DÉL-ALFÖLDI NEUROBIOLOGIAI TUDÁSKÖZPONT

Átírás

1 DNT DÉL-ALFÖLDI NEUROBIOLÓGIAI TUDÁSKÖZPONT TERÁPIÁS CÉLÚ IDEGRENDSZERI KUTATÁSOK A MOLEKULÁTÓL AZ INTEGRÁLT IDEGRENDSZERI MÛKÖDÉSIG DÉL-ALFÖLDI NEUROBIOLOGIAI TUDÁSKÖZPONT

2

3 VEZETÕI ÖSSZEFOGLALÓ A Dél-Alföldi Neurobiológiai Tudásközpont (DNT) egységes centrumként mûködik a kutatás és fejlesztés területén. Céljaink változatlanok: a neurológia betegségek új, hatékony és jól tolerálható diagnosztikai, illetve kezelési módszereinek, gyógyszerjelölt vegyületeinek felfedezése és fejlesztése. A szegedi régió kiemelkedõ tudományos eredményeit felhasználva sokat ígérõ kutatási és fejlesztési programot valósítunk meg. A DNT részt vesz a leggyakrabban elõforduló neurodegenerációs betegségek új gyógyszereinek kifejlesztésében. A gyógyszerkutatás valamennyi fázisában részt veszünk, a felfedezéstõl a preklinikai, klinikai kísérletekig. Az egyes munkacsoportok nagyon szorosan együttmûködnek egymással, valamint más kutatócsoportokkal a világ valamennyi részébõl. A DNT harmadik évének legfontosabb eredménye a 2006 májusában az Egyetem Campusának központjában megnyílt Kutatóközpont és Inkubátorház (KIH) mûködésének teljes beindulása. A központ inkubátor szerepének megfelelõen támogatja az induló spin-off cégek betelepülését (JSW Hungary, LipidArt Kft., Vitadel Kft., Provit Kft.) és együttmûködését az egyes kutatócsoportokkal, a kis (Rytmion Kft.) és nagy vállalatokkal (General Electrics, Kromat (Agilent) Kft., Csertex Kft.). A Kutatóközpont és Inkubátorház épületében a következõ kutató-fejlesztõ egységek mûködnek: Számítógép Központ ( High Performance Computer, HPC), NMR Laboratórium (500 és 600 MHz-es készülékekkel), a DNS-Oligonukleotid- RNS Laboratórium, Peptid- és Fehérje-Laboratórium, Neuroproteomikai Kutatóhely, Elektrofiziológiai Laboratórium, Sejt- és Szövettenyésztõ Laboratórium, Fluoreszcens Mikroszkópiai Kutatóhely, Állatház és Tanulási-Magatartási laboratóriumok. A felsorolt kutatóhelyek, laboratóriumok között szoros együttmûködés alakult ki a tervezett kutatásifejlesztési feladatok teljesítésére. A DNT végsõ célja a Kutatóközpont erõteljes fejlesztése és a fenntartható fejlõdés. Ebben az évben 2 új hasznosító (spin-off) vállalatot alapítottunk és 1 kisvállalkozás (LipidArt Kft.) csatlakozott a DNT-hez. Folytattuk a gyümölcsözõ együttmûködést hazai (Bay Zoltán Intézet) és multinacionális vállalatokkal (Eli Lilly Bécs, NUMICO Wageningen, JSW Research Graz). FP-7 közös pályázaton indultunk a Párizs-Évry Genopol K+F Centrummal. Összeállítottunk egy dinamikus termék- és szolgáltatás listát, amelyet a DNT képviselõi Lyonban mutattak be a Biosquare Kiállításon (2007. március ). A DNT további feladata, hogy megoldást találjon a neurodegeneratív betegségek korai felismerésére, diagnosztizálására. Folytatódott a jó együttmûködés az EGIS és a DNT között: az EGIS a Központ épületében több kutatólaboratóriumot mûködtet. A DNT kutatási-fejlesztési munkáiban 330 munkatárs vesz részt, többek között 6 akadémikus, 33 MTA doktora, 79 PhD vagy ezzel egyenértékû kutató, 45 doktorandusz és 62 egyetemi hallgató. A DNT 2007-ben összesen 104 dolgozót Hazai szabadalom 3 Külföldi szabadalom 3 Elõadás 143 SCI publikáció 87 Könyvrészlet 6 Könyv 1 PhD 7 MTA doktora - Új alapítású spin-off cég 2 Összesített impakt faktor 246,009 foglalkoztat, ami 60 új álláshely létesítését jelenti a délalföldi régióban. A DNT kutatási-fejlesztési munkái elõsegítik az innovációt, az egyetemi hallgatók és a doktoranduszok képzését. A DNT kutatási-fejlesztési eredményeibõl 3 új magyar szabadalmi bejelentés készült. Prof. Gyula Telegdy, MD. DSc akadémikus, projekt vezetõ 1

4 TARTALOMJEGYZÉK Vezetõi összefoglaló Tartalomjegyzék Küldetésnyilatkozat A DNT tagjai A DNT szervezeti felépítése Átfogó célok Partnerek bemutatása DNT kutatóközpont és inkubátorház Kutatási programok bemutatása Alprogram Alprogram Alprogram Alprogram Alprogram Meghatározó személyek listája Oktatási és képzési program Technológia transzfer Együttmûködés az ipari partnerekkel Fenntartható fejlõdés Médiamegjelenések Publikációk Összefoglaló a 2007-es gazdálkodásról Nagyobb beruházások listája Teljesítményindikátorok Monitoring értékelési rendszer Rövidítések Elérhetõségek

5 KÜLDETÉSNYILATKOZAT A Dél-Alföldi Neurobiológiai Tudásközpont (DNT) stratégiai célja, hogy magját adja egy, a dél-alföldi régió központtal kiépülõ élettudományi klaszternek. A DNT 9-10 éves távon a területen jelentõs magyarországi kutatóhelyekkel, gyógyszergyártókkal és csatlakozó, valamint spin-off KKV-kkel összefogásban egymást kiegészítõ funkciót vállalva nemzetközi jelentõségre tesz szert a neurobiológia kutatás-fejlesztésben (K+F), és jelentõs mértékû befektetési aktivitást vonz a dél-alföldi régióba. Alapító tagok A Konzorciumba belépett új tagok A Konzorcium által alapított társaságok LipidArt Kft. 3

6 SZERVEZET ÉS MENEDZSMENT október 31-én a DNT IT szavazati joggal rendelkezõ tagjai: ELNÖK: Prof. Telegdy Gyula akadémikus, egyetemi tanár DNT tudományos vezetõje DNT 2-es altéma vezetõ SZTE ÁOK Kórélettani Intézete IT TAGOK: Prof. Penke Botond Prof. Janka Zoltán akadémikus, egyetemi tanár tanszékvezetõ egyetemi tanár DNT koordinátor, DNT 4-es altéma vezetõ DNT 1-es altéma vezetõ SZTE ÁOK Pszichiátriai Klinika SZTE ÁOK Orvosi Vegytani Intézete Dr. Janáky Tamás Prof. Dékány Imre DNT 4-es altémavezetõ-helyettes akadémikus, tanszékvezetõ egyetemi tanár SZTE ÁOK Orvosi Vegytani Intézete Szegedi Tudományegyetem vezetõsége Prof. Tóth Gábor képviseletében tanszékvezetõ egyetemi tanár SZTE tudományos rektorhelyettese DNT 5-ös altéma vezetõ Prof. Vigh László SZTE ÁOK Orvosi Vegytani Intézete akadémikus Dr. Lévay György MTA Szegedi Biológiai Központ képviseletében kutatási osztályvezetõ MTA SZBK Biokémiai Intézete EGIS NyRt. képviseletében Prof. Vécsei László Keresztes Péter akadémikus, tanszékvezetõ egyetemi tanár ügyvezetõ igazgató DNT 3-as altéma vezetõ Kromat Kft. SZTE ÁOK Neurológiai Klinika Papp Csaba DNT menedzserigazgató OPERATÍV SZINT IRÁNYÍTÓ TANÁCS I. DÖNTÉSI SZINT DNT KOORDINÁTOR DNT ELNÖK DNT MENEDZSERIGAZGATÓ II. DÖNTÉSI SZINT 1. ALPROGRAM 2. ALPROGRAM KÖZPONTI ADMINISZTRÁCIÓ 3. ALPROGRAM 4. ALPROGRAM 5. ALPROGRAM 4

7 ÁTFOGÓ CÉLOK: 1. A DNT multidiszciplináris megközelítésû és nagy szakmai diverzitással jellemzett K+F tevékenységét a terápiás célú neurobiológiai alkalmazott kutatások terén erõsen fókuszált, alkalmazható eredménnyel kecsegtetõ, az ipari partnerek érdekkörébe esõ területen kívánja folytatni. 2. Cél, hogy a régióban a DNT által koordinált konzorciumi tagok részvételével egy neurobiológiai K+F övezet alakuljon ki, amely közös stratégiai célok mentén végzi hosszú távon jelentõs, részben önfenntartó, piacorientált munkáját. 3. Kiemelt célunk a szellemi áttörésekre képes kutatók kinevelése, megtartása. Minden szempontból vonzó, itthoni fejlõdésre alkalmas környezetet kívánunk teremteni a jövõ zálogát jelentõ tehetséges tudósnemzedék számára. Karrierlehetõséget kívánunk biztosítani a külföldrõl visszatérni szándékozó tudósaink számára. 4. Célunk, hogy a projekteket végrehajtó világszínvonalú tudományos potenciálhoz méltó infrastrukturális háttér jöjjön létre a modern funkcionális genomika, proteomika és a terápiás célú orvosi/kémiai fejlesztések területén. 5. Célunk, hogy a kutatók szemléletét a létrehozott szellemi termékek hasznosítása irányában fejlesszük, megfelelõ közgazdasági alapismeretekkel lássuk el õket ahhoz, hogy azok hasznosulhassanak, jól elõkészített spin-off vállalkozások jöhessenek létre, a konzorcium kutatásaira - fejlesztéseire alapozva. 6. Célunk, hogy mind a felsõoktatásban, mind a posztgraduális képzésben neurobiológiai tudásbázisunk hasznosuljon, az elért eredményeinket a dél-alföldi régió és az ország a lehetõségekhez mérten minél hamarabb megismerhesse. PARTNEREK: Konzorciumunk központi költségvetésbõl gazdálkodó tagjai: 1. Szegedi Tudományegyetem (SZTE) Az SZTE keretei között 37 munkacsoport vesz részt a kutató-fejlesztõ munkában. Ebbõl 19 az Általános Orvostudományi Karon, 9 a Természettudományi Karon, 6 a Gyógyszerésztudományi Karon, egy munkacsoport pedig a Tanárképzõ Fõiskolai Karon végzi munkáját. 2. Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központ (MTA - SZBK) Az Európai Unió Kiválósági Központja (Center of Excellence) címet viselõ kutatóközpontban 13 munkacsoport kapcsolódott be a konzorcium kutató-fejlesztõ munkájába. 3. Magyar Tudományos Akadémia Támogatott Kutatóhelyek (MTA-TKI) Szorosan kapcsolódó neurobiológiai kutatások terén Az MTA-TKI két munkacsoporttal képviselteti magát munkánkban. Ipari partnerek 4. EGIS Gyógyszergyár NyRt. Az EGIS NyRt. a hazai gyógyszergyártás egyik jelentõs képviselõje. A DNT konzorcium keretein belül a gyár az elkészült többfunkciós épületünkhöz kutatólaboratóriumok kialakításával is hozzájárult. 5. SOLVO Biotechnológia ZRt. A Solvo Biotechnológai ZRt. az ABC transzportfehérjékkel kapcsolatos in vitro gyógyszerkutatási módszerek, diagnosztikai eljárások és terápiás hatású vegyületek kutatás-fejlesztésével és forgalmazásával foglalkozó vállalkozás. A céget 2005-ben Magyar Innovációs Nagydíjjal jutalmazták. 6. Diagnosztikum ZRt. A cég profilja megalakulásától kezdve orvosi laboratóriumi diagnosztikumok gyártása, beszerzése, forgalmazása, valamint az ezekhez kapcsolódó eszközök, mûszerek forgalmazása és szervize. A Word Economic Forum (Svájc) 1997-ben beválasztotta a Global Growth Companies (GGC) közé, mint a Közép- és Kelet-Európa kiemelkedõ teljesítményt nyújtó vállalatainak egyikét. 7. Kromat Mûszerforgalmazó Kft. A Hewlett Packard vállalatból leváló Agilent Technologies nevében a teljes kémiai analitikai üzletágat a Kromat Kft. vette át Magyarországon. A cég kereskedelmi tevékenységét jól kiegészíti a hatékony proteomikai alap- és alkalmazott kutatások támogatása, élõ kapcsolatépítés a kutatóbázisokkal. 5

8 8. Creative Labor Szolgáltató Kft. A vállalat több éves tapasztalattal rendelkezik a molekuláris biológia területén. Klónozási technikák, real-time és hagyományos PCR-es alkalmazások kidolgozása, fehérje expresszió bakteriális és eukarióta rendszerben, fehérje- és DNS analitikai módszerek gyakorlati alkalmazása szerepel eszköztárában. 9. Rytmion Kutató és Fejlesztõ Kft. A cég elsõsorban a szív elektrofiziológia és aritmia gyógyszereinek kutatása területén tevékenykedik, szoros együttmûködésben a Szegedi Tudományegyetem Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézetével. Tevékenysége a különbözõ gyógyszerjelölt molekulák kardiovaszkuláris hatásainak GLP körülmények közötti vizsgálata. 10. Kation Európa Bt. A vállalkozás az extracelluláris elektrofiziológia és mikroiontoforézis tárgyköréhez kapcsolódó üveg mikroelektródák, elektronikai eszközök és software-ek fejlesztésével, gyártásával és eladásával foglalkozik. Cégünk részt vesz az élvonalbeli neurobiológiai kutatásokban is, kiválóan felszerelt elektrofiziológiai laboratóriumot tart fent az SZTE Általános Orvosi Kar Orvosi Vegytani Intézetében. 11. QualiCont In Vitro Diagnosztikai Kht. A Kht. tevékenysége a hazai in vitro diagnosztikai laboratóriumok szakszerû külsõ minõségellenõrzésének biztosítása, az ehhez kapcsolódó kutatás-fejlesztési, informatikai, képzési-, továbbképzési és nemzetközi együttmûködési feladatok végrehajtása év óta ISO 9001 minõségtanúsítással mûködik. 12. Dél-Alföldi Bio-Innovációs Centrum Kht. (DABIC) Genomikai Központja A Kht. tagjai a Szegedi Egyetem, a Bay Zoltán Intézet, a Gabonakutató Intézet, a Csongrád megyei és Szeged városi önkormányzata és számos olyan kis- és középvállalat, amely a genomikai kutatásokban érintett. A központ mûködésének egyik fõ célja olyan projektek irányítása és szervezése, mely több társintézet együttes munkáját igényli. Másik fõ célja egy bioinformatikai rendszer megteremtése. Csatlakozott ipari partnerek 13. JSW Hungary Kft. A társaság augusztusában csatlakozott a DNT programhoz. A cég gyógyszerjelölt molekulák kutatási szerzõdésen alapuló analitikai, biokémiai és molekuláris biológiai tesztelését, valamint azok in vitro szövettenyészeten és in vivo transzgenikus egérmodelleken történõ preklinikai kipróbálását végzi, szorosan kapcsolódva a DNT program 3. és 5. alprogramjához tartozó csoportok kutatásaihoz. Ezen túlmenõen kedvezményesen látja el a konzorcium minden egyes tagját az Alzheimer- és a Parkinson- kór transzgenikus állatmodelljeivel. 14. Musgenex Kft. Dr. Oláh Zoltán, 2006 januárjában MusGenex Kft névvel, az MTA SZBK Biokémiai Intézetének támogatásával és Dr. Sántha Miklós állatorvos bevonásával, egy új spin-off céget hozott létre. A cég tevékenységébe többek között beletartozik transzgenikus riporter állatmodellek tervezése, létrehozása és forgalmazása. Elsõsorban tudományos kutatással foglalkozó intézményeknek szállítunk, beleértve egyetemeket és gyógyszergyárakat, Európában vagy a világ bármely más kontinensén. 15. LipidArt Kft. A 2007 júniusában megalakult LipidArt Kft célja új típusú gyógyszerek felfedezése innovatív gyógyszerfejlesztési platform segítségével mely a membránok mikrodomén szerkezetének finomhangolása és a stresszválasz szelektív modulációja közötti kapcsolaton alapszik. A LipidArt elsosorban a globálisan egyre növekvõ jelentõségû neurodegeneratív betegségekre koncentrál. Konzorciumi alapítású társaságok 16. Provit Kft. A vállalat a Szegedi Tudományegyetem második hasznosító (spin-off) cége. Fõ profiljai: 1, funkcionális élelmiszer komponensek kutatása és alkalmazása, elsõsorban a tokoferolok neuroprotektív hatását kihasználva; 2, fehérjekémiai, proteomikai kutatások: az egyes betegségek kialakulásánál kulcsszerepet játszó célfehérjék azonosítása és kijelölése a racionális gyógyszertervezés céljára. 17. Vitadel Kft. A vállalat a Szegedi Tudományegyetem elsõ hasznosító (spin-off) cége. Fõ profiljai: 1, funkcionális élelmiszer komponensek kutatása és alkalmazása, elsõsorban a tokoferolok neuroprotektív hatását kihasználva; 2, fehérjekémiai, proteomikai kutatások: az egyes betegségek kialakulásánál kulcsszerepet játszó célfehérjék azonosítása és kijelölése a racionális gyógyszertervezés céljaira. 6

9 DNT KUTATÓKÖZPONT ÉS INKUBÁTORHÁZ A június 15-én megnyitott DNT központ 253 millió Ft-os (mintegy 1 millió eurós) beruházásával eddig a 2 legnagyobb a DNT történetében. A Központ 1300 m labor-és irodaterületet foglal el. A beruházás legnagyobb részét a DNT projektbõl fedeztük, de más forrásokat is igénybevettünk. (5,08 millió Ft-ot a KF-IIF/2005 pályázatból az épület informatikai és kommunikációs hálózatának kiépítésére; a main-frame komputerek valamint a 600 MHz-es NMR készülék beszerzésére). A Központban a következõ laboratóriumok kaptak helyek: 1) Számítóközpont és Molekulamodellezési Laboratórium Két main-frame számítógép (értékük: 57 millió Ft, ~ ); van elhelyezve a laboratóriumban, klaszterben kapcsolva. A központ fõ feladata a molekula-szimuláció és számítógépes molekula (gyógyszer) tervezés, valamint az NMR mérések adatainak feldolgozása. Ebben a laboratóriumban van az épület informatikai és telekommunikációs központja is. 2) NMR Centrum Az országban egyedülálló teljesítményre képes laboratórium egy 500 és egy 600 MHz-es Bruker gyártmányú NMR-készülékkel van felszerelve. Ezek összértéke kb. 250 millió Ft és más forrásból szereztük be õket, bár a laboratórium berendezését a DNT is támogatta 40 millió Ft-tal. A Centrum fõ feladata a fehérjék szerkezetének és kis molekulákkal (pl. gyógyszermolekulák) lejátszódó kölcsönhatásainak tanulmányozása. Az NMR Laboratórium a közeljövõben megszervezendõ Strukturális Biológiai Központ fontos alkotórésze. 3) DNS-Oligonukleotid Laboratórium A munkahely fõ feladata oligonukleotidok, antiszensz oligonukleotidok és peptid nucleinsavak (PNS) szintézise további biológiai vizsgálatok céljából. 4) RNS-Interferencia Laboratórium Magyarországon ez az egyetlen laboratórium, ahol molekulatervezés után kis interferáló RNS-et állítanak elõ. Az RNS interferencia a gyógyszertervezés és fejlesztés legmodernebb módszere (Kémiai Nobel-díj, 2006) 5) Peptid és Fehérjelaboratórium A munkahely feladata peptidek szintézise, a peptidek és fehérjék aggregációjának, a neurotoxikus peptid/fehérje szupramolekuláris szerkezeteknek, inklúziós testeknek a tanulmányozása. 6) Neuroproteomikai Kutatóhely Hazánkban ez is egy egyedülálló munkákra és teljesítményre képes laboratórium, képes kiszolgálni az egész ország neurobiológiai proteomikai igényét. A kutatóhely feladatai: fehérjék izolálása, 2D gélelektroforézissel vagy nano-hplc-vel történõ elválasztása, a fehérjék azonosítása a tömegspektrometriás peptidszekvenálás és adatbázisok segítségével. A kutatómunkát egy modern tömegspektrométer segíti, amely a legmodernebb szoftverrel van felszerelve. (A DNT 46 millió Ft-tal támogatta a csúcsteljesítményû mûszer beszerzését). A kutatóhely fõ feladata azoknak a célfehérjéknek az azonosítása és validálása, amelyek a neurodegenerációs folyamatokban kulcsszerepet játszanak. 7) Elektrofiziológiai Laboratórium A munkahely fõ feladata a gyógyszerjelölt vegyületek központi idegrendszerre gyakorolt hatásának tanulmányozása in vivo elektrofiziológiai állatmodelleken. 8) Sejt-és Szövettenyésztõ Laboratórium A laboratórium fõ feladata olyan in vitro kísérletek véghezvitele sejt- és szövetkultúrákon (pl. organotipikus kultúrák), amelyekkel a neurodegeneratív betegségek sejt- és szövetkultúra modelljein tanulmányozható a gyógyszerjelölt vegyületek hatása. 7

10 9) Fluoreszcens Mikroszkópiai Kutatóhely 2+ Sejt- és szövetkultúrákban specifikus fluoreszcens festéssel tanulmányozzuk a Ca beáramlást a sejtekbe, a 2+ Zn -ionok felszabadulását és a membránpotenciál változásokat a gyógyszerjelölt vegyületek hatására. Egy fluoro-plate-reader hasonló alapelven gyors és kvantitatív méréseket tesz lehetõvé. 10) Állatház A központban egymás mellett két állatház található: egy a patkányok és egy az egerek részére, minden felszerelés és berendezés eléri a GLP szintet. 11) Tanulási - Magatartási Laboratóriumok Ezeken a munkahelyeken azt tanulmányozzuk, hogy a gyógyszerjelölt vegyületek milyen hatást gyakorolnak a patkányok és (ritkábban végrehajtott kísérletekben) az egerek tanulására és viselkedésére. A következõ kísérleteket használjuk: nyílt porond (open field) teszt; passzív- és aktív elhárító magatartás; emelt plusz labirintus (maze); Morris vízlabirintus; tárgyfelismerés; forgórudas teszt és keresztlabirintus. A fenti laboratóriumok mellett két másik kutatócsoport is helyet kapott a Centrumban: az Alzheimer-kór Kutatócsoport és az Enterális Idegrendszeri Csoport. Az EGIS gyógyszergyár több laboratóriumot támogat a Centrumban. A DNT központi irodái szintén a Centrum épületében kaptak helyet. A DNT-t alkotó kisvállalatok (JSW Hungary, Rytmion, Vitadel Kft., Provit Kft.) mellett más cégek (General Electrics, 2 Csertex Kft., ISH Kft.) is laboratóriumot és/vagy irodát kaptak a Központ épületében. Egy 40 m -es szemináriumkönyvtár helyiséget alakítottunk ki szemináriumok, elõadások, munkamegbeszélések és üzleti tárgyalások céljára. 2 Jelenleg 72 m szabad, még nem beépített területünk van, melyet 2008 év elején tervezünk beépíteni. A DNT-tag kisvállalatok nem fizetnek bérleti díjat, csak rezsiköltséget a laboratóriumok és irodák bérletéért, a többi partner bérleti díjat és rezsiköltséget is fizet. Így a Centrum támogatni tudja az induló spin-off vállalkozásokat (inkubátor funkció). A Centrum épülete a közeljövõben megvalósításra kerülõ Szegedi Egészségügyi Központ területének északi részén helyezkedik el, így a tervek megvalósítása során a Centrum kutatói fizikailag is szoros kapcsolatot tudnak fenntartani és kiváló együttmûködést kiépíteni az Egészségügyi Központtal, illetve annak K+F+I részével, az Inkubátorház projekttel. A Centrum kiváló tudományos és laboratóriumi hátteret ad a gyógyszerkutatás és fejlesztés szinte valamennyi fázisának, a felfedezéstõl a preklinikai és klinikai kísérletekig. A Centrumban jelenleg 35 szenior, posztdoktori és doktori ösztöndíjas kutató dolgozik. 8

11 K KUTATÁSI PROGRAMOK BESZÁMOLÓI november október 31. A DNT a neurodegenerációs betegségek (elsõsorban az Alzheimer- és Parkinson-kór), valamint a szorongásos betegségek és a depresszió kialakulásának mechanizmusát és gyógyszeres kezelési lehetõségeit kutatja. A DNT a projekt lezárása (2008. december) után is folytatni kívánja a kutató-fejlesztõ munkát, az UMFT GOP pályázat keretében. Bár az alprogramok munkája szorosan kapcsolódik egymáshoz és sokszálú kooperációs hálózat alakultki, szervezési okok miatt a munkacsoportok munkáját 13 témacsoportra, klaszterre osztottuk fel. Ez a szervezés jól bevált, így a szakmai beszámolót is a 13 témacsoport szerint tagoltuk. Alzheimer-kór Depresszió NT O P Z I IDEGRENDSZERI BET EG S É Ö G E K K KÖZÖTTI KUTATÁSOK 2008 UTÁNI TERVEINK Alzheimer-kór Schizofrénia NT O P Z I IDEGRENDSZERI BET EG S É G E Ö K Parkinsonkór Anxietás Parkinsonkór Depresszió Huntingtonkór Huntingtonkór Anxietás 1. ALPROGRAM: Kóros fehérje-aggregációval járó betegségek (Alzheimer-kór, Parkinson-kór) terápiájának kutatása. Projektvezetõ: Dr. Penke Botond 1. Klaszter: Az Alzheimer-kór új gyógyszerei. Projektvezetõ: Dr. Penke Botond Munkacsoport-vezetõk: Dr. Bogár Ferenc, Dr. Dékány Imre, Dr. Kiss Tamás, Dr. Laczkó Ilona, Dr. Martinek Tamás, Dr. Kálmán János, Dr. Datki Zsolt, Dr. Toldi József, Dr. Budai Dénes, Borbély Emõke Célok és rövid áttekintés ( részfeladat) 1. Peptidek és peptidomimetikumok tervezése és szintézise a â-amiloidok és az á-szinuklein neurotoxikus hatásának kivédésére. 2. â-amiloid aggregációk, valamint az aggregációra ható potenciális gyógyszerjelölt peptidomimetikumok vizsgálata fizikaikémiai, spektroszkópiai és elektronmikroszkópos módszerekkel. 3. Az Alzheimer- és Parkinson-kór potenciális peptidomimetikum gyógyszereinek tesztelése humán trombocita modellen és in vitro sejttenyészeteken. 4. Az Alzheimer- és Parkinson-kór potenciális gyógyszereinek vizsgálata in vitro és in vivo elektrofiziológiai módszerekkel. 5. Az Alzheimer-kór potenciális gyógyszereinek tesztelése patkány magatartási és tanulási kísérletekkel. Potenciális gyógyszermolekulák tesztelése az Alzheimer-kór transzgenikus egérmodelljein. Elvégzett tevékenység: 1. Peptidek és peptidomimetikumok tervezése a â-amiloid és az á-szinuklein neurotoxikus hatásának kivédésére. 23 új vegyület elõállítása. Peptid és peptidomimetikum BSB vegyületek számítógépes tervezése. 9

12 2 â-amiloid aggregációk, valamint az agggregációra ható potenciális gyógyszerjelölt peptidomimetikumok vizsgálata: a) spektroszkópiai vizsgálatok: fémionok hatása az aggregációra b) az 1. részfeladatban elõállított új vegyületek dezaggregáló hatásának gyors screenelése c) a képzõdött fibrillumok elektronmikroszkópos vizsgálata d) gyógyszerjelölt molekulák konformációs preferenciáinak mérése, kölcsönhatásuk vizsgálata â-amiloid oligomerekkel: a lehetséges specifikus kötõdési hely(ek) megállapítása oldatfázisban e ) â-amiloid aggregációra ható gyógyszerjelölt peptidomimetikumok hatásának vizsgálata CD-spektroszkópiával. 3. Az Alzheimer- és Parkinson-kór potenciális peptidomimetikum gyógyszereinek tesztelése in vitro sejttenyészeteken. Neuroprotektív szabad-gyökfogó vegyületek biológiai tesztelése in vitro. 4. Az Alzheimer- és Parkinson-kór potenciális gyógyszereinek vizsgálata in vitro és in vivo elektrofiziológiai módszerekkel. In vitro mérések: az újabb peptid és petidomimetikum vegyületek elektrofiziológiai vizsgálata normál patkány motoros kérgében a â1-42 amiloid által kifejtett neuromodulációban. In vivo mérések: glutamát-receptorokon ható modulátoro neuroprotektív hatásának vizsgálata (gyógyszerjelölt molekulák). 5. Az Alzheimer-kór potenciális gyógyszereinek tesztelése patkány magatartási és tanulási kísérletekkel: 7 kísérletsorozat új vegyületekkel: Morris-féle vízilabirintus (referenciamemória), Y-labirintus (munkamemória) open field (anxietás, lokomóció), hisztológiai vizsgálatok. Potenciális gyógyszermolekulák tesztelése az Alzheimer-kór transzgenikus egérmodelljein. Eredmények 1. Peptidek és peptidomimetikumok tervezése és szintézise a â-amiloidok és az á-szinuklein neurotoxikus hatásának kivédésére. Az NMR laboratórium 1H-NMR kötésteszt segítségével kimutatta, hogy több, az in vivo tesztekben hatásosnak bizonyult molekula kötõdik a fibrilláris Aâ peptidhez. A kötõdés mechanizmusának jobb megértése céljából egy olyan szálmodellt készítettünk, ami a teljes Aâ1-42 szekvenciát tartalmazza, és lehetõvé teszi ezen molekulák lehetséges kötõhelyeinek vizsgálatát. A modell felépítéséhez az Aâ szál aminosavakat tartalmazó részének Lührs és mts. által publikált NMR szerkezetét használtuk, kiegészítve az N-terminális szakasszal (béta szerkezetet feltételezve) és felépítettünk egy Aâ oktamert. A kapott struktúrával 4ns-os explicit vizes dinamikai szimulációt végeztünk. Megállapítottuk, hogy az N terminális rész béta szerkezete a dinamika során stabil maradt, bár jelentõs mozgásokat végzett. A futás utolsó szerkezetét választottuk a kötõdés vizsgálatokhoz. Megvizsgáltuk, hogy néhány potenciális Alzheimer gyógyszerjelölt molekula hogyan kötõdik a fibrillum modell N-terminális szakaszához (1-10) és a tartományhoz. Megfigyeltük, hogy a gyógyszerjelölt vegyületek az N-teminális végen erõs, fõként a ligand fõlánca által alkotott H-kötésekkel kötõdnek a protofibrillumhoz. A legtöbb molekula esetében ez oda vezet, hogy a ligand apoláros oldalláncai befedik az Aâ poláros oldalláncait. Így a komplex apoláros felülete nagyobb lesz, mint az Aâoktameré volt, a poláros pedig lényegében változatlan marad. Az apoláris felszín növelése meggyorsítja az Aâ-peptid aggregációt. A gyógyszerjelölt vegyületek tehát nem szerkezetrombolók, hanem éppen ellenkezõleg: elõsegítik az aggregáció révén a nemtoxikus szuperstruktúrák képzõdését. Két vegyületcsaládban számos új peptidomimetikum szintézisére került sor. (Komolyabb szabadalmi védelemre csak akkor lehet számítani, ha a gyógyszerfejlesztésre kiválasztott 2-3 új vegyületnek szinte valamennyi, kémiailag rokon vegyületét is leõállítjuk és levédjük). A következõ szintézisekre került sor: 1. A Leu-Pro-Tyr-Phe-Asp-amid vezérvegyület (lead) család: 15 új vegyület elõállítása A biológiai screening (MTT-teszt) eredményébõl kiderült, hogy a gyógyszerjelölt vegyületek nagyon érzékenyek a szerkezeti változtatásokra. A peptidomimetikumok az N-terminális helyen szinte semmi változást nem viselnek el a biológiai hatás elvesztése nélkül. A Pro viszonylag jól cserélhetõ prolin-analógokkal, a Tyr helyén ugyancsak sokféle szerkezeti változtatás bizonyult jónak. A molekula C -terminusa ugyancsak nehezen tûri a változtatást, eddig mindössze 2 szerkezet bizonyult jónak. A szerkezeti változtatásokkal sikerült két enzimrezisztens, gyomorból felszívódó, a vér-agy gáton átjutó peptidomimetikumot (P59 és P79) találni, ezeket a vegyületeket választottuk ki további gyógyszerfejlesztéshez. 2, A Glu-Pro-Ala-Pro-Ala vezérvegyület családja: 8 új vegyület. Egyetlen kivétellel minden anyag aktív volt az MTT-teszten! Az ún. retro-inverz peptidek D-aminosavakból épülnek fel és enzimrezisztensek, gyógyszerfejlesztésre ezeket választottuk ki. A kötésvizsgálatok szerint ennek a vegyületcsaládnak a peptidjei és petidomimetikumai nem kötõdnek jól az Aâ és NAC aggregátumokon, mégis védenek a fenti anyagok neurotoxikus hatása ellen. Hatásmechanizmusuk vizsgálatát elkezdtük. Aâ-aggregációfok standardizálás. Óriási problémát okoz a szakirodalom értékelésében, valamint saját biológiai kísérleteinkben, ha nem tudjuk milyen aggregációs fokú Aâ peptiddel végeztük az in vitro és in vivo kísérleteket. Ezért kidolgoztunk egy olyan módszert, amellyel jól megismételhetõ módon mindig azonos aggregációs fokú Aâ peptideket kapunk. A módszernél egy olyan Aâ 1-42 analógból (izopeptidbõl) indulunk ki, amelyben a Gly25-Ser26 kötés nem peptid-, hanem észterkötés! A Ser26-izo Aâ 1-42 konformációja hélixes, monomer formában létezik, csak neutrális ph fölött O N acilvándorlással alakul ki az Aâ 1-42 peptidszerkezet, amely gyors konformációváltozással â-réteggé alakul. Idõben elõrehaladva 20 C-on a következõ konformációs és aggregációs állapotokat találjuk: 0-24 óra : monomer; konformációváltozás, kevés oligomer óra : oligomer keverék 72 óra után: protofibrillumok 4 nap után: fibrillumok, érett fibrillumok megjelenése Az aggregációs fokot részben dinamikus fényszóródás mérésével (QLS), részben TEM segítségével bizonyítottuk. Ennek 10

13 alapján lehetõvé vált, hogy külön-külön tanulmányozzuk a fenti Aâ aggregációs formák neurotoxicitását, ill. a gyógyszerjelölt vegyületek hatását az Aâ-aggregátumok által beindított, neurodegenerációhoz vezetõ folyamatokra. A standardizálás után elvégzett kísérletek egyértelmûen bizonyították, hogy a gyógyszerjelölt vegyületeink (P29, P59, P79) egyaránt kivédik az Aâ 1-42 oligomerek, protofibrillumok és fibrillumok toxikus hatásait. 2, â-amiloid és á-szinuklein (NAC) aggregációk, valamint az aggregációra ható potenciális gyógyszerjelölt peptidomimetikumok vizsgálata fizikai-kémiai, spektroszkópiai és elektronmikroszkópos módszerekkel. Fémionok hatása az aggregációra. Mivel a kétértékû kationok (elsõsorban a cink) nagymértékben befolyásolják az Aâ-peptidek aggregációját és toxicitását, a következõ vizsgálatokat végeztük el: A Zn és a Mg ion hatása az Aâ 1-42 aggregációjára A Zn ion aggregáció-moduláló hatásának befolyásolása: a. kereskedelmi forgalomban lévõ cink-kelátorral (TPEN) 2+ b. Zn -keláláson alapuló hatásmechanizmusú szabdalmaztatott gyógyszerrel (Perindropil ) Az Aâ 1-28 peptid aggregációjának vizsgálata, a Zn ion hatása az aggregációra A cink-ion (Zn ) és az N1, N2-bis-(piridin-2-ilmetil)-etán-1,2-diamin (ENDIP) reakciójának követése titrációs izoterm mikrokalorimetria segítségével A peptidek aggregációját elõször a fény szórásintenzitás változásával követtük. Tapasztalataink szerint minden esetben a jelenlévõ fémion (Mg vagy Zn ) hatására az Aâ-peptid aggregációja pillanatszerûen felgyorsult, mely a szórásintenzitás ugrásszerû növekedését okozta. Specifikus Zn-kelátor (TPEN) jelenlétében az Aâ aggregáció felgyorsulása nem észlelhetõ. A kelátor megköti a cinket, így nincs jelen szabad fémion, az aggregáció nem változik. Érdekes, hogy az ACE- inhibitorként ismert, gyenge Zn-kelátor Perindropil vérnyomáscsökkentõ gyógyszer viszonylag nagy (100µM) koncentrációban sem befolyásolja 2+ a Zn ionok hatását az Aâ aggregációra, minden bizonnyal gyenge Zn-kötési tulajdonsága miatt. 2+ Zn és ENDIP reakcióját titrációs izoterm mikrokalorimetria segítségével is követtük. Az eredményeink azt mutatták, hogy a cink-ionok kelálása endoterm folyamat, a reakció hõ elnyelésével jár. A kelátor mennyiségének csökkenésével közel lineárisan nõ a szükséges hõ mennyisége, amint viszont a rendszerben elfogy a szabad állapotú kelátor, a szükséges hõ mennyisége drasztikusan lecsökken, ami egyben a reakció teljes lejátszódását is indikálja. A számítások alapján a Zn-ENDIP kelát kialakulása ÄHképz = -1,30 kj/mol endoterm hõváltozással jár. Aâ42 idõfüggõ aggregációjának és gátlásának tanulmányozása CD spektroszkópiával. - Befejeztük az Aâ(1-42) aggregáció gátlásának tanulmányozását gyógyszerjelölt kisméretû peptidek jelenlétében és megállapítottuk, hogy a gyógyszerjelölt anyagok növelik a â-szerkezet mennyiségét és az Aâ 1-42 további aggregációját idézik elõ. - Elkezdtük a normál (egyenes szálú) és a Ser27 aminosavnál megtört, ún. izoaâ(1-42) másodlagos térszerkezetének és 2+ aggregációjának tanulmányozását Zn jelenlétében. A spektroszkópiai méréseket semleges (ph 7.4) és savas ph-n (ph2.0) végezzük a Zn /peptide mólarány (rm) függvényében. Elõzetes CD vizsgálataink szerint a Zn (rm=10-nél) a normál amiloid aggregációját idézte elõ 10% trifluoretanol/víz oldatban. Mivel az aggregátumokban a rendezetlen konformerek mennyisége 2+ növekedett a â sheet rovására, feltételezhetõ, hogy a Zn ilyen koncentrációban szétrombolja a â sheet konformációt és fibrilláris aggregátum nem fibrilláris aggregátum átrendezõdést eredményez. Gyógyszerjelölt vegyületek kötõdése fibrilláris Aâ 1-42 peptiden. Célul tûztük ki az Aâ1-42 és az amiloid fibrillumok mérgezõ hatását kivédõ tetra-, illetve pentapeptidek kölcsönhatásának vizsgálatát NMR spektroszkópia segítségével. A korábbiakban kidolgoztuk a fibrilláris Aâ[1-42] ligandum kötõdési tesztjét, és megállapítottuk, hogy az RIIGLa, LPYFDa, LPFFD és az FRHDSa szekvenciáknál a jelintenzitás 9-26% körüli értékkel csökkent, ami szignifikáns mértékû kötõdésre utal és összhangban áll az in vitro és in vivo neuroprotektív hatással. Az elmúlt idõszakban felismertük, hogy a ligandumok kötõdése fiziológiás foszfát pufferben idõfüggést mutat. A további kísérleteket LPFFD molekulán végeztük el. A kötõdés monitorozása kimutatta, hogy a ligandum kötõdésének erõssége és a felkötõdött ligandum mennyisége idõben csökken. LPFFD jelenlétében dezaggregálódott Aâ-hoz tartozó jeleket a spektrumban nem találtunk. Ezek az eredmények kizárják az LPFFD â-réteg romboló hatását a vizsgált idõintervallumban. Az NMR vizsgálatokkal párhuzamosan diffúz fényszórási és TEM méréseket végeztünk. A fényszórási mérések egyértelmûen mutatják, hogy tiszta fibrilláris Aâ esetén lassú ülepedés van, míg a ligandum hatására a részecskeméret-növekedés indul meg a mintacsõ teljes hosszában, és az ülepedés meggyorsul, melynek dinamikája jól egyezik az NMR mérések eredményeivel. Következtetésünk, hogy az amiloid fibrillumok aggregációját, flokkulációját a hozzáadott ligandumok okozzák és a folyamat során gyengén kötõdõ ligandumok leszorulnak. PBS-ben a gyenge kötõdés nem lehetséges. A gyógyszerjelölt petidek hatásmechanizmusukat tekintve semmiképpen nem nevezhetõk â-szerkezetrombolóknak, hanem éppen ellenkezõleg: gyorsítják az aggregációt és a nemtoxikus szuperaggregátumok kialakulását. Az összes alkalmazott fizikai-kémiaimérés és mûszeres vizsgálat végeredménye egyértelmû: az eddig â-szerkezetrombolónak (BSB) tekintett pentapeptidek nem akadályozzák meg az Aâ1-42 aggregációját (vagyis nem BSB hatásúak), viszont megkötõdnek az Aâ fibrillumokon és neuroprotektív hatásúak, mert megakadályozzák az Aâ-fehérje kölcsönhatásokat. 3, Az Alzheimer- és Parkinson-kór potenciális peptidomimetikum gyógyszereinek tesztelése in vitro sejttenyészeteken. Kidolgoztunk egy gyors, ex vivo módszert a korai Alzheimer-kór cink ionokkal kapcsolatos élettani folyamatainak detektálására. A módszer lényege a következõ: a hippokampális cink ürítés mértéke jellemzi a glutamáterg neuronok preszinaptikus aktivitását. Ha ez az élettani folyamat változik, a változás markerként jelzi az idegsejtek állapotát és aktivitását. Kutatásaink 11

14 során azt tapasztaltuk, hogy bizonyos regisztrált vérnyomáscsökkentõ ACE-inhibitor cink kelátorok (Captopril, Perindopril) a cinkionok redisztribúcióját okozzák. In vitro és ex vivo eredményeink a Captopril és a Perindopril védõ hatását mutatták ki neurodegeneráció tesztekben. Elsõ lépésként bebizonyítottuk, hogy az in vitro sejttenyésztési rendszerünkben a Captopril védõ hatású az exogén eredetû cinkkel szemben. Második lépésként megnéztük, hogy az aromatáz gátló Formestane-nal indukált ösztrogén hiányos patkányokban a cink homeosztázis, glutamáterg preszinaptikus cink ürítési képesség hogyan változik a Captopril alkalmazása után. Az eredmény azt mutatja, hogy a kezelést követõen a neuronok cink-ürítési képessége normalizálódik, a kontrollhoz közelítõ normál értéket mutat. E mérés alatt összehasonlítottuk a hippokampusz és a neokortex szabad (vízzel kioldható) relatív cinktartalmát is ugyancsak ösztrogén hiányos nõstény patkányokban. Azt találtuk, hogy itt is a Perindopril normalizálta a jobboldali hippocampusz cink mennyiségét. Az aszimmetrikus cink-koncentráció irodalmilag ismert jelenség, amely a cinkürítéskor nem jelentkezett, de a beoldható cink mennyiségében igen. Az elõzetes mérések alapján azt találtuk, hogy a cink kelátorok a hippokampális cink-homeosztázis zavarait kivédik; korai Alzheimer-kórban védõ hatásuk lehet a hippokampális alapú memória károsodásával szemben. Ez egy teljesen újszerû, független hatásmechanizmus, közvetlen hatással a glutamáterg alapú memória központokra, eltérõen a vérnyomásszabályozásra kifejtett hatásuktól. Újabb méréseink eredményeként sikerült bizonyítani, hogy az idõs nõstény patkányokban a cinkürítés mértéke lényegesen nagyobb, mint az ugyanolyan korú hímekben. Az irodalomban már bizonyított, hogy az Aâ 2+ peptidek a Zn ionokat megkötik, így aggregációjuk felgyorsul. Mindez az Alzheimer-kór korai fázisára jellemzõ folyamat, ezért 2+ az 1 éves, vagy annál idõsebb nõstény patkányok Zn diszhomeosztázisa jó kísérleti modellként szolgálhat az Alzheimer-kór korai fázisának tanulmányozására. 4, Az Alzheimer- és Parkinson-kór potenciális gyógyszereinek vizsgálata (elektrofiziológia). In vitro elektrofiziológia hippocampus szeleteken. In vitro elektrofiziológiai kísérleteinkben az újonnan szintetizált izo-amyloid Aâ1-42 hatását tanulmányoztuk a hippocampális -5 szinaptikus plaszticitásra. A peptidet 10 M-os koncentrációban oldottuk fel ACSF-ben, melyet rögtön lefagyasztottuk folyékony nitrogénben (<2 perc). Az oldatokat csak közvetlenül szelet felszínére történõ lokális applikáció elõtt olvasztottuk fel, melynek semmilyen detektálható hatása nem volt a Schaffer kollaterálisok orthodrom ingerlésére kapott mezõpotenciálok amplitúdóira a hippocampus CA1 régiójában. Ezután a szeletek mindkét csoportjában 20 percig regisztráltuk a szinaptikus alapaktivitást alacsony frekvenciás ingerléssel (0.05 Hz, 0.3 ms jelszélesség, µa amplitúdó), majd LTP-t indukáltunk nagyfrekvenciás ingerléssel (100 Hz, 500 db, a teszt pulzus 100%-án). A mezõpotenciálok amplitúdóinak változása kontroll szeletek esetén %-os (±0.62, N=6), míg az izo-amiloiddal kezelt szeletek esetén %-os (±0.35, N=7) volt a követés 1 órája alatt. A statisztikai analízis (Mann-Whitney teszt) alapján számos idõpillanatban a különbség a két csoport között szignifikáns volt, döntõen azonban az LTP követés 2. felében (p<0.05). A tapasztalt jelenség hátterében legnagyobb valószínûséggel az oligomer állapotú Aâ a poszt-szinaptikus AMPA receptorokra kifejtett hatása áll (Shemer, Eur J Neurosci, (8):2035). In vivo elektrofiziológia altatott patkányon Patkány hippocampus neuronokban, egysejt-elvezetéssel tanulmányoztuk a gyógyszerjelölt vegyületek hatását, altatás közben bejuttatva az Aâ aggregátumok, illetve a védõanyag oldatát multibarrel elektródon át mikroiontoforézissel a vizsgált neuron környezetébe. Egy másik kísérletsorozatban a gyógyszerjelölt vegyületeket nem iontoforézissel adtuk be, hanem gyomorszondán át kapták a kísérleti állatok. Bebizonyítottuk, hogy a P59 és a P79 vegyületek mind közvetlenül az idegsejtre juttatva, mind gyomorszondán át adva az állatnak, hatásosan kivédik az Aâ 1-42 oligomerek és protofibrillumok/fibrillumok toxikus hatását a neuronokon. Az elõzõ pontban (1.) elõállított és jól jellemzett standardizált Aâ 1-42 különbözõ formákat alkalmazva bebizonyítottuk, hogy az oligomerek, ill. Aâ- fibrillumok a hippocampus CA 1 neuronjainak AMPA receptorain különbözõ hatást fejtenek ki. Az Aâ 1-42 oligomerek növelték a receptorok AMPA által kiváltott tüzelési aktivitását, ezzel szemben az Aâ fibrillumok csökkentették, sõt csaknem teljesen megszüntették azt. Ezek a vizsgálatok arra utalnak, hogy az Aâ- oligomerek, illetve fibrillumok más szignalizációs utakat indítanak be a neuronon. 5, Az Alzheimer-kór potenciális gyógyszereinek tesztelése patkány magatartási és tanulási kísérletekkel. AD modell patkányokon Az Alzheimer-kór patogenezisében központi szerepet játszik az â-amyloid peptid kóros felhalmozódása az idegsejtekben. Ez a peptid aggregálódásra hajlamos, ennek során szolubilis, kisebb fragmensekbõl álló peptidszálak egymáshoz tapadnak és oldhatatlan aggregátumot hoznak létre. A különbözõ aggregációs állapotú oldékony formák (különösen az oligomer és fibrilláris â-amyloid(1-42)) toxikusak az idegsejtekre, és azok pusztulását okozzák. A lerakódásokban leggazdagabb területek a memóriafunciókért felelõs hippocamus formáció és az entorhinális kéreg (EC), így a neurotoxikus peptid felhalmozódása, fokozottan ezen areák funkciókiesésével jár együtt. A laboratóriumunkban kidolgozott állatmodell segítségével olyan gyógyszerjelölt vegyületeket teszteltünk, melyek in vitro mérések szerint, aggregátum inhibitorokként mûködnek. Azt vizsgáltuk, hogy ezek a vegyületek in vivo körülmények között kivédik-e a â-amyloid(1-42) EC-be injektálásával kiváltott memóriaromlást. Szintetikus â-amyloid(1-42) oldatot (0,375mg/ml) (â-amyloid-kezelt csoport), vagy fiziológiás sóoldatot (kontrol csoport), pentapeptid védõanyagokat: LPYFD és RIIGL,gyógyszerjelölt vegyületet (P59), valamint pozitív kontrollnak pentaglicint injektáltunk felnõtt hím Wistar patkányok entorhinális kérgébe bilaterálisan. A magatartástesztek három héttel a mûtétet követõen kezdõdtek. A rövid távú memóriát Y-labirintusban, a hosszú távú memóriát tárgyfelismerési teszttel, a térbeli memóriát pedig Morris-féle vízilabirintusban vizsgáltuk. A magatartásteszteket követõen szövettani festéseket, valamint 12

15 fehérjeexpressziót követõ Western Blott vizsgálatokat végeztünk. Eddigi eredményeink igazolták a modell mûködõképességét, ugyanis a kontroll és az â-amyloid-kezelt állatok teljesítménye között szignifikáns különbséget mutattunk ki mind a Morris-féle vízilabirintusban, mind a tárgyfelismerés tesztben. A pentapeptidek( LPYFD, RIIGL) esetében nem tudtunk védõhatást igazolni. A pentaglicinnel kezelt állatok teljesítményébõl látható, hogy a speciális aminosav oldalláncokkal nem rendelkezõ pentapeptid hatására nem mutatható ki teljesítményváltozás a kezelést követõen. Újabb kísérleteink során négy állatcsoportot vizsgáltunk; oligomer Aâ1-42-vel, a gyógyszerjelölt vegyülettel (P59), a védõanyaggal és Aâ1-42-vel (1:5 mólarányban), valamint fiziológiás sóoldattal injektált állatok viselkedési és tanulási paramétereit teszteltük. Vizsgálataink alapján a térbeli memóriát felmérõ Morris-labirintusnál találtunk szignifikáns különbségeket, a probe és a reverz úszásoknál, valamint a tárgyfelismerési tesztnél voltak eltérések az állatcsoportok között. A kívülrõl bejuttatott amyloid károsítja a hosszútávú és a térbeli memóriát, míg a spontán alternálás (Y-teszt) eredményei azt sugallják, hogy a munkamemóriában az Aâ nem okoz deficitet. A nyílt porond tesztben sem találtunk különbséget az állatok viselkedési paraméterei között. Valószínûleg az amyloid hatása specifikus, csak a memóriafolyamatokat érinti. A P59 neuroprotektív hatású volt. Szövettani vizsgálatainkból kitûnik, hogy az LPYFD-vel kezelt állatok esetén a hiperativált gliák száma nem haladja meg a kontrolloknál tapasztalt mértéket, ugyanakkor az â-amlyoiddal és LPYFD-vel is kezelt, valamint a kizárólag â-amyoid-kezelt állatokat összehasonlítva is közel azonos mértékû hiperreaktivitást tapasztalunk. Ezek az elõzetes eredmények alátámasztják a magatartási vizsgálatok során is megfigyelt hasonlóságot az â-amlyoid-kezelt és a mellette védõanyagot kapott csoportok memóriafunkcióiban. A reaktív asztrociták és a plakkszerû struktúrák megjelenése igen kifejezett volt az amiloiddal kezelt állatokon. Transzgenikus modell: a P59 és P79 gyógyszerjelölt anyagok tesztelése most fut. Az eredmények összefoglalása, további lépések Magyarországon kb , a világon 10 milliós nagyságrendû az Alzheimer-kórban szenvedõk száma. A betegségnek jelenleg nincs kielégítõ gyógykezelése. Egy Alzheimer-kór elleni gyógyszernek óriási forgalma lenne, de már egy lezárt preklinikai dosszié is nagyon értékes. Újabb 23 vegyület elõállításával lezártuk a szabadalmazandó vegyületek körét. Bebizonyítottuk, hogy a P59 és P79 felszívódik, átmegy a vér-agy gáton és kivédi az Aâ toxikus hatását. Kiderítettük a fenti vegyületek hatásmechanizmusát ban lezárjuk az állatkísérleteket és értékesítjük a szabadalmat. 2. Klaszter: Neuroprotektív szabad-gyökfogó vegyületek tervezése, szintézise, biológiai tesztelése. Kísérleti vér-agy gát modell kidolgozása. Projektvezetõ: Dr. Zarándi Márta Munkacsoport-vezetõk: Dr. Farkas Eszter, Dr. Deli Mária Célok és rövid áttekintés (1.7 részfeladat) Neuroprotektív szabad-gyökfogó vegyületek tervezése, szintézise, biológiai tesztelése. Kísérleti vér-agy gát modell kidolgozása. Elvégzett tevékenység: Neuroprotektív szabad-gyökfogó vegyületek tervezése, szintézise, biológiai tesztelése: 1. á- és ã-tocopherol antioxidáns hatásának in vitro vizsgálata 2. a vegyületek in vitro tesztelése sejttenyészeten, szabad gyök képzõdés és megkötés kimutatása 3. agyi hiperfúziós modellben, határozzuk meg a várt neuroprotekció mértékét 4. vér-agy gát funkciók vizsgálata: efflux pumpa mûködés, permeabilitás változások, junkcionális fehérjék expressziójának és lokalizációjának változásai. Eredmények 1, Tocopherol származékok és tesztelésük. Elõzõ kísérleteink szerint az á-tocopherol a patkányokban csak óriási dózisban (100 mg/kg ip beadással) okozott mérhetõ neuroprotektív hatást. A szakirodalom az utóbbi években számos negatív eredményrõl számol be az á-tocopherollal kapcsolatban: az enyhe kognitív hanyatlásban nem találtak hatást (Petersen R.C. The New England J. Med. 352:2379, 2005), az Alzheimer-kórban nagy beteganyag statisztikai elemzése is hatástalannak mutatta az á-tocopherolt (Foley D.J. JAMA287:3261, 2002). Néhány szakirodalom a nagy dózisú, (30 IU/nap felett) á-tocopherol káros, oxidáló hatásáról számol be, ami nem meglepõ a vegyület standard redoxpotenciáljának ismeretében. Az á-tocopherol nagy dózisai oxidálják a lipideket ( átocopherol mediated peroxidation ). 400 IU/nap dózisban adott á-tocopherol már a kardiovaszkuláris betegségek kockázatát növeli. Minden eddigi kísérlet eredménye arra utal, hogy az á-tocopherol nem mint szabadgyökfogó vegyület, hanem mint génexpressziót és szignáltranszdukciót szabályozó anyag játszik fontos élettani szerepet. Szabályozza pl. a protein kináz C enzimet, ezáltal egy sorozat biokémiai reakciót és a sejtproliferációt. á-tocopherol jelenlétében számos olyan gén aktivitása csökken, amelyek az akut gyulladás kialakulásáért felelõsek. Az á-tocopherol gyenge felszívódási készsége és a vér-agy gáton történõ átjutás nehézsége szintén hozzájárultak ahhoz, hogy a nagy centrumokban placebo kontrollal végzett vizsgálatok az Alzheimer-kór elleni védelem szempontjából negatív eredménnyel zárultak. Saját laboratóriumi kísérleteink azt bizonyítják, hogy az á-tocopherol számos veszélyes és reakcióképes oxidálószerrel nehezen lép reakcióba és szabad gyökfogó tulajdonsága gyenge. Ezzel szemben azt találtuk, hogy a ã -tocopherol (dezmetil-átocopherol) sokkal jobb antioxidáns, könnyen reagál a reaktív nitrogénoxidokkal (RNOS) és 5-nitro-ã tocopherollá alakul át. A ã- 13

16 tocopherol szintje a vérplazmában a rákbetegségek és a kardiovaszkuláris betegségek rizikójának jó biomarkere, egyben a prosztatarák megelõzésének legjobban bevált vegyülete (Wagner K.H. et al Ann. Nutr. Metab. 48:169, 2004). Az E-vitamin másik izoformája, az á-tocotrienol sejtkultúrában (striatális primer kultúra) a legjobbnak bizonyult neuroprotektív anyag, már nanomólos koncentrációban hatásos. Saját kísérleteink és a szakirodalom alapján egyértelmûvé vált, hogy neuroprotektív anyagként az á-tocopherol nem használható. Ennek egyszerû kémiai oka van: a gyûrûrendszer 5. helyén lévõ metilcsoport megakadályozza a szabad gyökökkel történõ gyors reakciót. Neuroprotekcióra, így az Alzheimer-kór prevencióra elsõsorban az 5-dezmetil forma, a ã-tokoferol és a tokotrienolok alkalmasak. Eddig ezek magas ára határt szabott a kísérleteknek, de az újonnan alapított LipidArt spin-off cégen keresztül sikerült olcsó, természetes ã-tocopherolhoz jutni. Ciklodextrinek segítségével a ã-tocopherol és a tocotrienolok felszívódása megjavult és az elõkísérletek szerint a vér-agy gáton történõ átjutás is növekszik. Az olcsó és természetes forrásból izolált ã-tocopherollal most kezdjük el az in vivo kísérleteket egy optimális diéta kialakítására, patkány modellen. 2, Agyi endotélsejtek interakciójának vizsgálata pathológiás fehérjeaggregátumokkal, peptidekkel: efflux transzporter aktivitás. Kísérleteinkben az amyloid típusú peptidek agyi endotélsejtekre gyakorolt közvetlen hatását vizsgáljuk. Megállapítottuk, hogy a â-amyloid peptidek, és a prion fehérje (Prp) peptidszakasza toxikus hatást fejt ki agyi endotélsejtekre, károsodik az endotélsejtek barrier funkcióközti szoros zárókapcsolatok mûködése és az agyi endotélsejtek TJ struktúrája. A 2007-es évben a munkatervnek megfelelõen kísérleteinket az efflux transzporterek vizsgálatára összpontosítottuk. A vér-agy gát egyik legfontosabb tulajdonsága, hogy megteremti a központi idegrendszer homeosztázisát. Ebben fontos szerepet játszanak az efflux transzporterek, amelyek megakadályozzák a toxikus xenobiotikumok bejutását az idegrendszerbe, illetve segítik a káros metabolitok eltávolítását. A vér-agy gát két fontos efflux transzportere a P-glikoprotein (Pgp)és a multidrog rezisztencia fehérje- 1 (MRP-1). Az efflux pumpa mûködést a Pgp ligand rodamin 123 sejten belüli akkumulációjával mértük. Primer agyi endotélsejt tenyészetekben inkubálás után a rodamin szintje alacsony, amit a Pgp inhibitor cyclosporin A jelentõsen megemelt. A sejtek kezelése oldhatatlan fehérjeaggregátumot létrehozó PrP peptiddel koncentráció-függõ módon megnövelte a sejten belüli rodamin szintet, ami azt jelenti, hogy a peptid hatására az endotélsejtek efflux transzporter mûködése károsodott. Ezt a károsító hatást pentosan ki tudta védeni, míg önmagában a Pgp aktivitást nem befolyásolta. RT-PCR technikával igazoltuk, hogy a PrP peptid a Pgp mrns expresszióját is szignifikánsan csökkentette. Az MRP-1 pumpa számos xenobiotikum, gyógyszerhatóanyag mellett glutation-konjugált vegyületek efflux transzportjáért felelõs. Aktivitását a glutation-konjugált bimane sejten belüli és sejtbõl kipumpált mennyiségének arányával határoztuk meg. Az ismert inhibitor, az indomethacin jelentõsen gátolta az MRP-1 pumpa mûködését. A PrP peptid az MRP-1 efflux aktivitását is szignifikánsan csökkentette, amit pentosan kezeléssel gátolni tudtunk. Pentosan kezelés önmagában jelentõsen fokozni tudta az MRP-1 efflux pumpa aktivitást, ami a vér-agy gát funkciókra kifejtett kedvezõ hatásának újabb bizonyítéka. Amyloid típusú peptid a vér-agy gát efflux pumpáinak mûködését gátolta, amit a korábbi kísérleteink során protektívnek bizonyult pentosan, egy erõsen szulfatált poliszacharid ki tudott védeni. A pentosan, mint vér-agy gát protektív hatóanyag klinikai fontosságú lehet neurodegeneratív megbetegedésekben. Eredmények összefoglalása, további lépések Farmakológiailag nagyon jelentõs lenne olyan tokoferol származékok vagy kompozitok elõállítása, amelyek átjutnak a vér-agy gáton és neuroprotektív hatásúak. Erre komoly kereslet van és azonnal eladható funkcionális élelmiszerként lenne forgalmazható. A ã -tokoferolt és tokotrienolokat, ill. komplexeiket próbáljuk 2008-ban funkcionális élelmiszerré fejleszteni. 3. Klaszter: Az Alzheimer-kór gyógyszerjelölt vegyületeinek in vivo vizsgálata és toxikológiája. Projektvezetõ: Dr. Falkay György Munkacsoport-vezetõk: Dr. Nagymajtényi László, Dr. Benedek György, Dr. Erõs István Célok és rövid áttekintés (1.8 részfeladat) Az Alzheimer- és Parkinson-kór gyógyszerjelölt vegyületeinek in vivo vizsgálata és toxikológiája. Elvégzett tevékenység: Az Alzheimer- és Parkinson-kór gyógyszerjelölt vegyületeinek in vivo vizsgálata és toxikológiája: 1. hatóanyagok transzportjának elõsegítése a vér-agy gáton keresztül 2. toxikológiai paraméterek megállapítása 3. gyógyszerjelölt vegyületek (LPYFD, P59) szervmegoszlása, bejutása az agyba 4. a kijelölt gyógyszerjelölt vegyületek (2 molekula) biztonságfarmakológiai vizsgálata. Eredmények 1, Hatóanyagok transzportja a központi idegrendszerbe. Az á-tokoferol és a ã-tokoferol protektív hatását vizsgálatuk az Alzheimer-kór kialakulásával kapcsolatban. Célul tûztük ki megfelelõ hordozórendszer kifejlesztését, mely egyaránt biztosítja a lipofil karakterû E-vitamin oldékonyságát, valamint elõsegíti a hatóanyag vér-agy gáton keresztül történõ transzportját. Az intranazális bevitel mellett ezért a fenti követelményeknek megfelelõ nem-ionos tenzidekbõl felépülõ vezikuláris gyógyszerhordozók (nioszómás rendszerek) formulálását és vizsgálatát is megkezdtük. Elõkísérleteink során nátrium-fluoreszceint alkalmaztunk modellanyagként. A tesztvegyületet három vivõanyagban dolgoztuk fel. Az elsõ rendszer foszfát puffer (ph=7,4), második és a harmadik Span60-at és koleszterint 1:1 mólarányban tartalmazó 14

17 nioszómás rendszer volt. A harmadik összetétel azonban glükóz alapú emulgenst is tartalmazott, mely várakozások szerint az agyi kapillárisok endotélsejtjein található glükóztranszporter rendszerhez (GLUT1) kapcsolódva receptor mediált endocitózis révén fokozza a vezikulumba bezárt hatóanyag központi idegrendszerbe irányuló transzportját. Vizsgálatainkhoz 10 hetes Wistar patkányokat (n=36) használtunk. A beadás minden vivõanyag esetén 5ml/ttkg dózisban történt az éteres narkózissal elaltatott patkányok farokvénájába. Az állatokat 3, 10, 30 perccel a beadást követõen éteres túlaltatással elpusztítottuk, agyukat eltávolítottuk. Az agyakból 6 régiót különítettünk el további vizsgálatok céljából, ezek a szaglógumó, az agykéreg, a hippokampusz, a köztiagy, a híd és a kisagy voltak. 3 perccel a beadás után a legmagasabb agyi szinteket a targetált nioszómák esetén mértük, míg 10 perccel a kezelés után a nem targetált nioszómás rendszer alkalmazásakor kaptuk a legjobb eredményt. A 30 perces adatokat tekintve viszont a pufferben oldott tesztanyag alkalmazásakor némileg magasabb értékeket kaptunk. Az eredmények talán azzal magyarázhatóak, hogy az alkalmazott glükóz alapú emulgens hidrofil fejcsoportját különbözõ hosszúságú glükózmolekulákból felépülõ lánc alkotja, melynek monoglikozid frakciójának részaránya nem volt elegendõ a GLUT1 transzporteren történõ transzport kellõen hatékony fokozásához. Továbbiakban tervezzük tisztán alkil-monoglikozidot tartalmazó emulgens kipróbálását. 3 2, A [ H]LPYFD és a P59 gyógyszerjelölt vegyület központi idegrendszerbe történõ bejutásának in vivo vizsgálata patkányban. Korábbi vizsgálataink során megállapítottuk, hogy a tríciált LPYFD intravénás bevitelét követõen radioaktivitás detektálható az 3 agyban, tehát a [ H]LPYFD vagy radioaktív metabolitja(i) bejutnak a központi idegrendszerbe. A pályázat jelenlegi szakaszában célul tûztük ki annak eldöntését, hogy a központi idegrendszerben észlelt radioaktivitásért az 3 intakt [ H]LPYFD vagy annak metabolitjai a felelõsek. A hím patkányokat (SPRD, tömeg: 200 g) 200, illetve 500 ml tríciált LPYFD peptiddel kezeltük intravénásan, illetve intraperitoneálisan majd két óra elteltével az állatok agyát eltávolítottuk. A folyékony nitrogénben lefagyasztott agyakból 25% és 75%-os acetonitriles (ACN) extraktumot készítettünk, melyeket HPLC analízisnek vetettünk alá (UV- és radiokromatográfiás 3 detektor). A [ H]LPYFD biotranszformációját in vitro körülmények között is megvizsgáltuk (agyi membránpreparátum, ACN-es extrakció, HPLC). Megállapítottuk, hogy 2 órával a kezelés után az intakt peptid csekély mennyiségben, a tríciumot hordozó metabolitjai viszont nagyobb mennyiségben mutathatók ki az agyban. 3 A [ H]LPYFD metabolizmusa bizonyos mértékben in vitro körülmények között agyi membránpreparátumban is végbemegy, de az intakt peptid minden frakcióban kimutatható és a keletkezõ metabolitok száma is kevesebb, mint az az in vivo kezelést követõen tapasztalható. Ez arra utalhat, hogy az agyban nem várható intenzív metabolizmus. Az in vivo és in vitro vizsgálatokból levonható az a következtetés, miszerint a LPYFD metabolizmusa jelentõs a periférián. A P59 gyógyszerjelölt vegyület triciált alakjával szintén elvégeztük a fenti kísérleteket. Ez az anyag peptidomimetikum és rezisztens a proteolitikus enzimekkel szemben. Intravénás bevitele után sem bomlik, az agyban még a beadás után 2 órával is jól kimutatható, viszont a vizelettel elég gyorsan kiürül. 3, Új állatmodell amiotroph lateral sclerosisra; toxikológiai és biztonságfarmakológiai vizsgálatok Újabb in vivo modellek kifejlesztésén is dolgozunk, melyek alkalmasak lehetnek az amyotrophikus lateral sclerosis (ALS) szimulálására patkányban, ez az irány azért fontos, mert néhány adat arra utal, hogy az Alzheimer betegség és az ALS patomechanizmusában vannak hasonlóságok. Eddigi vizsgálataink szerint a amyloid peptid intrathecalis adagolása esetén jelentõs arányban bénultak az állatok, míg az 1-42 peptid hatástalan volt. A jövõben tervezzük a kipróbálását azon anyagoknak ezen modellben, melyek hatékonyak voltak Alzheimeres állatmodellekben. A P29 gyógyszerjelölt vegyület megismételt toxikológiai vizsgálata azt mutatta, hogy a vegyület egészen 100 mg/kg határig nem toxikus (egér). A P59 toxikológiai vizsgálata (28 napos kísérlet) elkezdõdött. Jelenleg fut mindkét vegyület biztonságfarmakológiai vizsgálata is. Eredmények összefoglalása, további lépések A fenti vizsgálatok pozitív eredménye esetén ezen a szinten lezárható a preklinikai vizsgálatsorozat és egy eladható termék jön létre, amely Alzheimer-kór ellenes gyógyszer kifejlesztése esetén nagy értéket képvisel. Szükségesnek látszik egy új, kevésbé vízoldható és lassabban kiürülõ gyógyszerjelölt vegyület tervezése a P59 szerkezet alapján. 2. ALPROGRAM: Szorongásos betegségek és kóros neuroendokrin folyamatok (tanulás- és memóriazavarok, stressz, szenvedélybetegségek) gyógyszeres kezelése. Az alprogram két területen kapcsolódik a gyógyszerkutatáshoz és -fejlesztéshez: a szorongásos betegségek és a depresszió (4. klaszter), illetve a szenvedélybetegségek kezelésére alkalmas új vegyületek kutatásával (5. klaszter). Külön kutatásifejlesztési irányt képvisel az enterális idegrendszer, a brain-gut axis vizsgálata (7. klaszter). 4. Klaszter: Anxiolitikumok kutatása; AMPA-receptorok modulációja Projektvezetõ: Dr. Telegdy Gyula Munkacsoport-vezetõk: Dr. Telegdy Gyula, Dr. Lévay György Célok és rövid áttekintés ( részfealadat) 15

18 1, Szorongást és stresszhatást befolyásoló, anxiolitikus hatású peptidek és peptidomimetikumok tervezése, szintézise és biológiai vizsgálata. 2, Az AMPA/Kainát receptorokat moduláló potenciális gyógyszerek szintézise, in vitro és in vivo tesztelése és Az AMPA receptor moduláló gyógyszerek hatásmechanizmusának vizsgálata. Elvégzett tevékenység: Új vegyületek tesztelése állatkísérletekben. Tanulás és memória funkciók aktív és passzív elhárításos tanulási tesztekben. A vegyületek és analógjainak hatása az anxietás-anxiolysis folyamataira az ún. elevated plus maze rendszerben. Glutamát receptorokat moduláló potenciális gyógyszerek szintézise. 70 új, még korábban le nem írt molekula szintézise, valamint farmakológiai vizsgálata. Az NMDA receptor moduláló gyógyszerek hatásmechanizmusának vizsgálata: - a gyógyszerjelölt anyagok hatására történõ neurotranszmitter-felszabadulás meghatározása in vitro szuperfúziós technikával - a modulátorok által befolyásolt fehérjék proteomikai vizsgálata. Az NMDA receptor moduláló gyógyszerek hatásmechanizmusának vizsgálata, in vitro és in vivo tesztelése. A kiemelkedõ in vivo hatékonyságú vegyületek elõzetes gyógyszerbiztonsági, toxikológiai, mutagenitási (Ames teszt) és egyéb biztonság farmakológiai vizsgálatok. Eredmények Anxiolitikum és antidepresszáns hatású peptidek Kimutattuk, hogy az urocortinok (1,2,3) antidepressziós tesztben különbözõ módon hatnak. Az urocortin 1-nek nincs antidepressziós hatása, míg az urocortin 2 kismértékû, az urocortin 3 jelentõs antidepressziós hatással rendelkezik. Az urocortin 3 fragmentumainak antidepresziós hatását vizsgáltuk a hatáscentrum megállapitására. Kiderült, hogy a biológiai hatás a C-terminális 3-4 aminosavból álló fragmentumhoz kötött. A fragmentumból analógok készültek (Tóth Gábor - Orvosi Vegytani Intézet) és az analógok közül többnek kimutattuk az antidepressiós hatását. Az ezzel kapcsolatos szabadalmi eljárás elkezdõdöttt és a Szegedi Tudományegyetem hozzájárulása után a szabadalmi bejegyzés elindítható. Kimutattuk, hogy az urocortin 3 antidepressziós hatásában adrenergiás és serotonergiás mechanizmusok is résztvesznek. In vitro superfuziós rendszerben kimutattuk, hogy a CRF és az urocortin 1 fokozta a GABA release-t amygdala szeletek elektromos ingerlésére, amely hatás CRF1 antagonistával, antalarminnal, felfüggeszthetõ volt. A CRF 2 antagonista, astressin 2B, hatástalan volt. Urocortin 2 és urocortin 3 hatástalannak bizonyult az amygdala GABA releasére eletromos ingerlést követõen. Részletesen vizsgáltuk a neuromedin S hatását a hypophysis-mellékvesekéreg rendszer mûködésére, a különbözõ magatartási rekciókra és autonom folyamatokra. A neuropeptid S fokozta a mellékvesekéreg aktivitását dózis-hatás összefüggésben, amely hatás gátolható volt CRF 1 antagonistával. Fokozta az állatok mosakodási reakcióját, amely haloperidollal (dopamin antagonistával) és CRF 1 antagonistával gátolható volt. In vitro rendszerben a Neuromedin S fokozta a dopamin release-t amygdala szeletekbõl, azonban nem volt hatása a lokomócióra. NMDA-receptor moduláló vegyületek Ahogyan ezt már az elõzõ beszámolóban jeleztük, a glutamát receptor modulátorok projekt keretében kisebb módosítás történt. Az eddig vizsgált AMPA receptor modulátorok további vizsgálatait kellõen hatékony fejlesztésre alkalmas jelölt molekula hiányában leállítottuk. A továbbiakban a receptor család másik fontos tagjának, az NMDA receptor modulátorainak, nevezetesen a glicin kötõhelyen modulátor szerepet játszó, a glicin szintet szabályozó glicintranszporter-1 (GlyT-1) gátló hatású vegyületek vizsgálatait végezzük. A GlyT-1 inhibitorok az NMDA receptor komplex mûködésének módosításával hatékony terápiás eszközök lehetnek a depresszió és a schizophrenia gyógyításában. Az elmúlt idõszakban a project keretében az elõbbiekben említett GlyT-1 inhibitorok vizsgálatait, illetve a részletes farmakológiai karakterizáláshoz szükséges új modellek beállítását végeztük. Az eddigiekben alkalmazott spreading depression és patch clamp modelleket fokozatosan felváltják a glicin transzporter aktivitás mérésére szolgáló rendszerek (glicin release mérése, mikrodialízis), ezt követõen pedig azok az új módszerek, amelyek a különbözõ központi idegrendszeri stimulánsok (PCP-fenciklidin, MK-801, amphetamin, stb.) által kiváltott speciális viselkedésformák (hipermotilitás, sztereotipia) gátlásán alapulnak. Az új módszerek beállítása és validálása a referens vegyületek felhasználásával megtörtént. Az elmúlt évben több vegyületcsaládban összesen kb. 70 db új vegyület szintézise történt meg. A vegyületek biológiai hatékonyságát a projektben elfogadott screen rend szerint vizsgáljuk. Az átmeneti idõszakban a fentieknek megfelelõen a következõ vizsgálatokat végeztük el: Spreading depression mérése izolált csirke retinán: a teszten 35 vegyületet vizsgáltunk meg. Patch clamp vizsgálatok izolált cerebelláris szemcsesejteken: 10 vegyület vizsgálatát végeztük el, az NMDA receptor funkciót jelentõs mértékbe egyik vizsgált vegyület sem változtatta. Glicin felszabadulás mérése agyszeletbõl: 10 vegyület mérését végeztük el. Glicin és glutamátszintek mérése mikrodialízis technikával éber patkányban: a módszer beállításon kívül 2 vegyület mérését végeztük el. PCP és MK-801 hipermotilitás gátlására a referensek mellett 15 vegyületet vizsgáltunk meg, jelentõsebb hatást 2 vegyület esetében találtunk, ezeket további in vivo módszerekkel is meg fogjuk vizsgálni. Egyéb magatartás-farmakológiai vizsgálatot 2 vegyülettel végeztünk. Eredmények összefoglalása, további lépések Az urocortin-3 jelentõs antidepresszáns hatással rendelkezik, megtaláltuk a hatásért felelõs aktív centrumot. Nagy gyakorlati jelentõsége van a szorongást és stresszhatást befolyásoló peptideknek és mimetikumoknak, ezek mint vezérvegyületek (lead) 16

19 szerepelnek a további gyógyszerfejlesztésekben. A vegyületekre szabadalmat kérünk. Az NMDA receptor moduláló vegyületek a pánikbetegségek gyógyszerjelölt molekulái. 5. Klaszter: Opioid agonisták és antagonisták Projektvezetõ: Dr. Borsodi Anna Munkacsoport-vezetõk: Dr. Benyhe Sándor, Dr. Tóth Géza, Dr. Szûcs Mária, Dr. Szabó Gyula Célok és rövid áttekintés ( részfeladat) 1. Új opioid és nociceptiv receptor szelektív agonista és antagonista peptidek szintézise, radiojelölése, biokémiai vizsgálata. 2. Opioid peptidek komplex magatartás vizsgálata. javaslat egy nem addiktív új opioid típusú analgetikum vagy gyógyszerkombináció összeállítására. Elvégzett tevékenység: â-aminosavakat tartalmazó peptidek tervezése és szintézise. Radioaktív opioid ligandum termékké fejlesztése. Az elõzõ évben kiválasztott és tríciált opioid antagonista származék további részletes hatástani jellemzése natív szövetekben, sejttenyészetekben. A radiopeptidek in vitro stabilitási vizsgálatai. A lead nociceptiv analógok és antagonisták vizsgálata krónikus adminisztráció esetén. Opioid peptidek komplex magatartás vizsgálata: Patkányok alapvetõ magatartási reakcióinak (explorációs, tájékozódási, mozgáskoordinációs magatartás) vizsgálata. Eredmények 1, Opioid agonista és antagonista vegyületek szintézise, radiojelölése, biokémiai vizsgálata. Néhány biológiailag jelentõs endomorfin származékunkból in vivo vizsgálatokra (analgézia tesztek) új szintézisekkel 100 mg-os tételben állítottunk elõ peptideket. Glicinnel meghosszabbított endomorfin-1 és endomorfin-2 származékokat mint biológiai prekurzorokat terveztünk és szintetizáltunk és biokémiailag és farmakológiailag jellemeztünk. Új endomorphin analógokat szintetizáltunk Aba-Gly és spiro-aba-gly dipeptidek felhasználásával. A Tyr-spiro-R-Ala-Gly-Phe-NH2-ról NMR és molekula modellezési módszerekkel bizonyitottuk a â-kanyar szerkezetet a peptidláncban, és ez az analóg radioreceptor kötési vizsgálatok alapján megtartotta a potent és mu opioid szelektivitását. Radioaktívan jelzett Dmt-endomorfin-2 anyagunk kereskedelmi termék lett. Radioaktív jelölési technikáink segítettek új megbízások megszerzésében hazánkban és a világ más részeiben is (ESTEVE, IVAX). Tríciált anyagjaink 2007-ben eljutottak Franciaországba, Ausztriába, Angliába, az USA-ba, Lengyelországba és Olaszországba. Az új opioid antagonista peptid analóg [3H]H-Dmt-Tic-(2S,3R)âMePhe-Phe-OH szintézise és katalitikus tríciálása a jódozott prekurzor peptidbõl sikeresen megvalósult. A tisztított radiojelzett peptid specifikus aktivitása 2.15 TBq/mmol (58 Ci/mmol). Ezen vegyület újdonságnak számít mivel egy szerkezetileg módosított tirozin csoport (2',6'-dimetiltirozin, Dmt1) helyettesíti az egyes helyzetben lévõ tirozint az N-terminálison, valamint egy â-metil szubsztituált fenilalanin (âmephe3) csoport található a hármas helyzetben. Mivel a âmephe csoport különbözõ diasztereomer konfigurációt ad és ezáltal módosíthatja a biológiai aktivitást, mindkét lehetséges jelöletlen threo diasztereomer analógot (2S,3R és 2R,3S) megvizsgáltuk és bevontuk a kísérletekbe. Ezen analógok affinitását és szelektivitását (-opioid illetve -opioid receptor) radioligand kötési kísérletekben elemeztük. A különbözõ agonista illetve antagonista karakterüket, funkcionális [35S]GTPS kötési kísérletekben vizsgáltuk, kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtvonalakon melyek szelektíven és stabilan expresszálnak ä- vagy ì-opioid receptorokat. Egyensúlyi kísérletekben, a radiojelzett peptid származék [3H]H-Dmt-Tic-(2S,3R)âMePhe-Phe-OH kötõdése patkány agyimembrán homogenátumokban telíthetõ volt, és a Scathard szerinti transzformáció egy-kötõhelyes kötõdést mutatott 0.3 nm-os Kd és 127 fmol/mg fehérje Bmax értékekkel. Heterológ kompetíciós kísérletekben a [3H]H-Dmt-Tic-(2S,3R)âMePhe- Phe-OH kötõdésének gátlása különbözõ receptor-típus specifikus opioid jelöletlen ligandokkal a következõ kompetíciós kötési mintázatot adta: ä>ì>ê, utalva a ä-opioid kötõhelyek szelektív jelölésére. A funkcionális kísérletekben, mindkét (2S,3R) és (2R,3S) peptid parciális agonista hatást mutatott; önmagukban csak kismértékben aktiválták a szabályozó G-fehérjéket a CHOsejtvonalakon, de mindkét sztereoizomer kompetitív módon gátolta az agonistával stimulált [35S]GTPS kötést a rekombináns receptorokat expresszáló rendszerben. ä-cho sejteken a (2S,3R) izomer mutatott nagyobb ä-antagonista hatást. Több új endomorfin származék, köztük a béta-metil szubsztituált ciklohexil-alanin oldalláncot tartalmazó analógok széles körû biokémiai hatásvizsgálatát végeztük el. Jellemeztük a prolin-oldalláncán (Pro2) tríciált Dmt1-endomorfin II radioligandot. Farmakológiai kísérletekben mutattuk ki a Xenopus laevis trópusi és laboratóriumi békafaj természetes opioid peptidjének, a xendorfin-1-nek in vivo antinociceptív hatásait kétéltûekben. Biokémiai és funkcionális tesztekben jellemeztünk két, a TIPP delta-opioid receptor szelektív antagonista tetrapeptidek ('Schiller-peptidek') családjába sorolt, új, diasztereomer analógot, illetve egyikük radiojelzett változatát: [3H]H-Dmt-Tic-(2S,3R)âMePhe-Phe-OH. Megállapítottuk, hogy a nagy affinitású opioid ligandok egyidejûleg hordozzák a ì-agonista és ä-antagonista hatást. Biokémiailag jellemeztük a szintetikus endomorfin peptidomimetikumokat (Aba-Gly és spiro-aba-gly származékok). A konformációsan gátolt szerkezetek egyike, a Tyr-spiro-R- Aba-Gly-Phe-NH2 tetrapeptid a természetes endomorfinokhoz közelítõ affinitást és szelektivitást mutatott (hatásmegõrzés), másodlagos szerkezetében a â-turn konformáció dominál. 2, Opioid peptidek komplex magatartás vizsgálata. Nem addiktív új opioid típusú analgetikum kifejlesztése. Kis dependenciakapacitású, kevés mellékhatással rendelkezõ opioid analgetikum kifejlesztése, ún. 'lead' molekulák kiválasztása céljából szerkezet-hatás vizsgálatokat végeztünk a ì-receptor endogén ligandjainak tekintett endomorfin-1 és endomorfin-2 konformációsan gátolt 8 új származékával. Vizsgálatainkat kiterjesztettük a morfin kezelés beszüntetése utáni molekuláris változások mérésére. Megállapítottuk, hogy ha ez spontán történik, akkor a sejtfelszíni -opioid receptorok száma 37 17

20 %-kal, míg naltrexon-precipitált elvonáskor 66%-kal nõ. Az elvonás fázisában a receptorok jelátviteli sajátságaiban nem észleltünk szignifikáns változásokat. A megvonási tünetek kialakulásában az intracelluláris -opioid receptorok nem játszanak fontos szerepet, szemben a morfin dependencia állapotával. A ì-opioid receptorok endogén ligandja, az endomorfin 16 új, aliciklusos â-aminosavat tartalmazó konformációsan gátolt származékával végzett korábbi szerkezet-hatás vizsgálataink alapján, a tolerancia vizsgálatainkhoz lead molekulának a Tyr- (1S,2R)ACHC-Phe-Phe-NH2 ligandot választottuk. Az új peptidet intracerebroventrikulárisan injektáltuk patkányokba. Megállapítottuk, hogy a peptid ismételt adásakor (20 ìg, b.i.d., 10 nap) analgetikus tolerancia jön létre. Ez nem jár együtt a receptorok internalizációjával/down-regulációjával, viszont az intracelluláris -opioid receptor szám 46%-kal up-regulálódik. A krónikus peptid kezelés nem váltott ki receptor deszenzitizációt. Elvégeztük egy új, konformációsan gátolt, peptidomimetikum radioantagonista, a [3H]TYR-TIC-(2S,3R)-â-MEPHE-PHE-OH részletes kötési és funkcionális sajátságainak vizsgálatát. Az új ligand az alapvegyületnél négyszer potensebb ä-antagonista patkány agyban illetve rekombináns receptorokat expresszáló sejtvonalban. Amerikai együttmûködésben kimutattuk, hogy az új ligand intrathekális adása után mért tail-flick analgézia tesztben ún. ä1-opioid receptor szelektív antagonistaként viselkedik, mely összhangban van vadtípusú és transzgenikus agyi mmembránokban kapott funkcionális méréseinkkel. A radioligand kedvezõ tulajdonságai (magas affinitás, stabilitás, ä1-specifitás) miatt kiváló eszköz lehet szerkezeti és topográfiai vizsgálatokhoz. Kimutattuk, hogy a kannabinoid CB1 és a GABAB receptorok funkcionális interakcióba lépnek patkány hippocampusban és egy olyan új egységet hoznak létre, amelynek jelátviteli és ligandkötõ sajátságai eltérnek az egyedi receptorokétól. Hipotézisünk szerint receptor hetero-oligomerizációja állhat a háttérben. Eredmények összefoglalása, további lépések A szenvedélybetegségek (kábítószer- és alkoholfüggõség) leküzdésének elsõ lépését jelentik azok a vizsgálatok, melyek a különbözõ agonista és antagonista peptidek és mimetikumok pontos hatásmechanizmusának megértését teszik lehetõvé. Errõl a pontról indulhat egy racionális gyógyszertervezés. 6. Klaszter: Az enterális idegrendszer, a brain-gut axis vizsgálata Projektvezetõ: Dr. Lonovics János Munkacsoportvezetõ: Dr. Izbéki Ferenc Célok és rövid áttekintés (2.6 részfeladat) Új terápiás eljárások kidolgozása a brain-gut axis károsodása következtében kialakuló betegségek kezelésére. Elvégzett tevékenység: A szerin proteázok szerepe irritábilis bélbetegségben (IBS). Az IBS és a viscerális hiperszenzitivitás gyógyszeres befolyásolásával kapcsolatos vizsgálatok. Gliasejt-károsodás az enterális idegrendszerben (ENS) diabeteszes betegeknél. Eredmények Irritábilis bélbetegségben (IBS) a stressz vastagbél permeabilitás fokozódást és viscerális hiperszenzitivitást okoz. Kimutattuk, hogy a hasmenéssel járó IBS betegekben a széklet szerin-proteáz aktivitás emelkedett és a székletszám korrelál a proteáz emelkedettség mértékével. További vizsgálataink célja természetben elõforduló proteáz inhibitorok (szója, burgonya) szerepének vizsgálata az IBS kezelésésben. A stressz és a fekélybetegség kapcsolatában teszteltük a gasztrin lehetséges szerepét gasztrin knock-out (GKO) és vad típusú (WT) egerekben két, jelenleg a fekélybetegség kezelésében használt gyógyszer, omeprazol és ranitidine alkalmazásával. A GKO-egerek savszekréciója 65%-kal csökkent. A WT-egérben omeprazollal a gasztrin savtermelést fokozó hatása teljesen gátolható volt. Ranitidinel csak a kisdózisú gasztrin-stimulált savszekreció volt blokkolható, a nagydózisú gasztrin hatását csak részben tudtuk gátolni. A GKO-egerekben sem gasztrinnal sem hisztaminnal nem lehetett a savszekréciót serkenteni. Ezen kisérletek alapján kidolgoztuk humán endoszkópos mintából gyomormirigyek tenyésztését és ezek gyógyszeres befolyásolásának módszerét. További gyógyszeralkalmazási kutatási célunk a gasztrin és acetilcholin által kiváltott savszekréció jellemzése. Cukorbetegségnél fellépõ gyomor-bélrendszeri károsodásokban a bél-idegrendszer (ENS) neuronális és glia sejtjei egyaránt szerepet játszhatnak, amelyek a betegek hatékony kezelését is gátolják. A cukorbetegekben gyakori hasmenés tanulmányozásásval kapcsolatban patkányokban kimutattuk az ENS nitrerg elemeinek jelentõs pusztulását a vékonybél disztális szakaszán és a vastagbélben. Ezt a károsodást korai inzulinkezeléssel megelõztünk és a béltranzit-idõ is normalizálódott. Eddig nem vizsgált terület a glia károsodásának szerepe a cukorbetegek kóros ENS mûködésében. Eredményeink szerint a rövid idõtartamú cukorbetegségben nem alakul ki jelentõs glia károsodás, viszont a tartós diabétesz jelentõs glia károsodást is okoz, mely fokális és/vagy segmentalis. A munka további folytatásának célja a károsodás jellegének vizsgálata és a korai inzulinkezelés szerepének tisztázása a gliasejt-károsodás megelõzésében. Eredményeink két gyakori, jelentõs népegészségügyi problémát képezõ stresszhez kötõdõ betegségben merõben új terápiás megközelítések közvetett kidolgozását teszik lehetõvé. Cukorbetegségben eredményeink aláhúzzák a korai kezelés fontosságát kóros bélmûködés kezelésében, továbbá új utakat nyithatnak meg a nitrerg elemek specifikus farmakológiai befolyásolásában. Eredmények összefoglalása, további lépések A krónikus alkoholizmus, a diabetes és a stressz egyaránt károsítja az enterális idegrendszert, ezért hatásuk jelentõs 18