1/48/ Részjelentés: November december 31. RP7. A tumoros progresszió génexpressziós térképének kialakítása.

Átírás

1 Nemzeti Kutatási és Fejlesztési Program 1. Főirány: Életminőség javítása Nemzeti Onkológiai Kutatás-Fejlesztési Konzorcium a daganatos halálozás csökkentésére 1/48/ Részjelentés: November december 31. RP7. A tumoros progresszió génexpressziós térképének kialakítása. Dr. Tímár József Országos Onkológiai Intézet 1

2 RP7. A daganatos progresszió génexpressziós térképének kialakítása és felhasználása a prognózis megítélésére és új innovatív terápiás elvek kialakítására Témavezető: dr. Tímár József, Országos Onkológiai Intézet Résztvevők: dr. Németh Péter PTE Immunológiai Intézet dr. Puskás László MTA SZBK Dr. Hernádi Zsuzsa Pfizer kft. Dr. Sebeszta Miklós Janssen-Cilag kft. 1./ A daganatok áttétképzésében szerepet játszó adhéziós molekulák és jelátviteli pályáik meghatározása 1.1. Paralell b3 integrin expressziós modell kialakítása emberi melanóma sejtvonalban Miután emberi melanómában azzal lehet számolni, hogy a két b3 integrin együttesen expresszálódik, ezért olyan avb3-integrint expresszáló humán melanóma vonalakat állítottunk elő, amelyekbe aiib és b3 gént transzfektáltunk. A klónok aiib expresszióját mrns és protein szinten kontrolláltuk. Valamennyi klón párhuzamosan expresszálta az av(b3) integrint, így modellezve a humán melanóma tumorok egyik fenotípusos jellegzetességét, a fokozott avb3 expressziót (Trikha et al.ijc2002). 1. táblázat. Sejtfelszini b3 integrin expresszió human melanoma klónokban (flow cytometry) clone aiib b3 avb3 3.1 mock ESL F nd 19L ESH H Data are in % of positive cells (aiib and b3: mean+sem, n=3-6, avb3: average of two samples), nd= not determined A transzfektánsok in vitro proliferációs képességei változatlanok voltak, ugyanakkor SCID egerekbe oltva a primer tumorok növekedési üteme eltért, a kettős b3 integrint expresszáló klónok szignifikánsan jobban növekedtek in vivo. 1. ábra. aiibb3 transzfektált humán melanóma proliferáció in vitro és in vivo A/ In vitro növekedési ütem B/In vivo növekedés SCID egérben absorbance (BRdU+) cell number (x103) 3.1P 19L 19H volume (mean+sem, mm 3 ) Ez ellentmondásban látszott állni az in vitro eredményekkel, így megvizsgáltuk annak a lehetőségét, hogy emögött nem állhat-e fokozottabb vaszkularizáció és megállapítottuk, hogy a transzfektánsokból képződő tumorok érdenzitása szignifikánsan emelkedett (Döme et al.2004). days 3.1P 19L 19H 2

3 2. ábra. Transzfektáns melanóma klónok intratumorális érdenzitása SCID egérben A/ érdenzitás CD31 jelölés alapján B/ VEGF és bfgf protein mérés flow cytométerrel MVD/field (mean+sem) 20 * P 19L 19H % positive cells L 19H VEGF bfgf Következő lépésként megvizsgáltuk, hogy a két fő melanóma-angiogenetikus faktor expressziója milyen a transzfektánsokban. Immuncytokémiai és flow cytometriai vizsgálataink kimutatták, hogy változatlan és maximális VEGF expresszió mellett az alapklónban minimális a bfgf expresszió, míg az aiibb3 transzfektált (tehát av- és aiib-b3 integrint egyaránt expresszáló klónokban csaknem 100%-os lett a bfgf expresszió amit az in vivo növekedő tumorokban is igazoltunk (2b. ábra). A fokozott bfgf expresszió mögött két nagyságrenddel megnövekedett bfgf mrns szint áll kvantitatív PCR vizsgálataink alapján (Dömet et al.2005). Jelenleg folyó vizsgálataink arra keresik a magyarázatot, hogy humán melanómában milyen genetikai tényezők játszanak szerepet az egyes szervekbe történő áttétképző képességben. Vizsgálataink szerint ugyanis egyazon tumor a különböző szervekben szignifikánsan eltérő extravazációs képességgel rendelkezik (Paku et al. 2001). Valamennyi transzfektáns klón több szervbe is képes áttétet képezni (tüdő, máj, agy, csont) ezek között csak az áttétképzés hatékonyságában van eltérés, mert az aiibb3 transzfektált klón(ok) fokozott májáttétképző képességgel rendelkeznek. 2. táblázat. Metasztázis incidencia különböző szervekben b3 integrin transzfektált human melanoma klónokban Tüdő (i.v.) Máj (i.s.) Agy (i.c.) Csont (i.c.) clone 3.1P ESL ESH L H A tumorsejteket (10 6 /animals) i.v. (tüdő), intrasplenikusan (máj) illetve intrakardiálian (agy, csont) injektáltuk SCID egerekbe. 4-6 hét után az állatokat Nembutallal túlaltattuk és az egyes szervekben az áttéteket sztereomikroszkóp alatt számoltuk meg. Minden csoportban min. 5 állat volt. Az adatok az áttétek %-os gyakoriságát jelenti a csoporoton belül. 3

4 3. ábra. aiibb3 transzfektált melanóma klónok májáttétképző képessége SCID egérben májáttétek száma P E S L E S H 19L 19H 0 3.1P ESL ESH 19L 19H aiib-kló nok 1.2.A két b3 (αiiβ és av) integrin paralell expressziójának következményei: angiogenetikus fenotípus Vizsgálataink arra utaltak, hogy az αiibβ3 integrin transzfekciója αvβ3-at expresszáló humán melanóma vonalakba fokozza az apoptosis resistenciát, aminek következtében a sejtek tumorigenicitása növekedett. Ehhez azonban hozzá járult az is, hogy az in vivo növekedő tumorok kifejezettebb érdenzitással rendelkeztek, aminek egyik oka az volt, hogy a vizsgált transzfektáns klónban nagyságrendekkel emelkedett a bfgf expressziója, míg a VEGF szint konstitutíven magas maradt. Annak igazolására, hogy az αiibβ3 pozitív humán melanóma klónokban emelkedett az bfgf expresszió, szubklónoztuk az eredeti populációt és a kapott mintegy 10 klónt is megvizsgáltuk bfgf expresszióra qpcr módszerrel (Dömet et al.2004). 4. ábra. aiib és bfgf expresszió kapcsolata transzfektáns humán melanóma klónokban (cytokémia és qpcr) αiib protein expression (% of cells) P E S L 8 F L E S H 1 9 H ( t r a n s fe c t e d c lo n e s ) Ahogy azt korábban bemutattuk, humán vizsgálataink arra utaltak, hogy a melanóma vastagságával (nagyságával) az αiibβ3 integrin expressziója nő, míg az αvβ3 expresszió konstitutiven magas marad (Trikha 2002). Ezt a gondolatot emberi melanómás beteganyagon teszteltük, ahol kimutattuk, hogy az eltérő vastagságú és klinikai kimenetelű primer melanómák esetében, bár a peritumorális érdenzitás sokkal nagyobb mint az intratumorális, mégis az utóbbi denzitása függött csak össze az 5 éves túléléssel és a zsigeri áttétek kialakulásával (Döme et al.2002). Ezek a megfigyelések azt erősítették, hogy az intratumorális érdenzitás növekedése felelős a szervi áttétek kialakulásáért a használt (Q-PCR relative unit) bfgf mrna expression 4

5 melanoma modellekben és felvetették, hogy ezért esetleg a megjelenő aiib(b3) integrin és következményes bfgf expresszió felelhet. Kérdés volt továbbá, hogy a megnövekedett angiogenetikus képesség ténylegesen milyen érellátási formára való készséget jelent. Irodalmi adatok és saját vizsgálataink arra utalnak, hogy melanómában például elsősorban nem a klasszikus neoangiogenezis zajlik mint fő érellátási forma, hanem ér-kooptáció a domináló (Döme és mtsai 2002), de az un. vaszkuláris mimikri is gyakori jelenség (Hendrix 2003, Tímár és mtsai 2001). Genetikai vizsgálatok szerint a vaszkuláris mimikri hátterében endoteliális gének neoexpressziója állhat. DNS chip vizsgálataink szerint a 19H transzfektáns vonalban, melynek intratumorális erezettsége jelentősen megnő több un. endotél-specifikus gén fokozott expressziója figyelhető meg: CD34, endotelin receptorb, PI2 szintáz, ami felveti annak a lehetőségét is, hogy az aiib ektópiás expressziója lehet egy olyan genetikai változás melanómában amely az endoteliális genotípus egyes elemeinek megjelenését indukálja A két b3 (αiiβ- és av-) integrin paralell expressziójának következményei: jelátvitel Az αiibβ3-/+ humán melanóma klónokban microarray vizsgálattal teszteltük a génexpressziós változásokat egy 3200K humán cdns chipen az SZBK DNS-chip laboratóriumával kollaborációban. Első elemzéseink azt mutatták, hogy az αiibβ3 transzfektáns humán melanóma klónban az integrin-asszociált jelátviteli pálya több eleme is fokozottan expresszált: így a ABL, FYN, NEC2/3, TEC tirozin kinázok, valamint a farneziltranszferáz és a K-ras. (Fokozódás alatt >3x míg csökkenés alatt <50% expressziós változást tekintettünk). A lipid-szignálút vonatkozásában feltűnő volt a PLA 2, a PI-3K számos cyclooxygenáz és az általunk már korábban megfigyelt PKCα izoforma fokozott expressziója. (Ugyanakkor csökkent volt a FAK és a MAPK expresszió). 3. táblázat. Metasztatikus szignálútvonal expressziós változásai in vivo metasztatizálás során aiibb3 transzfektáns melanóma sejtvonalakban klón 3.1 (>3x) 19H (>5x) Tirozin-kaszkád c-abl EphA2 TEC NEK2 NEC3 Szerin/treonin kaszkád PKA PKCa K-ras Farnezil transzferáz PI3K PLA2 PKCa PKCb Ezen vizsgálatok több ponton is megerősítik korábbi megfigyeléseinket az ektópiás αiibβ3 melanóma sejtekben zajló jelátviteléről, hogy az ektópiás megakaryocyta integrin (αiibβ3) jelátvitele FAK-gátlással, illetve fokozott arachidonsav bomlással és fokozott 12-LOX és PKC aktivitással jár (Rásó et al.2001). A kérdés azonban továbbra is fenn maradt, milyen molekuláris mechanizmus vezet az ektópiás aiib(b3) integrin expresszió esetében a jelentős génexpressziós profilbeli változásokhoz. Irodalmi adatok utalnak arra, hogy a b3 integrin lánc különleges abban a tekintetben, hogy citoplazmatikus doménje endonexin fehérjével áll kapcsolatban (Shattil,1995). Az endonexin kétféle szerepet tölt be, egyrészt a b3 lánc jelátvitelét 5

6 szabályozza, mediálja egy közelebbről még nem ismert módon, másrészt transzkripciós faktorként is szerepel, s így ennek révén a b3 integrin aktiválódása direkt transzkripciós változásokat indukálhat. Ismert target génjei a THRA, RXR, NFkB és a cyclina (Ohtoshi,2000). Ennek ismeretében felmerült, hogy emberi melanómákban a b3 integrin fokozott expressziója endonexinen keresztül jelentős transzkripciós változások kiváltója lehet. 1. táblázat. Endonexin expresszió humán melanómában in vitro (QPCR/+ DNSchip) Q-PCR WM35 (nem metasztatikus) 1 HT A WM983B 1 3.1P H 6.5 Különböző biológiai aktivitású humán melanóma vonalainkban in vitro meglehetősen egyenletes szinten van a b3endonexin expresszió QPCR vizsgálatok szerint. Feltűnő ugyanakkor, hogy az igen alacsony aiib expressziójú (csak avb3-at kifejező) 3.1P klónunkban milyen alacsony az endonexin expresszió és ehhez képest az aiibb3 transzfektált 19H vonalban ez a szint több mint 20x magasabb. Ez a jelentősen megemelkedett endonexin expresszió már magyarázatot adhat az észlelt globális génexpressziós változásokra. Továbbmenve azt is megvizsgáltuk, hogy hogyan alakul az b3endonexin expresszió in vivo körülmények között a tényleges áttétképzés során. Olyan modellt használtunk SCID egerekben, amikor spontán áttétképzés csak újszülött egerekben van, felnőttben nincsen és a kétféle primer tumort hasonlítottuk egymáshoz, illetve a primer tumort a belőle keletkezett áttétéhez. A 3.1P vonal esetében a kétféle primer tumor között gyakorlatilag nem volt jelentős endonexin expresszióbeli eltérés csak az áttétekben emelkedett meg a szint ~5x mértékben. A 19H vonal esetében ezzel szemben már a metasztatikus primer tumorban létrejött egy 5x mértékű endonexin expresszió fokozódás amely az áttétekben már nem emelkedett tovább. 5. táblázat. Endonexin expresszió in vivo aiibb3 transzfektáns klónokban (DNS chip) Metasztatikus primer/ Metasztázis/primer Nem-metasztatikus primer 3.1P <0.6 >5 19H >5 <0.9 Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy a b3 integrin asszociált transzkripciós faktor endonexin expressziója az emberi melanóma áttétképzése során jelentősen fokozódik. Felmerül annak a lehetősége, hogy endonexin expresszió alapján esetleg prognosztizálni lehet a primer tumor alapján annak későbbi biológiai viselkedését/áttétképzését is. Ehhez azonban a piacon még nem létező monospecifikus antitest előállítására van szükség. 6

7 2./ A tumorsejtek ektópiás génexpressziójának felhasználása a differenciál diagnosztikában 2.1. Az ektópiás aiibb3 genetikai szerkezete Vizsgálataink során állandó problémát okozott az annak a ténynek a magyarázata, hogy szemben a trombocitával daganatsejtekben az ektópiás aiib(b3) integrin minden kisérleti adatunk szerint un. aktív magas affinitású konformációban van jelen (Trikha et al.1997, Tímár et al.1998). Normális körülmények között ez más integrinek esetében csak ligand-kötéskor, trombociták esetében pedig aktiválódáskor jön létre. Felmerült az, hogy ennek a konstitutív aktív konformációnak, aminek funkcionális következménye az állandóan bekapcsolt jelátviteli pálya (FAK tirozin-fiszforiláció) esetleg az aiib lánc szerkezeti változása állna. Kollaboráló munkacsoportom bemutatta, hogy az aiib integrin-lánc daganatokban citoplazma-domén hiányos formában is megjelenhet (Trikha 1998). A nyitott kérdés csak az volt, hogy ez új splice variáns-e vagy igazi génkárosodás eredménye. Ezek a megfigyelések fordították figyelmünket az aiib lánc szerkezetének vizsgálatára, ugyanis az emberi örökletes véralvadási/trombasténiás zavarok jelentős részében az aiib integrin lánc mutációja mutatható ki, azonban ezen károsodások valamennyien az integrin extracelluláris doménjét érintik. A különféle trombasténiákban vagy maga a ligand kötő régió vagy az un Ca-kötő béta-propeller régiók (amelyből 4 van az aiib láncban) károsodnak (Mitchell,2003). Ezért olyan primereket terveztünk amelyek aiib specifikus Ca-kötő domén azonosítására alkalmasak. A probléma azért nehéz, mert ebben a régióban (is) meglehetős homológia van a másik, sokkal gyakoribb integrin az αv vonatkozásában. 5. ábra. aiib lánc mrns kimutatása humán melanómában nested PCR és qpcr segítségével. A/ nested PCR: αiib extracelluláris régió outer primer gradiens és ionkoncentráció kalibráció B/ Real-time PCR kalibráció: 250mM, 65 C zöld: extracelluláris régió outer lila: intracelluláris régió - outer Az aiib extracelluláris doménjét a 19H aiibb3 transzfektánsban vizsgáltuk nested PCR segítségével. Meglepetésünkre 2 reakció-terméket kaptunk, melyek szekvenálása során a várt és autentikus (wt) aiib mellett egy kisebb termék is megjelent a 19H sejtekben. A termék 7

8 szekvenálása a nukleotida régióban deléciót jelzett, ami gyakorlatilag 3 aminósav deléciónak felelhet meg ( ). 6. ábra. aiib extracelluláris domén nukleinsav és aminósav szekvencia jelölve a 19H melanómában észlelt eddig még pontosan nem jellemzett eltérést. A/ nukleinsav-szekvencia 1081 accgaaaact ggccgaagtg gggcgtgtgt atttgttcctgcagccgcg ggcccccacg 1141 cgctgggtgc ccccagcctc ctgctgactg gcacacagct ctatgggcga ttcggctctg 1201 ccatcgcacc cctgggcgac ctcgaccggg atggctacaa tgacattgca gtggctgccc B/ aminósav sorrend 301 ldsyyqrlhr lraeqmasyf ghsvavtdvn gdgrhdllvg aplymesrad rklaevgrvy 361 lflqprgpha lgapsllltg tqlygrfgsa iaplgdldrd gyndiavaap yggpsgrgqv 421 lvflgqsegl rsrpsqvlds pfptgsafgf slrgavdidd ngypdlivga yganqvavyr A régió (AA ) az aiib nehézlánc Ca-kötő 2. béta-propeller régiójában helyezkedik el. Irodalmi adatok szerint a 374 pozicióban aminósav-csere megakadályozza az érett aiib lánc keletkezését, trombasténiát okoz (Michell,2003). Mutagenezis vizsgálatok ebben a régióban azonban azt is kimutatták, hogy a környező aminósavak is befolyásolják a Ca++ kötést és az aiib lánc érését és a régió bizonyos aminósav-cseréi az aiib lánc fokozott stabilitásához és ami ennél is érdekesebb, az un. aktív, magas affinitású konformáció konstitutív kialakulásához vezethet. Saját funkcionális vizsgálataink a humán melanóma vonalainkon azt mutatják, hogy különböző mértékig de az aiibb3 komplex magas affinitású konformációban van jelen a sejtfelszinen és igen ritka az aiibb3 hiánya, különösen nem áll ez a 19H klónra. A megfigyelt Ca-kötő régió-beli aminósav deléció nagy valószínüséggel nemhogy nem akadályozza meg a kóros fehérje felszinre jutását aiibb3 komplexben, hanem valószínüleg a konstitutív aktiváltság egyik okozója is lehet. Másik okként természetesen az aiib lánc citoplazmatikus domén-deléciója is állhat (ami a transzfektáns modellünkben természetesen nem állhat fenn). Ezek a vizsgálatok arra irányítják figyelmünket, hogy egy adott adhéziós molekula expressziója malignus daganatban önmagában még nem szolgáltat elegendő magyarázatot az esetleges különös vagy domináns funkciójára, annak hátterében génszerkezeti eltéréseket is érdemes keresni Melanóma-specifikus gének expressziójának vizsgálata klinikai anyagban Korábbi globális genomikai vizsgálataink során több olyan gén expressziójára figyeltünk fel, melyek nevushoz képest fokozott expressziót mutattak és ezt qpcr módszerrel is igazolni tudtuk. Ezek között a sejtciklust szabályozó cycline, a neurogén sejtek egyik receptora a cannabioid receptor-1 és szívizom Ca-csatornája a ryanodin receptor 2 voltak. Kérdés volt, hogy ezeket a géneket fehérje szinten is ki tudjuk-e mutatni sebészeti mintákban és vajon paraffinos anyag is elegendő erre nevus és melanóma vizsgálata alapján egyik fenti fehérje sem mutatható ki paraffinos melanóma mintákban a jelenleg hozzáférhető antitestek segítségével. Ugyanakkor valamennyi fehérje megbízhatóan detektálható fagyasztott anyagban, ebből azonban csak paralell minta állt rendelkezésre. A cyclin E esetében elsősorban magi reakciós mintázatot kaptunk, bár a melanómák egy részében intenzív cytoplazmatikus reakció is észlelhető volt. A minták között több negatív melanómát is találtunk ugyanakkor a nevusok negatívnak bizonyultak immuncytokémiai vizsgálattal. 8

9 7. ábra. Cyclin E protein kimutatása nevusban (A) és VGP melanómában (B). A B A nevusban a laphámsejtek pozitívak, míg a nevus sejtek negatívak. A melanóma sejtek intenzív magi és cytoplazmatikus reakciót mutatnak. Magfestés (piros), cyclin E (zöld). Immunfluoreszcencia. RyR2 fehérje esetében a fentiekhez nagyon hasonló mintázatot kaptunk, bár ez a fehérje egyértelműen cytoplazmatikus lokalizációjú volt az SSM melanómákban. 8. ábra. Ryanodin Receptor-2 kimutatása nevusban (A) és SSM melanómában (B) immunfluoreszcens módszerrel. A B A nevussejtek negatívak (A: zöld fluoreszcencia), míg a melanóma sejtek (B: zöld fluoreszcencia) erősen pozitívak RyR2-re. A sejtmagok pirosan fluoreszkálnak. A továbbiakban a CB1 cannabioid receptor fehjérjét kiséreltük meg kimutatni emberi melanóma sejtvonalakban amihez igen agresszív biológiai viselkedésű vonalakat használtunk: a HT199 és M1-et melyek genetikailag egymással nem állnak kapcsolatban. Immunfluoreszcens vizsgálattal igazoltuk, hogy humán melanóma sejtvonalakban a CB1 receptor protein kimutatható, mégpedig 2 lokalizációban, a sejtfelszinen illetve cytoplasmában (ez nem csoda), de meglepő módon nagy mennyiségben van jelen a sejtmagban is amire nézve eddig még nem találtunk magyarázatot. 9

10 9. ábra. CB1 receptor kimutatása emberi melanóma sejtekben in vitro (immunfluoreszcencia) A/ HT199 humán melanóma sejtek B/ M1 humán melanóma sejtek Cytoplazmatikus CB1 reakció A sejtmag pirosan jelölt. Nnukleáris CB1 reakció (zöld). Az elmúlt években számos közlemény jelent meg arról, hogy endogén cannabioidok jelentősen képesek különféle daganatféleségek proliferációját illetve apoptosisát befolyásolni, az adatok többsége proliferáció gátlásról és apoptosis indukcióról szól, ami in vitro és in vivo is kiváltható. (Bifulco, Di Matzo, Nat Med 8: ,2002). A vizsgálatok kimutatták, hogy a hatásért általában a CB1 receptor expresszió felelős, illetve annak daganatos szignalizációja melynek downstream targetje az EGFR illetve MAPK lehetne Mindezen adatokról még nem tudva, magunk emberi melanóma sejtvonalak globális génexpressziós mintázatát tanulmányozva észleltük, hogy ezek CB1 mrns-t tartalmaznak. Természetesen a kérdés az hogy ez a receptor funkcionálisan aktív-e. Ezért megvizsgáltuk 2 CB1 ligand biológiai hatásait több humán melanóma sejtvonalunkon és meglepő módon azt kaptuk, hogy mind a CB1 agonista 2met-F-AEA, mind a CB1 antagonista AM251 jelentősen gátolta a sejtproliferációt: az IC50 mindkét esetben 5 µm körül volt. Azt azért ehhez hozzá kell tenni, hogy a hatás elsősorban az apoptosis-érzékeny szérum-mentes közegben volt ilyen pregnáns, szérum jelenléte az IC50-et csaknem egy nagyságrenddel megemelte! 10. ábra. 2MetF-AEA CB1 agonista és AM251 CB1 antagonista hatása M1 melanóma in vitro proliferációjára (szerum mentes közegben) cell density µ M M e t - F - A E A A M A melanóma az egyik legagresszívebb roszindulatú daganat mely egyben igen rezisztens a kemoterápiás szerekre. Ennek hátterében az áll, hogy a melanocyta és a melanóma sejtek is apoptosis rezisztensek. Azt tartja a köztudat, hogy az apoptosis rezisztencia áttörése nélkül nem lehet ezt a daganatot gyógyszeresen kezelni. Ebből a szempontból lenne jelentősége a melanóma CB1 receptorát moduláló farmakológiának.ehhez azt kell igazolnunk, hogy melanóma esetében apoptosis indukcióról van szó, (más daganatokban is ez történik: emlőrák, prostatarák, vagy glioblasztóma). Pozitív esetben érdekes farmakológiai lehetőséget rejthet a funkcionális CB1 receptor jelenlétének kiaknázása emberi melanómában. 10

11 3./ A tumoros progresszió génexpressziós térképének kialakítása a tumorok individuális viselkedésének predikciójára 3.1.Progressziós oligo- chip készítése Humán melanóma Az áttétképzés folyamatának kutatásában a microarray technika jelentős előrehaladással kecsegtet. Alkalmazásának azonban gátat szab, hogy a műtéti anyagokból származó minták lokalizációja, stádiuma valamint a host genetikai és fiziológiai státusza egyaránt rendkívül heterogén mintázatot mutat. Célunk egy olyan kísérletes metasztázis modell kidolgozása volt, amely a lehető legtöbb paraméter szempontjából standardizálható, ismételhető és az azonos típusú, de különböző genetikai eredetű humán tumoroknak, jelen project esetén humán melanómák vizsgálatára egységes platformot biztosít, amely alapján a valóban host vagy tumor eredetű változásokra lehet a kérdéseinket fókuszálni. A vizsgálatok végső célja az, hogy a melanómák un. metasztatikus génexpressziós újjlenyomatát meghatározzuk, miután erre nézve csak igen kezdetleges adatok állnak rendelkezésre, szemben pl. az emlőrákkal. A modell alapja az a tény, hogy veleszületetten vagy mesterségesen immunszupprimált újszülött rágcsálókban számos olyan humán tumor ad megbízható gyakorisággal áttétet, amely kifejlett állatokban soha. Ily módon lehetőségünk van arra, hogy genetikailag gyakorlatilag azonos hostba, azonos időpontban, azonos lokalizációba, azonos tumorsejt-szuszpenziót implantáljunk. A különbség a két host között fiziológiás, ám az áttétképzés szempontjából mégis döntőnek bizonyul. Mivel a tumor stromális komponensei host eredetűek, a host és tumor eredetű változások külön speciesspecifikus DNS-chipen (egér ill. humán), azonos mintából vizsgálhatóak. Az áttétek könnyen hozzáférhetőek, azaz azonos időpontban hasonlíthatjuk össze a primer és az áttéti tumor génexpressziós mintázatát is és ezt is a stromális komponensek zavaró hatása nélkül. Veleszületetten immunhiányos újszülött (a születéstől számított 24 órán belül) és kifejlett scid/scid egérbe ugyanazon humán melanóma sejtvonal in vitro tenyészetéből származó egysejtszuszpenzióját implantáltunk azonos szubkután régióba (szemiortotop implantáció). A kiértékelés két időpontban történt, a tumor implantációjától számított 7. és 21. napon. A 7. napon a makroszkóposan színes gombostűfejnyi tumorból és környezetéből totál RNS-t izoláltunk. Ugyancsak RNS-t izoláltunk azonos alomból származó 7 napos állatok megfelelő szöveti régiójából. A 21. napon kizárólag a tokkal körülhatárolt primer tumort távolítottuk el mindkét állatcsoportból, illetve a tüdőáttéteket vágtuk ki egyenként az újszülöttként implantált állatok tüdejéből. Ugyanezen kísérletet három, genetikailag különböző eredetű humán melanóma sejtvonallal (WM983B, HT168M1, HT199) párhuzamosan végeztük el. Az expressziós mintázat változásának kiértékelését a 21. napon gén-specifikus probeot (Operon-SIGMA) hordozó humán oligonucleotide microarray-vel (SZBK, Dr. Puskás László Biorobotics TAS spotter) végeztük el. Szignálamplifikációt (Genisphere) követően a Cy5-jelölt mintákat Ventana Discoveries automata hibridizációs rendszerrel hibridizáltuk és olvastuk le. Az egyszínű jelölés lehetőséget nyújtott (az Affymetrix rendszeréhez hasonlóan) valamennyi minta összes más mintához történő összehasonlítására. A statisztikai elemzést Lowess normalizáció és T-teszt segítségével végeztük el. Az M és A értékeket alapján határoztuk meg azokat a géneket, amelyek expressziós változása szignifikánsnak volt tekinthető. A 7. napon nyert minták kiértékelésére a tumor eredetű faktorok esetén az Agilent 41,000 génre specifikus (60-mer oligo próbákat hordozó) Whole Human Genome Oligo Microarray Kit-jét, a host eredetű faktoroknál az Agilent 20,000 egér eredetű génre specifikus (ugyancsak 60-mer oligo próbákat tartalmazó) Agilent Mouse Oligo Microarray Kit-jét használtuk. A mintákat amplifikálás nélkül Cy3 és Cy5-jelölést követően páronként 11

12 egymással szemben hibridizáltuk és Agilent Microarray Scanner segítségével olvastuk le és a cég által biztosított Agilent Feature Extraction Software segítségével értékeltük ki. Az implantációtól számított 21. napon az újszülöttként implantált állatokban minden esetben tüdőáttétet, esetenként agyi és nyirokcsomó áttéteket találtunk. Kifejlett állatokban lényegesen hosszabb túlélés esetén sem tapasztaltunk áttétképzést ebből a lokalizációból egyetlen humán melanóma esetén sem Ez a modell számos előnnyel szolgál az áttétképzésben (potenciálisan) résztvevő gének felderítése szempontjából. Először is lehetőséget kínál annak eldöntésére, hogy az áttétképzésre alkalmas sejtpopuláció szelekcióját host vagy tumor eredetű tényezők befolyásolják. Azaz a host által biztosított környezet szelekciós nyomást gyakorol a kiindulási, in vitro tenyészetből származó sejtpopulációra, és ily módon egy olyan primer tumor alakul ki, amelyben már jelen vannak az áttétképzésre alkalmas sejtek. Ebben az esetben lényeges különbséget kell találnunk a kifejlett és az újszülött állatban kinőtt, azonos korú primer tumor génexpressziós mintázata között. Ez a szelekció, mivel ezen inbred állatok genetikai állománya gyakorlatilag azonos, azonos az implantáció lokalizációja, tehát a szöveti környezet is, mindössze a host fiziológiásnak tekinthető állapotkülönbségével, azaz a újszülött státusszal hozható összefüggésbe. A modell ebben a tekintetben egészen különleges lehetőségeket kínál a xenograft tumorok jól ismert szövettani sajátságai miatt. Ezen tumorokban ugyanis kizárólag a tumor humán eredetű, míg a stromális komponensek (kötőszövet, erek) host, azaz egér eredetűek. Amennyiben tehát a tumor génexpressziós mintázatában mutatkozó különbségeket szeretnénk vizsgálni, humán microarray-el nagy valószínűséggel megtehetjük. Nem szembesülünk azzal a humán műtéti anyagból származó mintákban oly gyakori problémával, hogy a tumorból származó RNS pool a stromális komponenseket is tartalmazza, annak arányától függően jelentősen torzíthatja hígíthatja a tumorra jellemző RNS mintát. Mivel a standardizálásra használt géneket a stromális komponensek is ugyanúgy expresszálják, a hígítás mértékét nem lehet kontrollálni. Izgalmas lehetőség, hogy eldöthető, hogy bizonyos, potenciálisan a host és a tumor által egyaránt expresszálható génekről eldönthető, hogy mely komponensből származnak. Ami ennél is lényegesebb, az újszülött és a kifejlett állat által a tumor számára nyújtott host eredetű faktorok egér microarray segítségével egyértelműen meghatározhatók és összevethetők. Mivel az eredmények validálása (humán gének esetén az Applied Biosystems TaqMan kártyája segítségével, host eredetű gének esetén kvantitatív PCR-ral, egyedileg tervezett primerekkel) most van folyamatban, végleges génlista még nem közölhető. 11. ábra. Humán oligochip hibridizálás M1 humán melanóma metasztatikus és nemmetasztatikus primer tumorának RNS-ével. A/ Oligo-chip spot-fluoreszcencia B/ Génexpresszió változások megoszlása A 21. napon vett minták alapján levonható következtetések (kizárólag olyan géneket figyelembe véve, amelyek a három tumor közül legalább kettőben több mint 2-szeres különbséget mutattak): 12

13 Az áttétképző és nem-áttétképző sajátossággal rendelkező primer melanómák (újszülött szubkután vs felnőtt szubkután) 72 eltérő módon expresszálódó gént hordoztak. Ez a szám a szelekciós teóriát támasztja alá, mivel lényegesen több, mit az újszülött primer tumora és tüdőáttéte közötti 42 gén különbség. Különösen ha tekintetbe vesszük, hogy ezen gének egy része nagy valószínűséggel az új mikrokörnyezet (szubkután vs tüdő) hatására váltott expressziós mintázatot. Érdekes módon feltűnően sok mrns-splicingért felelős gén mutatott szignifikáns eltérés ebben az összehasonlításban. A legnagyobb különbséget (103 gén) az in vitro tenyészet (amiből a szubkután implantációk megtörténtek) és a szubkután növő tumor expressziós mintázatában találtunk, amely a tenyészeteken végzett kísérletek korlátolt értékelhetőségére hívhatja fel a figyelmünket. A 7. napon értékelt minták esetében 846 up és 1175 down-regulált humán gén mutatott 2-szeresnél nagyobb expressziós különbséget egybehangzóan legalább kétféle humán melanóma esetében. Ez a változás arányaiban lényegesen nagyobb, mint a 21. napos változás. Az eltérő platformon kívül a host esetleges változása (az újszülött felnő ) is magyarázhatja ezt a jelenséget. Az újszülött esetén szelekciós nyomást gyakoroló faktorok eltűntével ugyanis a tumor genetikai instabilitásának köszönhetően az új faktorok által támogatott populációkkal gyarapszik, s ezzel kihígul az áttétképzésre jellemző expressziós mintázat. Különös tekintettel figyelünk azon génekre, amelyek megváltozott expressziója a 21. napra még mindig megtartott. Az egér-gének vizsgálatakor (inváziós host) 36 down és 46 upregulált gént észleltünk (p<0.001) ami alaposan leszűkíti a szelekciós nyomásért felelőssé tehető faktorok számát. Ennek kiszűrése és a humán műtéti anyagok stromájából a megfelelő humán gének expressziójának kimutatása teljesen újszerű eredményeket ígér Fejnyaki laphámrák Régi klinikai megfigyelés, hogy a különböző anatómiai lokalizációjú fejnyaki rákok esetében a klinikai lefolyásban jelentős eltérések vannak, bár a szövettani típus vagy a klinikai stádium igen hasonló. Ennek egyik lehetséges magyarázata lehet az, hogy ugyanazon daganattípus génexpressziós profilja az anatómiai környezet (normál szövet) hatására eltérő lehet. Ennek tisztázására húsz glottikus gégerák esetében az un. metasztázis gének expressziós mintázatát vizsgáltuk egy 96 génből álló Superarray makrochip segítségével. A daganatokat larynngeaális és hypopharyngealisakra osztottuk és eltérő expresszió határának a 2x különbségeket vettük. A vizsgált 96 gén közül 18 esetében találtunk eltérő expressziót a két anatómiai lokalizációban (20%). Vizsgálataink szerint a jobb prognózisú laryngeális daganatokban 3 metasztázis szuppresszor gén: NME4, DCC és E-cadherin1 jelentős expressziót mutat a hypopharyngeális tumorokhoz képest, ami alátámaszthatja ezen tumorok kevésbé aggresszív viselkedését. Ugyanakkor a laryngealis rákokban számos u. metasztázis asszociált gén expressziója mutatható ki (integrin a5/a6, MMP1, CD44, osteopontin) amelyek nincsenek jelen a hypopharyngeális rákokban, igazolva azt, hogy a két daganatféleség progressziós képessége jelentősen eltérhet (1. táblázat). 13

14 6. táblázat. Glottikus tumorok differenciált metastasis-asszociált génexpressziója (SuperArray macrochip) Gene nam e GeneBank Description Larynx (n=5) Rac1 NM Ras-related C3 botulinum toxin substrate NME1 NM Non-metastatic cell-1 protein (NM23A) S100A4 NM S100 calcium binding protein A4 Osteopontin NM Secreted phosphoprotein-1 (osteopotin) CD44 NM CD44 antigen Integrin α5 NM Integrin, alpha 5 (fibronectin receptor alpha) Integrin α6 NM Integrin, alpha 6 Collagenase1 NM Matrix metalloproteinase 1 (interstitial) PAI-1 NM Plasminogen activator inhibitor type 1 Cystatin C NM Cystatin C DCC NM Deleted in colorectal cancer NME4 NM Non-metastatic cell-4, protein E-cadherin NM Cadherin 1, epithelial CD31 NM Platelet/endothelial adhesion molecule-1 MT1-MMP NM Matrix metalloproteinase 14 (membraneinsert) TMPRSS4 NM Transmembrane protease, serine 4 FGF2 NM Fibroblast growth factor 2 (basic) c-fes NM Feline sarcoma oncogene homolog Hypopharynx (n=5) Human tumor metasztásis gene-array-t (SuperArray HS 007-N) használtunk 5-5 poolozott laryngeális és hypopharyngeális tumor exőressziós mintázatának megállapítására. A cdns biotinylated-16-dutp volt jelölve és chemiluminescens probával. A 4 párhuzamos spot intenzitását Alpha Innotech Chemi Imager 8900 készülékkel mértük. A gének expressziós szintjét GAPDH housekeeping genhez hasonlítottuk. Jelek: nincs= fehér, van=fekete, down-regulált=zöld, over-expresszált=piros, eltérés >2 fold Hasonló következtetésekre lehetett jutni a génpolimorfizmus vizsgálatokkal: a DNS repair gének XRCC1 és XRCC3 polimorfizmusainak igen eltérő gyakorisága észlelhető a laryngealis illetve hypopharyngealis rákokban (Tímár és mtsai 2005). Ezek a megfigyelések előre vetítették annak a lehetőségét, hogy a kétféle anatómiai lokalizációban a rákok progressziója eltérő genetikai mechanizmusokkal történhet. A progresszióban szerepet játszó genetikai újjlenyomat meghatározására vonatkozó vizsgálatok eredményét az RP5. beszámoló tartalmazza. 14

15 3.2. Progressziós protein-chip tervezése (Németh P., PTE-IBI) A projekt záró szakaszában elsősorban az anti-hbxag ellenanyagon alapuló onkodiagnosztikai kit rendszer végső fejlesztéseit végeztük el. A kit egyik eleme a korábbi beszámolóban (2003. december) részletezett elméleti megfontolások alapján kifejlesztett immunszerológiai mérőrendszer, a másik, a szervezet immunológiai válaszreakciójának vizsgáló antitest meghatározás.a betegek vérszérumából történő HBxAg mennyiségi meghatározására kifejlesztésre került tesztrendszer is két részből áll: a.) individuális méréseket lehetővé tevő, un. szendvics ELISA b.) fluoreszcens mikrogyöngy alapú multiparameteres vizsgálati esszé. Mindkét eljárás alapját azok az monokonális ellenanyag párok képezik, melyeket a korábban kidolgozott és rekombináns technikával expresszáltatott HBxAg ellen készültek. A teljes antigén elleni ellenanyag epitópjának meghatározása az intézetben kidolgozott és publikált - random fág könyvtár segítségével történt. A bioinformatikai analízis alapján kiválasztott második ellenanyag lehetővé tette, hogy mindkét esszét standardizálni lehessen. A szendvics ELISA alkalmas a rutin diagnosztikán kívül retrospektív és prospektív vizsgálatok elvégzésére. A mikrogyöngy alapú esszé más markerekkel történő korreláció vizsgálatára ad lehetőséget. Mindkét módszer fontos prognosztikai eszköz lehet az onkológus kezében, mert nagyfokú specificitásuk és érzékenységük a primér hepatocelluláris carcinoma rizikójának egyetlen előjelző markere jelenleg a HBxAg kimutatása. Mindkét esszé tesztelése megtörtént, a K+F fázisból a gyártási-forgalmazási fázisba történő átvitelük folyamatban van. A piacon jelenleg nincs hasonló szerodiagnosztikum forgalomban. A metodikák és a vizsgálati eredmények publikáció alatt állnak (Pál J, Pálinkás L, Nyárády Z, Czömpöly T, Marczinovits I, Lustyik Gy, Younes Saleh A, Berencsi Gy, Chen R, Varró R, Pár A, Németh P: Sandwich type ELISA and a fluorescent cytometric microbead assay for quantitative determination of Hepatitis B virus X antigen level in human sera. Hepatology, Manuscript ID: HEP ). A projekt másik részfeladatát a szervezet válaszreakciójának térképezése jelentette. Különböző rekombináns technikával előállított antigén fragmenseken végeztük a térképezést. A vizsgálatok eredménye azt mutatta, hogy a HBxAg molekula C terminális része a felelős az effektív humorális immunválasz (antitest termelés) kiváltásáért. Az elvégzett regresszió analízisek alapján egyértelműen azonosítani lehetett a C terminális fragmens szerepét a hordozóvá válás, ill. a krónikus hepatitisz kialakulásában. A vizsgálatok során sikerült a szűkebb szakasz térképezése is, ami alkalmas lehet további modellvizsgálatok után terápiás vakcina tervezésére. Az eredmények publikációja folyamatban van (Pál J, Nyárády Z, Marczinovits I, Younes Saleh A, Berencsi Gy, Németh P: The C terminal end of HBxAg is responsible for the efficient immune response against Hepatitis B virus: bioinformatic analysis of serum HBxAg level and the specific antibody production against their various epitopes.) 15

16 4./ Preklinikai vizsgálatok új innovatív antimetasztatikus terápiás eljárások kidolgozására 4.1./ Antiaggregációs terápia Thrombocyta αiibβ3 specifikus antitest terápia lehetősége melanómában Korábbi vizsgálatainkban bemutattuk, hogy b3 integrin-ellenes antitest kezeléssel (RheoPro) emberi melanóma tüdő-áttétképzése gátolható volt. Miután az antitest nem tesz különbséget a thrombocyta és daganatsejt aiibb3 illetve az aiibb3 illetve avb3 integrinek között, ezek az adatok csak felvetették annak lehetőségét, hogy a hatásért esetleg a melanóma sejtfelszini aiibb3 is felelős lehet (Trikha et al.2002). Hogy a kérdést tovább vizsgáljuk B16a melanóma sejteket kezeltünk anti-aktív αiibβ3 integrin antitesttel (PAC-1) órára, ahol kontrollként IgM illetve a fiziológiás ligand, a fibrinogén szolgált. A kísérlet során meghatároztuk a mitózis-, apoptózis rátát és a sejtszámot. 24 órás antitestkezelés (2-20 µg/ml) nem okozott szignifikáns apoptózis szám emelkedést a kezelt sejtekben. Ugyanakkor 48 órára a mitózis-szám szignifikánsan (50%-kal) csökkent és a sejtproliferáció is drámaian lecsökkent. 12. ábra. PAC-1 antitest kezelés hatása B16a melanóma proliferációjára in vitro. A/ Sejtpoliferáció 48 óra B/ Mitózis szám 24 óra cell density FBG PAC-1 concentration (µg/ml) FBG PAC-1 number of mitosis/10 3 cells Ez a sejtproliferáció-gátlás lehetséges következménye lenne a jelátviteli kísérletekben PAC-1 hatásra bekövetkező foszfotirozin foszfatáz aktiválódásnak és következményes gátolt tirozinszignál-aktivitásnak. 13. ábra. PAC-1 kezelés hatása a tirozin foszforiláció dinamikájára B16 sejtekben CTR PAC-1 % positive cells m in B16a sejteket in vitro inkubáltuk PAC1 antitesttel és a jelzett időpontokban mintát vettünk, melyekben a foszforilált tirozin-os fehérjéket immuncitokémiával jelöltük és a + sejtek százalékát flow cytométerben mértük. Ezek a megfigyelések kisértetiesen hasonlítanak azon jelenségekhez, amit manapság több daganatféleségben leírtak. Az c-erbb2 amplifikált emlőrákokban és c-erbb1-et fokozottan kifejező laphámrákokban ezek a daganatsejtek a két tirozin-kináz un. konstitutív aktivitásával jellemzhetők és a receptor-ellenes un. gátló antitestekkel (extracelluláris domén- 16

17 specifikusakkal) a daganatsejtek proliferációját lehet gátolni és a daganatszövet növekedését fékezni, miközben a jelátviteli pálya kikapcsolódik. Melanóma-modell rendszerünkben az ektópiás aiibb3 integrin konstitutívan aktivált állapotban van, amit a FAK konsitutív tirozinfoszforilációja igazol (Rásó 2001). Ezt a folyamatot a PAC-1 antitest fel tudja függeszteni (eddig még nem pontosan ismert módon), ami nem egyszerűen a ligand-kötő domén lefedése lehet, mert a fiziológiás ligand, a fibrinogén kezelés nem képes a sejtproliferációt leállítani a B16 sejtekben. Mindezek a kisérleti eredmények felvetették annak a lehetőségét, hogy antiaiibb3 integrin elleni antitest-kezeléssel ilyen melanómák progressziója gátolható lenne LMWH heparin antimetasztatikus hatásának további elemzése Korábban bemutattuk, hogy az LMWH specifikus antimetasztatikus hatással bír. Egyes szerzők heparin ilyen hatásának vizsgálata során az endothel sejtekhez történő daganatsejt kitapadást és annak selectin mediált mechanizmusát tételezték fel. Ennek megfelelően mi is megvizsgáltuk humán melanóma sejtek és endothelsejtek felhasználásával, hogy az LMWH befolyásolja e az adhéziót. 14. ábra. M1 humán melanóma sejtek kitapadása emberi endotélsejt réteghez heparin és LMWH (Fragmin) jelenlétében in vitro (4 óra). 30 Control UFH number of adherent cells per field (mean ± SEM) *p<0.05 * * LMWH 0 Control UFH LMWH Vizsgálataink szerint a pozitív kontrollként használt heparinhoz hasonlóan a Fragminnak (LMWH) is melanóma-endotél adhéziót gátló hatása volt, tehát ez lehet az egyik lehetséges magyarázat a korábban megfigyelt tüdőkolonizáció gátló hatásnak. További kérdés volt, hogy a keringésbe juttatott melanóma sejtek hová kerülnek LMWH hatása alatt. Korábbi vizsgálataink azt mutatták, hogy a célszervbe (tüdő) sokkal kevesebb daganatsejt jut el, más szervben pedig áttét nem keletkezik. Ezért az LMWH-val kezelt állatok véréből humán melanóma kimutatást végeztünk érzékeny q-pcr módszerrel amikor is a humán WT1 gént használtuk markerként. 17

18 15. ábra. Heparin és Fragmin (LMWH) előkezelés hatása a keringésben lévő melanóma sejtek számára SCID egérben 5 Control UHFFH 4 LMWH H min 60 min Az állatokat a daganatsejtek i.v. bejuttaása előtt i.p. kezeltük humán ekvivalens dózis heparinnal illetve Fragminnal (200IU/kg). A bemutatott időpontokban vért vettünk, melynek sejtes elemeiből RNSt izoláltunk. Az adatok β-actinra normalizált relatív mrns expressziót jelentenek és 3 mérés átlagai. Megállapítottuk, hogy a daganatsejtek keringésbe juttatása után már 5 perccel jelentősen több daganatsejt reked a vérpályában LMWH kezelés alatt, mint anélkül és ez a hatás 60 percig áll fenn. Ezek az adatok arra utalnak, hogy az LMWH kezelés egyrészt gátolja a melanóma sejtek endotélsejtekhez történő kitapadását a célszervben, emiatt a daganatsejtek tovább maradnak a keringésben és emiatt valószínűleg nagyobb eséllyel pusztulnak el (mivel más szervekben egyáltalán nem és a célszervben is csökkent mértékben képesek áttétet képezni). A célszervbe eljutott kevesebb daganatsejt pedig migrációjuk gátolt volta miatt nagyobb eséllyel pusztul el vagy lesz képtelen invázióra (korábbi kisérletek). 4.2./ Az endocrin terápia lehetőségeinek kiterjesztése un. nem hormonérzékeny daganatokra Fejnyaki daganatok A kutatási project záró évében tovább folytattuk a fejnyaki daganatok hormonreceptor státuszának vizsgálatát. A hormonreceptor státuszt két alternatív módszerrel határoztuk meg, egyrészt fagyasztott mintában immuncytokémiai módszerrel vizsgáltuk az ösztrogén receptor (ER)a, ERb és a progeszteron receptor (PgR) fehérje tumorban történő jelenlétét fluoreszcens mikroszkópiával, majd a pozitív minták esetében adatainkat RT-PCR módszerrel is ellenőriztük és limitált esetben a kapott terméket meg is szekvenáltuk. Összesen 67 esetet vizsgáltunk ilyen kritériumok szerint, 24 szájüregi rákot és 43 glottikus tumort, az esetek döntő többsége férfi volt és a tumorok valamennyien laphámrákok. A fejnyaki daganatok 58.2%-a expresszált valamilyen sex hormon receptort és ebből a szempontból nem volt különbség a kétféle lokalizáció között. Jellemzően gyakoribb volt a többes hormonreceptor expresszió mint a szoliter és ezek között a leggyakoribb az ERa+PgR genotípus volt a leggyakoribb amit az ERa/b+PgR követett. Klinikai szempontból a funkcionális ER expressziónak lehet jelentősége az esetleges hormonterápia szempontjából, ezért külön is megvizsgáltuk az ER+PgR fenotípusú kombinációt, mert a PgR megjelenése ER mellett indirekt bizonyíték az ER funkcionális expressziójára, mivel a PgR ER transzkripciós kontroll alatt áll. A fejnyaki daganatok 41.8%-ban találtunk un. funkcionális ER expressziót, ami igen magas arány még az emlőrákokhoz képest is. 18

19 7. táblázat. Fejnyaki daganatok sex hormon receptor státusa (n=67) Összes (n=67) szájüregi rák (n=24) Glottikus rák (n=43) neg ERa ERb ERa/b PgR ERa- ERb+PgR ERa/b+PgR PgR 28/67 0/67 1/67 5/67 5/67 15/67 4/67 9/67 10/24 0/24 0/24 4/24 0/24 6/24 1/24 3/24 18/43 0/43 1/43 1/43 5/43 9/43 3/43 6/43 A receptor pozitivitást immuncytokémiával és RT-PCR-ral határoztuk meg. A 67 eset közül 48 esetében már rendelkezésre állt a 3 éves túlélési adat. A 48 daganat között 15 szájüregi rák volt, azonban ezek között nem volt kiegyenlített arányban receptor negatív tumor ezért a szájüregi rákok esetében nem lehetett statisztikai elemzést végezni, csak a glottikus tumorok esetében. A 33 glottikus tumoros beteg 3 éves túlélésének elemzése azt mutatta, hogy az ER negatív daganatos betegek túlélése lényegesen jobb mint a receptor pozitív eseteké (78.9% versus 42.8%). Hasonló eredményt kaptunk, amikor az un. funkcionális ER pozitivitás szempontjából vizsgáltuk a túlélést (ER+PgR+): mert a negatív csoportban 75% volt míg a pozitívban csak 46.2%. 16. ábra. Ösztrogén receptor státusz hatása glottikus rákok túlélésére survival fraction (%) Ezek a vizsgálatok elsőként igazolták molekuláris szinten, hogy a fejnyaki rákokban autentikus és funkcionális hormonreceptorok expresszálódnak. Előzetes adataink a vizsgált beteganyag mintegy felén azt mutatják, hogy az ösztrogén receptor expressziónak a túlélés szempontjából komoly prognosztikus ereje van. Ezen két megfigyelésünk alapján azt állítjuk, hogy a fejnyaki daganatok (de legalább is a glottikus tumorok) nagy valószínüséggel hormondependens daganatok és szelektív ösztrogén receptor antagonista gyógyszerekkel valószínüleg kezelni lehetne. A hipotézist klinikai vizsgálatban kellene tesztelni. Humán Melanoma month ER+ (n=14) ER- (n=19) Az irodalomban régóta folyik a vita, hogy humán melanóma hormonérzékeny daganat és hogy expresszálhat ösztrogén receptort. Korábbi vizsgálatainkban azt találtuk, hogy emberi melanóma vonalak kisérleti májáttétképzése jelentősen függött a host nemétől: a nóstány 19

20 állatokban sokkal kevésbé volt hatékony a folyamat. Ez felvetette azt, hogy a melanómákban ösztrogén receptor lenne és ez volna felelős az eltérésért. Jelen kutatási periódusban az un. glukokortikoid receptor család expresszióját térképeztük fel az általunk használt humán melanóma sejtvonal-panelen. A vizsgálatokat első lépésben RT- PCR módszerrel végeztük és az ösztrogén receptorokat (ERa és b), a progeszteron receptort (PgR), az androgén receptort (AR) valamint a glukokortikoid receptort (GCR1) határoztuk meg. 17. ábra. Humán melanóma glukokortikoid receptor expressziós analízise RT-PCR módszerrel (n=15) ERα ERβ PGR AR marker, 2.+kontroll, 3. 8F3, 4. 9B4, 5.28/01tumor, 6. M29, 7. 35/01 tumor, 8. 32/01 tumor, 9. A2058, 10. WM983A, 11.6E5, , 13. WM983B, 14. HT168, 15. M1, 16. WM35, 17. HT199, 18. negativ GCR marker, 2. M1, 3. HT168, 4. A2058, 5. HT199, 6. M35, 7. M24, 8. WM983A, 9. WM983B, 10. tumor, H, L, kontroll, 14. negativ Eredményeink szerint a vizsgált humán melanóma vonalakban és a néhány tumorszövetben autentikus ER, PgR, AR és GCR expressziót lehet kimutatni. Feltűnő, hogy az ER izoformák a PgR és az AR tekintetében számos un. splice variáns is kimutatható, bár gyakoribb a vad típusú génforma. Amennyiben humán melanóma vonalaink megfelelő sex hormon receptort expresszálnak, felmerül annak lehetősége, hogy ezen hormonok befolyásolnák az áttétképzést. Ebből a célból két sejtvonal esetében un. arteriális kolonizációs tesztet végeztünk SCID egérben. A két sejtvonal elsősorban a májba képezett áttéteket, így vizsgálatainkat ezen modell esetében folytattuk. 20

21 A kísérleteket a tumorsejtek beoltását megelőzően orchiectomián ill. ovariectomián átesett hím ill. nőstény, valamint kontroll hím és nőstény egereken végeztük, két, korábbi vizsgálatokban erős májpreferenciát mutató melanoma sejtvonalon. Mindkét sejtvonal esetében jelentős különbség mutatkozott a szívbeoltást követően létrejött májáttétek számában a kontroll hím és nőstény állatok között, az előbbiek javára. Emellett az orchiectomián átesett hímekben a májkolóniák száma szignifikáns mértékben csökkent (különösen a HT168-M1 sejtvonal esetében). Ezzel szemben az ovariectomián átesett nőstényekben a kontrollokhoz viszonyítva a HT199 vonal esetén magasabb áttétszámot találtunk, és hasonló tendenciát figyeltünk meg a HT168-M1 vonalnál, bár itt a különbség nem volt szignifikáns. 8. táblázat. HT168-M1 HT199 Előfordulás Áttét (átlag) Áttét (SEM) Előfordulás Áttét (átlag) Áttét (SEM) Hím, kontroll 100% 130,7 33,2 100% 101,0 23,3 Hím, orchiect. 67% 1,7 0,8 100% 56,0 8,1 Nőstény, kontroll 43% 0,6 0,8 100% 24,0 11,0 Nőstény, ovariect. 67% 2,6 1,0 100% 61,4 7,8 Ezen megfigyelésünk alapján egyértelmű, hogy az androgén hormon igen erős májmetasztázist potencírózó hatású humán melanóma esetében, míg az ösztrogénnek kisfokú, de esetenként jelentős májáttétképzést gátló hatása van. Természetesen az in vitro kimutatott receptor expresszió a humán melanóma vonalakban még nem elegendő bizonyíték arra, hogy a látott hatásért receptor-mediált folyamatokat tegyünk felelőssé, ehhez funkcionális receptor moduláns vizsgálatokra van szükség. Vizsgálataink egy másik részében fehérjeszinten is vizsgáltuk a glükokortikoid-receptor - mint a szteroidhormon-hatás lehetséges közvetítője - jelenlétét humán melanómákban. Immuncitokémiai és immunhisztokémiai módszerekkel kilenc fagyasztott tumormintában ill. hét humán melanóma sejtvonalon mutattunk ki GCR-t különböző lokalizációkban. Előfordult sejtmagi, diffúz citoplazmás és kevert jelölődés is. 18. ábra. GCR protein kimutatása emberi melanómában. A monoklonális antitest a PTE munkacsoport saját fejlesztése (Németh P). A/ HT199 melanóma sejtek in vitro B/ 2404 sebészeti melanóma A sejtmagok piros szinben tűnnek fel, míg a az antigcr lokalizációját zöld fluoreszcencia jelzi. A sebészi mintát fagyasztva metszettük majd MetOHban fixáltuk hasonlóan a tenyészetekhez. Annak ellenére, hogy a GCR (referenciaszekvencia: nuclear receptor subfamily 3, group C, member 1; NR3C1) mrns- és fehérjeszinten is megtalálható volt, dexametazonnal (Dex) in vitro tesztekben nem sikerült jelentős proliferációgátlást elérni. Két napos kezelés még az igen nagy, 80 µm koncentrációjú dexametazonnal (a legmagasabb alkalmazott humán dózis 21