Transzgénikus modell állatok: genomikai megközelítések

Átírás

1 Transzgénikus modell állatok: genomikai megközelítések Vellai Tibor Eötvös Loránd Tudományegyetem Genetikai Tanszék

2 GENETIKA A jelen biológiai kutatások integráló diszciplínája (a legutóbbi 10 orvosbiológiai Nobel díj közül 6-ot genetikai kutatásokért ítélték oda). Alapvető célja: az öröklődés törvényszerűségeinek feltárása gének és géntermékek biológiai funkciójának meghatározása Eszköztára: funkció elrontása - mutagenezis szerkezet (információ) meghatározása - szekvenálás

3 Orvosi Nobel díj, 2002 Sydney Brenner I almost forgot to say that genetics will disappear as a separate science because, in the 21st century, everything in biology will become gene-based, and every biologist will be a geneticist. Sydney Brenner

4 Funkcionális megközelítés: gének funkciójának megváltoztatása genetikai boncolás I. mutáns analízis (forward genetika és reverse genetika) -gene knock out (génkiütés deléciók) -transzpozonok -fenotípusos elemzés (mutant screens) II. RNS interferencia - géncsendesítés (reverse genetika) (gene knock down) Klasszikus (forward) genetika: mutáns fenotípus gén Fordított (reverse) genetika: gén biológiai funkció (fenotípus) feltétele: genomi szekvenciák ismerete

5 A reverse genetikai világ alapja genomika (teljes genom szekvenciák ismerete) humán genom (23 pár kromoszóma)

6 DNA: the molecule of life DNA sequence Genome analysis

7 Reverse genetika A, B, PCR primerek Duplaszálú RNS (géncsendesítés) Random mutagenezis, deléciós allél izolálása PCR-alapú (a kisebb fragment preferáltan amplifikálódik)

8 Mutánsok elemzése a mutagenezis korszaka előtt Morgan iskola Spontán mutánsok izolálása fáradságos munkával Morgan csoportjában. Thomas Hunt Morgan Orvosi Nobel díj, 1933 Vad típus. Piros szemű (w + ) Fehér szemű mutáns (w - )

9 Vad típus Drosophila morfológiai mutánsok

10 Mutációk indukálása: Hermann Muller, a mutagenezis atyja mutagenezis a gén genetikai természete Muller s morphs: Amorph (null) Hypomorph (redukált) Hypermorph (túlaktivált) Antimorph (domináns-neg.) Neomorph (új funkció) Hermann J. Muller Orvosi Nobel díj, 1946

11 Mutációk típusai működés szerint Amorf: a funkció teljes elvesztése genetic null deficienciával szemben nem javít (klasszikus loss-of-function) Hipomorf: részleges funkcióvesztés (reduction-of-function) Hipermorf: funkciónyeréses mutációk (gain-of-function), sokszor a szabályozó régióban hiperfunkció vagy ektopikus expresszió (olyan sejtekben is, ahol normálisan nem expresszálódnak - sokszor domináns) Genetika Antimorf: a mutáció ellentétesen hat a vad típusú alléllel dominánsnegatív mutációk Neomorf: a vad típusú alléltól teljesen eltérő új funkció alakul ki

12 Muller morfok: amorf mutációk Teljes funkcióvesztés (loss-of-function) genetikai null mutáció Vad típus Vad típus mutáns homozigóta vad heterozigóta homozigóta mutáns Általában recesszív, néha domináns (ilyenkor haploinsufficient)

13 Muller morfok: hypomorf mutációk Részleges funkcióvesztés (reduction-of-function) Vad típus Vad típus mutáns homozigóta vad heterozigóta homozigóta mutáns Weak vagy leaky allél. A legtöbb báziscsere (szubsztitúció) ezt okozza.

14 Muller morfok: hypomorf és amorf (null) mutációk a white lókuszban Homozigóta! Homozigóta! White+/+ White-/- White-/- White+ (vad) White hypomorf White amorf

15 Muller morfok: hypermorf mutációk Funkciónyeréses (gain-of-function) mutációk Vad típus mutáns mutáns homozigóta vad heterozigóta homozigóta mutáns

16 Muller morfok: hypermorf mutáció a white lókuszban White+/+ White+ White+/- White hypermorf Mutációk általában a gén szabályozó régiójában (ektopikus expresszió) vagy a fehérje funkcionális doménjében (onkogenikus mutációk - pl. nem tud foszforilálódni)

17 Muller morfok: fenotípusok palettája Funkciónyeréses Funkcióvesztéses White gf/gf White+/+ White+/- White-/- hypermorf Vad típus hypomorf amorf

18 Muller morfok: antimorf mutációk Az antimorf allél terméke interferál a vad típusú fehérjével (pl. dimerizálódnak, és így a vad termék kititrálódik) Vad típus mutáns mutáns homozigóta vad heterozigóta homozigóta mutáns Már heterozigóta állapotban is megnyilvánul a mutáns fenotípus: domináns negatív mutáció

19 Muller morfok: antimorf mutáció a white lókuszban Vad típus mutáns mutáns White+/+ White+/- White-/- Homozigóta vad Heterozigóta! Homozigóta mutáns! Domináns negatív

20 Antimorf mutációk felismerése hypomorf White+/+ White+/- White-/- amorf White+/+ White+/- White-/- antimorf Már heterozigótában is!! White+/+ White+/- White-/-

21 Muller morfok: neomorf mutációk A neomorf allélek új funkciót adnak a fehérjének. Vad típus Vad / mutáns) mutáns homozigóta vad heterozigóta homozigóta mutáns

22 Muller morfok: neomorf fenotípus Pl. az Antp (Hox) gén ektopikus expressziója az antennát lábbá transzformálja (homeotikus mutáció). Vad morfológia Antennapedia mutáns antenna láb Antp+/+ Antp+/D

23 A mutagenezis célja: génjeink funkciójának megismerése Egyedfejlődésünk feltérképezése.

24 A mutagenezis célja: génjeink funkciójának megismerése Honnan jövünk... és merre tartunk?

25 Az ember, mint genetikai modell rendszer? Nem: hosszú generációs idő kicsi egyedszám (egy keresztezésből) nem mutagenizálható nem keresztezhető szabadon Valójában igen: szekvenálási hatékonyság természetes mutagenezis (betegségek) mutáns bankok (kórházakban) családfák (CEPH családok, LOD analízis)

26 Megoldás: genetikai modell szervezetek Bakétriumok Élesztő (egysejtű) Caenorhabditis elegans (fonalféreg) Drosophila melanogaster (rovar) Danio rerio (hal) Mus musculus (emlős) Arabidopsis thaliana (növény)

27 Génfunkciók és az egyedfejlődés alapvető kérdéseinek tanulmányozása genetikai modell szervezeteken Caenorhabditis elegans e n e G a k i t Drosophila melanogaster Mus musculus

28 és természetesen Arabidopsis thaliana

29 A fonalféreg Caenorhabditis elegans

30 A C. elegans kutatások kezdete Genetika Frontvonalak: idegrendszer működése egyedfejlődés szabályozása

31 Brenner levele a Nobel-díjas Max Perutz-hoz, az MRC igazgatójához Genetika

32 C. elegans, mint genetikai modell rendszer Előnyök: 1. Laboratóriumban könnyen fenntartható (agar tartalmú Petri lemezeken) 2. Egyszerű anatómia (959 testi sejt, 302 neuron. Transzparens test!!!) 3. Kis testméret (1.2 mm) 4. Nagy egyedszám (250 utód generációnként) 5. Gyors életciklus (kb. 3 nap 25 C-on) 6. Speciális szexuális dimorfizmus: önmegtermékenyítő hímnősek (hermafroditák) és hímek. A hímnősek a tiszta genetikai vonalak fenntartását (nincs hímekkel történő keresztezés), a hímek a genetikai vonalak kombinálást (pl. kettős mutánsok előállítása) teszik lehetővé.

33 Fenntartás

34 A C. elegans törzsek lefagyaszthatók Spontán háttérmutációk kiküszöbölése.

35 A C. elegans 3 napos életciklusa Aging modell

36 Morfológiai mutáns fenotípusok vad dumpy small long

37 Az embrió burka (egg shell) átlátszó: fénymikroszkóp segítségével az egyedfejlődés nyomon követhető Genetikai vizsgálatok egyedi sejtszinten (at the single-cell level)

38 Blasztoméra képződése Genetika

39 Orvosi Nobel díj 2002 C. elegans egyedfejlődése konzervált sejtleszármazás

40 Invariáns sejtvonal

41 5.30, 6.10

42 Apoptózis (programozott sejthalál) genetikai útvonala Robert Horvitz Nobel price, 2002

43 Egyszerű idegrendszer (302 neuron)

44 Az idegrendszer elektronmikroszkópos (sorozat)metszete

45 The mind of the worm

46 Idegrendszer-specifikus fehérjék expressziója in vivo

47 Az elsőként megszekvenált soksejtű genom mérföldkő az emberi genom megismerése felé Cosmid klón Kicsi genom: 100 Mbp

48 Genom annotálás: ORF-ek (open reading frame) meghatározása Splice variánsok

49 Genetikai transzformáció: instrumentumok mikroinjektor génpuska

50 Géntranszfer C. elegans csíravonal prekurzor sejtekbe

51 Expressziós analízis Mikor (az egyedfejlődés mely stádiumában) és hol (mely sejtekben) fejeződik ki egy gén. GFP: green fluorescent protein Expressziós vektor

52 Expressziós konstrukciók RE (restrikciós enzim) RE RE RE plazmid promóter STOP ATG GÉN (kódoló régió STOP jel) GFP plazmid frame unc-54 3 UTR Minden génre megtervezhető genom-szintű erőfeszítések. GFP analízis vs. antitest festés melyik jobb? Transzkripciós fúziós rendszer Transzlációs fúziós rendszer mutáns menekítés

53 GFP konstrukciók

54 GFP Martin Chalfie Nobel price in chemistry, 2008 Aequorea victoria, medúza

55 GFP, CFP, YFP, RFP GFP, CFP, YFP, RFP G: green C: cyan Y: yellow R: red

56 Neuronális GFP expresszió Neuronális GFP-RFP expresszió Ko-expresszió: sárga

57 daf-7 HSF-1 binding site Consensus: GAANNTTCNNGAA C. elegans: AGAAGCTTCCAGAAAA -278bp -strand C. briggsae: CGGAGCTTCTAGAAAA -284bp -strand C. remanei: GGAATTTTCTGGAAGT -317bp -strand C. brenneri: GGAAACTTCTAGAAGC -247bp +strand Kötőhely elemzés (irányított mutagenezis) 3,8 kb HSF-1 binding site ATG daf-7 GFP pdaf-7::gfp TTCTGGAAGCTTCT p mut daf-7::gfp TTCTGGAAGCTTCT pdaf-7::gfp p mut daf-7::gfp wild-type wild-type ASIs A HSF-1 köt a daf-7 promóterhez (gátol). hsf-1(-) hsf-1(-) Mutáns promóterhez nem tud kötni: nem represszálja az expressziót.

58 Genomszintű géncsendesítés Duplaszálú RNS specifikusan inaktiválja a szekvencia homológ endogén mrns-t. Transzlációs gátlás vagy mrns destabilizálás.

59 Öröklődő géncsendesítés

60 Zsíranyagcserét szabályozó gének genomi analízise C. elegansban Vad típus daf-2(-) daf-2(-);daf-16(-) daf-2 daf-16 Kevés lipid Sok lipid Kevés lipid Ruvkun és mtsi. Nature, 2003

61 Gének, melyek elhízást okozhatnak C. elegans gének Humán ortológ biológiai funkciója

62 Drosophila melanogaster (gyümölcslégy muslica)

63 A Drosophila életciklusa

64 A Drosophila embrió korai fejlődése

65 Szegmentáció és a sejtek szegment identitása az anteroposzterior tengely mentén korán kialakul 3 órás embrió 10 órás embrió lárva

66 Imaginális diszkuszok

67 Korai egyedfejlődés - anyai hatású gének korai letalitás, embrió polaritása mrns bicoid nanos fehérje

68 Korai egyedfejlődést befolyásoló mutációk izolálása Recesszív anyai hatású mutációk Screen F3-ban! Screen F2-ben!

69 A gap gének expressziós mintázata mutánsok hunchback Krüppel knirps

70 Korai lárva letális mutációk: a Drosophila lárva szegmentális mintázatának defektusai

71 Ko-linearitás Homeotikus szelektor gének Hox gének

72

73 Emlős Hox clusterek akár külön kromoszómákon Hox paralógok

74 A HOX fehérjék ko-faktorokkal válnak specifikussá (önmagukban nem tudnak specifikus szekvenciához kötődni) Ubx-Exd komplex HOX ko-faktork: Extradenticle, PBX és Homothorax fehérjék

75 Az A/P szegmentációs mintázatot kialakító hiearchikus génkaszkád

76 Korai embrionális fejlődés Ed Lewis Christiane Nüsslein-Volhard Eric Wieschaus 1995 Nobel díj: A korai embrionális fejlődés genetikája

77 Transzformáció érzőneuronok lárvában

78 UAS-Gal4 rendszer Gal4 élesztő transzkripciós faktor, ami a megfelelő DNS-szekvenciához köt a célgén promóterében (UAS upstream activating sequence), és elindítja a génexpressziót. dpp-gal4, UAS-eyeless

79 In vivo UAS-RNSi könyvtárak Eyeless RNSi

80 Flip rekombináz kötőhely Szomatikus klónok Flip rekombináz CD2 kivágása: promóter meghajtja a gal4-et Atg8::mCherry, GFP a GAL4 meghajtja az UAS promóter mögé kapcsolt gént Amelyik sejt zöld, abban van kikapcsolva egy adott gén. Kontroll az identikus környezet.

81 Atg2 RNSi

82 Zebrahal (Danio rerio)

83 Korai egyedfejlődés

84

85 A trópusi, édesvízi zebrahalat, a Brachydanio rerio-t, számos előnyös tulajdonsága miatt választottuk: a generációs ideje mindössze 3-4 hónap; a felnőtt nőstények heti rendszerességgel több száz ikrát raknak, amelyek gyorsan és szinkronban fejlődnek az anyán kívül; a hal kicsi (3 cm), szívós és könnyen tartható. A 7 napos, szabadon úszó halak mindössze néhány milliméter hosszúak, de már a kifejlett egyedek számos morfológiai és viselkedési bélyegét mutatják. Mindez lehetővé teszi a mutációk nagy léptékű szűrését. Mivel a normális fejlődés 25 és 31 C fok között zajlik, lehetőség nyílik hőmérsékletérzékeny mutációk izolálására is. Nature (1981) 291:

86 Keresztezési stratégia

87 Átlátszó In situ hibridizáció Fluoreszcens immunfestés Idegsejt-aktivitás detektálása in vivo Ca 2+ szenzitív festékekkel

88 Géncsendesítés - morfolino

89 Atg8:GFP Regenerációs modell

90 Regenerációs modell

91 Expressziós analízis

92 CRISPR RNS-vezetett Cas9 nuclease genom engeneering

93 Ismétlés: forward genetikai analízis Genomi szekvencia ismerete - targetálás Gene knockout-ot (deléciós mutációk) létrehozása bármely génre A célgén Marker gén X: rekombináció határoló szekvenciák Cre rekombináz A deléció

94 Eredménye Generation of the Ripply3 knockout mouse. deléció mrns szint

95 Dystrophin gén KO (kiütött) egér

96 Izom degeneráció dys gén: X-kapcsolt 1:3600 halálos Dystrophin gén mutáns ember: Duchenne muscular dystrophy

97 GFP analízis - génexpresszió