Celluláris és Molekuláris Neurobiológia 2016

Átírás

1 Az asztro- és mikrogliasejtek biológiája Celluláris és Molekuláris Neurobiológia 2016

2 glia glia (görög): ragadós A GLIA felfedezése 1858, Rudolf Ludwig Karl Virchow alkotta meg a passzív elem fogalmát az agyban és bevezette az elgondolást, miszerint az agy is tartalmaz kötőszövetet, s ennek neve neuroglia , German doctor, anthropologist, pathologist, prehistorian, biologist and politician , Italian physician, pathologist, scientist, and Nobel laureate Camillo Golgi már 1871-ben felismerte, hogy a gliasejtek az idegsejtektől eltérő sejtes populációt alkotnak. Megfigyelte, hogy a gliasejtek nyúlványokat nyújtanak a véredényekhez és azokon végtalpakat létesítenek. Ő javasolta először, hogy a gliasejtek metabolikus anyagokat továbbítanak az erekből az agy-parenchimába (1875; 1894).

3 1888, Ramon y Cajal fejlesztette ki az arany-klorid szublimálásos technikát, ami specifikus volt a rostos és plazmás asztrociták számára (e festés targetje IF, GFAP!) , Spanish pathologist, histologist, neuroscientist, Nobel laureate

4 1893, Lenhossék Mihály vezette be az asztrocita kifejezést. Ő írta az első terjedelmes összefoglalást a gliasejtekről. Állította, hogy a gliasejtek, melyeket oly sokan leírtak, egy vegyes populáció, és valójában több sejttípusból áll , was an Hungarian anatomist and histologist uncle to Albert Szent-Györgyi ( ) Protoplazmás asztrocita Rostos asztrocita 1895, Albert von Kölliker és Andriezen leírták a rostos és protoplazmás asztrocitákat szürkeállomány fehérállomány Rudolf Albert von Kölliker, , Swiss anatomist and physiologist

5 1894, Carl Ludwig Schleich ismerte fel, hogy a gliasejtek dinamikus, aktív szerepet játszanak az idegrendszer működésében! , German surgeon Schleich hitte, hogy a gliasejtek és a neuronok egyenrangúak és mindkettő aktív sejtes eleme az agynak. Schleich szerint az idegi aktivitás neuronról neuronra intercelluláris réseken át terjed, melyek glianyúlványokkal vannak kitöltve, melyek szabályozzák a hálózatban a serkentést/gátlást. Felvetette, a gliasejtek állandóan változó térfogata kontrollálja a neuronális kommunikációt , Spanish physician, histologist, anatomist 1921, Pio del Rio- Hortega Bevezette az ezüst karbonátos festést, ami szelektíve jelölte az oligodendrocitákat és bevezette a mikroglia fogalmát ( garbage collecting cells ). mikroglia

6 Gliális sejttípusok az idegrendszerben neuroektodermális eredet (kivéve mikroglia) mezodermális eredet neuronok neuroglia erek falát és agyhártyákat alkotó sejtek asztroglia oligodendroglia ependyma mikroglia * asztrociták * II. típusú asztrociták * radiális glia * Bergmann glia * Müller glia * Pituicita (hipofízis) * tanycita * glia limitans sejtjei GLIA: gyűjtőfogalom!!! gliák * oligodendrociták * NG2 sejtek * szatellitasejtek * olfactory nerve ensheating cells (ONEC) * Schwann sejtek * corpus pineale * adenohipofízis gliasejtjei csillagsejtjei *ependymociták *choroid plexus hámsejtjei * enterális gliasejtek perivaszkuláris periszinaptikus pericelluláris * rezidens mikroglia *bevándorolt makrofágok perinodális asztrociták

7 Asztroglia Ia pial tanycyte Ib vascular tanycyte II radial astrocyte (Bergmann glial cell) III marginal astrocyte IV protoplasmic astrocyte V velate astrocyte VI fibrous astrocyte VII perivascular astrocyte VIII interlaminar astrocyte IX immature astrocyte X ependymocyte XI choroid plexus cell Kettenmann and Ransom 2005

8 4 fő GFAP + sejtcsoport a humán agykéregben réteg: interlamináris asztrociták sejttestjei, melyek nyúlványai a 2-4. rétegbe nyúlnak pár mm mélyen; tekervényes (tortuous) morfológia 2. Plazmás asztrociták, leggyakoribbak a 2-6. rétegben. 3. Polarizált asztrociták (varicose projection astrocytes), csak emberben, az 4-6. rétegben, szétszórtan. Milliméteres, varikozitásokkal teli nyúlványok. 4. Rostos asztrociták, fehérállományban. Sárga vonalak: a klb. asztrocita populációk előfordulási helyei. Scale = 150 μm. Heterogeneity of astrocytic form and function. Oberheim, Goldmann, Nedergaard 2012 GFAP = gliális fibrilláris savas protein, IF

9 1. Interlaminar astrocytes tortuous GFAP MAP2 DAPI 3. Polarized astrocytes: varicose projection astrocytes varicose Oberheim, Goldmann, Nedergaard 2012

10 hgfap-gfp Asztrocita Emsley 2006

11 About half the cells in the human brain are glia, but we're only beginning to understand what they do. Ben Barres Henry Markhram: Human Brain Project modellezés, szuperkomputáció what about glial cells??? HBP: , ~1,4 milliárd Euro

12 Teljes sejtszám felnőtt hermafrodita C. elegans-ban: neuron 50 glia (5 %) 24 sheath glia, 26 socket glia C. elegans glia Amphid: fő kemoszenzoros szerv a nematodákban (kutikula beidegzett betűrődései). Minden amphid-ot 12 érző neuron és 2 glia (kék/piros) alkot. C: Red: sheath glia, green: neuronal cilia Blue: socket glia

13 Gliasejtek ablációja: (lézeres mikrosebészet...) - nincs neuronpusztulás - de az érzőneuronok dendrit és axonnövekedés zavart lesz

14 AFD = termoszenzoros neuron, az amphid 12 neuronjának egyike. Ezt is AMsh glia öleli körbe. A KCC-3 K + /Cl - transzporter az AMsh gliasejt AFD neuron mikrovillusait körbevevő részein lokalizálódik és szabályozza a K + /Cl - szintet az ec. térben. A Cl - ionok direkt módon gátolják a neuron receptor guanylyl-ciklázt (GCY-8), ami cgmpt szintetizál. A magas cgmp szint gátolja az aktin regulátor WSP-1/WASP-ot, ami blokkolja a neuronális növekedési kúp elongációját. Components of this pathway are broadly expressed throughout the nervous system, suggesting that ionic regulation of the NRE microenvironment may be a conserved mechanism by which glia control neuron shape and function.

15 Agy mérete elefánt, bálna agya nagyobb mint emberé Agy/testtömeg arány kis emlősöknél, pl. mókuscickánynál nagyobb az agy/test tömeg aránya, mint embernél Agykéreg mérete delfinek, bálnák abszolút és relatív agykéreg mérete is nagyobb lehet, mint az emberé miért vagyunk okosabbak?? Milyen gének expresszálódnak inkább a humán agyban a főemlősökéhez képest? több glia-related gén, mint neuronális! Gliasejtek mérete/morfológiája emberben elágazóbb, jóval nagyobb (asztrociták)

16 Asztrocita méret humán asztrocita 2-3X nagyobb, 10X több nyúlványa van plazmás asztrocita territóriumában rágcsáló: 20, ,000 szinapszis ember: 2 millió szinapszis Scale : 20 um Verkhratsky, Parpura, Rodríguez 2011 Oberheim, Nedergaard 2012

17 cortical human astrocyte [Image: Nancy Ann Oberheim and Takahiro Takano, University of Rochester Medical School]

18 Brainbow Asztrocita transgenic multicolor labeling strategy called Brainbow, Jeff Lichtman (Harvard University)

19 Brainbow Asztrocita Jeff Lichtman (Harvard University)

20 B = billion. G/N = 0,99 Teljes humán agy neuron:glia arány = 1:1!!!! G/N = 3,76 Agykéreg!!! G/N = 11,35 G/N = 0,23 DAPI NeuN (Fox3)

21 Humanized mice

22 Csillag alakúak Asztrocita A legnagyobb glia populáció a CNS-ben Fő markere mindmáig : GFAP (gliális fibrilláris savas fehérje) DE a GFAP expresszió nagyon varábilis Minden Bergmann-glia GFAP+, de a cortexben és HC-ban az asztrocitáknak csak ~15-20 % - a GFAP+ (felnőttben)!!!

23

24 Markerek Asztrocita Huang 2006 GFAP glial fibrillary acidic protein GLT-1(EAAT2) glutamate transporter GLAST(EAAT1) glutamate transporter GS glutamin synth(et)ase glutamát uptake AQP4 aquaporin4 Aquaporin 4 (asztro végtalp) Glutamate + ATP + NH 3 Glutamine + ADP + phosphate S100b McDougal 2011 Thrane 2010 GFAP/AQP4-GFP mouse cortex

25 Asztrocita McDougal 2011 asztrociták az agytörzsben (Texas Red is a sulfonyl chloride derivative of SR101) Sulforhodamine 101 In vivo two-photon imaging of cortical astrocytes at a 250 mm depth (P21 rat) 30 minutes after SRB (20 mg/kg) iv injection.

26 Asztrocita Aldh1L1-EGFP Aldh1L1 Aldh1L1 is a specific pan-astrocyte marker aldehyde dehydrogenase 1 family, member L1 gene, also known as 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase (FDH) 10-CHO-THF is important in purine biosynthesis Affymetrix A, Aldh1L1 labels both cell bodies and processes of astrocytes in cortex B, GFAP does not label the finer processes C, GFAP labels a subset of astrocytes whereas Aldh1L1 labels many astrocytes not labeled by GFAP D F, Aldh1L1 does not label neurons, OLs, or OPCs G I, Aldh1L1-EGFP transgenic mouse cortex 2008, Ben Barres

27 Asztrocita Glycogen granules Sárga ill. piros nyilak: glikogén szemcsék asztrocitákban: kicsi, kerek, sötét szemcsék glikogén glükóz Marker: brain glycogen phosphorylase

28 Asztrocita rés kapcsolatok Nagy JI 1998 Connexin43 asztrocita rés-kapcsolatokban immunogold jelöléssel. (A, B) Asztrocita gap junction a neuropilben (nyilak). (C, D) Connexin43 asztrocita rés-kapcsolatokban a szürke (C) és fehérállományban (D).

29 Glia fiziológia Kapcsoltság - átlagosan egy asztro-pár a szürkeállományban 230 GJ-vel kapcsolt: magas fokú kapcsoltság!! 300 um slice - Lucifer yellow, Alexa dyes (~450 kda), biocitin: 1 asztroba injektálva szomszédos asztro jelölődik - kapcsoltság mértéke agyterületenként nagyon eltér: cortexben szinte teljes kapcsoltság (~100%); látóidegben 80%, HC-ban csak 50%, corpus callosumban szinte semmi 50 um slice Astrocytic coupling in the neocortex and in the corpus callosum. Biocytin. GFAP-GFP mice

30 Glia fiziológia Kapcsoltság P11 egér Sulforhodamine B Asztro biocitin jelölése cortexben Asztro azonosítás morfológia/elfiz alapján Houade, Giaume 2006

31 propagating intercelllular Ca ++ wave Glia fiziológia Ca ++ calcium hullám átugrik a sejtmentes sávon Ca ++ hullám a stimulált sejt körül ATP Ca ++ hullám amit a perfúzió eltérít Hassinger 1996 InsP3

32 Glia fiziológia Ca ++ waves Ca ++ oszcillációk HC asztro nyúlványaiban Oregon Green BAPTA-1 töltés A: regions of interest (ROI) B: a 4 nyúlvány elég különböző Ca ++ jeleket ad C. II. csoport kinagyítva: Ca ++ ROIs 9-10 területén kezdődött, innen ic. calcium hullám halad végig a nyúlványon Nett 2002

33 Intercelluláris Ca++ hullámok : - fejlődés során - specializált szövetekben (pl. retina) - patológiás esetekben (pl. Alzheimer kór, epilepszia ) - normál felnőtt agyban :??? Ugyanakkor glia Ca++ excitabilitása nagyon fontos!! - neuronális transzmitter ürítésre adott válasz - spontán Ca++ tranziensek - Ca++ szint növekedés gliotranszmitter ürítéshez vezethet - patológia

34 - genetically encoded calcium indikátorok (G-CaMP) - Bergmann gliában spontán Ca++ hullámok transzgliális hullámok - melyek P2-receptor antagoinistákkal blokkolhatóak és - melyeket ATP adásával ki lehet váltani Please check: - egér hippocampus több száz asztrocitájának monitorozása, in vivo - minden asztro részt vesz regeneratív, sejtről sejtre terjedő hullám kialakításában: glissandi - glissandi függ a neuronális aktivitástól és glissandi alatt csökken a vörösvértest-áramlás - alacsony lézerintenzitások mellett látható csak mindez!!!

35 - glia Ca++ hullám: szignálterjedés glia neuronok erek között - spontán Ca++ hullámok 20x gyakoribbak öreg állatokban, mint felnőttben és - ez korrelál a nyugvó agyi oxigén tenzióval - felnőtt állatban a nyugvó agyi oxigén tenzió növelése növelte a gliális Ca++ hullámok gyakoriságát - ATP által kiváltott hullámok csökkentették a szöveti oxigén tenziót - Purkinje sejtek aktivitása nem okozott megnövekedett gliális Ca++ hullám gyakoriságot - ugyanakkor a spontán glia Ca++ aktivitás befolyásolta a neuronok ic. Ca++ aktivitását

36 Intercelluláris Ca++ hullámok : - fejlődés során - specializált szövetekben (pl. retina) - patológiás esetekben (pl. Alzheimer kór, epilepszia ) - normál felnőtt agyban :??? Ugyanakkor glia Ca++ excitabilitása nagyon fontos!! - neuronális transzmitter ürítésre adott válasz - spontán Ca++ tranziensek - Ca++ szint növekedés gliotranszmitter ürítéshez vezethet - patológia

37 Volterra, Meldolesi 2005 Glia fiziológia Gliotranszmitterek Asztrocitákban!

38 Glia fiziológia Neurotranszmitter/neuromodulátor receptorok - szinte minden receptort expresszálnak, amit a neuronok: lokálisan azt, amit az adott környezet adott idegsejtjei - így képesek neuronális működést érzékelni Sőt: térbeli szegregáció: pl. gátló szinapszisok közelében Bergmann gliában inkább GABA receptorok koncentrálódnak - nagyon gyakran amire receptoruk van azt saját maguk is képesek szekretálni Verkhratsky és Butt, 2007

39 Glia-neuron interakció Gliotranszmitterek neuronok által aktivált gliális Ca++ szignalizáció következtében gliotranszmitter (pl. Glu) release asztroból ez visszahat a neuronműködésre: AMPA/NMDAR-on át direkt posztszinatikus neuronális depolarizációt okozhat ILLETVE preszinaptikus mglur-t is aktiválhat gliotranszmitter ATP is lehet: vagy P2 purinreceptorokon át direktben hat vagy adenozinná bomlik, és P1 receptorokon hat gliális [Ca++]ic : bekövetkezhet még spontán vagy pl. elektromos vagy mechanikus stimulálásra

40 Intercelluláris Ca ++ hullámok : patológia Pl. epilepszia ha szinaptikus aktivitást gátolják és fesz.függő Ca ++ csatornákat blokkolják neuronokon akkor is kilakulhat lassú neuronális depolarizáció: photolysis of caged Ca ++ elegendő gliális Ca ++ szint növekedés kiváltásához gliális Glutamát release epileptikus aktivitás glia-farmakológia!!!

41 AsztroGlia fiziológia Ion-homeosztázis az extracelluláris térben A fő ion-transzport rendszerek asztrocitákban

42 1. K + feszültségfüggő csatornákon át távozik neuronból 2. normális esetben ennek nagy részét a sejt visszaveszi a 3Na/2K ATPáz ionpumpával 3. a többlet K+ -ot a glia veszi fel szintén a 3Na/2K ATPáz révén illetve elektrokémiai gradiens mentén K+ csatornákon (K ir ) át. Ekkor Cl- is kotranszportálódik, hogy fennmaradjon az ionegyensúly. Ezúton a lecsökkent ec Na+ is pótlódik. 4. a K+ többlet a réskapcsolatokon át szétterjed a glia-hálózatban 5. K + csatornákon át leadódik az intersticiális térbe (spatial buffering) vagy a perikapilláris térbe (siphoning) 6. a perikapilláris térből endotélsejtek a 3Na/2K ATPase pumpa segítségével felveszik és a kapillárisba üríthetik K+ spatial buffering

43 AsztroGlia fiziológia [Glu] ec koncentráció szabályozása glutaminase [Glu] IC ~1-10 mm [Glu] IV ~100 mm [Glu] EC ~1uM glutamine synthase [Glu] IC ~50uM-1 mm glutamát-glutamin sönt Neuronális glutaminsav reciklizálása: glutamát-glutamin ciklus Siegel GJ, Agranoff BW, Albers RW, et al., editors. 1999

44 AsztroGlia fiziológia Gátló (GABAerg) szinapszis [GABA] ec koncentráció szabályozása glutamate decarboxylase GLNase Bak LK. et al GABA-erg neuronoknál fontosabb a re-uptake mint a szintézis - GABA-erg terminálisokban kisebb a Gln raktár - GLIA az idegi gátlást tudja kontrollálni ily módon!

45 AsztroGlia fiziológia Swelling Víz - homeosztázis szabályozása moderate, transient swelling of astrocyte endfeet occurs at active synapses 1. végtalpakon K+, Na+ és Glu- uptake (Kir4.1, Na/Glu kotranszporterek, és valószínűleg egyéb?? kation csatornák): IC ozmolit-koncentráció nő 2. ozmotikus viszonyok által irányított víz influx (aquaporin, AQP4) és duzzadás (swelling) 3. volume sensing and osmotransduction nem teljesen feltárt eseménysorozat mely végső soron RVD-hez (regulatory volume decrease) vezet: swelling-indukálta ic. Ca++ (ic. Ca++ raktár ürülés és kapacitatív Ca++ influx??trpv4?? csatornákon át) kíséri a jelenséget 4. RVD: ozmolitikum efflux: Cl-, taurin, excitatorikus aminosavak ürítése volume-regulated anion channel (VRAC) on keresztül és valószínűleg K+ efflux volume-sensitive (és Ca++ függő?) K+ csatornákon át 5. IC ozmolitikumok kiáramlását követően víz efflux, térfogatcsökkenés Benfenati, Ferroni 2010 Ca++ szerepe e folyamatokban még erősen kérdéses (vannak változását cáfoló adatok is)! Egy csomó kináz is aktiválódik swelling esetén: sok még a??? Gliális RVD ionos mechanizmusai is :????

46 AsztroGlia fiziológia Víz - homeosztázis szabályozása Kir és AQP kolokalizáció, ko-immunprecitipáció, molekuláris együttműködés! szinaptikus aktivitás glia duzzadás lokális ec. tér szűkülés hatékonyabb szignalizáció (neurotranszmitter koncentrációja nagyobb és a spillover kisebb) - periszinaptikus glia végtalp lokális gliaduzzadás - távoli végtalpakon zsugorodás : sokszor kimérték, hogy neuronális aktivitásra hogyan változik EC tér a stimuláció helyén és attól távol

47 AsztroGlia fiziológia Víz - homeosztázis szabályozása Asztrociták az extracelluláris ozmolaritást érzékelik: pl. hipozmotikus stressz (EC ozmolaritás ) asztro duzzadás RVD (agyi ödéma!) regulatory volume decrease : (szabályozott térfogatcsökkenés) ozmotikusan aktív anyagok kizárása a sejtből K+ Cl-, szerves aminok, glutamát, glycin, taurine, GABA release astrocyte majd víz efflux Súlyos esetben (hypoxiaischaemia, trauma): nagyfokú asztro-duzzadás (citotoxikus ödéma) és RVD gyengülése - megszűnése!

48 Glia-neuron interakció Glia Neuron szignalizáció 4. Neuronális Hálózatok kontrollja Philip Haydon Halassa 2007 Reichenbach 2010 A, 3 asztrocita. Különböző neuronális kompartmentumokat más-más asztro kontrollálhat. B, egyetlen asztro is koordinálhat pl. egy több dendritből álló csoportot

49 Neurovaszkuláris kapcsoltság Agyi mikrocirkuláció szabályozása Funkcionális hyperaemia: lokális neuronális aktivitás esetén gyorsan nő a lokális agyi vérellátás 1890, Sherrington - vazodilatáció az aktív neuronokhoz közel, um távolságban következik be - sokféle elmélet próbálta magyarázni: lokális neuronális vazoaktív faktor release, lokális innerváció, NO termelés ma: asztro szerepe egyértelmű neuronális aktivitás asztro Ca++ szignalizáció gátlása szétkapcsolja a neuronális aktivitást az ér-tónus szabályozástól!! asztro [Ca ++ ] ic arachidonsav (AA) kibocsátása glia végtalpból e végtalp által körbefogott kis arteriolák tónusának változása vazodilatáció (blood flow nő): ha AA prosztaglandin-származékká alakul cyclooxygenáz segítségével (ezt aszpirin gátolja) vazokontrikció: ha AA átalakulás útja 20- hydroxyeicosatetraenoic acid (2-HETE), cytochrome p450 enzim segítségével