1/48/2001. RP7. A tumoros progresszió génexpressziós térképének kialakítása. Zárójelentés: május december 31.

Átírás

1 Nemzeti Kutatási és Fejlesztési Program 1. Főirány: Életminőség javítása Nemzeti Onkológiai Kutatás-Fejlesztési Konzorcium a daganatos halálozás csökkentésére 1/48/21 Zárójelentés: 21. május december 31. RP7. A tumoros progresszió génexpressziós térképének kialakítása. Dr. Tímár József Országos Onkológiai Intézet 1

2 RP7. A daganatos progresszió génexpressziós térképének kialakítása és felhasználása a prognózis megítélésére és új innovatív terápiás elvek kialakítására Témavezető: dr. Tímár József, Országos Onkológiai Intézet Résztvevők: dr. Németh Péter PTE Immunológiai Intézet dr. Puskás László MTA SZBK Dr. Hernádi Zsuzsa Pfizer kft. Dr. Sebeszta Miklós Janssen-Cilag kft A daganatok áttétképzésében szerepet játszó adhéziós molekulák és jelátviteli pályáik meghatározása 1.1. Paralell b3 integrin expressziós modell kialakítása emberi melanóma sejtvonalban Miután emberi melanómában azzal lehet számolni, hogy a két b3 integrin együttesen expresszálódik, ezért olyan avb3-integrint expresszáló humán melanóma vonalakat állítottunk elő, amelyekbe aiib és b3 gént transzfektáltunk. A klónok aiib expresszióját mrns és protein szinten kontrolláltuk. Valamennyi klón párhuzamosan expresszálta az av(b3) integrint, így modellezve a humán melanóma tumorok egyik fenotípusos jellegzetességét, a fokozott avb3 expressziót (Trikha et al.ijc22). 1. táblázat. Sejtfelszini b3 integrin expresszió human melanoma klónokban (flow cytometry) clone aiib b3 avb3 3.1 mock ESL F nd 19L ESH H Data are in % of positive cells (aiib and b3: mean+sem, n=3-6, avb3: average of two samples), nd= not determined A transzfektánsok in vitro proliferációs képességei változatlanok voltak, ugyanakkor SCID egerekbe oltva a primer tumorok növekedési üteme eltért, a kettős b3 integrint expresszáló klónok szignifikánsan jobban növekedtek in vivo. 1. ábra. aiibb3 transzfektált humán melanóma proliferáció in vitro és in vivo A/ In vitro növekedési ütem B/In vivo növekedés SCID egérben absorbance (BRdU+) cell number (x13) 3.1P 19L 19H volume (mean+sem, mm 3 ) Ez ellentmondásban látszott állni az in vitro eredményekkel, így megvizsgáltuk annak a lehetőségét, hogy emögött nem állhat-e fokozottabb vaszkularizáció és megállapítottuk, hogy days 3.1P 19L 19H 2

3 a transzfektánsokból képződő tumorok érdenzitása szignifikánsan emelkedett (Döme et al.24). 2. ábra. Transzfektáns melanóma klónok intratumorális érdenzitása SCID egérben A/ érdenzitás CD31 jelölés alapján B/ VEGF és bfgf protein mérés flow cytométerrel MVD/field (mean+sem) 2 * P 19L 19H % positive cells L 19H VEGF bfgf Következő lépésként megvizsgáltuk, hogy a két fő melanóma-angiogenetikus faktor expressziója milyen a transzfektánsokban. Immuncytokémiai és flow cytometriai vizsgálataink kimutatták, hogy változatlan és maximális VEGF expresszió mellett az alapklónban minimális a bfgf expresszió, míg az aiibb3 transzfektált (tehát av- és aiib-b3 integrint egyaránt expresszáló klónokban csaknem 1%-os lett a bfgf expresszió amit az in vivo növekedő tumorokban is igazoltunk (2b. ábra). A fokozott bfgf expresszió mögött két nagyságrenddel megnövekedett bfgf mrns szint áll kvantitatív PCR vizsgálataink alapján (Dömet et al.25). Jelenleg folyó vizsgálataink arra keresik a magyarázatot, hogy humán melanómában milyen genetikai tényezők játszanak szerepet az egyes szervekbe történő áttétképző képességben. Vizsgálataink szerint ugyanis egyazon tumor a különböző szervekben szignifikánsan eltérő extravazációs képességgel rendelkezik (Paku et al. 21). Valamennyi transzfektáns klón több szervbe is képes áttétet képezni (tüdő, máj, agy, csont) ezek között csak az áttétképzés hatékonyságában van eltérés, mert az aiibb3 transzfektált klón(ok) fokozott májáttétképző képességgel rendelkeznek. 2. táblázat. Metasztázis incidencia különböző szervekben b3 integrin transzfektált human melanoma klónokban Tüdő (i.v.) Máj (i.s.) Agy (i.c.) Csont (i.c.) clone 3.1P ESL ESH L H A tumorsejteket (1 6 /animals) i.v. (tüdő), intrasplenikusan (máj) illetve intrakardiálian (agy, csont) injektáltuk SCID egerekbe. 4-6 hét után az állatokat Nembutallal túlaltattuk és az egyes szervekben az áttéteket sztereomikroszkóp alatt számoltuk meg. Minden csoportban min. 5 állat volt. Az adatok az áttétek %-os gyakoriságát jelenti a csoporoton belül. 3

4 3. ábra. aiibb3 transzfektált melanóma klónok májáttétképző képessége SCID egérben májáttétek száma P ESL ESH 19L 19H aiib-kló nok 3.1P E S L E S H 19L 19H 1.2.A két b3 (αiiβ és av) integrin paralell expressziójának következményei: angiogenetikus fenotípus Vizsgálataink arra utaltak, hogy az αiibβ3 integrin transzfekciója αvβ3-at expresszáló humán melanóma vonalakba fokozza az apoptosis resistenciát, aminek következtében a sejtek tumorigenicitása növekedett. Ehhez azonban hozzá járult az is, hogy az in vivo növekedő tumorok kifejezettebb érdenzitással rendelkeztek, aminek egyik oka az volt, hogy a vizsgált transzfektáns klónban nagyságrendekkel emelkedett a bfgf expressziója, míg a VEGF szint konstitutíven magas maradt. Annak igazolására, hogy az αiibβ3 pozitív humán melanóma klónokban emelkedett az bfgf expresszió, szubklónoztuk az eredeti populációt és a kapott mintegy 1 klónt is megvizsgáltuk bfgf expresszióra qpcr módszerrel (Dömet et al.24). 4. ábra. aiib és bfgf expresszió kapcsolata transzfektáns humán melanóma klónokban (cytokémia és qpcr) αiib protein expression (% of cells) P E S L 8 F L E S H 1 9 H ( t r a n s fe c t e d c lo n e s ) Ahogy azt korábban bemutattuk, humán vizsgálataink arra utaltak, hogy a melanóma vastagságával (nagyságával) az αiibβ3 integrin expressziója nő, míg az αvβ3 expresszió konstitutiven magas marad (Trikha 22). Ezt a gondolatot emberi melanómás beteganyagon teszteltük, ahol kimutattuk, hogy az eltérő vastagságú és klinikai kimenetelű primer melanómák esetében, bár a peritumorális érdenzitás sokkal nagyobb mint az intratumorális, mégis az utóbbi denzitása függött csak össze az 5 éves túléléssel és a zsigeri áttétek kialakulásával (Döme et al.22). Ezek a megfigyelések azt erősítették, hogy az intratumorális érdenzitás növekedése felelős a szervi áttétek kialakulásáért a használt melanoma modellekben és felvetették, hogy ezért esetleg a megjelenő aiib(b3) integrin és következményes bfgf expresszió felelhet (Q-PCR relative unit) bfgf mrna expression 4

5 Kérdés volt továbbá, hogy a megnövekedett angiogenetikus képesség ténylegesen milyen érellátási formára való készséget jelent. Irodalmi adatok és saját vizsgálataink arra utalnak, hogy melanómában például elsősorban nem a klasszikus neoangiogenezis zajlik mint fő érellátási forma, hanem ér-kooptáció a domináló (Döme és mtsai 22), de az un. vaszkuláris mimikri is gyakori jelenség (Hendrix 23, Tímár és mtsai 21). Genetikai vizsgálatok szerint a vaszkuláris mimikri hátterében endoteliális gének neoexpressziója állhat. DNS chip vizsgálataink szerint a 19H transzfektáns vonalban, melynek intratumorális erezettsége jelentősen megnő több un. endotél-specifikus gén fokozott expressziója figyelhető meg: CD34, endotelin receptorb, PI2 szintáz, ami felveti annak a lehetőségét is, hogy az aiib ektópiás expressziója lehet egy olyan genetikai változás melanómában amely az endoteliális genotípus egyes elemeinek megjelenését indukálja A két b3 (αiiβ- és av-) integrin paralell expressziójának következményei: jelátvitel Az αiibβ3-/+ humán melanóma klónokban microarray vizsgálattal teszteltük a génexpressziós változásokat egy 32K humán cdns chipen az SZBK DNS-chip laboratóriumával kollaborációban. Első elemzéseink azt mutatták, hogy az αiibβ3 transzfektáns humán melanóma klónban az integrin-asszociált jelátviteli pálya több eleme is fokozottan expresszált: így a ABL, FYN, NEC2/3, TEC tirozin kinázok, valamint a farneziltranszferáz és a K-ras. (Fokozódás alatt >3x míg csökkenés alatt <5% expressziós változást tekintettünk). A lipid-szignálút vonatkozásában feltűnő volt a PLA 2, a PI-3K számos cyclooxygenáz és az általunk már korábban megfigyelt PKCα izoforma fokozott expressziója. (Ugyanakkor csökkent volt a FAK és a MAPK expresszió). 3. táblázat. Metasztatikus szignálútvonal expressziós változásai in vivo metasztatizálás során aiibb3 transzfektáns melanóma sejtvonalakban klón 3.1 (>3x) 19H (>5x) Tirozin-kaszkád Szerin/treonin kaszkád PKA PKCa c-abl EphA2 TEC NEK2 NEC3 K-ras Farnezil transzferáz PI3K PLA2 PKCa PKCb Ezen vizsgálatok több ponton is megerősítik korábbi megfigyeléseinket az ektópiás αiibβ3 melanóma sejtekben zajló jelátviteléről, hogy az ektópiás megakaryocyta integrin (αiibβ3) jelátvitele FAK-gátlással, illetve fokozott arachidonsav bomlással és fokozott 12-LOX és PKC aktivitással jár (Rásó et al.21). A kérdés azonban továbbra is fenn maradt, milyen molekuláris mechanizmus vezet az ektópiás aiib(b3) integrin expresszió esetében a jelentős génexpressziós profilbeli változásokhoz. Irodalmi adatok utalnak arra, hogy a b3 integrin lánc különleges abban a tekintetben, hogy citoplazmatikus doménje endonexin fehérjével áll kapcsolatban (Shattil,1995). Az endonexin kétféle szerepet tölt be, egyrészt a b3 lánc jelátvitelét szabályozza, mediálja egy közelebbről még nem ismert módon, másrészt transzkripciós faktorként is szerepel, s így ennek révén a b3 integrin aktiválódása direkt transzkripciós változásokat indukálhat. Ismert target génjei a THRA, RXR, NFkB és a cyclina (Ohtoshi,2). Ennek ismeretében felmerült, hogy emberi melanómákban a b3 integrin fokozott expressziója endonexinen keresztül jelentős transzkripciós változások kiváltója lehet. 5

6 4. táblázat. Endonexin expresszió humán melanómában in vitro (QPCR/+ DNSchip) Q-PCR WM35 (nem metasztatikus) 1 HT A WM983B 1 3.1P.3 19H 6.5 Különböző biológiai aktivitású humán melanóma vonalainkban in vitro meglehetősen egyenletes szinten van a b3endonexin expresszió QPCR vizsgálatok szerint. Feltűnő ugyanakkor, hogy az igen alacsony aiib expressziójú (csak avb3-at kifejező) 3.1P klónunkban milyen alacsony az endonexin expresszió és ehhez képest az aiibb3 transzfektált 19H vonalban ez a szint több mint 2x magasabb. Ez a jelentősen megemelkedett endonexin expresszió már magyarázatot adhat az észlelt globális génexpressziós változásokra. Továbbmenve azt is megvizsgáltuk, hogy hogyan alakul az b3endonexin expresszió in vivo körülmények között a tényleges áttétképzés során. Olyan modellt használtunk SCID egerekben, amikor spontán áttétképzés csak újszülött egerekben van, felnőttben nincsen és a kétféle primer tumort hasonlítottuk egymáshoz, illetve a primer tumort a belőle keletkezett áttétéhez. A 3.1P vonal esetében a kétféle primer tumor között gyakorlatilag nem volt jelentős endonexin expresszióbeli eltérés csak az áttétekben emelkedett meg a szint ~5x mértékben. A 19H vonal esetében ezzel szemben már a metasztatikus primer tumorban létrejött egy 5x mértékű endonexin expresszió fokozódás amely az áttétekben már nem emelkedett tovább. 5. táblázat. Endonexin expresszió in vivo aiibb3 transzfektáns klónokban (DNS chip) Metasztatikus primer/ Metasztázis/primer Nem-metasztatikus primer 3.1P <.6 >5 19H >5 <.9 Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy a b3 integrin asszociált transzkripciós faktor endonexin expressziója az emberi melanóma áttétképzése során jelentősen fokozódik. Felmerül annak a lehetősége, hogy endonexin expresszió alapján esetleg prognosztizálni lehet a primer tumor alapján annak későbbi biológiai viselkedését/áttétképzését is. Ehhez azonban a piacon még nem létező monospecifikus antitest előállítására van szükség. 6

7 7.1.3a. A vaszkuláris adhéziós protein (VAP1) expressziója és szerepe melanómában A daganatok vérellátásának több mechanizmusa lehetséges amelyek egymás mellett is működhetnek: neoangiogenezis, ér-inkorporáció, glomeruloid érfonat-képzés (Döme és mtsai 23) és vaszkuláris mimikri. A daganatos erek számos ponton eltérhetnek a normális erektől: átmérőjük változékony, permeabilitásuk fokozott és a fal defektív, abnormális bazális mebránnal és pericyta köpennyel. Fenotípusát tekintve a tumoros erekben atradicionális érmarkerek (Cd1, CD34, CD15) hiányozhatnak, de eltünhetnek más adhéziós molekulák is, mint a E-szelektin vagy a VE-cadherin. A VAP1 adhéziós protein egy 9 kd transzmembrán fehérje, amelynek extracelluláris doménje monoaminooxidáz aktivitással rendelkezik és normálisan fehérvérsejtek extravazációjában játszik szerepet. Korábbi vizsgálataink arra hívták fel a figyelmet, hogy a malignus melanomában található intratumorális ereknek jelentős szerepük lehet a daganatok áttétképzésében (Döme és mtsai,22), azonban ennek módja illetve mechanizmusa még tisztázatlan. Ezért jelen periódusban a korábban még nem vizsgált új endothel-adhéziós molekula a VAP1 expresszióját vizsgáltuk 28 primer bőr melanómában immuncitokémia és immunhisztokémia valamint immunelektronmikroszkópia segítségével és morfometriával kombináltuk. Normál bőrben az epidermis-közeli mikroerek endothelje VAP1 pozitiv volt, míg a mélyebb erekben elsősorban a pericyták mutattak reakciót. 5.ábra. Normál bőr mikroerek VAP1 expressziója E P A/ confokális mikroszkópia VAP1: zöld, mag: kék, BM: piros b/ immunelektronmikroszkópia VAP1: elektrondenz precipitátum Melanómák körül a peritumorális érdenzitás igen magas és ezeken a területeken az új erek erős VAP1 pozitivitást mutatnak. Ugyanakkor a daganat belseje felé haladva az intratumorális erek egyre inkább elvesztik VAP1 pozitivitásukat, ami mind az endothel, mind a pericytát érinti. 6. ábra. VAP1 expresszió primer bőr melanomában (immuncitokémia) PT IT Fehér: tumor/stroma határ. PT peritumorális terület, IT intratumorális terület. Zöld: VAP1, piros: laminin 7

8 Az intratumorális erek csökkent VAP1 expresziója (amit az intratumorális erek VAP pozitivitási %-ban fejeztünk ki) nem függött a daganatok vastagságától, gyakorlatilag amint a tumornak volt dermális komponense, a jelenség egyöntetüen megfigyelhető volt. 7. ábra VAP1+intratumorális/peritumorális erek gyakorisága a melanoma vastagságának függvényében. % VAP-1+ vessels (mean+sem) PT IT < >4 mm Az intratumorális erek melanomában pericytákkal borítottak (Döme és mtsai 22) így felmerült, hogy a VAP1 expresszió csökkenése/megszűnése esetleg a pericyta boríték elvesztése miatt történik. Kettős jelöléses vizsgálatok szerint azonban a melanoma intratumorális ereinek pericyta borítéka megmarad, csak a VAP1 expresszió vész el. A VAP1 adhéziós molekula mint azt más rendszerekben közölték, a limfociták/leukociták extravazációjában játszik szerepet. Melanóma esetében felmerült hogy az immunreakciót befolyásoló tényező lehet. Az intratumorális antigén prezentáló sejtek vagy CD8 citotoxikus T sejtek denzitása nem tért el jelentősen a magas vagy alacsony VAP1 expressziót mutató melanomákban, ami arra utal hogy az intratumorális erek ezen megváltozott fenotípusa a tumort infiltráló sejtek denzitására hatástalan. Ugyanakkor megfigyeltük, hogy csökkent VAP1 expresszió a primer tumorban (<25%) jelentősen csökkentette a betegek 5 éves túlélését (26.3% illetve 42.6%) (12. ábra), a két csoport vastagsága nem tért el szignifikánsan. 8. ábra. Melanomás betegek 5 éves túlélése az intratumorális erek VAP1 expressziós szintje alapján. survival fraction.9 VAP>25 (n= 7).8 VAP<25 (n=19) months Mindezen megfigyeléseink arra utalnak, hogy a melanoma intratumorális ereinek 1./ jelentősége van a daganat progressziójában, 2./megváltozott a fenotípusa (csökkent VAP1 expresszió), amit prognosztikus faktorként is fel lehetne használni (Forster-Horváth Cs és mtsai 23). 8

9 7.1.4.Humán fibrosarcoma sejtek mozgása in vitro Kísérleteinkben megállapítottuk, hogy a HT18 humán fibrosarcoma sejtek in vitro Matrigélen félkör alakot vesznek fel, amely alakot megtartják mozgásuk során (1. ábra). Ez a megfigyelés jelentősen különbözik a korábbi tapasztalatokhoz, amely szerint a fibroblasztok mozgása során a vezető membránjuk kitüremkedését egy farok rész retrakciója követ. A HT18 sejtek mozgása ezzel szemben a halak keratocitájának mozgásával mutat hasonlóságot, azzal a különbséggel, hogy a tumorsejtek mozgása sokkal lassabb. Megvizsgáltuk a sejtekben az adhéziós helyek, valamint a sejtváz komponenseinek eloszlását a mozgás során. Kimutattuk, hogy a sejtekben az adhéziók csak a sejtek széli részén helyezkednek el félkörben, és a mozgás során a sejtek alatt csak elvétve képződnek. 9. ábra. HT18 humán fibrosarcoma sejt alakja in vitro migrációja alatt Matrigélen. 1. ábra. Adhéziós plakkok kimutatása in vitro migráló humán fibrosarcoma sejtekben. Vinculin immunfluoreszcencia (a), foszfotirozin-tartalmú proteinek kimutatása (b). a b A citoszkeleton elemek, az α-aktinin (3a ábra) és a miozin (3b ábra), valamint az aktinkötegek (4. ábra) elhelyezkedésének eloszlásából megállapíthattuk, hogy a sejtmozgáshoz szükséges kontrakció közvetlenül a membrán mögött keletkezik a mozgó sejtekben. 9

10 11. ábra. α-aktinin (a) és miozin (b) molekulák eloszlása in vitro migráló humán fibrosarcoma sejtekben. a b 1µm 12. ábra. Aktinkötegek elrendeződése in vitro migráló humán fibrosarcoma sejtekben. Az adhéziós plakkok mozgásának dinamikáját is megvizsgáltuk a mozgó tumorsejtekben. Ehhez a sejteket transzfektáltuk GFP-vinkulin plazmiddal, és a mozgást konfokális mikroszkóppal követtük sorozatfelvételeket készítve. Az eredmények azt mutatják, hogy az adhéziós helyek a sejtek felszínén képződnek, és néhány perc múlva, amikor a sejtek elhaladnak felettük, meg is szűnnek A mozgásuk (természetesen nem egyedi plakk mozgásáról van szó) leírására alkalmas a hal keratociták mozgásánál felfedezett GRE (Graded Radial Extension) modell. Ez a modell azt állítja, hogy a mozgás során a sejtmembrán minden pontja merőlegesen mozdul el a felszínre, mégpedig csökkenő távolsággal (legnagyobb a sejt elején, legkisebb a sejt két oldalsó végén). Ennek megfelelően a sejtfelszín pontjai előre és oldalra irányuló mozgást mutatnak a migráció alatt, a sejt két oldalán természetesen ellenkező irányba. A transzfektált sejteken jól láthatóan kirajzolják az adhéziós plakkok ezt a kétoldali plakk-elmozdulást. 1

11 13. ábra. Adhéziós plakkok dinamikája in vitro mozgó humán fibrosarcoma tumorsejtben. Kiindulási helyzet (a), 3 perces elmozdulás sorozatfelvételei egymásra vetítve (b). a b 1µm A citoszkeleton elemek elhelyezkedése valamint az adhéziós plakkok dinamikájának vizsgálatával felállítottunk egy új modellt a humán fibrosarcoma sejtek migrációjára (6. ábra). Ez a modell a már korábban leírt GRE-modelt használja, és jelentősen különbözik a fibroblasztok mozgását leíró eddigi elképzelésektől. A mozgás során az adhéziós plakkok kizárólag a sejtmembrán frontján keletkeznek, és gyors turnover-ük van. Több adhéziós komponens egyszerre található meg ezeken a helyeken, tehát nincs adhézió érése/öregedése a tumorsejtekben. Az adhéziók dinamikája azt mutatja, hogy az új adhéziós helyek folyamatosan keletkeznek az előzőek előtt egy kicsit oldalra mozdulva. Az aktinkötegek, amelyek az adhéziókat kötik össze íveket formálnak, amelyek konkáv felszínei néznek a mozgás irányára. Ennek megfelelően az aktintól eredő erő merőleges a mozgás irányára. A miozin és az α-aktinin közvetlenül a membrán alatt is megtalálható, és mennyiségük fokozódik a mag felé, amelyből arra következtethetünk, hogy a mozgáshoz szükséges aktin-miozin filament csúszás már a membrán mögött azonnal kialakul. Az aktinkötegeknek folyamatosan kell nőniük a sejt legnagyobb átmérőjéig, ahol az adhéziókkal együtt bekerülnek a sejttestbe és lebomlanak. Látható, hogy ebben a modellben nincs hátsó vége a sejteknek, nincsenek adhéziók a sejttest alatt vagy esetleg a végében, hiszen ezek az adhéziók csak hátráltatnák a sejtmozgást. 14. ábra. Hipotetikus modell in vitro migráló HT18 humán fibrosarcoma sejtek mozgásának leírására t 4 t 3 t 2 adhéziók aktin kötegek sejt frontja erők az aktinról és a szubsztrától t 1 11 t start

12 Motilitással összfüggő gének expressziója humán melanómában metasztatikus és nem metasztatikus körülmények között. A sejtek mozgásának szabályozásában parakrin és autokrin faktorok egyaránt részt vesznek. Korábbi kutatásainkban sikerült kimutatni, hogy az egyik legjobban ismert autokrin szabályozó, az autocrin motilitási faktor (AMF) fontos szerepet játszik egér melanóma sejtek mozgásának szabályozásában. Korábbi vizsgálataink során meghatároztuk az AMF receptoráról (gp78) induló szignálútvonalak egyes komponenseit. Ezek szerint a gp78-hoz kapcsolt G proteinek aktiválódása után a szignál foszfolipáz A2-n (PLA2) keresztül arachidonsav (AA) bontásával folytatódik, amelyet lipoxigenázok (LOX) és ciklooxigenázok (COX) végeznek. Ezek után a szignál jelentős protein kináz C alpha (PKC) aktivitás-fokozódást eredményez, majd több foszfoszerin foszfatáz (PSPP) és protein tirozin kináz aktiválódik (PTK), amelyek már az effektorfunkciókban is szerepet játszanak (pl. citoszkeleton elemek átrendeződése). Azt is kimutattuk korábban, hogy az AMF receptor humán tumorvonalakon és klinikai melanóma mintákban is expresszálódik, és az expressszió mértéke összefüggést mutatott a klinikai stádiummal (Tímár és mtsai 1999,22). Irodalmi adatok szerint a sejtmozgás effektor funkcióinak szabályozásában kis G-proteinek játszanak kulcsszerepet. A rho/rac/cdc42 kis G-proteinek a sejtmozgás különböző eseményeit irányítják (stressz rostok kialakulása, lamellipodia képződése, filopódia megjelenése), és több molekulát magában foglaló folyamat kiindulópontjai. Jelen vizsgálatainkban arra voltunk kíváncsiak, hogy a már korábban leírt, a motilitás szabályozásában részt vevő szignálkomponensek expressziójában van-e valamilyen különbség metasztatizálást megengedő és gátló környezetben növekedő humán melanóma xenograftokban. Ehhez β3-integrinnel transzfektált humán melanóma sejteket oltottunk felnőtt és újszülött SCID egerekbe subcután. A tumorok újszülött egerekben mindig képeznek tüdőáttétet, míg felnőttben nem tapasztalunk ilyet. Az összehasonlító vizsgálatban metasztatikus és nem metasztatikus körülmények között növekedő primer daganatokból RNS-t izoláltunk, és 32 gént tartalmazó DNS hibridizációs chipen teszteltük (SZBK DNS chip Labor). Az eredményekből megállapítható, hogy a korábban egér melanómában leírt AMF szignálútvonal több komponensének expressziója jelentősen (több mint ötszörösére) fokozódik a metasztatikus körülmények között növekedő primer daganatban. A legmagasabb expresszió-fokozódást a PKCα esetében tapasztaltuk, amelynek melanoma sejtmozgásban betöltött kulcsszerepét több közleményünkben is leírtuk. Ezen felül azonban fokozott expressziót mutatott több, a lipidszignálban résztvevő elem is (K-Ras, PLA2, PI3K, COX1, TXS), valamint számos tirozin-kináz (Abl, TEK, TEC, NEK, EphA). 15. ábra. Korábban leírt AMF szignálútvonal egyes komponensei expressziójának összehasonlítása metasztatikus és nem metasztatikus körülmények között növő humán primer melanómákban. (lilával azon gének, amelyek expressziója >5x volt az áttétképző tumor szövetében). KRas 5x< PI3K5x< 1x 13x Ezrin 5X TXS 5x< NEC3, TEC, NEK2 EphA 5x< 12

13 A motilitás effektor-funkcióit szabályozó molekuláris útvonalak egyes komponenseinek expressziójában is jelentős változást találtunk a metasztatikus körülmények között levő primer melanómában a nem metasztatikushoz képest. A legjelentősebb különbségek a stresszrostok kialakulását szabályozó útvonalban mutatkoztak (Rho, mdia, LIMK), amelyben biztos hogy szerepe van a PKCα-nak is, de más upstream-elemek is fokozott expressziót mutattak, mint pl. az NWASP. 16. ábra. A daganatsejt-mozgás végrehajtásában résztvevő szignálútvonalak egyes komponenseinek expressziója metasztatikus körülmények között növekedő humán melanómában (lilával azon gének, melyek >5x expressziót mutattak). 5x 1x 2x 13x 2x Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a korábban egér melanoma modellben általunk felállított motilitási jelátviteli pálya számos eleme emberi melanomában is kimutatható, még in vivo körülmények között is. Továbbmenve, az a tény, hogy az áttétképző tumorszövetben ezen gének közül számos expressziója jelentősen fokozódik arra utal, hogy ezen motilitási jelátviteli pályának az áttétképzésben is kiemelkedő szerepe van. Harmadrészt, az a tény, hogy ugyanazon génkészlettel rendelkező melanoma sejtek metasztatizálást megengedő környezetben mutatnak ilyen jellegzetes expressziós profilt, arra utal, hogy a szöveti környezet fontos szabályozója a daganatsejtek metasztatikus képességének. 13

14 7.2. A tumorsejtek ektópiás génexpressziójának felhasználása a differenciáldiagnosztikában és prognosztikában (Tímár et al.21a) Humán melanóma sejtvonalakban és mintegy 3 emberi melanómában mutattuk ki az αiib(β3) megakariocita integrin illegitim expresszióját. Vizsgálataink szerint az integrin közeli rokona, az általánosan expresszálódó avβ3 vitronektin receptor konstitutive expresszálódik emberi melanómában, míg az αiib(β3) megakariociter integrin a tumor vastagságának növekedésével párhuzamosan jelenik meg és a vastag, rossz prognózisú esetekben expressziója hasonló az avb3 integrinéhez (Trikha et al. 22). 7.táblázat. β3 integrinek expressziója primer bőr melanómában. Immunhisztokémia, konfokális lézer scanning mikroszkópia. vastagság αiib (β3) αv (β3) <1.5 mm > * Az adatok a + tumorsejtek %-át jelölik Az ektópiás aiibb3 genetikai szerkezete Vizsgálataink során állandó problémát okozott az annak a ténynek a magyarázata, hogy szemben a trombocitával daganatsejtekben az ektópiás aiib(b3) integrin minden kisérleti adatunk szerint un. aktív magas affinitású konformációban van jelen (Trikha et al.1997, Tímár et al.1998). Normális körülmények között ez más integrinek esetében csak ligand-kötéskor, trombociták esetében pedig aktiválódáskor jön létre. Felmerült az, hogy ennek a konstitutív aktív konformációnak, aminek funkcionális következménye az állandóan bekapcsolt jelátviteli pálya (FAK tirozin-fiszforiláció) esetleg az aiib lánc szerkezeti változása állna. Kollaboráló munkacsoportom bemutatta, hogy az aiib integrin-lánc daganatokban citoplazma-domén hiányos formában is megjelenhet (Trikha 1998). A nyitott kérdés csak az volt, hogy ez új splice variáns-e vagy igazi génkárosodás eredménye. Ezek a megfigyelések fordították figyelmünket az aiib lánc szerkezetének vizsgálatára, ugyanis az emberi örökletes véralvadási/trombasténiás zavarok jelentős részében az aiib integrin lánc mutációja mutatható ki, azonban ezen károsodások valamennyien az integrin extracelluláris doménjét érintik. A különféle trombasténiákban vagy maga a ligand kötő régió vagy az un Ca-kötő béta-propeller régiók (amelyből 4 van az aiib láncban) károsodnak (Mitchell,23). Ezért olyan primereket terveztünk amelyek aiib specifikus Ca-kötő domén azonosítására alkalmasak. A probléma azért nehéz, mert ebben a régióban (is) meglehetős homológia van a másik, sokkal gyakoribb integrin az αv vonatkozásában. 17. ábra. aiib lánc mrns kimutatása humán melanómában nested PCR és qpcr segítségével. A/ nested PCR: αiib extracelluláris régió outer primer gradiens és ionkoncentráció kalibráció 14

15 B/ Real-time PCR kalibráció: 25mM, 65 C zöld: extracelluláris régió outer lila: intracelluláris régió - outer Az aiib extracelluláris doménjét a 19H aiibb3 transzfektánsban vizsgáltuk nested PCR segítségével. Meglepetésünkre 2 reakció-terméket kaptunk, melyek szekvenálása során a várt és autentikus (wt) aiib mellett egy kisebb termék is megjelent a 19H sejtekben. A termék szekvenálása a nukleotida régióban deléciót jelzett, ami gyakorlatilag 3 aminósav deléciónak felelhet meg ( ) ábra. aiib extracelluláris domén nukleinsav és aminósav szekvencia jelölve a 19H melanómában észlelt eddig még pontosan nem jellemzett eltérést. A/ nukleinsav-szekvencia 181 accgaaaact ggccgaagtg gggcgtgtgt atttgttcctgcagccgcg ggcccccacg 1141 cgctgggtgc ccccagcctc ctgctgactg gcacacagct ctatgggcga ttcggctctg 121 ccatcgcacc cctgggcgac ctcgaccggg atggctacaa tgacattgca gtggctgccc B/ aminósav sorrend 31 ldsyyqrlhr lraeqmasyf ghsvavtdvn gdgrhdllvg aplymesrad rklaevgrvy 361 lflqprgpha lgapsllltg tqlygrfgsa iaplgdldrd gyndiavaap yggpsgrgqv 421 lvflgqsegl rsrpsqvlds pfptgsafgf slrgavdidd ngypdlivga yganqvavyr A régió (AA ) az aiib nehézlánc Ca-kötő 2. béta-propeller régiójában helyezkedik el. Irodalmi adatok szerint a 374 pozicióban aminósav-csere megakadályozza az érett aiib lánc keletkezését, trombasténiát okoz (Michell,23). Mutagenezis vizsgálatok ebben a régióban azonban azt is kimutatták, hogy a környező aminósavak is befolyásolják a Ca++ kötést és az aiib lánc érését és a régió bizonyos aminósav-cseréi az aiib lánc fokozott stabilitásához és ami ennél is érdekesebb, az un. aktív, magas affinitású konformáció konstitutív kialakulásához vezethet. Saját funkcionális vizsgálataink a humán melanóma vonalainkon azt mutatják, hogy különböző mértékig de az aiibb3 komplex magas affinitású konformációban van jelen a sejtfelszinen és igen ritka az aiibb3 hiánya, különösen nem áll ez a 19H klónra. A megfigyelt Ca-kötő régió-beli aminósav deléció nagy valószínüséggel nemhogy nem akadályozza meg a kóros fehérje felszinre jutását aiibb3 komplexben, hanem valószínüleg a konstitutív aktiváltság egyik okozója is lehet. Másik okként természetesen az aiib lánc citoplazmatikus domén-deléciója is állhat (ami a transzfektáns modellünkben természetesen nem állhat fenn). Ezek a vizsgálatok arra irányítják figyelmünket, hogy egy adott adhéziós molekula expressziója malignus daganatban önmagában még nem szolgáltat elegendő magyarázatot az esetleges különös vagy domináns funkciójára, annak hátterében génszerkezeti eltéréseket is érdemes keresni... 15

16 Thrombocyta Lipoxygenase Az arachidonsav a jelátviteli rendszerek egyik általános hirvivő-forrása, melynek átalakítását a ciklo- és a lipoxigenáz rendszerek végzik. Elsőként mutattuk ki molekuláris biológiai módszerekkel humán melanóma sejtvonalakban és sebészi anyagban, hogy a melanómában kórosan expresszálódik a thrombocita-típusú 12-lipoxigenáz enzim (Timar es mtsai 21bc) 19. ábra. p-12-lipoxigenáz enzim expressziójának kimutatása humán melanóma sejtvonalakban A/ nested-pcr B/ Western blotting =MW, 2=+CTR, 3-6=WM35,WM983B,HT168, HT168M1(humán melanómák),7víz Egyúttal azt is bemutattuk, hogy az enzim expressziója az invazívabb vastag tumorokban fokozódik. Ezek a vizsgálataink megerősítik korábbi megfigyeléseinket, hogy a 12- lipoxigenáz enzim a daganatos progresszióban érintett jelátviteli pályákban fontos szerepet játszik Heparán szulfát proteoglikán A melanómák sejtfelszini heparánszulfát proteoglikán expressziójának jelentőségét a progresszióban már évekkel ezelőtt megfigyeltük (Tímár et al.22), ugyanakkor nem volt ismeretes, hogy melyik konkrét proteoglikánról van szó. Vizsgálataink során kimutattuk, hogy a CD44 molekula v3 splice variánsa, mely HSPG funkciót tölt be, a humán melanómák egy részében expresszálódik RNS és fehérje szinten. Mintegy 5 emberi melanóma vizsgálata során azt találtuk, hogy a CD44v3 expresszió az áttétképző daganatokra jellemző (azok mintegy felében van jelen), és ezesetben a betegek 5 éves túlélése szignifikánsan rosszabb mint a negatív daganatos betegeké (Döme et al.21). 2. ábra. Malignus melanómás betegek 5 éves túlélése a CD44v3 expresszió függvényében. % survival CD44v3 negative (n=24) CD44v3 positive* (n=14) 7 6 MMP-2CD44v3-= MMP-2CD44v3+= ** months 16

17 Szintén elsőként igazoltuk emberi melanóma sejrtvonalakban és sebészi anyagban egy kötőszöveti alkotó elem, a TGFβ-t szabályozó decorin gén expresszióját. Vizsgálataink szerint a gén kóros formában van jelen és ennek tulajdonítjuk, hogy a fehérje nem befolyásolja a TGFβ biológiai hatásait melanómák esetében (Ladányi és mtsai 21, Tímár et al.22). Eddigi vizsgálataink szerint a decorin nincsen jelen melanocitákban nevusban és dysplastikus melanocita léziókban, ami felcsillantja annak a lehetőségét, hogy ezen kóros génexpresszió a malignus átalakulás indikátora lenne melanómában. Ennek jelentősége az, hogy jelenleg ilyen indikátorral nem rendelkezünk. A melanómák erezettsége és ennek jelentősége a progresszióban már régóta vita tárgya az irodalomban. Munkánk során mintegy 5 emberi melanómában vizsgáltuk az erezettséget és annak összefüggését a betegség kimenetelével. Megállapítottuk, hogy bár a daganatkörüli erezettség jóval magasabb mint a tumoron belül ennek nincs klinikai jelentősége, csakis a daganatszigeteken belüli érdenzitásnak. Ennek valószínű oka az hogy itt történik a daganatsejtek intravazációja, a hematogén áttétképzés első lépése. Megállapítottuk, hogy egy bizonyos intratumorális erezettség alatt (3/mm 2 ) a betegek 5 éves túlélése csaknem 1 % (Döme et al. 22) ábra. Malignus melanómás betegek 5 éves túlélése a daganaton belüli érdenzitás függvényében a l u rviv s % Autokrín motilitási faktor receptor Az áttétképzésben kiemelkedő szerepet játszó sejtmozgást meghatározó autokrín motilitási faktor receptorának (AMFR) kiterjedt expresszióját találtuk humán melanóma sejtvonalakban és sebészi anyagban. Kisérleti körülmények között kimutattuk, hogy a receptor expressziója az áttétképző képességgel fokozódik. A klinikai anyagban bemutattuk, hogy a vastag tumorokban (melyek áttétképző hajlama jelentősen kifejezettebb) az AMFR expresszió is jelentősen megnőtt (Tímár et al.22). 22.ábra. AMF-receptor expressziója emberi primer bőr melanómában (immunhisztokémia, konfokális lézer scanning mikroszkópia) A % of cases months MVD<3 MVD>3 mm < >4. n=24 n=16 n=14 weak heterogenous diffuse/strong 17

18 7.2.. Melanoma specifikus génexpressziós profil meghatározása A klinikai és patológiai gyakorlatban használatos melanoma-markerek gyakorlatilag nem azok: valamennyien melanocyta-markerek. Globális génexpressziós vizsgálatok többszörösen igazolták, hogy a melanocyták markerei a tyrosinase, tyrbp1, dopachrom-tautomerase (DCT), S1B és a MART1/MelanA amelyek a nevusokban és melanomákban is különböző gyakorisággal és intenzitással megmaradnak. Emellett kiderült, hogy a melanocytákban több jellegzetes transzkripciós faktor (PAX3, SOX1, SLUGH, MITF) és tirozin kináz (c-met, c- kit, c-erbb3) expresszálódik. Miután a mindennapi gyakorlatban nagy szükség lenne malignus-melanoma-specifikus markerre, hiszen egyre gyakoribbak az un. borderline nevussejtes elváltozások célul tűztük ki ilyen gének kutatását. A korábbi vizsgálatok legnagyobb hibájául az róható fel, hogy a melanoma szövet/sejtvonal génexpressziós profilját normál bőr vagy másfajta tumorhoz hasonlították és nem nevushoz (azaz jóindulaú melanocyta daganathoz) ami a mindennapi differenciáldiagnosztika gyakori problémája. Mi 32 cdns klonból álló chipen vizsgáltuk 4 különböző genetikai eredetű humán melanoma sejtvonal (WM35, HT199, A258, HT168) génexpressziós profilját, melyet emberi nevus mrns expressziós profiljához hasonlítottunk. Konzekvens un. melanoma-specifikus génexpressziót (>1.5x növekedés illetve >5% csökkenés) akkor vélelmeztünk, ha a 4 sejtvonalból legalább 3 esetében volt kimutatható az adott gén expressziójának eltérése. 6. táblázat. Melanoma-specifikus gének expressziója humán melanoma sejtvonalakban (4) Fokozottan expresszált csökkent 33/32 14/32 Legalább 3 sejtvonal 18/32 5/32 A melanómákban csökkenten expresszálódó gének listáját a 6. táblázat, míg a fokozottan expresszálódó génekét a 7. táblázat tartalmazza. 7. táblázat. Melanómában csökkent expressziót mutató gének cdns WM35 HT199 A258 HT168 Glycerol kinase Fibronectin Homo sapiens cdna similar to RNA binding protein C. elegans Jagged 1 (HJ1) NADH: ubiquinone oxidoreductase subunit B13 (B13) Az adatok relatív expressziós szinteket jelentenek nevus mrns-re vonatkoztatva Az érintett gének nem tűnnek különösebben izgalmasnak mivel közöttük 2 metabolikus enzim, egy közönséges matrix fehérje és egy talán a későbbiekben jelentőséggel bíró jelátviteli molekula található. 18

19 8. táblázat. Melanómában fokozott expressziót mutató gének cdns WM35 HT199 A258 HT168 Nuclear cup binding protein 8kD Ryanodin receptor Peptidyl-prolyl cistrans isomerase MP isomerase Sorcin MTG8a protein ATP synthase O SRNP polypeptide B SH3p Glutamate receptor Cyclin E PTPase non-rec NADH:ubiquinon oxidoreductase 15kD Rb-like prot (17kD) IFN-inducible p Biliverdin-IX a reductase 6Sribosomal pl FBR-Mu-SV Az adatok relatív expressziós szinteket jelentenek nevus mrns-re vonatkoztatva A melanomában fokozottan expresszálódó gének között sejtciklus-szabályozók (cycline, RBlike p17) és jelátviteli alkotók voltak döntő többségben (ryanodin R2, sorcin, SH3p18, PTPnR1). A gének közül 2-nek az expresszióját vizsgáltuk tovább. A cycline jelentőségét abban gondoltuk, hogy azt esetleg diagnosztikus markernek fejleszthetjük, mivel jó antitestek állnak rendelkezésre amelyek paraffinos formalin-fixált mintákon is működnek. A ryanodin R2-t pedig abból a szempontból választottuk, hogy ez egy szív-specifikus Ca csatorna, melyet esetlegesen terápiás targetként lehetne fejleszteni. Megkezdtük ennnek megfelelően a cycline expresszió melanoma-specificitásának vizsgálatát, első lépésben Q-PCR technikával. Olyan melanomákat választottunk, amelyek nevus talaján alakultak ki. A daganat két részét az általunk hazánkban bevezetett laser-mikrodisszekciós módszerrel választottuk el egymástól és a környező stromától, majd RNSt izoláltunk és BioRad Icyclerrel vizsgáltunk. A mikrodiszekciós mintákban 1. sejtből sikerült megfelelő minőségű RNS-t nyerni a tumor fagyasztott metszeteiből. Eredményeink szerint cyclin E mrns expresszió csak a melanoma szövetben volt kimutatható, sem a nevusban sem a környező stromában nem volt detektálható mennyiségben. 19

20 23. ábra. Cyclin E expresszió (mrns) kimutatása Q-PCR és laser mikrodisszekció kombinálásával humán bőr melanoma szövetből. stroma Temperature, Celsius Naevusból izolált melanocyták Melanoma szövetből izolált tumorsejtek Melanoma szövetből izolált stromális komponensek A továbbiakban a cycline fehérje expresszióját kívánjuk vizsgálni nagyszámú nevus/melanoma tumormintákon immunhisztokémia segítségével. A ryanodin R2 a szívizom sarcoplazmás retikulum membránjában lévő Ca csatorna amely azonban T sejtekben, az idegrendszerben myometriumban is kimutatható. Érdekes megfigyelés, hogy a ryanodinr1 a melanocitákban is jelen van. Első lépésben olyan primert terveztünk amely a ryanodin R 1 és 2-t specifikusan el képes különíteni. Ennek segítségével analizáltuk a ryanodin R2 expressziót Q-PCR segítségével a korábban cdns chippel vizsgált humán melanoma sejtvonalakban. Megállapítottuk, hogy a melanoma vonalakban igazolható a ryanodin R2 expresszió és a sejtvonalak közötti relatív expressziós szint Q-PCR-rel is hasonló mint amit a chip-eredmények mutattak. 24. ábra. Ryanodin R2 mrns expresszió kimutatása humán melanoma sejtvonalakban Q- PCR-rel. A következőkben monospecifikus antitest segítségével vizsgáltuk a ryanodin R2 fehérje expresszióját a humán melanoma sejtvonalakban és 3 bőr melanoma fagyasztott mintájában konfokális mikroszkópiával. 2

21 A sejtvonalakban a ryanodinr2 egyrészt az ER zónában perinukleárisan helyezkedett el, de jellegzetes membrán-aggregációt is mutatott. A melanoma szövetben a ryanodin R2 egyrészt igen intenzív citoplazmatikus jelölődést mutatott a melanoma sejtekben, ami igen kifejezetten granuláris jellegű volt. 25. ábra. RyR2 HT168 humán melanomában. 26. ábra. RyR2 humán bőr melanomában Ezek a vizsgálatok azt igazolják, hogy humán melanomákban a Ryanodin R2 gyakori protein szintű expressziójával kell számolni. A Ca csatorna működésének sajátosságai, jelátviteli szerepének tisztázása adhat csak választ arra kérdésre, hogy expressziója szolgálhat-e terápiás célpontként, ami a további periódus kutatási feladata lesz Melanóma-specifikus gének expressziójának vizsgálata klinikai anyagban Korábbi globális genomikai vizsgálataink során több olyan gén expressziójára figyeltünk fel, melyek nevushoz képest fokozott expressziót mutattak és ezt qpcr módszerrel is igazolni tudtuk. Ezek között a sejtciklust szabályozó cycline, a neurogén sejtek egyik receptora a cannabioid receptor-1 és szívizom Ca-csatornája a ryanodin receptor 2 voltak. Kérdés volt, hogy ezeket a géneket fehérje szinten is ki tudjuk-e mutatni sebészeti mintákban és vajon paraffinos anyag is elegendő erre. 2 2 nevus és melanóma vizsgálata alapján egyik fenti fehérje sem mutatható ki paraffinos melanóma mintákban a jelenleg hozzáférhető antitestek segítségével. Ugyanakkor valamennyi fehérje megbízhatóan detektálható fagyasztott anyagban, ebből azonban csak 1-1 paralell minta állt rendelkezésre. A cyclin E esetében elsősorban magi reakciós mintázatot kaptunk, bár a melanómák egy részében intenzív cytoplazmatikus reakció is észlelhető volt. A minták között több negatív melanómát is találtunk ugyanakkor a nevusok negatívnak bizonyultak immuncytokémiai vizsgálattal. 21

22 27. ábra. Cyclin E protein kimutatása nevusban (A) és VGP melanómában (B). A B A nevusban a laphámsejtek pozitívak, míg a nevus sejtek negatívak. A melanóma sejtek intenzív magi és cytoplazmatikus reakciót mutatnak. Magfestés (piros), cyclin E (zöld). Immunfluoreszcencia. RyR2 fehérje esetében a fentiekhez nagyon hasonló mintázatot kaptunk, bár ez a fehérje egyértelműen cytoplazmatikus lokalizációjú volt az SSM melanómákban. 28. ábra. Ryanodin Receptor-2 kimutatása nevusban (A) és SSM melanómában (B) immunfluoreszcens módszerrel. A B A nevussejtek negatívak (A: zöld fluoreszcencia), míg a melanóma sejtek (B: zöld fluoreszcencia) erősen pozitívak RyR2-re. A sejtmagok pirosan fluoreszkálnak. A továbbiakban a CB1 cannabioid receptor fehjérjét kiséreltük meg kimutatni emberi melanóma sejtvonalakban amihez igen agresszív biológiai viselkedésű vonalakat használtunk: a HT199 és M1-et melyek genetikailag egymással nem állnak kapcsolatban. Immunfluoreszcens vizsgálattal igazoltuk, hogy humán melanóma sejtvonalakban a CB1 receptor protein kimutatható, mégpedig 2 lokalizációban, a sejtfelszinen illetve cytoplasmában (ez nem csoda), de meglepő módon nagy mennyiségben van jelen a sejtmagban is amire nézve eddig még nem találtunk magyarázatot. 22

23 29. ábra. CB1 receptor kimutatása emberi melanóma sejtekben in vitro (immunfluoreszcencia) A/ HT199 humán melanóma sejtek B/ M1 humán melanóma sejtek Cytoplazmatikus CB1 reakció Nnukleáris CB1 reakció (zöld). A sejtmag pirosan jelölt. Az elmúlt években számos közlemény jelent meg arról, hogy endogén cannabioidok jelentősen képesek különféle daganatféleségek proliferációját illetve apoptosisát befolyásolni, az adatok többsége proliferáció gátlásról és apoptosis indukcióról szól, ami in vitro és in vivo is kiváltható. (Bifulco, Di Matzo, Nat Med 8:547-55,22). A vizsgálatok kimutatták, hogy a hatásért általában a CB1 receptor expresszió felelős, illetve annak daganatos szignalizációja melynek downstream targetje az EGFR illetve MAPK lehetne Mindezen adatokról még nem tudva, magunk emberi melanóma sejtvonalak globális génexpressziós mintázatát tanulmányozva észleltük, hogy ezek CB1 mrns-t tartalmaznak. Természetesen a kérdés az hogy ez a receptor funkcionálisan aktív-e. Ezért megvizsgáltuk 2 CB1 ligand biológiai hatásait több humán melanóma sejtvonalunkon és meglepő módon azt kaptuk, hogy mind a CB1 agonista 2met-F-AEA, mind a CB1 antagonista AM251 jelentősen gátolta a sejtproliferációt: az IC5 mindkét esetben 5 µm körül volt. Azt azért ehhez hozzá kell tenni, hogy a hatás elsősorban az apoptosis-érzékeny szérum-mentes közegben volt ilyen pregnáns, szérum jelenléte az IC5-et csaknem egy nagyságrenddel megemelte! 3. ábra. 2MetF-AEA CB1 agonista és AM251 CB1 antagonista hatása M1 melanóma in vitro proliferációjára (szerum mentes közegben) cell density µ M M e t - F - A E A A M A melanóma az egyik legagresszívebb roszindulatú daganat mely egyben igen rezisztens a kemoterápiás szerekre. Ennek hátterében az áll, hogy a melanocyta és a melanóma sejtek is apoptosis rezisztensek. Azt tartja a köztudat, hogy az apoptosis rezisztencia áttörése nélkül nem lehet ezt a daganatot gyógyszeresen kezelni. Ebből a szempontból lenne jelentősége a melanóma CB1 receptorát moduláló farmakológiának.ehhez azt kell igazolnunk, hogy melanóma esetében apoptosis indukcióról van szó, (más daganatokban is ez történik: emlőrák, prostatarák, vagy glioblasztóma). Pozitív esetben érdekes farmakológiai lehetőséget rejthet a funkcionális CB1 receptor jelenlétének kiaknázása emberi melanómában. 23

24 WT1 génexpresszió az endothelsejtek és endothelialis tumorok új markere A klasszikus endothelialis markerek angioblaszt-specifikus gének mint a CD31, CD34, VCAM, VE-cadherin, VEGFR2 és a FVIII. Az endothel sejtek angioblasztokból differenciálódnak amelyek csontvelői őssejtekből keletkeznek. A csontvelői őssejtek konstitutiven expresszálják a c-kit-et és a WT1 gént, ugyanakkor angioblasztokban csak a c- kit-re vannak adatok ami a kiérett endothel-sejteken már nem expresszálódik. Felmerült a kérdés, vajon a másik ősi csontvelői marker-gén, a WT1 meddig expresszálódik az endothelsejtek diferenciálódása során illetve daganataiban visszatér-e expressziója. Első lépésben in vitro tenyésztett humán endothel sejteken néztük meg a WT1 gén expressziót RT-PCR segítségével. Megállapítottuk, hogy a HUVEC és a Kaposi sarcoma sejtek WT1+ak, míg az agyi mikrovaszkuláris endothel (HBME) WT1 negatív volt. 31. ábra. WT expresszió humán endothel sejtekben in vitro, RT-PCR. KS HBME HBME HBME HBME HUVEC a nyíl: WT1 A KS sejtek SCID egerekben tumorigének és metasztatikusak, melyekből áttéti modellt is kialakítottunk. Ezen xenograft szövetekben mind a primer, mind az áttéti szövetekben WT mrns és protein expressziót tudtunk kimutatni RT-PCR illetve immunhisztokémia segítségével. A módszer érzékenységét jól mutatta, hogy az egerek keringésében is sikerült RT-PCR módszerrel a keringő KS sejteket kimutatni WT1 expresszió alapján. Azt is megállapítottuk, hogy ezek a KS sejtek a WT több splice variánsát is expresszálják (17AA+/- illetve KTS+/-). A következőkben 42 bőrbiopsziás anyagban vizsgáltuk a WT1 protein expressziót panwt1 illetve 17AA-specifikus antitest segítségével. Kontrollként a CD34 reakciót végeztük el. Meglepetésre a bőr mikroereinek endothelje intenzíven jelölődött, de csak a panwt1 antitesttel, azonban a reakció citoplazmatikus volt (18a ábra). Gyulladásos szövetben is megfigyeltük a regenerálódó erekben a WT1 pozitivitást 32.ábra. WT1 protein expresszió emberi bőrben (immunhisztokémia) A/ normál bőr mikroerek B/ dermatitis, granulációs szövet 24

25 A továbbiakban 1 benignus (haemangioma, és 26 malignus érdaganatban (Kaposi sarcoma és angiosarcoma) tanulmányoztuk a WT1 expressziót. Az esetek döntő többségében csak a panwt1 antitest mutatott citoplazmatikus reakciót, a 17AA antitest csak a Kaposi sarcomák egy kis részében adott magi pozititást a daganatsejtekben. 33. ábra WT1 protein expresszió érdaganatokban. A/ haemangioma B/ Kaposi sarcoma C/ angiosarcoma Valamennyi esetben a tumort körülvevő normál szövetben az erek WT1 pozitivak voltak és az un. peritumorális neoangiogenetikus erek is hasonlóan jelölődtek. Az endothelialis tumorsejtek a haemangiomák és Kaposi sarcomák 3%-ban expresszálták a WT1-et. Ugyanakkor az angiosarcomák egy eset kivételével WT1 pozitívaknak bizonyultak 9.táblázat. WT1 protein expresszió érdaganatokban TC Normál bőr (n=42) 42/42 gyulladás (n=6) 6/6 Benignus tu. (n=1) 3/1 1/1 1/1 pte ne Malignus tu. (n=26) 14/26 26/26 26/26 KS (n=18) 7/18 18/18 18/18 AS (n=8) 7/8 8/8 8/8 NE= normál erek, pte= peritumorális érhálózat, TC= tumorsejtek Mindezen vizsgálatok alapján számol fontos következtetésünk van. 1./ A WT1 expresszió (bizonyos megszorításokkal) új endothelialis markernek tekinthető. 2./ Felmerül az is hogy a WT1 expresszió angioblast marker, erre nézve további vizsgálatok kellenek. 3./ A WT1 az angiosarcomák markere. 4./ A Kaposi sarcomák a WT1 expresszió alapján is inkább lymphogen, mint vérér eredetűek. 25

26 7.2.3.Tumor-infiltráló sejtek prognosztikai jelentősége A melanómát infiltráló T-sejtek aktiváltsági állapota és prognosztikai jelentősége Emberi melanómákat (76 eset) infiltráló T-sejtek aktivációs állapotának meghatározását két T-sejt-aktivációs marker, a CD25 illetve a CD134 (OX4) elleni antitesttel végeztük. A CD25 (IL-2-receptor-α) a tumorokat infiltráló limfocitáknak csak kis részén jelenik meg, és a sejtosztódást szabályozó receptorként a T-sejtek működésében is kiemelten fontos szerepe van. Az OX4 a frissen aktivált CD4 + sejtek - igen specifikus markere. A két T-sejt-aktivációs markert (CD25, 2. ábra, OX4, 21. ábra) hordozó limfociták mennyisége a peritumorális infiltrátumban szignifikáns különbséget mutatott a nem metasztatikus vagy csak nyirokcsomóáttétet adó tumorok és a szervi áttétet adók között, az előbbiek javára. 34. ábra. Humán melanóma T sejt aktivációs markereinek expressziója és a progresszió CD25 + OX cells/mm cells/mm Nonmet+LN-met Visceral met Nonmet+LN-met Visceral met Ugyanezek a paraméterek a betegek túlélésével is összefüggést mutattak: azok a melanómás betegek, akiknek tumora nagymennyiségű CD25 + (22. ábra) illetve OX4 + (23. ábra) limfocitát tartalmazott, szignifikánsan hosszabb túlélési idővel rendelkeztek, mint azok, akiknél alacsony volt ezen sejtek peritumorális denzitása (CD25: p=,28; OX4: p=.255). A két marker tehát prognosztikai faktorként használható melanómás betegekben (Ladányi et al. 23a,b,c). 35/a. ábra. CD25 és melanóma túlélés. 35/b. ábra. OX4 és melanóma túlélés. CD25 + Survival ratio 1,,9,8,7,6,5,4,3,2,1, CD25+>75 (n=37) CD25+<75 (n=39) months OX4 + Survival ratio 1,,9,8,7,6,5,4,3,2,1, OX4+>2 (n=28) OX4+<2 (n=48) months 26

27 Dendritikus sejtek vizsgálata primer malignus melanómákban Különböző progressziós stádiumú primer melanómákban vizsgáltuk a mononukleáris infiltrátum sejtes összetevőit. Ezen belül kvantitatívan értékeltük a legjelentősebbnek tartott antigénprezentáló sejtek, a dendritikus sejtek denzitását (77 tumormintában), a melanóma sejtfészkeket infiltráló intratumorális, illetve a tumorokat körülvevő infiltrátumban megjelenő peritumorális lokalizációban. Mind intra-, mind peritumorálisan a legmagasabb dendritikus sejt-szám az 1, mm-nél vékonyabb melanómáknál volt megfigyelhető. Az 1,1-2, mm közötti tumorokban már ennél kevesebb dendritikus sejtet találtunk, míg a 2,-4, mm-es és a 4, mm-nél vastagabb kategóriában további csökkenés mutatkozott. A tumorvastagsággal való fordított korreláció szignifikáns volt (Kruskall-Wallis teszt, p<,1). 36. ábra. Humán melanóma DC sejtek denzitása és a tumorvestagság Intratu. CD1a + Peritu. CD1a cells/mm cells/mm < >4. mm < >4. mm Mind az intratumorális, mind a peritumorális infiltrátumban megfigyelhető volt, hogy az áttétet nem adó daganatok esetén az átlagos dendritikus sejt-szám magasabb volt, mint az akár nyirokcsomó-, akár szervi áttétet adók esetén. Ennek oka nagyrészt az, hogy a legvékonyabb kategóriában találhatók a legmagasabb értékek, s ez a csoport kizárólag nem metasztatikus tumorokból állt ebben a vizsgálatban. Amennyiben az 1, mm-nél vékonyabb melanómákat kihagytuk a vizsgálatból, a különbség eltűnt. Azok a melanómás betegek, akiknek primer tumora nagymértékű peritumorális dendritikus sejt-infiltrációt mutatott (>3 sejt/mm 2 ), jobb túlélési eséllyel rendelkeztek (5 éves túlélés: 78% vs. 54%, p=,422). Azonban ha a vékony ( 1, mm) tumorokat nem vesszük figyelembe, a különbség itt sem szignifikáns. Ez azt jelenti, hogy a vizsgálat szerint ez a paraméter nem alkalmazható prognosztikus faktorként, minthogy hatása a tumorvastagságtól függ, és a középvastag-vastag kategóriákban, ahol ténylegesen kérdéses a betegség kimenetele, nem ad információt erre nézve (Ladányi et al. 23a,b). Megfigyeléseink alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a melanoma vastagságával egyre csökken abban az antigén-prezentáló sejtek denzitása, ami az un. immunterápiák esélyét csökkentő tényező. 27

28 7. 3./ A tumoros progresszió génexpressziós térképének kialakítása a tumorok individuális viselkedésének predikciójára 3.1.Progressziós oligo- chipek készítése Az SZBK chip-laboratóriumával kollaborációban megkezdtük vizsgálni emberi melanómák génexpressziós profilját 32 emberi gént tartalmazó cdns-chip segítségével. Referenciaként nem-metasztatikus sejtvonal szolgált (WM35) míg áttétképző sejtvonalakból 3 genetikailag egymással kapcsolatba nem álló sejtvonalat választottunk. Bár számos gén expressziójában találtunk eltérést, ezek közül véleményünk szerint azoknak lehet jelentősége amelyek a vizsgált sejtvonalak többségében is megjelentek. Ilyen szigorú kritériumok alapján mintegy 2 gént tartalmazó lista keletkezett, melyek expressziója szignifikánsan eltért az áttétképző illetve a nem-áttétképző sejtvonalakban (Kopper és Tímár 22). A gének között vannak olyanok, melyeket korábban már kapcsolatba hoztak a melanóma progressziójával (TIMP3, upareceptor, RXRγ), azonban döntő többségükről eddig még ilyen adataink nincsenek. A továbbiakban a kapott adatok részletes elemzése illetve egygénes PCR és kvantitatív PCR ellenőrzése folyik 1. táblázat Génexpressziós profil változások áttétképző emberi melanómákban (3.2K cdns chip, SZBK) fokozódás csökkenés RXRgamma MLC IL-1 upar v-ral MBP IL-17R TIMP3 GAPSH3 b3 endonexin IL-1b konvert. enzim lizozim foszfoszerin kináz LAMP2 teratocc. GF karboxipeptidáz M aminotranszferáz metallotionein 3 CD73 kalpastatin ferritin TRAIL A program keretében hazánkban elsőként munkába állítottunk egy lézer-mikrodisszekciós készüléket és kialakítottunk egy ilyen laboratóriumot, ahol emberi szövetek metszeteiből néhány sejtet mikroszkópos ellenőrzés mellett eltávolítva mód nyílik arra, hogy a génexpressziót daganatokban szöveti környezetben is sejtekhez lehessen kötni. Kidolgoztuk a DNS és RNS izolálás metodikáját amikoris 1 3 illetve 1 4 sejtből lehetséges un. azonosított géenxpressziós profil meghatározása. Ezek a vizsgálatok ahhoz fognak hozzásegíteni, hogy a melanóma progressziójában szerepet játszó gének szöveti környezetben történő expresszióját nyomon követhessük 37. ábra. Primer bőr melanóma tumorszigetének mikrodisszekciója és actin-pcr-je 28

29 Progressziós oligo-chip tervezése Az elmúlt időszakban számos vizsgálat alkalmazta a globális génexpresszió meghatározását arra, hogy egyes daganatféleségek, vagy a metasztatikus daganatok specifikus génjeit meghatározzák. Ezen vizsgálatok érdekes eredményekkel jártak amelyek az áttétképzésről alkotott elképzeléseinket is alapjaiban változtathatják meg. A két érvényes teória szerint az áttétképző képesség az áttétképző primer tumor sejtjeinek döntő részére jellemző, így az prediktálható az általános génexpressziós profil alapján, míg a másik vélemény szerint ezzel a képességgel csak a populáció egy kicsi, sokszor elenyésző része rendelkezik, így azt ilyen vizsgálat nem képes felderíteni, erre az áttétek vizsgálata alkalmasabb, mert abban feldúsulhat ez a populáció. Kisérleti rendszerben vizsgáltuk ezt a kérdést, amikoris humán melanoma sejteket oltottunk semiorthotopikus (subcutan) pozícióba SCID egerekbe olyan körülmények közé, amikor a gazdaszervezet metasztázis permisszív (újszülött) illetve restriktív (felnőtt) volt. A primer és metasztatikus tumorokból RNSt izoláltunk és 3.2 K humán cdns chippel hasonlítottuk össze az expressziós profilokat. A vizsgálatot 3 tumorvonallal végeztük el, a WM983B un. szülői vonal (heterogén összetételű, metasztatikus), annak negatívan szelektált, gyengén metasztatikus variánsa, 3.1 és ennek integrin aiibb3 transzfektált erősen metasztatikus klónja, 1919H. 11. táblázat. Génexpressziós eltérések primer és áttéti tumorban, WM983B melanoma. WM983B (parent) NM/Mp P/M Represszált 6 7 Ribosomal protein L Pig1 mrna.513 Brain-derived neurotrophic factor.5 Interferon-inducible protein.5 Acyl-Coenzyme A dehydrogenase long chain.5 Glutathione S-transferase theta2.5 Gap junction protein beta Glucocorticoid receptor alpha.491 Receptor protein-tyrosine kinase (HEK7).436 Translation elongation factor 1 delta.513 KIAA Actin related protein, subunit 5.54 overexpresszált 14 2 Eukaryotic translation initiation factor 3, TIF CDC28 protein kinase Protein phosphatase 2A (beta-type) Small nuclear ribonucleoprotein B and B Death associated transcription factor 1, DATF Metallothionein 1L 2.59 Light polypeptide similar to ferritin 2.57 Utrophin 2. TNF-alpha converting enzyme, TACE, ADAM17 2. RNA polymerase III subunit 2. EGFR2 2. Aconitase 2, mithocondrial 2. Mitotic feedback control protein Madp2 hom 2. DNA polymerase alpha-subunit 2. Q1366 GAGE-2 protein 2.51 UDP-glucuronosyltransferase 2B1 pre. 2.6 Összesen változó 2 9 NM= nem áttétképző primer tumor, Mp= áttétképző primer tumor, P= primer, M= metastasis. Az adatok relatív expressziós szinteket jelentenek nevus mrns-re vonatkoztatva 29

30 Az alapvonal (WM983B) esetében azt tapasztaltuk, hogy a primer tumorban mintegy 2 gén expressziója változott amikor az áttétképzést hajtott végre, míg a primer tumor és áttéte között csak 9 gén expressziója volt eltérő, ami arra utalt, hogy a primer tumorban jelentős mennyiségű áttétképző sejt volt jelen, melyek klónjai az áttétekben is megtalálhatók (nem volt további szelekció). További érdekesség volt, hogy a primer tumorban elsősorban bizonyos gének expressziójának csökkenése volt az áttétképző tumorban, míg az áttétekben inkább génexpresszió fokozódás volt a jellemző. A gének között általában nem ismert géneket találunk, a tirozin kinázok és foszfatázok, az apoptosist és a proliferációt szabályozó gének közül. A negatívan szelektált gyengén áttétképző 3.1 klón esetében hasonló tendenciák érvényesültek de érdekes módon más és kevesebb gén részvételével, melyek között számos még nem tisztázott fehérjét kódoló szerepelt. 12. táblázat. Génexpressziós változások metasztatikus körülmények között gyengén metasztatikus 3.1 melanomában. 3.1 (negatian szelektált) NM/Mp P/M represszált 1 2 Histidyl-tRNA synthetase.369 Proteosome component C5.379 HUL 15/ overexpresszált 7 HUL9/ HUL19/ HUL19/ HUL21/ HUL 21/ HUL12/ HUL22/ Összesen változó 8 2 NM= nem áttétképző primer tumor, Mp= áttétképző primer tumor, P= primer, M= metastasis. Az adatok relatív expressziós szinteket jelentenek nevus mrns-re vonatkoztatva A 3.1-transzfektált és fokozottan áttétképző hajlamú klónja a 1919H esetében a fentiekkel ellentétes tendenciákat tapasztaltunk. Az áttétképzést megengedő körülmények alig befolyásolták a klónok expressziós profilját (5 gén változott) amelyek között nukleinsav szintézist végző gén illetve transzkripció szabályozó volt. Ugyanakkor igen jelentős génexpressziós profil eltérés keletkezett a primer tumor és áttéte között: az áttétben sok gén expressziója fokozódott, amelyek között a proliferációban a sejt-metabolizmusban, a matrixkölcsönhatásban a túlélésben szerepet játszó gének sora aktiválódott. Ez arra utal, hogy az integrin-transzfekció hatására a tumor populációban jelentős képességű, de kis számú különleges sejt keletkezett amelyek a metasztázisokban mintegy bedúsulhattak. Külön érdekesség, hogy az itt aktiválódott vagy kikapcsolódott gének egyik előző sejtvonalban sem szerepeltek. Ez arra utal, hogy ugyanazt a célt, az áttétképző daganatsejtek igen eltérő molekuláris megoldásokkal (génkészlettel) képesek elérni. Ennek igen nagy klinikai jelentősége lehet, mert ezek szerint nehéz készíteni egyszerű sablonokat, a daganatok individualitása ebből a szempontból is érvényesül. 3

31 13. táblázat. Génexpressziós profilok változása integrin transzfektált 3.1 melanoma klonban (1919H) Transzfektált 3.1/1919H NM/Mp P/M represszált 3 17 Interferon inducible protein Very low density lipoprotein receptor.315 Nuclear cap binding protein, 8kD.456 Laminin, gamma1.325 NBPhox.347 Cysteinyl-tRNA synthetase.41 AMY-1 mrna.44 CUL-2 mrna.429 ERC-55 mrna.429 Grancalcin.432 Human TNF-alpha converting enzyme.434 Endothelin receptor type B.434 Krueppel-related zincfinger protein.437 Multidrug resistance protein Death associated transcription factor.459 Glucocorticoid receptor alpha.475 Ribosomal protein, large, P.475 Ionotropic ATP receptor P2X5a.497 CHD1 mrna.498 Ribonuclease, A family.51 overexpresszált 2 7 Cysteinyl-tRNA synthetase Ribosomal protein S Humán interferon-gamma induced protein EGFR Putative oral tumor suppressor Chloride intracellular channel Solute carrier family Phosphatidylinositol 4-kinase alpha 2.13 HUL2/ Összesen 5 24 NM= nem áttétképző primer tumor, Mp= áttétképző primer tumor, P= primer, M= metastasis Az adatok relatív expressziós szinteket jelentenek nevus mrns-re vonatkoztatva Ezek a vizsgálatok arra is felhívták a figyelmünket, hogy az in vivo észlelhető géenexpressziós profilok alapvetően eltérnek az in vitro tapasztaltaktól (melyekről az 1. sz jelentésben már beszámoltunk). Ez a tény tovább erősíti azt a véleményünket, hogy az áttétképzés mechanizmusát illetve az ebben szereplő géneket nem lehet in vitro megismerni, ehhez releváns állati modellekre és értlemes klinikai vizsgálatokra van szükség. Megdöbbentő volt továbbá az a tény, hogy a 3 melanoma sejtvonal esetében csak 1 olyan gén volt amely 2 sejtvonal esetében is hasonlóan változott az áttétképzés során, ez a glucocorticoid receptor-α volt. Korábban már melanoma sejtvonalakban észleltük ennek a génnek expresszióját az áttétképző sejtvonalakban. Saját korábbi megfigyeléseink melyeket kisérleti melanoma modelleken tettünk, valamint a klinikai adatok mind arra utalnak, hogy steroid receptorok szerepet játszhatnak a melanoma progressziójában, sajnos eddig még nem tisztázott módon. A steroid receptor (család) expressziójának és funkciójának vizsgálata humán melanomában talán közelebb vezethet bennünket a kérdés tisztázásához a kutatási program utolsó évében. 31

32 Humán melanóma chip... Az áttétképzés folyamatának kutatásában a microarray technika jelentős előrehaladással kecsegtet. Alkalmazásának azonban gátat szab, hogy a műtéti anyagokból származó minták lokalizációja, stádiuma valamint a host genetikai és fiziológiai státusza egyaránt rendkívül heterogén mintázatot mutat. Célunk egy olyan kísérletes metasztázis modell kidolgozása volt, amely a lehető legtöbb paraméter szempontjából standardizálható, ismételhető és az azonos típusú, de különböző genetikai eredetű humán tumoroknak, jelen project esetén humán melanómák vizsgálatára egységes platformot biztosít, amely alapján a valóban host vagy tumor eredetű változásokra lehet a kérdéseinket fókuszálni. A vizsgálatok végső célja az, hogy a melanómák un. metasztatikus génexpressziós újjlenyomatát meghatározzuk, miután erre nézve csak igen kezdetleges adatok állnak rendelkezésre, szemben pl. az emlőrákkal. A modell alapja az a tény, hogy veleszületetten vagy mesterségesen immunszupprimált újszülött rágcsálókban számos olyan humán tumor ad megbízható gyakorisággal áttétet, amely kifejlett állatokban soha. Ily módon lehetőségünk van arra, hogy genetikailag gyakorlatilag azonos hostba, azonos időpontban, azonos lokalizációba, azonos tumorsejt-szuszpenziót implantáljunk. A különbség a két host között fiziológiás, ám az áttétképzés szempontjából mégis döntőnek bizonyul. Mivel a tumor stromális komponensei host eredetűek, a host és tumor eredetű változások külön speciesspecifikus DNS-chipen (egér ill. humán), azonos mintából vizsgálhatóak. Az áttétek könnyen hozzáférhetőek, azaz azonos időpontban hasonlíthatjuk össze a primer és az áttéti tumor génexpressziós mintázatát is és ezt is a stromális komponensek zavaró hatása nélkül. Veleszületetten immunhiányos újszülött (a születéstől számított 24 órán belül) és kifejlett scid/scid egérbe ugyanazon humán melanóma sejtvonal in vitro tenyészetéből származó egysejtszuszpenzióját implantáltunk azonos szubkután régióba (szemiortotop implantáció). A kiértékelés két időpontban történt, a tumor implantációjától számított 7. és 21. napon. A 7. napon a makroszkóposan színes gombostűfejnyi tumorból és környezetéből totál RNS-t izoláltunk. Ugyancsak RNS-t izoláltunk azonos alomból származó 7 napos állatok megfelelő szöveti régiójából. A 21. napon kizárólag a tokkal körülhatárolt primer tumort távolítottuk el mindkét állatcsoportból, illetve a tüdőáttéteket vágtuk ki egyenként az újszülöttként implantált állatok tüdejéből. Ugyanezen kísérletet három, genetikailag különböző eredetű humán melanóma sejtvonallal (WM983B, HT168M1, HT199) párhuzamosan végeztük el. Az expressziós mintázat változásának kiértékelését a 21. napon 18. gén-specifikus probe-ot (Operon- SIGMA) hordozó humán oligonucleotide microarray-vel (SZBK, Dr. Puskás László Biorobotics TAS spotter) végeztük el. Szignálamplifikációt (Genisphere) követően a Cy5-jelölt mintákat Ventana Discoveries automata hibridizációs rendszerrel hibridizáltuk és olvastuk le. Az egyszínű jelölés lehetőséget nyújtott (az Affymetrix rendszeréhez hasonlóan) valamennyi minta összes más mintához történő összehasonlítására. A statisztikai elemzést Lowess normalizáció és T-teszt segítségével végeztük el. Az M és A értékeket alapján határoztuk meg azokat a géneket, amelyek expressziós változása szignifikánsnak volt tekinthető. A 7. napon nyert minták kiértékelésére a tumor eredetű faktorok esetén az Agilent 41, génre specifikus (6- mer oligo próbákat hordozó) Whole Human Genome Oligo Microarray Kit-jét, a host eredetű faktoroknál az Agilent 2, egér eredetű génre specifikus (ugyancsak 6-mer oligo próbákat tartalmazó) Agilent Mouse Oligo Microarray Kit-jét használtuk. A mintákat amplifikálás nélkül Cy3 és Cy5-jelölést követően páronként egymással szemben hibridizáltuk és Agilent Microarray Scanner segítségével olvastuk le és a cég által biztosított Agilent Feature Extraction Software segítségével értékeltük ki. Az implantációtól számított 21. napon az újszülöttként implantált állatokban minden esetben tüdőáttétet, esetenként agyi és nyirokcsomó áttéteket találtunk. Kifejlett állatokban lényegesen hosszabb túlélés esetén sem tapasztaltunk áttétképzést ebből a lokalizációból egyetlen humán melanóma esetén sem Ez a modell számos előnnyel szolgál az áttétképzésben (potenciálisan) résztvevő gének felderítése szempontjából. Először is lehetőséget kínál annak eldöntésére, hogy az áttétképzésre alkalmas sejtpopuláció szelekcióját host vagy tumor eredetű tényezők befolyásolják. Azaz a host által biztosított környezet szelekciós nyomást gyakorol a kiindulási, in vitro tenyészetből származó sejtpopulációra, és ily módon egy olyan primer tumor alakul ki, amelyben már jelen vannak az áttétképzésre alkalmas sejtek. Ebben az esetben lényeges különbséget kell találnunk a kifejlett és az újszülött állatban kinőtt, azonos 32

33 korú primer tumor génexpressziós mintázata között. Ez a szelekció, mivel ezen inbred állatok genetikai állománya gyakorlatilag azonos, azonos az implantáció lokalizációja, tehát a szöveti környezet is, mindössze a host fiziológiásnak tekinthető állapotkülönbségével, azaz a újszülött státusszal hozható összefüggésbe. A modell ebben a tekintetben egészen különleges lehetőségeket kínál a xenograft tumorok jól ismert szövettani sajátságai miatt. Ezen tumorokban ugyanis kizárólag a tumor humán eredetű, míg a stromális komponensek (kötőszövet, erek) host, azaz egér eredetűek. Amennyiben tehát a tumor génexpressziós mintázatában mutatkozó különbségeket szeretnénk vizsgálni, humán microarray-el nagy valószínűséggel megtehetjük. Nem szembesülünk azzal a humán műtéti anyagból származó mintákban oly gyakori problémával, hogy a tumorból származó RNS pool a stromális komponenseket is tartalmazza, annak arányától függően jelentősen torzíthatja hígíthatja a tumorra jellemző RNS mintát. Mivel a standardizálásra használt géneket a stromális komponensek is ugyanúgy expresszálják, a hígítás mértékét nem lehet kontrollálni. Izgalmas lehetőség, hogy eldöthető, hogy bizonyos, potenciálisan a host és a tumor által egyaránt expresszálható génekről eldönthető, hogy mely komponensből származnak. Ami ennél is lényegesebb, az újszülött és a kifejlett állat által a tumor számára nyújtott host eredetű faktorok egér microarray segítségével egyértelműen meghatározhatók és összevethetők. Mivel az eredmények validálása (humán gének esetén az Applied Biosystems TaqMan kártyája segítségével, host eredetű gének esetén kvantitatív PCR-ral, egyedileg tervezett primerekkel) most van folyamatban, végleges génlista még nem közölhető. 38. ábra. Humán 42 oligochip hibridizálás M1 humán melanóma metasztatikus és nemmetasztatikus primer tumorának RNS-ével. A/ Oligo-chip spot-fluoreszcencia B/ Génexpresszió változások megoszlása A 21. napon vett minták alapján levonható következtetések (kizárólag olyan géneket figyelembe véve, amelyek a három tumor közül legalább kettőben több mint 2-szeres különbséget mutattak): Az áttétképző és nem-áttétképző sajátossággal rendelkező primer melanómák (újszülött szubkután vs felnőtt szubkután) 72 eltérő módon expresszálódó gént hordoztak. Ez a szám a szelekciós teóriát támasztja alá, mivel lényegesen több, mit az újszülött primer tumora és tüdőáttéte közötti 42 gén különbség. Különösen ha tekintetbe vesszük, hogy ezen gének egy része nagy valószínűséggel az új mikrokörnyezet (szubkután vs tüdő) hatására váltott expressziós mintázatot. Érdekes módon feltűnően sok mrns-splicingért felelős gén mutatott szignifikáns eltérés ebben az összehasonlításban. A legnagyobb különbséget (13 gén) az in vitro tenyészet (amiből a szubkután implantációk megtörténtek) és a szubkután növő tumor expressziós mintázatában találtunk, amely a tenyészeteken végzett kísérletek korlátolt értékelhetőségére hívhatja fel a figyelmünket. A 7. napon értékelt minták esetében 846 up és 1175 down-regulált humán gén mutatott 2-szeresnél nagyobb expressziós különbséget egybehangzóan legalább kétféle humán melanóma esetében. Ez a változás arányaiban lényegesen nagyobb, mint a 21. napos változás. Az eltérő platformon kívül a host esetleges változása (az újszülött felnő ) is 33