGK funkcionális károsodása (pl. bizonyos természetes mutációk következtében) összefüggésbe hozható az emberi hemolitikus anémiával (33, 34). A hemolitikus anémia olyan betegség, mely X kromoszómához kötötten öröklődik. A 6

15 vörösvérsejtek működésében zavarok támadnak, s egy idő után képtelen lesz a sejt ellátni a funkcióját, végül elpusztul. Az utóbbi időben az emberi eredetű PGK a rákkutatással, azon belül pedig a tumor angiogenezissel kapcsolatban került előtérbe. A tumorsejtek energiaigényüket az angiogenezis előtt, a glikolízis során termelődött ATP-ből nyerik, amihez természetesen a PGK működése is szükséges. Ez a folyamat, mivel hipoxiás a sejt, a tejsavas erjedéshez vezet. A tumorsejtek folyamatos táplálást és oxigénellátást igényelnek. Továbbá meg kell szabadulniuk a szén-dioxidtól és anyagcseréjük hulladékától. Amíg a sejthalmaz átmérője kb. 1 mm alatt marad, diffúzió segítségével meg tudják oldani a sejtek ezeket az ellátási és felszámolási problémákat. Ha viszont túl szeretnék nőni ezt a határt más módszerre lesz szükségük, ez pedig saját vérkeringési rendszer kialakítása, azaz az angiogenezis. A kutatók megfigyelése szerint a daganatsejtben az angiogenezis során a glikolízis egyik energiatermelő lépését katalizáló enzim, a PGK diszulfid reduktázként működik (35) és a plazmint képes redukálni. Ily módon a PGK szerepet játszik a tumor angiogenezis inhibítor, az angiosztatin keletkezésében. In vivo, tumoros egereken végzett kísérletek valóban ezt látszanak alátámasztani. A PGK, tehát ellentétben a többi glikolitikus enzim csupán tumort tápláló hatásával, tumort csökkentő hatással is bír. Bár a közölt adatok látszólag elég egyértelműen bizonyítják a PGK diszulfid-reduktáz aktivitását és tumorellenes hatását, mindaddig ezen eredményt fenntartással kell kezelnünk, amíg nem születik ésszerű magyarázat a PGK tiol-reduktáz aktivitás mechanizmusáról. A legújabb adatok szerint ugyanis az aktív centrum közelében található két, szekvenciálisan szomszédos reaktív tiol-csoport ezen aktivitásban egyáltalán nem vesz részt, bár ez lett volna várható. Tehát elég paradox módon a plazmin redukciója azaz a tiol-reduktáz aktivitás - független a PGK tiol csoportjaitól (36). A jelenséget először a doménzáródás okozta konformáció-változásokkal próbálták összefüggésbe hozni. Újabb közlemények azonban felvetnek két másik lehetséges mechanizmust, melyek során egy enzim képes egy másik enzim SH-csoportjait redukálni (37). Ezek közül a PGK esetén a legvalószínűbb, hogy egy glutaminsav vagy aszparaginsav segíti a plazmin S-S kötésének polarizációját, mely végső soron a kötés felbomlásához vezet. Ezen hipotézis bizonyítása azonban még várat magára. A PGK angiogenezist gátló hatásától eltérően, sokkal kézenfekvőbb magyarázat adódik a PGK-nak azon, csak nemrég közölt, de igen fontosnak látszó tulajdonságára, hogy képes előállítani bizonyos nukleotid analógok (antivirális ill. rákellenes gyógyszerek ill. gyógyszerjelöltek) aktív formáit a sejtben (38, 39). Ez összhangban van azzal a régen 7

16 ismert ténnyel, hogy a PGK a nukleotid szubsztrátokra sokkal kevésbé specifikus, mint a 3-PG-re, ill. az 1,3-BPG-re (40). A PGK-nak ezt az aktivitását vizsgálva már megállapították azt is, hogy a PGK a purinbázist tartalmazó nukleotidokat gyorsabban defoszforilálja, mint a pirimidinbázist tartalmazóakat (39), továbbá, hogy a pirimidin analógok közül viszont az L-analógokat alakítja át gyorsabban a D-analógokhoz viszonyítva. A PGK tehát mindamellett, hogy jó modell a domének együttműködésének vizsgálatára, figyelemreméltó enzim kémiai reakciómechanizmusának és in vivo betöltött szerepének sokrétűsége miatt is A szubsztrátok kötődési módja A 3-PG kötőhely Az első, 3-PG-t kötő kristályszerkezet megszületése előtt NMR mérésekkel és helyspecifikus mutagenezissel próbálták feltérképezni a 3-PG szubsztrát kötőhelyét. Már az első NMR mérés kimutatta, hogy három His aminosavnak van szerepe a 3-PG kötésében (41), melyeket csak később azonosították (42): His 62/Ys 62, 169/Ys167 és 172/Ys170. Eközben Blake és mti (43) bár nem tudták meghatározni a 3-PG kötődésének részleteit, de azt valószínűsítették, hogy a 3-PG az N-terminális doménen, az Arg 38 és az Arg 170 között kötődik. Ez a két aminosav, továbbá az Arg 21/Ys21, His 62/Ys62, Arg 65/Ys65, His 169/Ys167 és His 172/Ys170 alkotják az N-domén bázikus foltját. Ezen aminosavak helyspecifikus mutagenezissel történő cseréje megmutatta, hogy a 3-PG és a PGK kölcsönhatásában fontos szerepük van (ld. 1. táblázat). NMR mérések rámutattak, hogy a His-ek fontossági sorrendje a 3-PG kötésében: His 62/Ys62 > 169/Ys167 > 172/Ys170 (42), továbbá arra is, hogy a His 62 hidrogén kötés centrumként viselkedik a szubsztrát kötésében (44). A His 62/Ys62 Gln-ra történő cseréje gyakorlatilag alátámasztja ezt az eredményt (45). Az Arg 21/Ys21 mutációjának NMR-es vizsgálata rámutatott arra, hogy ezen oldallánc nem vesz részt a szubsztrátok kötésében, és a szubsztrátok K m értéke valószínűleg az enzim/szubsztrát H-híd rendszer részleges felbomlása miatt növekszik jelentősen (46). A mutációs munkák összességét tekintve azonban megállapítható, hogy az N-domén pontmutációi nagyobb mértékben károsítják a Az aminosav oldalláncok számozása az emlős PGK szekvenciájára vonatkozik valamennyi fejezetben, kivéve ha nincs külön jelezve, pl. Ys (Yeast), Bs (Bacillus stearothermophilus), Tm (Thermotoga maritima), Tb (Trypanosoma brucei). 8

17 3-PG-vel való kölcsönhatást, a MgATP-hez képest. Mindez azt sugallta, hogy a 3-PG az N-doménen kötődik. Az Arg 38/Ys38 Ala mutáns jellemzése pedig azt is megmutatta, hogy az Arg 38 az egyetlen esszenciális oldallánc az N-domén bázikus foltjának aminosavai között (45, 47) (ld. 1. táblázat k kat érték). 1. táblázat Az N-domén bázikus foltjá -n végzett pontmutációk hatása a szubsztrátok kötődésére, illetve az enzimaktivitásra (az adatokat 40, illetve 50mM szulfát jelenlétében mérték, kivéve az anionaktiválási kísérleteket, melyek alacsony ionerősségnél készültek) Aminosav Mutáció 3 PG m K növekedés faktora MgATP m K növekedés faktora k kat Anion aktiválás 3 PG d K növekedés faktora 21/Ys21 Arg Ala c % eltűnik Arg Lys g 8 3,6 25% eltűnik Arg Met g 4,3 4 15% eltűnik /Ys38 Arg Ala f 5 3,2 0,5-1% eltűnik 47 62/Ys62 His Gln c % nem változik 3 d His Ala f 5,4 4,2 85% eltűnik 43,6 65/Ys65 Arg Gln e 6 2,2 165% eltűnik 6 Arg Met e 5,4 2,2 165% eltűnik Arg Met h 21 4, % eltűnik >50 Arg Ala e 5,7 2,2 165% eltűnik Arg Lys h 2,2 1 kicsit nő csökken 4 122/Ys121 Arg Met h 2, % csökken Arg Lys h 2, % eltűnik 169/Ys167 His Ser c 10,5 1,5 40% eltűnik 170/Ys168 Arg Met a,g 7,8 3,5 20% csökken 15 b Arg Lys a,g 2,7 2,7 50% eltűnik 2,3 b Arg Gln c 19 2,3 55% eltűnik 172/Ys170 His Asp b 100% 4 a (48), b (42), c (45), d (44), e (49), f (47), g (46), h (50) (A mutáció feliratú oszlop hivatkozásai vonatkoznak az adott sorban leírt mutáció esetén a teljes sorra. Más esetben egy másik hivatkozással jeleztem ezt a megfelelő cellában. Az egyértelműen nagy hatásokat vastagon szedtem és aláhúztam.) Az 1992-ben Harlos és mti által közölt 3-PG-t kötő kristályszerkezet (19) egyrészt alátámasztotta az N-doménen való kötődést, másrészt megmutatta a kötődés részleteit (3.A ábra). A kristályszerkezet alapján a 3-PG foszfát-csoportjának oxigénjei hidrogénkötéseket, illetve ionos kölcsönhatásokat alakítanak ki a His 62, Arg 65, Arg 122 és Arg 170 oldalláncaival. A hidroxil-csoport, mely a D-sztereospecifitásért felel, az Asp 23 és az Asn 25 oldalláncával alakít ki hidrogénkötést. A karboxil-csoport ionos kölcsönhatásba lép az Arg 38 oldalláncával. További kölcsönhatás alakul ki egy 9

18 vízmolekulán keresztül a 14-es hélix Gly 396 peptid N-atomjával. A kristályszerkezet alapján megfigyelhető a 3-PG kötés hatására a 13-as hélix rendeződése is (a másodlagos szerkezeti elemek számozását ld. az 1. ábrán), továbbá az, hogy az N-domén közelebb kerül a C-doménhez, amely kb. 7,7 o -os záródást jelent (19). Ezt a 3-PG kötődési módot azóta már számos kristályszerkezet alátámasztotta (21-23, 25, 51) (ld. 2. táblázat), melyekből megállapítható, hogy az lényegében nem változik meg a nukleotid szubsztrát jelenlétében sem. A későbbiekben a T. maritima PGK-val közölt mindkét szubsztrátot (ill. analógot) kötő terner komplex már majdnem teljesen zárt szerkezetben kristályosodott (23). Az ebben a szerkezetben kötött 3-PG érdekes módon kölcsönhatást alakít ki a C-doménben elhelyezkedő konzervatív Lys 215/Tm197 aminosav oldalláncával is. Az eddig ismert számos PGK kristályszerkezetek közül csak a zárt szerkezetek azok, ahol ez a kölcsönhatás kialakul, ami annál is inkább figyelemre méltó, mert a Lys 215 teljesen konzervatív oldallánc és szerepe a katalízisben még nincs tisztázva. Az egyetlen feltételezés, hogy részt vesz a PGK aktivitását szabályozó anionok (2.8. fejezet) megkötésében, modellezés eredménye (52). 3. ábra A 3-PG kötőhelyének térszerkezete (A), valamint az 1,3-BPG lehetséges kötődési módja (B) Az A ábra a 3-PG kötődését (kék) mutatja a disznóizom PGK biner komplexében (19). A B ábrán az 1,3-BPG lehetséges kötődési módját a T. brucei PGK 3-PG*MgADP szerkezetében ((26), B lánc) kötött 3-PG, illetve foszfát*mgadp szerkezetében ((26), D lánc) kötött foszfát adja. (A két szerkezet összemásolása az ADP atomjai szerint történt.) A 3-PG-t zöld, a foszfátot piros golyós modell mutatja. A kölcsönhatásokat szaggatott vonal jelzi. A B ábrán a zárójelben lévő számok az emlős PGK szekvenciájára vonatkoznak. 10

19 2. táblázat Az eddig közölt röntgenkrisztallográfiás PGK szerkezetek összefoglaló táblázata Enzimkomplex Forrás Doménkonformáció Felbontás (Å) PDB kód Hivatkozás szubsztrátmentes lóizom nyitott 2,5 (16) 3-PG biner disznóizom nyitott 2,0 (19) MgADP biner B. stearothermophilus nyitott 1,65 1PHP (20) 3-PG*MgAMP-PNP disznóizom nyitott 2,0 (21) 3-PG*MgADP T. brucei zárt 2,5 13PK (26) 3-PG*MgAMP-PNP T. maritima zárt 2,0 1VPE (23) 3-PG*MgADP disznóizom nyitott 1,8 1HDI (25) 3-PG*MgAMP-PCP disznóizom nyitott 2,5 1KF0 (51) Az 1,3-BPG lehetséges kötődési módja Az 1,3-BPG szubsztrát kötődési módjára eddig nem született kristályszerkezeti adat, mivel az 1,3-BPG igen bomlékony anyag (t 1/2 = 6 h, ph=7,5, 10 o C (53)). Azonban a T. brucei PGK terner komplexét foszfátból kristályosítva (26) létre lehetett hozni az 1,3-BPG-t, mégpedig a következő módon: ebben a kristályban az aszimmetrikus egység négy PGK molekulát tartalmaz, ez a négy molekula két aszimmetrikus dimerre bontható. Ezen dimerekben az egyik molekula a 3-PG*MgADP terner komplex, a másik pedig a foszfát*mgadp pszeudoterner komplex. A két szerkezetet az ADP atomjai szerint összemásolva (a valódi terner komplexet a pszeudoterner komplexszel) azt találták, hogy a kristályban kötődő foszfát éppen az 1,3-BPG 1-es foszfátja helyén található (3.B ábra). Ez tehát egy lehetséges módja az 1,3-BPG kötődésének. 1,3-BPG analógok kötődését vizsgálták oldatkísérletekben NMR módszerrel (54), ugyanis inhibítorokat kerestek a PGK működésének gátlásához. Azt találták, hogy minden vizsgált ligandum képes kétféle orientációban is kötődni az N-domén bázikus régiójához, azaz a 3-PG korábban megjósolt, majd röntgendiffrakciós szerkezetekben bizonyított kötőhelyére. Azonban az analógok kétféle orientációjú kötődése közül nagyobb valószínűségű az, amikor a 3-as foszfátnak megfelelő csoport kötődik a 3-PG foszfátjának (a 3-as foszfátnak) a helyére. A nagyobb negatív töltéssel rendelkező difluor-dimetán foszfonát csoportot tartalmazó analógok esetén ez a kötődési mód még inkább kedvező. Megállapították azt is, hogy az inhibítor akkor kötődik szorosan, ha a 3-as foszfát csoport kétszeres negatív töltésű, az 1-es pozíciójú foszfát (átadódó foszfát-csoport) pedig egyszeresen negatív töltést hordoz. Tehát a 3-as foszfát kölcsönhatásai az N-terminális domén pozitív töltésű oldalláncaival fontosabbak, nemcsak az 1,3-BPG, hanem a 3-PG kötődésében is. Ezt alátámasztja az a megfigyelés is, hogy a 3-PG vizsgált szubsztrátanalógjai közül a glicerol-3-foszfát (G-3-P, a 3-PG karboxil-csoportja hiányzik) 11

20 jobb inhibítora a PGK-nak, mint a 2-foszfo-glikolát (2-PG, a 3-PG hidroxil-csoportja hiányzik) (55), továbbá a glicerinsav (a 3-PG foszfát- és hidroxil-csoportja is hiányzik) alig gátol. Tehát az inhibítor karboxil-csoportja kevésbé fontos a gátlás (azaz az enzimmel való kölcsönhatás) szempontjából a 3-as foszfát-csoporthoz képest A nukleotid kötőhely Röntgenkrisztallográfiás analízis egyetlen nukleotid kötőhely létezését mutatta a MgADP (16, 20, 22, 25), a MgAMP-PNP (21, 23, 56), ill. a MgAMP-PCP (51) kötődése esetén. Az oldatkísérletek azonban nem egyértelműek, ugyanis ahogy a 3. táblázatból kitűnik, számos publikáció két, míg mások egy kötőhely létezését bizonyították egyensúlyi dialízis, gélszűrés, kémiai módosítás, NMR, illetve az enzim valamely reaktív csoportja kémiai módosításának módszerét alkalmazva. 3. táblázat A nukleotid kötőhelyek számának meghatározása az irodalmi adatok tükrében Módszer 1 kötőhely 2 kötőhely Egyensúlyi dialízis (57), (58) (59) Gélszűrés (60), (61) Kémiai módosítás (51), (55) (62) NMR (41), (60) (63), (64), (65), (66) Fluorimetriás titrálás (67), (68), (69) A 90-es években elvégzett NMR vizsgálatok (65, 66) megmutatták, hogy mi lehet az ellentmondások magyarázata. Eszerint 3-PG és Mg 2+ távollétében az ATP vagy ADP a nukleotid szubsztrát valódi katalitikus helye helyett inkább alakít ki elektrosztatikus kölcsönhatást az N-terminális bázikus foltjával, azaz a 3-PG kötőhellyel, de azért kisebb valószínűséggel a kristályszerkezetekből ismert nukleotid kötőhelyen is kötődnek a fémionmentes nukleotidok az adenozin részükkel. Mg 2+ jelenlétében az ATP és az ADP már inkább a molekula adenozin részével kötődik a PGK-hoz, s ezért a kötődésben főleg a hidrofób kölcsönhatások dominálnak. Tehát Mg 2+ hatására csökken a nukleotidok affinitása az elektrosztatikus helyhez, s ha a Mg 2+ :ADP arány 1:1, akkor az elsődleges kötőhely a C-domén belső, hidrofób felszínén található katalitikus hely lesz. Munkám megkezdéséig nem volt olyan térszerkezeti adat, amely akár az ATP, akár az ADP kötődését mutatta volna meg fémion távollétében. Az ismert kristályszerkezetekben (ld. 2. táblázat) a MgADP kötődése igen jól jellemzett, mind az enzimmel alkotott biner komplexben (20), mind pedig 3-PG jelenlétében a terner komplexben (22, 25) (4.A ábra). A MgATP kötődéséről munkám 12