Glia-neuron interakció aspektusai. Neuron-glia metabolikus együttműködés

Átírás

1 Glia-neuron interakció aspektusai Agyi mikrokörnyezet szabályozása Neuron-glia metabolikus együttműködés Neurovaszkuláris kapcsoltság ion, víz homeosztázis szabályozása neurotranszmitter homeosztázis szabályozása glutamát-glutamin ciklus asztrocita neuron laktát sönt glutathione prekurzor szintézis. ascorbate neurovaszkuláris unit (NvU) lokális véráramlás gliális szabályozása gliális BBB kontroll

2 Glia-neuron interakció aspektusai máshol tárgyalva Szinaptikus működés szabályozása tripartite synapse neuron glia szignalizáció neuron/glia szinapszisok glia neuron szignalizáció, gliotranszmitterek neuronális hálózatok kontrollja szinaptogenezis, szinapszis fenntartása, eliminációja Neurogenezis Neuronal guidence glia mint őssejt glia mint őssejt-niche tagja glia és az axon pathfinding Patofiziológiai aspektusok agyi ödéma akut léziók (trauma, stroke) krónikus neurodegeneratív kórképek neuroimmunológiai reakciók (mikroglia!) remodeling and recovery of neuronal function

3 Glia-neuron interakció Metabolikus együttműködés Agy metabolikusan legaktívabb szervünk: - a teljes testtömegnek csak 2 %-a, de - de a teljes vérellátás 15%-a - a teljes oxigén felhasználás ~20%-a - a teljes glükóz felhasználás ~25%-a az agyban történik. Bonvento 2002 Neuronális aktivitás metabolikus változások hemodinamikus változások kapcsolatának vizsgálata: Glükóz konzumpció: FDG-PET (FluoroDeoxyGlucose-Positron Emission Tomography (FDG-PET) [ 18 F]-2-FDG Oxigén konzumpció: oxyhemoglobin - deoxyhemoglobin (HbO 2 /Hb) szint változás mérése: Blood Oxygen Level Dependent-Magnetic Resonance Imaging (BOLD-MRI) [ 15 O]H 2 O Vérátáramlás mérése: H 2 O-PET.

4 Glia-neuron interakció Metabolikus együttműködés Neuronok energetikai problémái nincs direkt hozzáférésük vérben szállított tápanyagokhoz - vérben fő tápanyag: glükóz és albuminhoz kötött zsírsavak - pl. tüdő, szív mindkettőt hasznosíthatja, de a BBB az albumint kizárja: agyban glükóz monodependencia - glükóztól is 4 membrán (2 endotél, 2 asztro) választja el a neuront (kapilláris asztro végtalp borítottsága 99,7%!, lásd később) hosszú diffúziós útvonalak - pl. ATP a sejttestől 1 mm-re 1 óra alatt diffundálna pl. a denritben, miközben ATP turnover másodperces! (...axonal transport of mitochondria...) kis méretek (dendrittüske, axonátmérő, stb) okozta metabolikus kihívás (metabolic challenge) *(next page) - EPSP (a nagy energiafelhasználók) a felületen történnek: ATP pedig a citoplazmában képződik. Minél vékonyabb egy neuronális nyúlvány, annál nagyobb a felület/térfogat arány: saját energiaellátás annál rosszabb. Asztro nyúlványban ezzel szemben egy nagyságrenddel gyorsabb a diffúzió, mint pl. transzporterek vagy metabolikus enzimek turnovere. fluktuáló energiaigény - mikor egy neuron nyugvó állapotból 10 Hz tüzelésbe kezd, ATP felhasználása 7x nő: tehát gyorsan reagáló ATP pótló rendszer kell: másodperceken belül kell új ATP! energiaraktározás hiánya! L. Felipe Barros 2013

5 * diffusionweighted MR spectroscopy (DW-MRS).. is a method to noninvasively quantitate the translational displacement of endogenous metabolites in intact mammalian tissues Nikolay 2001 ADC: apparent diffusion coefficient valós modell!!..we show how long-range morphology of neurons and astrocytes can affect the diffusion of cell-specific metabolites at ultra-long diffusion times and that adequate modeling strategy seems to allow extracting morphological parameters such as astrocytic and neuronal process length and complexity, opening the way to noninvasive histology of the brain Palombo 2016

6 Net gain ~36 ATP wiki

7 L. Felipe Barros 2013

8 Glycolysis and its branches acetyl CoA lasd kesobb 1 L. Felipe Barros 2013 PPP Neuronban van glycogen synthase, de inaktív. Ha inaktivitása mutálódik: aberráns neuronális glikogén felhalmozódás: Lafora disease. epilepszia, mental deterioration HEK : hexokinase PFK: phosphofructokinase PK: pyruvate kinase PDH: pyruvate dehydrogenase GP: glycogen phosphorilase G6PD: glucose-6-posphate dehydrogenase GS: glycogen synthase LDH: lactate dehydrogenase PC: pyruvate carboxylase 2 PPP

9 Glia-neuron interakció Metabolikus együttműködés Neuronok evolúciósan sok fajban neuronnak egyedül kellett megoldania e sok problémát - de aztán jött az asztro neuronok energiaigénye magasabb, mint asztroé, de lassabban metabolizálják a glükózt - tenyészetben - szeletben - FACS szerint 3 neuronokban a phosphofructokinase (PFK) működése funkcionálisan gátolt: pentose phosphate kör aktív: redukáló környezet (oxidatív stressz elleni védelem!) emiatt viszont neuronokban glikolízis nem effektív: bezzeg asztrocitákban: asztro ATP hiány esetén erőteljes glikolízisbe kezd!! Neuron viszont pyruvátot tud csinálni másból (pl. laktátból) is ami megy tovább az energiatermelő folyamatokba (Krebs, ox. foszf.) 4 asztrocitákban viszont pyruvate dehydrogenase foszforiláció által tónusosan gátolt: asztro a laktát termelés és export felé van eltolva 5 asztrociták glikogénből is inkább laktátot állítanak elő!

10 módszer: genetically encoded FRET sensor Laconic in vivo imaging asztrociták és neuronok intravénásan adott L-laktátot akkumulálják az asztrocitáknak szignifikánsabb magasabb a laktát-szintje, mint a neuronoknak ez a laktát gradiens szükséges a carrier-mediálta laktát flux-hoz (asztroból neuronba) FRET sensors are fusion proteins composed of a ligandbinding moiety, the recognition element, and a fluorescent pair with overlapping emission and excitation spectra, typically CFP and YFP. Binding of the test molecule (lactate) causes a conformational change that affects the relative distance and/or orientation between the fluorescent proteins, causing an increase or a decrease in FRET efficiency. The nanosensor described here is based on LldR, a bacterial transcription regulator that consists of two modules, a lactate-binding/regulatory domain and a DNA-binding domain. FRET: fluorescence resonance energy transfer: a mechanism describing energy transfer between two light-sensitive molecules (chromophores).a donor chromophore, initially in its electronic excited state, may transfer energy to an acceptor chromophore through nonradiative dipole dipole coupling. The efficiency of this energy transfer is inversely proportional to the sixth power of the distance between donor and acceptor, making FRET extremely sensitive to small changes in distance.

11 Glia-neuron interakció Neuronok Metabolikus együttműködés! Lényeg: neuronok a glikolízist kiszervezik asztrocitákba. Ennek előnyei neuron számára: - neuron antioxidáns státusza (reduktív környezete) érintetlen marad - asztro nyúlvány neuron körül sokkal nagyobb térfogatú: jóval több laktát tud itt keletkezni - gap junction hálózaton is tud glükóz/laktát terjedni (bár laktát GJ transzport függ a membrán-potenciáltól, ami az MCT transzporterekre nem igaz) - de ez jó is, mert neuronális aktivitásnál a laktát a közeli asztroban koncentrálódik! - laktát termelés térben szeparált és független a neuronális működéstől

12 Luc Pellerin et al. 2007, 2010 Glia-neuron interakció Neuroenergetika (alap) GLUT3: neuronális glükóz transzporter GLUT1: gliális glükóz transzporter Asztro: glikogén raktár! MCT: laktát transzporter TCA cycle (monocarboxylate) Agyi glikogén: (humán): 0,5-1,5g (0,1% of total brain weight) Agyban: glükóz (majdnem) teljes oxidációja (6CO 2 +6H 2 0)!!

13 Glutamáterg aktiváció: korai fázis 1. Glu ürülés szinapszisban AMPA receptor aktiváció, EPSP, Na + belépés 2. depolarizációs hullám, fesz. függő Na + csatornák nyílnak, Na + /K + ATPáz visszaállítja iongradienst - ami sok energiát használ 3. oxidatív foszforiláció aktiválódik, NADH elhasználódik 5. De: AMPAR aktivációra a neuronális glükóz felvétel csökken 4. Citromsavciklus felpörög - piruvát elhasználódik, nő a glükóz és laktát lebontás 6. főleg laktátot használ az idegsejt!

14

15 Glutamáterg aktiváció: késői fázis GLAST: be: 1 glutamát, 3 Na+, 1 H+ ki: 1 K + 1. A szinaptikus résbe kerülő glutamátot az asztrocita felveszi (GLAST, GLT1 glutamát transzporterek) 2. ez nagy Na+ influxot is jelent, amit Na+/K+ ATPáz állít helyre 3. és aktiválódik a glükóz transzport 4. és a glükóz feldolgozás is a gliában 5. a glikolízis nagy citoplazmás NADH szint növekedést okoz ami segíti piruvát laktát átalakulást, és a laktát ürülést

16 Glutamáterg aktiváció: intenzív és hosszútávú stimuláció - asztro glikogénje lokálisan, saját környezetében hasznosul 1. intenzív glutamate reuptake asztrocitákban, és az ec. glükóz készlet hamar kimerül 2. ilyenkor a gliális glikogén mobilizálódik 3. glikolízis az elsődleges energiatermelési útvonal ilyenkor 4. és a laktát termelődés biztosítja a magas glikolitikus rátát - a raktározott glikogén 20 perccel növelheti meg az axon funkcióképességi idejét

17 Glia-neuron interakció Metabolikus együttműködés Amiről eddig beszéltünk : Asztrocita neuron laktát sönt hipotézis (ANLSH) Astrocyteneuron lactate shuttle Hipotézis!!! arról, hogy a neuronális aktivitás és glükóz felhasználás az asztrociták aerob glikolízisét és a neuronok laktát hasznosítását vonja maga után. Dienel GA, Cruz N Pellerin et al A neurometabolikus community megosztott: csak glükózt vagy laktátot is használ az agy energiaként!!

18 Glia-neuron interakció Metabolikus együttműködés G protein-coupled receptor GPR81, also known as hydroxycarboxylic acid receptor 1 (HCA1 or HCAR1) = lactate receptor GPR81 has been deorphanized recently: camp signaling

19 Glia-neuron interakció Metabolikus együttműködés A: electron micrograph showing double immunogold labeling at synapses between parallel fiber terminals (T) and Purkinje cell spines (S). The section was double-labeled with antibodies to GluR2/3 (15-nm gold particles) and to MCT2 (10-nm gold particles). B: the membranes of the Bergmann glia facing the parallel fiber terminals and Purkinje cell spines are labeled with antibody to MCT4 (10-nm gold particles). C: the lactate receptor (10-nm gold, red arrowheads) is at the postsynaptic membrane (black arrowheads). Synapse of a nerve terminal (t) and a dendritic spine (s) is shown. Stratum radiatum, hippocampus CA1. D and E: the lactate receptor GPR81/HCAR1 (green) is in the pyramidal cell somatodendritic compartment including spines (white arrows in D). Hippocampus CA1. Neurons labeled for MAP2 (red), nuclei with DAPI (blue). Gundersen 2015

20 glutamátra adott neuronális válasz neuronális Ca++ jel - patkány HC: tanulás során glikogén eredetű laktát szint nő - gliális laktát transzporterek (MCT4 vagy MCT1) kilövése amnéziát okoz, amit L- laktát visszaállít (de a glükóz nem!!) - neuronális laktát transzporter hiánya szintén amnéziához vezet, amit sem a laktát, sem glükóz nem állít helyre Arc, Zif268, c-fos, and BDNF neural plasticity related genes

21 Multiple sleep/wake cycles recorded using simultaneous electroencephalographic and (A) lactate/glutamate biosensors or (B) lactate/glucose biosensors plotted during the lights-on period. Epochs scored as wake are noted in red, Non-Rapid Eye Movement (NREM) sleep epochs are colored blue, and rapid eye movement (REM) sleep epochs are indicated in green. Concentration change for each analyte is indicated on the y-axis. The lower graphs (C, D) correspond to time periods on the upper graphs indicted by the solid box. In all expanded graphs, lactate concentration change is plotted in a manner similar to that of the large-scale graphs with colors indicating sleep/wake state and the secondary analyte (C) glutamate or (D) glucose plotted as on overlay in fuchsia or orange, respectively. From Naylor et al. (2012).

22 Glia-neuron interakció Metabolikus együttműködés Asztrociták számos olyan metabolikus kulcsenzimet expresszálnak, melyek a neuronokban nem fordulnak elő (vagy nem jellemzőek/nem funkcionálisak):! glutamát-glutamin ciklus: GS glutamin synth(et)ase glikogén mobilizáció: glikogén foszforiláz 6 lásd korábbi dia glikolízisről oxálacetát anaplerotikus szintézise: pyruvát karboxiláz (azokat a reakciókat, amelyek a citromsavciklus köztitermékeit hozzák létre, anaplerotikus reakcióknak nevezzük) (citrát kör feltöltése lásd korábban lásd korábban taurine szintézis: cysteine sulfinate decarboxylase glycin metabolizmus: glycine cleavage system (glycine decarboxylase complex or GCS, több enzim), nagy glycin koncentrációk aktiválják neuronális glutathione szintézis prekurzorainak előállítása lásd nemsoká

23 Glia-neuron interakció Metabolikus együttműködés ROS (reactive oxygen species) reaktív oxidatív szabadgyökök Hidroxilgyök OH Szuperoxidgyök O 2 Nitrogénoxid-gyök NO Lipidperoxil-gyök LOO Pl. stroke esetén: ROS káros hatásai: Hidrogén-hiperoxid H 2 O 2 Szuperoxid anion O 2 - Hipoklórossav HOCl Ózon O 3 Nitrogén monoxid NO Peroxynitrit ONOOoxidatív stressz - DNS károsítás - lipid peroxidáció - fehérje károsítás - enzimek oxidatív inaktiválása

24 Glia-neuron interakció Metabolikus együttműködés Neuronális glutathione szintézis prekurzorainak előállítása asztrocitákban Glutathione (g-glutamylcysteinylglycine, GSH): szulfhidril (-SH) antioxidáns, antitoxin, enzim kofaktor. GSH nagyon fontos a ROS detoxifikációban!! a GSH egy tripeptide C 10 H 17 N 3 O 6 S, mely egy-egy aminosav gyököt tartalmaz az alábbiakból: glutamát, cisztein, glicin A GSH szulfhidril csoportja alkalmas a ROS nem enzimatikus redukálására. A GSH keletkező, oxidált formája két molekulából áll, melyet diszulfid híd tart össze (GSSG). Glutathione hiány esetén: súlyos idegr. károsodások, neuronvesztés!!!!

25 Glycolysis and its branches acetyl CoA lasd kesobb 1 L. Felipe Barros 2013 PPP Neuronban van glycogen synthase, de inaktív. Ha inaktivitása mutálódik: aberráns neuronális glikogén felhalmozódás: Lafora disease. epilepszia, mental deterioration HEK : hexokinase PFK: phosphofructokinase PK: pyruvate kinase PDH: pyruvate dehydrogenase GP: glycogen phosphorilase G6PD: glucose-6-posphate dehydrogenase GS: glycogen synthase LDH: lactate dehydrogenase PC: pyruvate carboxylase 2 PPP

26 Glia-neuron interakció glutamát, cisztein, glicin Glutathione Metabolikus együttműködés xct Glycine Asztrociták glycint és glutamátot az EC térből akkumulálnak. A cystine-t cystine/glutamate exchanger (xct) révén veszik fel. Az ic. cystine cysteine né redukálódik. Ez a glutamáttal γ-glutamylcysteine t alkot (γ-glucys). Ez a dipeptid gylicin inkorporációval tripeptiddé, glutathionná (GSH) alakul. Hertz, Zielke 2004

27 Hertz, Zielke 2004 Glia-neuron interakció Metabolikus együttműködés Glutathione Neuron nem képesek a cystine cystein redukcióra, így gliális glutathione-tól függnek! xct A GSH-t a γ-glutamyl transpeptidase (γ-gt) alakítja át: cysteinylglycine (CysGly) és glutamát keletkezik. A cysteinylglycine-t a neuronális felszínen egy másik ektopeptidáz, az aminopeptidase N (ApN) hasítja: glycine és cysteine keletkezik. Mindkettőt a neuron akkumulálja. A neuronokban újra γ-glutamylcysteine keletkezik cysteine és glutamate felhasználásával (glutamát glutaminból vagy újrafelvételből származik). Végül glycine hozzáadásával elkészül a neuronális glutathione.

28 Glia-neuron interakció aspektusai Agyi mikrokörnyezet szabályozása Neuron-glia metabolikus együttműködés Neurovaszkuláris kapcsoltság ion, víz homeosztázis szabályozása neurotranszmitter homeosztázis szabályozása glutamát-glutamin ciklus asztrocita neuron laktát sönt glutathione prekurzor szintézis. ascorbate neurovaszkuláris unit (NvU) lokális véráramlás gliális szabályozása gliális BBB kontroll

29 Glia-neuron interakció aspektusai máshol tárgyalva Szinaptikus működés szabályozása tripartite synapse neuron glia szignalizáció neuron/glia szinapszisok glia neuron szignalizáció, gliotranszmitterek neuronális hálózatok kontrollja szinaptogenezis, szinapszis fenntartása, eliminációja Neurogenezis Neuronal guidence glia mint őssejt glia mint őssejt-niche tagja glia és az axon pathfinding Patofiziológiai aspektusok agyi ödéma akut léziók (trauma, stroke) krónikus neurodegeneratív kórképek neuroimmunológiai reakciók (mikroglia!) remodeling and recovery of neuronal function

30 Tripartite szinapszis In 1994, Vladimir Parpura and colleagues conducted a set of experiments making an intriguing discovery: cultured astrocytes release glutamate, which leads to Ca2+ elevation of nearby neurons. Later studies demonstrated that this process can be observed in acute brain slices and in vivo. Astrocytes were later shown to release a number of chemical transmitters, including ATP, D-serin, TNF-alpha, and ANP in a process that has recently been termed gliotransmission. Based on the early studies of gliotransmission, the concept of the tripartite synapse was proposed highlighting the role of the astrocyte as a third active element in information processing at the synapse. Although many aspects of this astrocytes-to-neuron communication are still to be elucidated the introduction of molecular genetic tools is shedding light on the neuromodulatory roles of astrocytes on brain function at the level of synapses, circuits, and behavior. Halassa 2007, 2010

31 Glia-neuron interakció Neuron glia Glia szignalizáció Glutamaterg szinapszis. 1. neuronok stimulációja Ca ++ szignalizációt indukál asztrocitákban 2. asztrociták érzékelik a neuronális aktivitás intenzitását: ha a szinaptikus aktivitás nő nő a glia Ca ++ oszcilláció frekvenciája is - Asztro is rendelkezik memóriával, mint neuron: intenzív neuronális aktivitás esetén neuronális EPSP amplitúdója nő (LTP!) ÉS a gliális Ca ++ válasz frekvenciája is nő! Verkhratsky Butt 2007

32 Glia-neuron interakció Neuron Glia szignalizáció Példa 1. Hippocampus Figure 1.5. Hippocampal pathways and their stimulation Signals from the entorhinal cortex (EC) enter the dentate gyrus (DG) via the perforant path (PP). From the DG granule cells information travels to the CA3 pyramidal neurons via the mossy fibers. From the CA3 neurons the signal leaves via the Schaffer collaterals and joins with the commissural fibers (Comm.) from the contralateral CA3 making connections with CA1 pyramidal neurons. Signals leaving CA1 then travel to neurons within the subiculum. A bipolar stimulating electrode was placed on the Schaffer collateral and commissural (comm.) fibers. Recording electrodes placed in the dendritic layer and/or the pyramidal layer of CA1 will record an Excitatory Postsynaptic Potential (EPSP) or a population spike (PS) following stimulation, respectively. EPSP represents the response at the CA3- CA1 synapse and the PS represents the number of pyramidal cells firing and the contribution of the EPSP at that location. The top portion of the figure demonstrates the four layers that the CA1 pyramidal neuron lies within (S. denotes Stratum). The small neuron with a letter I represents an inhibitory interneuron. The pathway diagramed in the top portion of the figure corresponds to the recurrent inhibitory loop in area CA1.

33 Glia-neuron interakció Neuron Glia szignalizáció Példa 1. Hippocampus Schaffer-kollaterálisok stimulációja [Ca ++ ] ic növekedést vált ki CA1 stratum radiatum asztrocitákban - kis szinaptikus aktivitás csak mglur-t aktivál asztron - nagy szinaptikus aktivitás mglur-t és AMPAR-t is aktivál - repetitív Ca ++ szignálokat csak a nagy-frekvenciájú stimuláció vált - az asztro nyúlványokban a Ca ++ válaszok aszinkron természetűek: az asztrociták különböző, relatíve izolált kompertmentumai egyedi vagy néhány szinapszis aktivitását követik Porter, Porter, McCarthy McCarthy

34 Glia-neuron interakció Neuron Glia szignalizáció a: stimuláció előtt [Ca ++ ] ic b,c: stimuláció után (200 ma, 50 Hz, 2 sec) Ca ++ szenzítív fluoreszcens festékkel töltött asztrociták d: stimuláció után 28 sec e: GFAP immunfestés azonosítás Porter, McCarthy 1996 Porter, McCarthy 1996

35 Glia-neuron interakció Példa 2. Cerebellum Hoogland 2010 Tanaka BGC: Bergmann glial cells PC: Purkinje cell ml: molecular layer AC: cerebellar astrocytes (velate protoplasmic astrocytes) gcl: granule cell layer wm: white matter

36 Glia-neuron interakció Példa 2. Cerebellum -parallel rost/purkinje neuron szinapszisokat Bergmann glia körbeveszi Neuron Glia szignalizáció -parallel rost stimulációra Bergmann gliában erősen lokalizált Ca ++ válaszok jelennek meg szignalizációs mikrodomének A: kísérleti felállás: parallel rost stimuálció Bergmann glia Ca ++ imaging B: Bergmann glia Oregon green 488 BAPTA-1 Ca ++ -szenzitív fluorfestékkel feltöltve. Ca ++ mérés több régióban C: Bergmann glia mikrodomének sematikus rajza. Több, közel futó parallel rost egy mikrodomént aktiválhat. Verkhratsky Butt 2007 függelék Bergmann glia főbb nyúlványa

37 Glia-neuron interakció Példa 3. Hippocampus Neuronális acetilkolin release asztrogliális Ca ++ tranzienseket generál Szeptumból hippocampusba érkező kolinerg afferensek repetitív stimulációja [Ca2] ic oszcillációkat vált ki a stratum oriensben található asztrocitákon, muszkarinikus AchRec-on keresztül. Tehát asztrociták távoli axonális inputra is reagálhatnak. Példa 4. Hippocampus GABAerg interneuronok aktiválják asztrocitákat Neuron Glia szignalizáció Araque 2002 CA1 piramissejteken szinaptizáló GABA-ergic interneuronok repetitív tüzelése [Ca2] ic szint növekedéshez vezet a környező asztrociták egy csoportjában (paired patch-clamp recordings), GABAB receptoron át, extracell Ca++-tól függő módon. Neuronális gátlás is Ca++ növekedést okoz. Példa 5. Hippocampus Neurotrophin kiváltotta Ca ++ szignalizáció asztrocitákban Kang 1998 BDNF (amely neuronokból aktivitás-függő módon ürülhet) a TrkB-T1 receptorokon keresztül késleltetett [Ca2] ic növekedést váltott ki CA1 asztrocitákon. Gliális Ca++ válasz késleltetése, időzítése! Rose 2003 Reviewed in Volterra, Steinhauser 2004

38 Glia-neuron interakció Neuron Glia szignalizáció Neuron/glia szinapszisok szinapszis-szerű kapcsolatok hipofízis pars intermedia pituicitái és a nucleus arcuatusból érkező axonok között norepinephrine terminálisok synaptoid kontaktusokkal végződnek szepto-hippocampalis asztrocitákon Christian Steinhauser szinapszisok végződnek GluR sejteken szinapszisok NG2+ sejteken!! lásd korábban, 04 előadás.,ng2 sejt

39 Neuron/glia szinapszisok Jabs 2005, Bergles 2010 Legalább kétféle preszinaptikus neuron (glutamaterg CA3 piramissejt és GABAerg interneuronok) innerválják az NG2 sejteket. Ezek posztszinaptikus áramai jól megkülönböztethetőek. Neuron-NG2 szinaptikus kapcsolat potenciális funkciója: NG2+ sejt myelináló oligodendrogliává való differenciálódásának szabályozása neuronális aktivitás függvényében! erre már kezd gyűlni némi bizonyíték:

40 Neuron Glia szignalizáció Neuron/glia szinapszisok

41 Glia-neuron kapcsolat interakció Neurotranszmitter gyors eltávolítása, szinaptikus hatékonyság megőrzése: Glia Neuron szignalizáció 1. G N : neurotranszmitter konc. szab. A. Uptake Részleteket lásd korábban: [Glu] ec koncentráció szabályozása [GABA] ec koncentráció szabályozása illetve egyéb, szinapszis-típustól (pl. monoaminerg, etc.) függő uptake - amihez megfelelő gliális transzporterek társulnak B. Kötő-fehérje release: Központi kolinerg szinapszisokban: periszinaptikus asztrociták acetylcholine-kötő fehérjét (AChBP) szintetizálnak és ürítenek a szinaptikus résbe. E fehérje gliális szekréciója intenzív kolinerg stimulációra nő.

42 Glia-neuron interakció 1. transzendocitózis, exoszómák Glia neuron szignalizáció

43 Glia-neuron interakció Glia neuron szignalizáció 1. transzendocitózis, exoszómák RNS axonális transzportja Dia az Axonális transzport előadásból!! Spekulatív modell Gliasejt / axon transzcelluláris transzfer hipotézise Egyelőre:??? Ribonucleoprotein particles (RNPs) Asztrocita HC-ban tudja fagocitálni a degenerálódó butont ÉS a leváló spinule transzendocitózissal bejuthat gliába.... fordított irányú kommunikáció is lehetséges?! (Spacek 2004 JNeurosci) Sossin 2006

44 Glia-neuron interakció neuronok által aktivált gliális Ca ++ szignalizáció következtében gliotranszmitter (pl. Glu) release asztroból ez visszahat a neuronműködésre: AMPA/NMDAR-on át direkt posztszinatikus neuronális depolarizációt okozhat ILLETVE preszinaptikus mglur-t is aktiválhat gliotranszmitter ATP is lehet: vagy P2 purinreceptorokon át direktben hat vagy adenozinná bomlik, és P1 receptorokon hat Glia Neuron szignalizáció 2. Gliotranszmisszió gliális [Ca ++ ]ic : bekövetkezhet még spontán vagy pl. elektromos vagy mechanikus stimulálásra

45 Volterra, Meldolesi Nature Rev Neurosci, 2005 Glia-neuron interakció Glia Neuron szignalizáció 2. Gliotranszmisszió

46 Glia-neuron interakció Glia Neuron szignalizáció Példa 1. Hippocampus Heteroszinaptikus depresszió Feed-forward szinaptikus moduláció 2. Gliotransz misszió 1. Glutamát ürül (1, piros folt) amikor a Schafferkollaterális (S) CA1 piramissejt (P) szinapszis nagy frekvenciájú tüzelése stimulál egy asztrocitát 2. Az asztrocita erre ATP kibocsátással reagál 3. Ez gyorsan adenozinná alakul (2; kék folt), ami egy másik S-P kapcsolatot a preszinaptikus adenozin A1 receptoron keresztül szupresszálni fog! tonic suppression of synaptic transmission Volterra, Meldolesi 2005

47 Glia-neuron interakció Glia Neuron szignalizáció Példa 2. Hippocampus Szinaptikus transzmisszió asztrociták általi modulációja Szomszédos piramissejtek excitációja és szinkronizációja nem direkt módon kapcsolt neuronok asztrociták általi összeköttetése 1. asztrocita spontán [Ca2+]ic oszcillációt mutat 2. ez gliális glutamát-releaset triggerel (piros folt) 3. ezt két piramissejt is érzékeli egy időben 2. Gliotransz misszió 4. szinkronizált NMDAR-dependens excitatorikus áramok generálódnak Fiziológiás körülmények között spontán oszcillációk ritkák (szeletben): kb 2 percenként Volterra, Meldolesi 2005

48 Glia-neuron interakció Glia Neuron szignalizáció Példa 3. Hippocampus Szinaptikus transzmisszió asztrociták általi modulációja Feedback moduláció 2. Gliotransz misszió Gátló szinapszis potenciációja GABAerg interneuronok és piramissejtek között 1. GABA ürül (1; sárga folt) GABAerg interneuronpiramissejt szinapszisban, repetitív tüzelés során 2. a GABA a szomszédos asztrocitán GABAB receptorokat aktivál 3. ez az asztrocita glutamát ürítéssel válaszol (2; red spot) mely a GABAerg interneuront éri 4. ez tovább potencírozza (feedback potenciáció) a GABAerg interneuron általi gátlást (3) (decreases GABA mediated synaptic failures) Volterra, Meldolesi 2005

49 Glia Neuron szignalizáció N G is 2. Gliotranszmisszió Példa 4. Hipotalamusz Hogyan szabályozzák a neuroendokrin neuronok szekréciós aktivitását az asztrociták Sisk, Foster 2004 HT GnRH neuroendokrin neuronok eminencia mediana, portális keringés hipofízis, gonadotropin (LH, FSH) szekréció véráram, gonádokban gametogenezis szteroid hormonok ürülése... feedback... stb.. Neuroendokrin területeken asztro mglur és AMPAR sejtmembránban kapcsolatban van erbb receptorokkal (EGF rec. család, ligand pl. TGFa, neuregulin) Diedzic 2003

50 Glia-neuron interakció Glia Neuron szignalizáció Példa 4. GnRH neuronok szinaptikus aktivációja glutamát, gliális aktivációja PGE2 által. 2. Gliotransz misszió morphological rearrangement prosztaglandin 1. neuronális Glu release 2. Glu aktiválja asztron mglur-t, AMPAR-t 3. ez mátrix metalloproteinázokat (MMP/ADAM) aktivál melyek katalizálják a pro-tgfa és a pro- NRG (pro-neuregulin) ektodomén vedlését (shedding) 4. a szekretált érett TGFa and NRG aktiválja az erbb1/erbb2 and erbb4/erbb2 heterodimereket 5. erbb receptorok serkentik a gliális prosztanoidok (pl. PGE2) szekrécióját - ez posztszinaptikus neuronális EP2 recetoron át (PGE2 receptor alosztály) GnRH release-t indukálhat 5. * emelett TGFa és NRG a HT asztro morfológia változását is indukálják Prevot 2010

51 Glia-neuron interakció Glia Neuron szignalizáció Szinaptikus borítottság változása 3. Gliotranszmisszió és asztrocita morfológiai remodelling Már régebben, GFAP festésekből is kiderült, a gliamorfológia változik: - hipotalamusz: nucleus supraopticus (SON), suprachiasmaticus (SCN), arcuatus, preopticus : dehidratáció, cirkadián ritmus, fluktuáló szteroid szintek -hippocampus CA1, vizuális cortex: gazdag szenzoros input esetén! De disztális glia nyúlványok motilitásának változása neuronális működéssel összhangban még egyértelműbb sok példa Lásd: review of Theodosis Hypothalamo-neurohypophysial system 2. Basal hypothalamus 6. Cerebellum 3. Suprachiasmatic nucleus 7. Barrel cortex 4. Brain stem 8. Neocortex 5. Hippocampus 9. Visual cortex

52 3. Gliotranszmisszió és asztrocita morfológiai remodelling asztro SON első alkalommal vemhes; stb SON nucleus supraopticus: vajúdás, tejelválasztás alatt OT neuronok glia borítottsága nagyon lecsökken neuronális felszínek egymás mellé kerülnek: asztro retrakció, OT neuron nagyobbodás Theodosis 2008 Gyors változás: neuroszekréció indukciója után 1 órával már észlelhető, in vivo mérések szerint

53 Glia-neuron interakció Glia Neuron szignalizáció Szinaptikus borítottság változása Nem stimulált: pl. szűz vagy elválasztás utáni patkány Stimulált: laktáló és dehidrált patkányok 3. Gliotranszmisszió és asztrocita morfológiai remodelling A hipotalamikus szupraoptikus magban az asztrociták morfológiai plaszticitása a tejelválasztással hozható összefüggésbe 1. oxytocin-termelő idegsejteken levő szinapszisokról asztrociták visszahúzzák nyúlványaikat laktáció alatt 2. így a glia kevésbé tudja visszavenni a szinapszisba ömlő glutamátot, és diffúzió is jobb (fekete nyilak) így a Glu képes távolabb elhelyezkedő mglur receptorokat aktiválni preszinaptikusan vagy szomszédos GABAerg terminálisokon 3. ez a neurotranszmitter-ürülés homoés heteroszinaptikus modulációját okozza: más glutamaterg és GABAerg szinapszisok működésének modulációja Theodosis 2008

54 Glia-neuron interakció Glia Neuron szignalizáció 3. Gliotranszmisszió és asztrocita morfológiai remodelling D-serine függő metaplaszticitás Szupraoptikus magban (SON) : (a) asztrocita-eredetű D-serine el tudja érni az NMDA receptorokat, és segíti az NMDAR mediálta transzmissziót és az LTP kialakulását (b) Ha a glianyúlványok visszahúzódnak, a D-serine nem tud ko-agonistaként működni az NMDA receptorokon, LTD alakul ki inkább (c) Gyors asztrocita (zöld) nyúlvány mozgás a dendrittüske (piros) körül (sec) Theodosis 2008 Halassa and Haydon rev. 2009

55 Hipofízisben is vannak (pituicita!) morfológiai változások: 3. Gliotranszmisszió és asztrocita morfológiai remodelling Neurohipofízisben pituicita retrakció (szürke) következik be az axonokról és erekről a neuroszekretoros tevékenység aktivációjának hatására: nagyobb release, könyebb véráramba jutás Theodosis

56 Glia-neuron interakció Glia Neuron szignalizáció 4. Neuronális Hálózatok kontrollja Philip Haydon Asztro network??? Halassa 2007 Reichenbach 2010 A, 3 asztrocita. Különböző neuronális kompartmentumokat más-más asztro kontrollálhat. B, egyetlen asztro is koordinálhat pl. egy több ( ezer!!) dendritből álló csoportot

57 Glia-neuron interakció Glia Neuron szignalizáció 4. Neuronális Hálózatok kontrollja dnsnare transzgén egér: asztrocitában nincs (vezikuláris) gliotranszmisszió csökkent lassú oszcillációk a szomatoszenzoros kéregben Representative LFP (local field potential) recording showing slow oscillation activity in the somatosensory cortex In vivo current-clamp recordings from representative neurons showing slow oscillations in the cortex of WT asztro ezt a folyamatot két ponton modulálja: 1. adenozin A1 receptor aktiváció gátlódik (tehát heteroszinaptikus gátlás megszűnik) 2. neuronális NMDAR funkció is csökken (itt a gliális D-serine ürülése csökken)! Tehát asztrocita eredetű gliotranszmisszió valóban befolyásolja agyi hálózatok működését in vivo

58 NREM Glia-neuron interakció Glia Neuron szignalizáció Alvás korai kutatása: vér, CSF transzfer alvó állatból éberbe: sikertelenek de kiderül, hogy agyban lokálisan termelődő faktorokról van szó: sleep factors. Adenozin is egy endogén sleep factor (2002, 2003 Porkka-Heiskannen et al): ébrenlét adenozin szint progresszívan nő alvás alatt leapad CSF: cerebrospinal fluid 4. Neuronális Hálózatok kontrollja NREM (Non-Rapid-Eye-Movement) fázis (vagy lassú hullámú alvás) : lassú oszcillációk

59 sok Adenozin: - akkumulálódva álmossá tesz, lelassítja a neuronális működést - ér-dilatációt okoz (alvás alatti jobb oxigénellátás) KV addiktív! (heroin is a dopamin szintet emeli ) koffein 6 óra alatt tűnik el a szervezetből Koffein: - adenozin-receptorhoz köt, melyhez ezáltal az adenozin nem fér hozzá - nagyobb neuronális aktivitás, éberség - a hipofízis a nagyobb neuronális aktivitás hatására adrenalint ürítésre utasítja a mellékvesét - emiatt: pupilla kitágul, gyorsabb szívverés, légutak megnyílnak (asztmások adrenalint kapnak), vérnyomás nő, vércukorszint nő, izmok vérellátása fokozódik, - adenozin-receptor gátlás agyi érkontrakciót is okoz (néhány fejfájás elleni orvosság koffein-tartalmú) - és még.. Pl.: migraine pain is caused byvasodilation in the cranial blood vessels

60 Glia-neuron interakció 5. Viselkedés kontrollja dnsnare egereken krónikus EEG mérések (beültetett elektródák) miközben alszanak csökkent lassú hullámú aktivitás (slow wave activity, SWA) A1 receptor farmakológiai gátlása hasonlót hullámokat eredményez és ha A1 receptorokat kiütik előagyi excitatorikus neuronokon (Bjorness 2009) akkor ezekben az egerekben romlik a memória a krónikus alváshiány miatt dnsnare egerek rezisztensek a rövidtávú alvásdepriváció okozta kognitív zavarokra Vagyis: asztro eredetű adenozin viselkedési mintázatokba is beleszól! Purinergic Gliotransmission Contributes to Memory Impairment Following Sleep Loss (A) Novel object recognition (NOR) paradigm: mice are trained to recognize two identical objects and are either left undisturbed or sleep deprived for 6 hr following training. At hour 24, mice are tested for the ability to recognize a novel object replacing one of the familiar objects. (B) SD impairs NOR in wild-type mice. (C) dnsnare mice are unaffected by the effects of SD on NOR memory Halassa 2009

61 dnsnare : 2005 óta min. 12 cikk, jó újságokban stb.. de!!! Vita.

62 .. és akkor there is a need for better genetic models to study astrocyte function. in contrast to the prevailing literature, we find that neither receptordriven astrocyte Ca(2+) fluxes nor, by extension, gliotransmission is likely to be a major modulating force on the physiological processes underlying behavior.

63 Tools for selectively activation of astrocyte signaling in vivo Optogenetika Farmakogenetika

64 Pharmacogenetic Activation of Astrocytic Signaling In Vivo Using DREADDs In 2007, a new family of engineered GPCRs, Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADD) were developed GPCRs = G protein coupled receptors DREADDs represent a chemogenetic tool to modulate GPCR signaling in vivo. Introducing two mutations in transmenbrane III and V of muscarinic receptors which create DREADDs receptors that can precisely control the Gq-, Gi-, or Gs-signaling pathways. DREADDs technology has been successfully applied in β-cells, astrocytes, and a variety of neurons to control GPCR signaling in vivo. DREADDs technology has a great potential to be used in drug discovery, gene therapy, and tissue engineering.

65 Glia-neuron interakció 5. Viselkedés kontrollja

66 Glia-neuron interakció Szinaptogenezis Néhány hetes tiszta RGC (retinal ganglion cell) vagy gerincvelői motoneuron tenyészet: - alacsony szinaptikus aktivitás, - szinaptikus fehérjék alacsony szintje Asztroglia + RGC kokultúra: - nagy szinaptikus aktivitás (100 X); - szinapszisszám nő (7X) 1 héttel asztrociták eltávolítása után a kokultúrákból: - a legtöbb szinapszis eltűnik ACM: asztro conditioned medium, asztro tenyészet felülúszója Ullian EM. Christopherson KS, Barres BA 2004 Thrombospondin (TSP): sejt-sejt és sejt-mátrix adhézió (fibrinogen, fibronectin, laminin, collagen és integrin kötő glikoprotein) In vitro szinapszis OK Tenyésztett neuronok közti szinapszisok száma

67 Neurovaszkuláris kapcsoltság Agyi kapilláris Perifériás kapilláris Agyi endotél: TJ kapcsoltság (BBB): makromolekulák paracelluláris transzportja és vérsejtek inváziója gátolt. (de pl. choroid plexusban: fenesztrált endotélum, igaz itt az epitélsejtek között van TJ) Perifériás kapillárisokban jellemzőek a pinocitotikus granulumok

68 Neurovaszkuláris kapcsoltság endotélsejtek közötti tight junction Agyi kapilláris. endothelial cell (EC) tight junctions (arrows) part of a pericyte (P) astrocytes end-feet (EF)

69 Neurovaszkuláris kapcsoltság Serial Section Electron Microscopy and 3D Reconstruction The capillary surface is completely covered by a perivascular glial sheath. A) This sheath surrounds the capillary and pericyte. A perivascular astrocyte with nucleus (N) and cell body (ascb) embraces (aspve II) the endothelial tube. The pericyte (pe) is seen through discontinuities in the endfoot indexed aspve III. Astrocytic processes (asp) from the endfeet stretch out in different directions. B) Structure in A viewed from the right. All four endfeet (pve I-IV) in the reconstruction is represented together with the pericyte (pe). Part of a probable microglial cell process, indexed as a perivascular cell process (pvcp), is seen peripheral to the glial sheath. C,D) Removal of the pericyte, pve III, and pve IV (structures reconstructed in C) allows the remaining perivascular sheath (pve I and II) to be viewed from the inside (D). The most important feature in C is the six linearly arranged discontinuities of the third endfoot (pveiii). E) Elements reconstructed in D are shown in color and entered into a drawing adapted from Ramon y Cajal (1911).

70 Neurovaszkuláris kapcsoltság Asztro végtalpak: teljesen körbeölelik kapillárisokat Asztro eredetű faktorok: - (pl. TGFa, GDNF) endotél sejtek közötti TJ kapcsolatot indukálják és - fenntartják az endotél luminális/bazális polarizáltságát (ioncsatorna, AQP, receptorkészlet) - prostaglandin (PGE), nitrogén monoxid (NO) vazodilatáció - endothelin, ATP - vazokonstrikció - arachidonsav (AA) - vazokonstrikció és/vagy dilatáció Endotélsejtek is jeleznek asztro felé: - LIF (leukemia inhibitory factor) az asztrociták érését segíti Agyi endotél szelektív permeabilitása: (1) adenine-nucleotide binding (ABC) cassette transzporterek (energiaigényesek) melyek xenobiotikumokat exkretálnak (drogok, antibiotikumok, citosztatikumok stb) cytostatics, opioids etc. nem jutnak át BBB-n) (2) aminosav transzporterek (L1) (3) glükóz transzporterek (GLUT1 type) (4) ion exchangerek, stb.

71 Neurovaszkuláris kapcsoltság Transzporter rendszerek (protein szinten ismertek) BCRP, breast cancer resistance protein (also known as ABC transporter G family member 2); GLUT, solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member; LRP, low-density lipoprotein receptor-related protein family member; MCT, monocarboxylic acid transporter family member; MRP, multidrug resistanceassociated protein family member; OAT, organic anion transporter family member; OATP, organic anion transporter polypeptide family member; Pgp, P-glycoprotein; RAGe, advanced glycosylation end productspecific receptor; RLiP76, Ral-binding protein 1 Neuwelt 2011

72 Neurovaszkuláris kapcsoltság NVU Neurovaszkuláris unit (NvU) extended NvU: neuronok, asztrociták, mikroglia, endotél pericita, simaizom sejt, vérsejtek: polymorfonukleáris (PMN) sejtek, limfociták, monociták BBB modell + asztro és pericita Cardoso 2010 Neuwelt 2011

73 Neurovaszkuláris kapcsoltság Agyi mikrocirkuláció szabályozása Funkcionális hyperaemia: lokális neuronális aktivitás esetén gyorsan nő a lokális agyi vérellátás 1890, Sherrington - vazodilatáció az aktív neuronokhoz közel, um távolságban következik be - sokféle elmélet próbálta magyarázni: lokális neuronális vazoaktív faktor release, lokális innerváció, NO termelés - ma: asztro szerepe egyértelmű! neuronális aktivitás asztro [Ca ++ ] ic arachidonsav (AA) kibocsátása glia végtalpból asztro Ca++ szignalizáció gátlása szétkapcsolja a neuronális aktivitást az értónus szabályozástól!! vazodilatáció (blood flow nő): ha AA prosztaglandin-származékká alakul cyclooxygenáz segítségével (ezt aszpirin gátolja) e végtalp által körbefogott kis arteriolák tónusának változása vazokonstrikció: ha AA átalakulás útja 20- hydroxyeicosatetraenoic acid (2-HETE), cytochrome p450 enzim segítségével

74 Agyi mikrocirkuláció szabályozása David Attwell et al Nature Pathways from astrocytes and neurons that regulate blood flow by sending messengers to influence the smooth muscle around the arterioles that supply oxygen and glucose to the cells (shown as the vessel lumen surrounded by endothelial cells and smooth muscle). In neurons, synaptically released glutamate acts on N-methyl-D-aspartate receptors (NMDAR) to raise [Ca 2+ ] i, causing neuronal nitric oxide synthase (nnos) to release NO, which activates smooth muscle guanylate cyclase. This generates cgmp to dilate vessels. Raised [Ca 2+ ] i may also (dashed line) generate arachidonic acid (AA) from phospholipase A 2 (PLA 2 ), which is converted by COX2 to prostaglandins (PG) that dilate vessels. Glutamate raises [Ca 2+ ] i in astrocytes by activating metabotropic glutamate receptors (mglur), generating arachidonic acid and thus three types of metabolite: prostaglandins (by COX1/3, and COX2 in pathological situations) and EETs (by P450 epoxygenase) in astrocytes, which dilate vessels, and 20-HETE (by ω-hydroxylase) in smooth muscle, which constricts vessels. A rise of [Ca 2+ ] i in astrocyte endfeet may activate Ca 2+ -gated K + channels (g K(Ca) ), releasing K +, which also dilates vessels.

75 Neurovaszkuláris kapcsoltság Agyi mikrocirkuláció szabályozása AA membrán foszfolipidekből keletkezik Ca 2+ -függő és Ca 2+ -independens lipázok segítségével. Zöld: vazodilátor, Piros: vazokonstriktor, Kék: a megfelelő enzimek lokalizációja. COX, cyclooxygenase; CYP, cytochrome P450 superfamily of enzymes; EET, epoxyeicosatrienoic acid; 20-HETE, 20-hydroxyeicosatetraenoic acid; HPETE, hydroperoxy-eicosatetraenoic acid. David Attwell et al Nature

76 Neurovaszkuláris kapcsoltság Proximális integráció modellje Agyi mikrocirkuláció szabályozása A piális artéria B penetráló artéria C prekapilláris artéria D valódi kapilláris (a, b) neuronális aktiváció helyszínei (a)+(b) a és b szignálok integrációja Piros nyíl: véráramlás Kék nyíl: neuronális aktivitás szignáljainak elvezetődése a kapillárisoktól a proximális artériákig (1) Asztro végtalp szignáljai szabályozzák lokális arteriolát a simaizomsejtek tónusának változtatásával. A fehér nyilak a perifériáról jövő info integrációját jelzik. (2) A kapilláris véráramlását Mindig is kérdéses volt, hogy a lokális neuronális kisrészt lokális pericitakonstrikció szabályozza, tüzelés infoja hogyan jut el a proximális (kezdeti) artériákig, nagyobb erekig a kapillárisoktól: asztro nagyrészt a prekapilláris illetve pericita GJ mediálta retrográd info-terjedés területről érkező véráram erek mentén!! egyelőre ez csak egy hipotézis!!! Itoh 2012

77 Neurovaszkuláris kapcsoltság Periciták Winkler

78 Pericita